JPS62265992A - ヒト細胞を用いる有用物質の製造方法 - Google Patents
ヒト細胞を用いる有用物質の製造方法Info
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- JPS62265992A JPS62265992A JP61107981A JP10798186A JPS62265992A JP S62265992 A JPS62265992 A JP S62265992A JP 61107981 A JP61107981 A JP 61107981A JP 10798186 A JP10798186 A JP 10798186A JP S62265992 A JPS62265992 A JP S62265992A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明の製造方法は蛋白質性生理活性物質、特に原核細
胞性宿主中では生産困難な修飾された蛋白質、例えばグ
リコジル化されたインターロイキン−２、γ−インター
フェロン、エリスロボイエチン等の蛋白質性生理活性物
質をヒト細胞を利用して恒常的に産生させる際に利用で
きる。
胞性宿主中では生産困難な修飾された蛋白質、例えばグ
リコジル化されたインターロイキン−２、γ−インター
フェロン、エリスロボイエチン等の蛋白質性生理活性物
質をヒト細胞を利用して恒常的に産生させる際に利用で
きる。
〈従来の技術〉
近年、組換えＤＮＡ技術を用いて有用な生理活性物質を
生産しようとする試みが多くなされてきている。原核生
物である大腸菌や枯草菌などの細菌類を宿主細胞として
異種の有用な蛋白質性生理活性物質を生産する技術はほ
ぼ確立されてきているが、これらの微生物宿主によって
、糖蛋白、さらにはアシド化、リン酸化、カルボキモル
化等の修飾された蛋白をつくることはできない。また、
微生物宿主による蛋白質性生理活性物質の立体構造、例
えば−５−Ｓ−結合の保持等、種々の問題点が指摘され
ている。
生産しようとする試みが多くなされてきている。原核生
物である大腸菌や枯草菌などの細菌類を宿主細胞として
異種の有用な蛋白質性生理活性物質を生産する技術はほ
ぼ確立されてきているが、これらの微生物宿主によって
、糖蛋白、さらにはアシド化、リン酸化、カルボキモル
化等の修飾された蛋白をつくることはできない。また、
微生物宿主による蛋白質性生理活性物質の立体構造、例
えば−５−Ｓ−結合の保持等、種々の問題点が指摘され
ている。
そこで、天然型に近い蛋白質性生理活性物質を得るため
には動物培養細胞を宿主として使用する事が望ましい。
には動物培養細胞を宿主として使用する事が望ましい。
しかし、動物細胞における宿主、ベクター系については
現在、侵れた系の開発をめざして研究が進行中で、実用
化できるような系は確立されていないと言える。
現在、侵れた系の開発をめざして研究が進行中で、実用
化できるような系は確立されていないと言える。
誠
ジヒドロ葉酸還元麿素（ｄｈｆｒ）はプリン、チミジル
酸、グリシンのｄｏ ｎｏｖｏ合成に必要なテトラヒド
ロ葉酸を生成する酵素である。葉酸拮抗剤の一種である
メソトレキセー） （ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｓ ）を
培地に加えると、メソトレキセートはｄｈｆｒの活性部
位に強く結合し、ｄｈｆ ｒ酵素活性を不活化する。マ
ウスｄｈｆｒのｃＤＮＡ遺伝子（Ａ、Ｃ，Ｙ、 Ｃｈａ
ｎｇ ＠ｔ ａｌ、：Ｎａｔｕｒｅ、２７５，６１７（
１９７８）＞に動物ウィルス由来の遺伝子発現調節シグ
ナルをつけたキメラ遺伝子は、捕乳動物細胞でマウスｄ
ｈｆｒを発現する。
酸、グリシンのｄｏ ｎｏｖｏ合成に必要なテトラヒド
ロ葉酸を生成する酵素である。葉酸拮抗剤の一種である
メソトレキセー） （ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｓ ）を
培地に加えると、メソトレキセートはｄｈｆｒの活性部
位に強く結合し、ｄｈｆ ｒ酵素活性を不活化する。マ
ウスｄｈｆｒのｃＤＮＡ遺伝子（Ａ、Ｃ，Ｙ、 Ｃｈａ
ｎｇ ＠ｔ ａｌ、：Ｎａｔｕｒｅ、２７５，６１７（
１９７８）＞に動物ウィルス由来の遺伝子発現調節シグ
ナルをつけたキメラ遺伝子は、捕乳動物細胞でマウスｄ
ｈｆｒを発現する。
ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｔｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ
）細胞にはジヒドロ葉酸還元酵素欠損株であるＣＨＯ
ｄｈｆｒ−細胞があり、その生育にプリン、チミジル酸
、グリシンを必要とする。このＣＨＯｄｈｆ ｒ−細胞
に上記のマウスｄｈｆｒキメラ遺伝子を導入する際には
、プリンなどの補足のない培地で生育可能なＣＨＯｄｈ
ｆｒ＋を選別する事によって、容易に形質導入が可能で
ある。
）細胞にはジヒドロ葉酸還元酵素欠損株であるＣＨＯ
ｄｈｆｒ−細胞があり、その生育にプリン、チミジル酸
、グリシンを必要とする。このＣＨＯｄｈｆ ｒ−細胞
に上記のマウスｄｈｆｒキメラ遺伝子を導入する際には
、プリンなどの補足のない培地で生育可能なＣＨＯｄｈ
ｆｒ＋を選別する事によって、容易に形質導入が可能で
ある。
（Ｓｕｂｒａｍａｒｉ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ、： Ｍｏ
１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 １゜８５４（１９８１
）＞メソトレキセートの添加濃度を段階的に上げた培地
で培養し、最終的に生き残った細胞ばｄｈｆｒ遺伝子が
増幅しており、多量のジヒドロ葉酸還元酵素を産生ずる
。この際、それに伴って近傍にある遺伝子も共に増幅す
る事が知られている。したがって、ｄｈｆ ｒ遺伝子の
近傍に目的遺伝子をつなぎ、ＣＨＯｄｈｆ ｒ−細胞に
導入し、形質転換株取得後、メソトレキセート耐性をつ
けることにより、ｄｈｆ ｒ遺伝子と共に、目的遺伝子
も増幅し、生産性を向上させる事ができる。このｄｈｆ
ｒ遺伝子とＣＨＯｄｈｆｒ″″絹胞の系は今までヒトβ
−インターフェロン（Ｆ、 ＭｃＣＯＲＭＩＣＫ、 ａ
ｔ ａｌ、： Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ。
１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 １゜８５４（１９８１
）＞メソトレキセートの添加濃度を段階的に上げた培地
で培養し、最終的に生き残った細胞ばｄｈｆｒ遺伝子が
増幅しており、多量のジヒドロ葉酸還元酵素を産生ずる
。この際、それに伴って近傍にある遺伝子も共に増幅す
る事が知られている。したがって、ｄｈｆ ｒ遺伝子の
近傍に目的遺伝子をつなぎ、ＣＨＯｄｈｆ ｒ−細胞に
導入し、形質転換株取得後、メソトレキセート耐性をつ
けることにより、ｄｈｆ ｒ遺伝子と共に、目的遺伝子
も増幅し、生産性を向上させる事ができる。このｄｈｆ
ｒ遺伝子とＣＨＯｄｈｆｒ″″絹胞の系は今までヒトβ
−インターフェロン（Ｆ、 ＭｃＣＯＲＭＩＣＫ、 ａ
ｔ ａｌ、： Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ。
Ｂｉｏｌ、 ４，１６６（１９８４））、ヒトＴＰＡ
（Ｒ，Ｊ。
（Ｒ，Ｊ。
Ｋａｕｆｍａｎ＊ ｅｔ ａｌ、： Ｍｏ１． Ｃｅ１
１． Ｂｉｏｌ、 ５．１７５０（１９８５）＞、牛黄
体形成ホルモン（Ｄ、Ｍ。
１． Ｂｉｏｌ、 ５．１７５０（１９８５）＞、牛黄
体形成ホルモン（Ｄ、Ｍ。
Ｋａｅｔｚｅｌ、 ｅｔ ａｌ、： Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
８２．７２８０（１９８５）＞などの生産に応用されて
いる。
いる。
しかしながら、ヒトの蛋白質性生理活性物質を異種の動
物細胞で産生させた場合、糖鎖の修飾が若干、ヒトのも
のと異なってくる可能性がある。
物細胞で産生させた場合、糖鎖の修飾が若干、ヒトのも
のと異なってくる可能性がある。
例えば、上記の牛黄体形成ホルモンの例ではその点が指
摘されている。これらの動物細胞に産生させ丸缶白質性
生理活性物質は生物活性は有していても、ヒトに医薬品
などとして使用する場合、抗原として認識される可能性
が危惧される。したがって、ヒトの蛋白質性生理活性物
質はヒトの細胞で生産させる事が望ましい。ところが、
現状ではヒトの細胞で遺伝子工学的手法を用いて、有用
物質を生産させる系はまだほとんど知られていない。
摘されている。これらの動物細胞に産生させ丸缶白質性
生理活性物質は生物活性は有していても、ヒトに医薬品
などとして使用する場合、抗原として認識される可能性
が危惧される。したがって、ヒトの蛋白質性生理活性物
質はヒトの細胞で生産させる事が望ましい。ところが、
現状ではヒトの細胞で遺伝子工学的手法を用いて、有用
物質を生産させる系はまだほとんど知られていない。
前述の遺伝子増幅の系にしてもｄｈｆｒ（−）のｍｕｔ
ａｎｔがないと、使用が困難であり、ヒト細胞を宿主と
してこのｄｈｆ ｒ遺伝子増幅の系を物質生産に用いた
例はない。
ａｎｔがないと、使用が困難であり、ヒト細胞を宿主と
してこのｄｈｆ ｒ遺伝子増幅の系を物質生産に用いた
例はない。
ｄｈｆｒ（−）のｍｕｔａｎｔがない細胞では、もとも
との細胞がｄｈｆｒ遺伝子を有しているので、ｄｈｆｒ
遺伝子と目的遺伝子をつないだベクターが細胞に導入さ
れたか否かが判定できない。そこで、発明者らはＣｏ−
ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ法を用い、その問題点を克服
した。すなわち、ｎｅｏやＥｃｏｇｐｔといったｄｏｍ
ｉｎａｎｔ−ａｃｔｉｎｇな優性選択マーカーを持つベ
クターとｄｈｆ ｒ遺伝子ならびに目的遺伝子をつない
だベクターとを後者を過剰量にした上で共にヒト細胞に
トランスフェクション（形質導入）し、あらかじめ、優
性選択マーカーで出現した細胞株を拾い、しぼシ込んだ
上で、目的遺伝子の組込みを確認した細胞株について、
遺伝子増幅を行なえば、目的の蛋白質性生理活性物質を
多量に生産する細胞株が簡便に得られる。このＣｏ−ｔ
ｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ法を併用し遺伝子増幅効果によ
ってヒト細胞で有用物質、すなわち、蛋白質性生理活性
物質を多量に生産させるという試みは全くなく、本特許
が初の報告である。
との細胞がｄｈｆｒ遺伝子を有しているので、ｄｈｆｒ
遺伝子と目的遺伝子をつないだベクターが細胞に導入さ
れたか否かが判定できない。そこで、発明者らはＣｏ−
ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ法を用い、その問題点を克服
した。すなわち、ｎｅｏやＥｃｏｇｐｔといったｄｏｍ
ｉｎａｎｔ−ａｃｔｉｎｇな優性選択マーカーを持つベ
クターとｄｈｆ ｒ遺伝子ならびに目的遺伝子をつない
だベクターとを後者を過剰量にした上で共にヒト細胞に
トランスフェクション（形質導入）し、あらかじめ、優
性選択マーカーで出現した細胞株を拾い、しぼシ込んだ
上で、目的遺伝子の組込みを確認した細胞株について、
遺伝子増幅を行なえば、目的の蛋白質性生理活性物質を
多量に生産する細胞株が簡便に得られる。このＣｏ−ｔ
ｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ法を併用し遺伝子増幅効果によ
ってヒト細胞で有用物質、すなわち、蛋白質性生理活性
物質を多量に生産させるという試みは全くなく、本特許
が初の報告である。
く本発明が解決しようとする問題点ならびＫその問題点
を解決するための手段〉 従来、ｄｈｆｒ遺伝子の増幅効果を利用して遺伝子工学
的に動物細胞て有用物質を生産させる系でばｄｈｆｒ遺
伝子欠損のＣＨＯｄｈｆｒ−細胞が用いられてきた。し
かし、ヒトの蛋白質性生理活性物質を生産する場合、よ
り天然型に近いものを得るためにはヒト細胞での生産が
不可欠である。本発明は従来の方法では生産の宿主とし
て用いる事ができなかったｄｈｆ ｒ遺伝子欠損株のな
いヒト細胞てお−てＣｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法
を併用する事によって容易に有用物質、すなわち蛋白質
性生理活性物質を多量に産生させるというものである。
を解決するための手段〉 従来、ｄｈｆｒ遺伝子の増幅効果を利用して遺伝子工学
的に動物細胞て有用物質を生産させる系でばｄｈｆｒ遺
伝子欠損のＣＨＯｄｈｆｒ−細胞が用いられてきた。し
かし、ヒトの蛋白質性生理活性物質を生産する場合、よ
り天然型に近いものを得るためにはヒト細胞での生産が
不可欠である。本発明は従来の方法では生産の宿主とし
て用いる事ができなかったｄｈｆ ｒ遺伝子欠損株のな
いヒト細胞てお−てＣｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法
を併用する事によって容易に有用物質、すなわち蛋白質
性生理活性物質を多量に産生させるというものである。
すなわち、本発明は２、特許請求の範囲て記載された製
造方法に関するものである。以下、本発明について詳細
に説明する。本発明で用いる有用物質生産遺伝子とは動
物細胞、特にヒトの蛋白質性生理活性物質の遺伝子をさ
し、従来の原核生物宿主では天然型に近い物質を得る事
が困難であった、修飾された蛋白質、すなわち、糖付加
、アンド化、リン酸化、カルボキモル化等の修飾された
蛋白質の遺伝子にも適用する事ができる。例えば、ヒト
インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ヒトＢＵＦ、ヒト
γ−インターフェロン、ヒトエリスロポイエチン、ヒト
組織グラスミノーグン活性化因子、ヒトＴＮＦなどのリ
ンフ才力インや種々のホルモン類さらには抗体等の生産
にも適用できる事は明らかである。本発明で丈用するｄ
ｈｆｒ遺伝子とはマウスのｄｈｆｒ遺伝子のｃＤＮＡを
指す。（Ａ、Ｃ，Ｙ、 Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ、：
Ｎａｔｕｒｅ。
造方法に関するものである。以下、本発明について詳細
に説明する。本発明で用いる有用物質生産遺伝子とは動
物細胞、特にヒトの蛋白質性生理活性物質の遺伝子をさ
し、従来の原核生物宿主では天然型に近い物質を得る事
が困難であった、修飾された蛋白質、すなわち、糖付加
、アンド化、リン酸化、カルボキモル化等の修飾された
蛋白質の遺伝子にも適用する事ができる。例えば、ヒト
インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ヒトＢＵＦ、ヒト
γ−インターフェロン、ヒトエリスロポイエチン、ヒト
組織グラスミノーグン活性化因子、ヒトＴＮＦなどのリ
ンフ才力インや種々のホルモン類さらには抗体等の生産
にも適用できる事は明らかである。本発明で丈用するｄ
ｈｆｒ遺伝子とはマウスのｄｈｆｒ遺伝子のｃＤＮＡを
指す。（Ａ、Ｃ，Ｙ、 Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ、：
Ｎａｔｕｒｅ。
２７５．６１７（１９７８））このａ ＤＮＡの前に種
々のプロモーター（例えば動物ウィルス由来のＳＶ４０
のもの）をつけ、さらに、後に種々のスプライ７ングな
らびにポリＡシグナルをつけ、ヒト細胞の中で発現でき
るようにしたキメラ遺伝子を本発明で使用するｄｈｆｒ
遺伝子とする。マ念、後につけるスゲライジングならび
にポリＡシグナルは必ずしもつけなくてもよい。そして
、本発明では有用物質生産遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を同
一のプラスミド（以下ベクター■と呼ぶ）上に連結する
。本発明で使用するプラスミドとはシャトルベクターの
事であり、大腸菌とヒト細胞の両方を宿主として複製可
能でなければならない。本発明で使用するＣｏ−ｔｒａ
ｎｓｆａｅｔｉｏｎ法は従来の技術のところで述べた通
りであるが、ベクター■と共にＣｏ−ｔｒａｎｓｆａｅ
ｔｉｏｎする優性選択マーカーを持つベクター（以下、
ベクター■と呼ぶ）としては、抗生物質Ｇ４１８耐性と
なるｎｅｏ遺伝子あるいはミコフェノール酸耐性となる
Ｅｃｏ−ｇｐｔ遺伝子、あるいはこれらと同様にヒト細
胞で優性に選択マーカーとなりうるいずれの遺伝子をつ
ないだベクターであってもよい。
々のプロモーター（例えば動物ウィルス由来のＳＶ４０
のもの）をつけ、さらに、後に種々のスプライ７ングな
らびにポリＡシグナルをつけ、ヒト細胞の中で発現でき
るようにしたキメラ遺伝子を本発明で使用するｄｈｆｒ
遺伝子とする。マ念、後につけるスゲライジングならび
にポリＡシグナルは必ずしもつけなくてもよい。そして
、本発明では有用物質生産遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を同
一のプラスミド（以下ベクター■と呼ぶ）上に連結する
。本発明で使用するプラスミドとはシャトルベクターの
事であり、大腸菌とヒト細胞の両方を宿主として複製可
能でなければならない。本発明で使用するＣｏ−ｔｒａ
ｎｓｆａｅｔｉｏｎ法は従来の技術のところで述べた通
りであるが、ベクター■と共にＣｏ−ｔｒａｎｓｆａｅ
ｔｉｏｎする優性選択マーカーを持つベクター（以下、
ベクター■と呼ぶ）としては、抗生物質Ｇ４１８耐性と
なるｎｅｏ遺伝子あるいはミコフェノール酸耐性となる
Ｅｃｏ−ｇｐｔ遺伝子、あるいはこれらと同様にヒト細
胞で優性に選択マーカーとなりうるいずれの遺伝子をつ
ないだベクターであってもよい。
また、ヒト細胞へのベクター■とベクター■の導入方法
（トランスフェクション）の方法としては例えば、リン
酸カルシウム法（ＣａＰＯ４法）、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔ
ｒａｎ法、マイクロインノｚクシｗＺ法、電気５ｈｏｃ
ｋ法などのいずれの方法でもよい。本発明で使用するヒ
ト細胞は上記のベクターＩとベクターＨの発現が可能な
ものなら何でもよい。例えば、Ｈｅ１ｍ細胞、ＰＬ細胞
、ＷＩＳＨ細胞、Ｊ−１１１細胞などである。Ｃｏ−ｔ
ｒａｎｓｆａｅｔｉｏｎ法の際、ベクターＩとベクター
■の量比を前者を多重に添加する（例えば１０：１）事
が望ましい。そして、ベクター■の優性選択遺伝子、例
えばｎｅｏを用いるとすると、Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔｆｏｎを行なっに後に抗生物質Ｇ４１８に耐性になり
た細胞株を取得し、それらについて、メソトレキセート
添加による遺伝子増幅を行なえばよい。そして、それら
の細胞株の中からベクターＩが組み込まれ、有用物質を
産生じている細胞株を選択すればよい。ベクターＩをベ
クター■より多量に添加する事はベクター■の優性選択
遺伝子によりて選択された耐性株の中にベクターＩも共
に組み込まれる確率ヲ高める効果を持つ。以上のように
して、分離されたヒト細胞株について、メソトレキセー
トの添加量を次第に高める事によってｄｈｆｒ遺伝子な
らびにその近傍【ある有用物質遺伝子の増幅を引き起こ
し、目的の有用物質を多量に培地中に生成・蓄積せしめ
るヒト細胞株を得る。この時、得られるヒト細胞株は野
性型細胞では通常、致死【至るメントレキセー）ｙＪ度
の培地中で生育可能になっているものである。
（トランスフェクション）の方法としては例えば、リン
酸カルシウム法（ＣａＰＯ４法）、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔ
ｒａｎ法、マイクロインノｚクシｗＺ法、電気５ｈｏｃ
ｋ法などのいずれの方法でもよい。本発明で使用するヒ
ト細胞は上記のベクターＩとベクターＨの発現が可能な
ものなら何でもよい。例えば、Ｈｅ１ｍ細胞、ＰＬ細胞
、ＷＩＳＨ細胞、Ｊ−１１１細胞などである。Ｃｏ−ｔ
ｒａｎｓｆａｅｔｉｏｎ法の際、ベクターＩとベクター
■の量比を前者を多重に添加する（例えば１０：１）事
が望ましい。そして、ベクター■の優性選択遺伝子、例
えばｎｅｏを用いるとすると、Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔｆｏｎを行なっに後に抗生物質Ｇ４１８に耐性になり
た細胞株を取得し、それらについて、メソトレキセート
添加による遺伝子増幅を行なえばよい。そして、それら
の細胞株の中からベクターＩが組み込まれ、有用物質を
産生じている細胞株を選択すればよい。ベクターＩをベ
クター■より多量に添加する事はベクター■の優性選択
遺伝子によりて選択された耐性株の中にベクターＩも共
に組み込まれる確率ヲ高める効果を持つ。以上のように
して、分離されたヒト細胞株について、メソトレキセー
トの添加量を次第に高める事によってｄｈｆｒ遺伝子な
らびにその近傍【ある有用物質遺伝子の増幅を引き起こ
し、目的の有用物質を多量に培地中に生成・蓄積せしめ
るヒト細胞株を得る。この時、得られるヒト細胞株は野
性型細胞では通常、致死【至るメントレキセー）ｙＪ度
の培地中で生育可能になっているものである。
以上の如く、本発明におけるヒト細胞を用いる有用物質
の製造方法は目的の有用物質の遺伝子が恒常的に高コピ
ー数で安定に複製され、生産しようとする物質がヒト由
来の蛋白質性生理活性物質である場合、ヒト細胞で生産
させるため、従来の方法に比べて、より天然型に近い物
質が多数に培地中に分泌されるため、実用化に充分供し
うるものである。以下、実施例をもって本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はなψ。
の製造方法は目的の有用物質の遺伝子が恒常的に高コピ
ー数で安定に複製され、生産しようとする物質がヒト由
来の蛋白質性生理活性物質である場合、ヒト細胞で生産
させるため、従来の方法に比べて、より天然型に近い物
質が多数に培地中に分泌されるため、実用化に充分供し
うるものである。以下、実施例をもって本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はなψ。
〈実施例〉
１． ヒト・インターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子の
発現ベクターｐＳＤＩの構築 ヒト・インターロイキン２遺伝子は谷口ら（Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｃ３０２，３０５（１９８３）＞によりてクローニ
ングされたｃ ＤＮＡを用いた。［［−２ｃＤＮＡはｐ
ＣＥＩＬ −２というベクターの中に含まれている（第
１図）。このＩＬ−２ｃＤＮＡは両端に数十塩基の長さ
に及ぶＧＣテイルを有している。このＧあるいはＣとい
う同一の塩基が並んだ場合、ｃＤＮＡの発現の邪魔にな
ると考えられた。したがりてｐＣＥＩＬ −２よシ制限
酵累Ｐｓｔｌ（宝酒造）処理によりＩ Ｌ −２ｃＤＮ
Ａフラグメントを分離し、それにエクソヌクレアーゼで
あるＢａ１３１（ＮＥＢ）処理を行ない、ＧＣテイルの
除去を行なった。そして、Ｔ ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙ：
ｎｅｒａｓｅ （宝酒造）で両末端を平滑末端にした後
、ｐＣＥＩＬ −２よりＰｓｔ ｌ処理をしてＩＬ−２
ｅＤＮＡを除い九フラグメントも同様にＴ ４ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍａｒａｓｅで平滑末端にし、両者をＴ４Ｄ
ＮＡ １１ｇａｍｅ （宝酒造）で結合した。そして、
作製されたグラスミドを大腸菌Ｉ（Ｂ １０１株に導入
した後、得られた形質転換株より、プラスミドを調製し
た。得られたプラスミドの中で、ＧＣティルが除かれ発
現効率の高まったものを選択するためてサルＣＯ８−１
細胞での発現を行なった。このプラスミドはＳＶ４０の
複製開始領域のＤＮＡ、うさぎのβ−グロビン遺伝子な
らびにｐＢＲ３２８由来のＴｅｔｒ（テトラサイクリン
耐性）遺伝子を含むＤＮＡ断片からなるプラスミドであ
り、このプラスミドＩ Ｌ −２ｃＤＮＡの上流にばＳ
Ｖ４０ 初期蛋白遺伝子のプロモーター（ＳＶ４０ ｅ
ａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ）が存在するので、この
支配下にＩ Ｌ −２ｃＤＮＡがＣ０８−１細胞内で発
現できるようになっている。本発明者らはデアニーデキ
ストラン法（Ｌｕｔｈａｍａｎ ａｔ。
発現ベクターｐＳＤＩの構築 ヒト・インターロイキン２遺伝子は谷口ら（Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｃ３０２，３０５（１９８３）＞によりてクローニ
ングされたｃ ＤＮＡを用いた。［［−２ｃＤＮＡはｐ
ＣＥＩＬ −２というベクターの中に含まれている（第
１図）。このＩＬ−２ｃＤＮＡは両端に数十塩基の長さ
に及ぶＧＣテイルを有している。このＧあるいはＣとい
う同一の塩基が並んだ場合、ｃＤＮＡの発現の邪魔にな
ると考えられた。したがりてｐＣＥＩＬ −２よシ制限
酵累Ｐｓｔｌ（宝酒造）処理によりＩ Ｌ −２ｃＤＮ
Ａフラグメントを分離し、それにエクソヌクレアーゼで
あるＢａ１３１（ＮＥＢ）処理を行ない、ＧＣテイルの
除去を行なった。そして、Ｔ ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙ：
ｎｅｒａｓｅ （宝酒造）で両末端を平滑末端にした後
、ｐＣＥＩＬ −２よりＰｓｔ ｌ処理をしてＩＬ−２
ｅＤＮＡを除い九フラグメントも同様にＴ ４ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍａｒａｓｅで平滑末端にし、両者をＴ４Ｄ
ＮＡ １１ｇａｍｅ （宝酒造）で結合した。そして、
作製されたグラスミドを大腸菌Ｉ（Ｂ １０１株に導入
した後、得られた形質転換株より、プラスミドを調製し
た。得られたプラスミドの中で、ＧＣティルが除かれ発
現効率の高まったものを選択するためてサルＣＯ８−１
細胞での発現を行なった。このプラスミドはＳＶ４０の
複製開始領域のＤＮＡ、うさぎのβ−グロビン遺伝子な
らびにｐＢＲ３２８由来のＴｅｔｒ（テトラサイクリン
耐性）遺伝子を含むＤＮＡ断片からなるプラスミドであ
り、このプラスミドＩ Ｌ −２ｃＤＮＡの上流にばＳ
Ｖ４０ 初期蛋白遺伝子のプロモーター（ＳＶ４０ ｅ
ａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ）が存在するので、この
支配下にＩ Ｌ −２ｃＤＮＡがＣ０８−１細胞内で発
現できるようになっている。本発明者らはデアニーデキ
ストラン法（Ｌｕｔｈａｍａｎ ａｔ。
ａｌ、： Ｎｕｃｌｅｌｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、：
１１ ＊ １２９５ （１９８３）＞を用いＣＯ８−１
細胞の形質転換を行った。また、コントロールとして、
ｐＣＥＩＬ −２よりＩ Ｌ −２ｃＤＮＡフラグメン
トを除き、そのｔま自己環状化させたプラスミドｐＣＥ
−１も同様にＣＯ８−１細胞に導入した。形質転換さ
れたｃｏｓ −ｉ細胞を、修生血清１０％を含むＤＭＥ
Ｍ （ＧＩ ＢＣＯ）培地で７２ｈｒ＊３７℃で培養後
、培養液のＩＬ−２活性を調べた。その結果、ＧＣテイ
ルをけずった事により、元のＰＣＩＩ −２よシ、数倍
高いＩＩ、−２活性を示すグラスミドｐＣＥＩＬ −２
（Ｂａｌ ７ ）を得た（第１表参照）。
１１ ＊ １２９５ （１９８３）＞を用いＣＯ８−１
細胞の形質転換を行った。また、コントロールとして、
ｐＣＥＩＬ −２よりＩ Ｌ −２ｃＤＮＡフラグメン
トを除き、そのｔま自己環状化させたプラスミドｐＣＥ
−１も同様にＣＯ８−１細胞に導入した。形質転換さ
れたｃｏｓ −ｉ細胞を、修生血清１０％を含むＤＭＥ
Ｍ （ＧＩ ＢＣＯ）培地で７２ｈｒ＊３７℃で培養後
、培養液のＩＬ−２活性を調べた。その結果、ＧＣテイ
ルをけずった事により、元のＰＣＩＩ −２よシ、数倍
高いＩＩ、−２活性を示すグラスミドｐＣＥＩＬ −２
（Ｂａｌ ７ ）を得た（第１表参照）。
ＩＬ−２ｃＤＮＡを含まないｐＣＥ −１はＩＬ−２活
性を示さなかった。ＩＬ−２活性はＣＴＬＬ −２細胞
の３Ｈ−チミゾンのとり込み看で測定した（Ｇｉｌｌｉ
ｓ、 Ｓ、 ｅｔａｌ、： Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ＊ １２０ ｅ ２０２７（１９７８））。
性を示さなかった。ＩＬ−２活性はＣＴＬＬ −２細胞
の３Ｈ−チミゾンのとり込み看で測定した（Ｇｉｌｌｉ
ｓ、 Ｓ、 ｅｔａｌ、： Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ＊ １２０ ｅ ２０２７（１９７８））。
第１表
ＩＬ
発現効率の高まった１−２発現ベクターの取得プラスミ
ド ｐＣＥ−１ｐＣＥＩＬ−２ｐｃ］１ＴＬ−２（
Ｂａ１７）ＩＬ−２活性 ＜４ ＜４ ６．７
４．１ ２９．４ １３．４（ｕ ｎ ｉ ｔ ｓ
／ｌｎｌ ） こうして得られたｐ（ＪＩＬ −２（Ｂａ１７ ）から
は制限酵素ＢａｍＨＩ（全酒造〕処理によりＩＬ−２ｃ
ＤＮＡフラグメントを分離する事ができる。このフラグ
メントの塩基配列を第２図に示す。このＩＬ−２ｃＤＮ
Ａ断片をＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって
平滑末端にし、さらにＢａｍＨＩ ｅ Ｈｌｎｄｌｎの
各リンカ−（宝酒造）と共にＴＡ ＤＮＡ ｌｉｇａｍ
ｅ処理を行ない、その後、ＢａｍＩ（Ｉ 、 Ｈｌｎｄ
Ｉ［Ｉ （全酒造〕処理を行なった。こうして得られ
たＩＬ−２ｃＤＮＡの両端はＢａｍＨＩ ｅ Ｈｌｎｄ
ｌｌｌのいずれかの切断個所を持った混合物となる。そ
して、これｋ ｐｓＶ２− ｄｈｆｒ （Ｓ、 Ｓｕｂ
ｒａｍａｎｉ、 ｅｔ。
ド ｐＣＥ−１ｐＣＥＩＬ−２ｐｃ］１ＴＬ−２（
Ｂａ１７）ＩＬ−２活性 ＜４ ＜４ ６．７
４．１ ２９．４ １３．４（ｕ ｎ ｉ ｔ ｓ
／ｌｎｌ ） こうして得られたｐ（ＪＩＬ −２（Ｂａ１７ ）から
は制限酵素ＢａｍＨＩ（全酒造〕処理によりＩＬ−２ｃ
ＤＮＡフラグメントを分離する事ができる。このフラグ
メントの塩基配列を第２図に示す。このＩＬ−２ｃＤＮ
Ａ断片をＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって
平滑末端にし、さらにＢａｍＨＩ ｅ Ｈｌｎｄｌｎの
各リンカ−（宝酒造）と共にＴＡ ＤＮＡ ｌｉｇａｍ
ｅ処理を行ない、その後、ＢａｍＩ（Ｉ 、 Ｈｌｎｄ
Ｉ［Ｉ （全酒造〕処理を行なった。こうして得られ
たＩＬ−２ｃＤＮＡの両端はＢａｍＨＩ ｅ Ｈｌｎｄ
ｌｌｌのいずれかの切断個所を持った混合物となる。そ
して、これｋ ｐｓＶ２− ｄｈｆｒ （Ｓ、 Ｓｕｂ
ｒａｍａｎｉ、 ｅｔ。
ａｌ、： Ｍｏ１． Ｃａ１１． Ｂｉｏｌ、 １，８
５４（１９８１） ＞のＨ１ｎｄ’ｌｌｌ 、 Ｂｇｌ
ｌ処理して得られる大きい方の断片と結合し、大腸菌
ＤＨＩ株に形質転換し、その中から、第１図のｐｓｖ
２− Ｉ Ｌ ２を有するものを得る。すなわち、ｐＳ
Ｖ ２− ｄｈｆｒ由来（７）ＳＶ４０初期蛋白遺伝子
のプロモーター（Ｓ Ｖ ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍ
ｏｔｅｒ ）とＳＶ４０初期領域のスプライシイグとポ
リＡのシグナルを含んだ部分（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ
ｒｅｇｉｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ）との間く、転写される正
しい向き（第１図参照）にＩＬ−２ｃＤＮＡが挿入され
たものを得る。次にこのｐｓｖ ２−ＩＬ−２プラスミ
ドをＰｖｕ ■、 ＢａｍＨｌ処理して得られるＩＬ−
２ｃＤＮＡを含んだフラグメントにＢａｍＨＩリンカ−
をつけ、ＢａｍＨＩ処理した後に、ｐＳＶ ２ｄｈｆｒ
のＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、グラスミドりＳＤＩを
得た。このプラスミドｐＳＤＩはＩＬ−２ｃＤＮＡの上
流にｐＳＶ ２− ｄｈｆｒ由来のマウ７． ｄｈｆｒ
ｃＤＮＡを有している。このマウスｄｈｆｒ ｃＤＮ
Ａは上流にＳＶ４０の初期蛋白遺伝子のプロモーターを
、下流にＳＶ４０初期領域のスプライシングならびに、
ｆｆすＡのシグナルを含んだ部分を有しておシ、動物細
胞で発現する事ができる。したがって、このプラスミド
ｐｓｐｒを動物細胞（ヒト細胞ももちろん含む）に形質
転換した後にメソトレキセート添加によってｄｈｆ ｒ
遺伝子の増幅をおこせば、そのすぐ下流にあるＩ Ｌ
−２ｃＤＮＡの増幅も同時におこシ、ＩＬ−２ｃＤＮＡ
のコピー数、増加と共に、ＩＬ−２の大量生産が期待さ
れる。
５４（１９８１） ＞のＨ１ｎｄ’ｌｌｌ 、 Ｂｇｌ
ｌ処理して得られる大きい方の断片と結合し、大腸菌
ＤＨＩ株に形質転換し、その中から、第１図のｐｓｖ
２− Ｉ Ｌ ２を有するものを得る。すなわち、ｐＳ
Ｖ ２− ｄｈｆｒ由来（７）ＳＶ４０初期蛋白遺伝子
のプロモーター（Ｓ Ｖ ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍ
ｏｔｅｒ ）とＳＶ４０初期領域のスプライシイグとポ
リＡのシグナルを含んだ部分（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ
ｒｅｇｉｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ）との間く、転写される正
しい向き（第１図参照）にＩＬ−２ｃＤＮＡが挿入され
たものを得る。次にこのｐｓｖ ２−ＩＬ−２プラスミ
ドをＰｖｕ ■、 ＢａｍＨｌ処理して得られるＩＬ−
２ｃＤＮＡを含んだフラグメントにＢａｍＨＩリンカ−
をつけ、ＢａｍＨＩ処理した後に、ｐＳＶ ２ｄｈｆｒ
のＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、グラスミドりＳＤＩを
得た。このプラスミドｐＳＤＩはＩＬ−２ｃＤＮＡの上
流にｐＳＶ ２− ｄｈｆｒ由来のマウ７． ｄｈｆｒ
ｃＤＮＡを有している。このマウスｄｈｆｒ ｃＤＮ
Ａは上流にＳＶ４０の初期蛋白遺伝子のプロモーターを
、下流にＳＶ４０初期領域のスプライシングならびに、
ｆｆすＡのシグナルを含んだ部分を有しておシ、動物細
胞で発現する事ができる。したがって、このプラスミド
ｐｓｐｒを動物細胞（ヒト細胞ももちろん含む）に形質
転換した後にメソトレキセート添加によってｄｈｆ ｒ
遺伝子の増幅をおこせば、そのすぐ下流にあるＩ Ｌ
−２ｃＤＮＡの増幅も同時におこシ、ＩＬ−２ｃＤＮＡ
のコピー数、増加と共に、ＩＬ−２の大量生産が期待さ
れる。
２、 プラスミドベクターｐＳＤＩによるヒトＨｅ１ａ
細胞の形質転換とＩＬ−２産生 プラスミドｐＳＤＩ ３８ ＡｔとグラスミドｐｓＶ２
ｎｅ。
細胞の形質転換とＩＬ−２産生 プラスミドｐＳＤＩ ３８ ＡｔとグラスミドｐｓＶ２
ｎｅ。
４μｇをカルシウム・フォスフエイト法（Ｆ、Ｌ。
Ｇｒａｈａｍ ｅｔ、 ａｌ、： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ＋
５２ ａ ４５６ （１９７３）＞でヒトＨｅ１ａ細
胞にトランスフェクションした。
５２ ａ ４５６ （１９７３）＞でヒトＨｅ１ａ細
胞にトランスフェクションした。
ｐＳＤＩ 、 ｐｓＶ２ ｎｅｏ共に制限酵素Ｐｖｕ
■処理によりて直鎖状にした後、混合してＣｏ−ｔｒａ
ｎａｆｅｃｔｌｏｎに供した。ヒ）Ｈｅ１ａ細胞は修生
血清２チを含むＤＭＥＭ （ＧＩＢＣＯ）培地で培養す
る。ｐＳＤＩ 、 ｐｓＶ２ｎｅ。
■処理によりて直鎖状にした後、混合してＣｏ−ｔｒａ
ｎａｆｅｃｔｌｏｎに供した。ヒ）Ｈｅ１ａ細胞は修生
血清２チを含むＤＭＥＭ （ＧＩＢＣＯ）培地で培養す
る。ｐＳＤＩ 、 ｐｓＶ２ｎｅ。
をヒトＨｅ１ａ細胞にトランスフェクション後、４８時
間経過した後、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ）８００μｇ／Ｆ
ｎｌ。
間経過した後、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ）８００μｇ／Ｆ
ｎｌ。
Ｍ＠ｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ （Ｓｉｇｍａ ） ５ Ｘ
１０ Ｍ ｔ−上記培地中に添加した。この選択培
地は３〜４日ごとに交換した。グラスミドｐＳＤＩ 、
ｐＳＶ ２ ｎｅｏをトランスフェクションしていな
い野性型のＨｅ１ａ細胞はＧ４１８８００μｇ／ｒｒｌ
の濃度で全細胞死滅した。３週間後、２１９個の０４１
８耐性株を取得した。それらのうち生育良好な株１２株
についてＩＬ−２活性を調べたところ１１株にＩＬ−２
産生全確認した。ＩＬ−２オ゛生株について、メソトレ
キセート濃度を４×１０−８Ｍ、ｌＸｌ０Ｍとさらに上
昇させた培地で培養を継続した。そして、遺伝子増幅が
おこり、生育可能になった細胞を選択した。メソトレキ
セート濃度ｌＸｌ０ Ｍで生育可能になりた細胞株は
いずれもＩＬ−２産生量が増大しており、最高４１２ｕ
ｎｉｔｓ ／ｌｎｌ／ ２４ ｈｒのＩＬ−２を生産す
る細胞株魔１２−１０ を得た。野性型のＨｏｌ＆細
胞はＩＬ−２を産生じていなりが、本発明により、ＩＬ
−２遺伝子が導入されたＨｅ１ｍ細胞を容易に選択し、
かつ培地中のメソトレキセート濃度を次第に高める事に
よって、ＩＬ−２遺伝子がｄｈｆ ｒ遺伝子と共に、遺
伝子増幅し、ＩＬ−２を大量に産生ずる株を得る事がで
きた。
１０ Ｍ ｔ−上記培地中に添加した。この選択培
地は３〜４日ごとに交換した。グラスミドｐＳＤＩ 、
ｐＳＶ ２ ｎｅｏをトランスフェクションしていな
い野性型のＨｅ１ａ細胞はＧ４１８８００μｇ／ｒｒｌ
の濃度で全細胞死滅した。３週間後、２１９個の０４１
８耐性株を取得した。それらのうち生育良好な株１２株
についてＩＬ−２活性を調べたところ１１株にＩＬ−２
産生全確認した。ＩＬ−２オ゛生株について、メソトレ
キセート濃度を４×１０−８Ｍ、ｌＸｌ０Ｍとさらに上
昇させた培地で培養を継続した。そして、遺伝子増幅が
おこり、生育可能になった細胞を選択した。メソトレキ
セート濃度ｌＸｌ０ Ｍで生育可能になりた細胞株は
いずれもＩＬ−２産生量が増大しており、最高４１２ｕ
ｎｉｔｓ ／ｌｎｌ／ ２４ ｈｒのＩＬ−２を生産す
る細胞株魔１２−１０ を得た。野性型のＨｏｌ＆細
胞はＩＬ−２を産生じていなりが、本発明により、ＩＬ
−２遺伝子が導入されたＨｅ１ｍ細胞を容易に選択し、
かつ培地中のメソトレキセート濃度を次第に高める事に
よって、ＩＬ−２遺伝子がｄｈｆ ｒ遺伝子と共に、遺
伝子増幅し、ＩＬ−２を大量に産生ずる株を得る事がで
きた。
第１図は本発明の例示遺伝子としてＩＬ−２ｃＤＮＡを
組み込んだ、遺伝子増幅ベクタープラスミド９の構築を
示す図である。 第２図は発現効率を高めるため両端についていたＧＣテ
イハを除去し、上記プラスミド作成に用いたＩＬ−２ｃ
ＤＮＡのフラグメントの塩基配列を示す図である。
組み込んだ、遺伝子増幅ベクタープラスミド９の構築を
示す図である。 第２図は発現効率を高めるため両端についていたＧＣテ
イハを除去し、上記プラスミド作成に用いたＩＬ−２ｃ
ＤＮＡのフラグメントの塩基配列を示す図である。
Claims (1)
- 有用物質生産遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を有するプラス
ミドをＣｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法を用いヒト細
胞へ導入後、有用物質生産能を有する細胞株を取得し、
さらにその細胞株のメソトレキセート耐性度を高める事
によって、遺伝子増幅効果による有用物質の大量生産能
を有したヒト細胞を取得し、そのヒト細胞の培養液より
有用物質を取得することを特徴とするヒト細胞を用いる
有用物質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61107981A JPS62265992A (ja) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | ヒト細胞を用いる有用物質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61107981A JPS62265992A (ja) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | ヒト細胞を用いる有用物質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62265992A true JPS62265992A (ja) | 1987-11-18 |
Family
ID=14472957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61107981A Pending JPS62265992A (ja) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | ヒト細胞を用いる有用物質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62265992A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11225785A (ja) * | 1997-12-01 | 1999-08-24 | Roche Diagnostics Gmbh | 内在性遺伝子活性化のための細胞の最適化 |
| JP2001511343A (ja) * | 1997-07-23 | 2001-08-14 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | 内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの製造 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59183693A (ja) * | 1983-01-19 | 1984-10-18 | ジエネンテック・インコーポレイテッド | ＤＨＦＲタンパクをコ−ドするベクタ−を使用するヒトｔＰＡの産生 |
| JPS615785A (ja) * | 1984-06-19 | 1986-01-11 | Ajinomoto Co Inc | ヒト細胞の形質転換方法 |
| JPS6188875A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
-
1986
- 1986-05-12 JP JP61107981A patent/JPS62265992A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59183693A (ja) * | 1983-01-19 | 1984-10-18 | ジエネンテック・インコーポレイテッド | ＤＨＦＲタンパクをコ−ドするベクタ−を使用するヒトｔＰＡの産生 |
| JPS615785A (ja) * | 1984-06-19 | 1986-01-11 | Ajinomoto Co Inc | ヒト細胞の形質転換方法 |
| JPS6188875A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒトインタ−フエロン−γ |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001511343A (ja) * | 1997-07-23 | 2001-08-14 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | 内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの製造 |
| JPH11225785A (ja) * | 1997-12-01 | 1999-08-24 | Roche Diagnostics Gmbh | 内在性遺伝子活性化のための細胞の最適化 |
| EP0957165A3 (de) * | 1997-12-01 | 2000-10-04 | Roche Diagnostics GmbH | Optimierung von Zellen für die endogene Genaktivierung |
| EP1464705A1 (de) * | 1997-12-01 | 2004-10-06 | Roche Diagnostics GmbH | Optimierung von Zellen für die endogene Genaktivierung |
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