JPS62272917A - トウモロコシを再生する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 ［発明の背景］ （発明の分野） 本発明はトウモロコシの再生についての一般的な方法お
よびその方法によって生産される植物に関するものであ
る。さらに詳細に述べれば、本発明はトウモロコシの多
数の品種からトウモロコシ苗を再生するための組織およ
び細胞培養の使用に関するものである。

（先行技術の説明） 培養中の細胞からの植物再生は、体細胞交雑の応用、体
細胞クーロン変異による新品種の生産および新品種の生
産における遺伝学的技術の使用に際して必須である。ト
ウモロコンの数品種については組織培養から植物を再生
することができるが、同様の技術の使用では再生が達成
されなかった品種が多数ある。

最近、植物細胞培養の成功が、植物の生長および発生の
制御における細胞と生物体の各役割に著しい影響をもた
らしている。この見方は、分離した植物細胞が生体外培
養によくなじむことが判明し、また完全な植物が体細胞
胚発生物から直接にまたは器官形成物から間接に、体細
胞組；褒から誘導される培養物から再生され得ｒこ時支
持された。

一般的に、再生経路の選択は外部の要因、特に生長調節
因子の操作により実験的に決定される。ある植物種の初
期の研究は、オーキシンの減少が胚形成の開始を導くと
いうように、外因性オーキンン濃度が体細胞胚発生の制
御の主要な因子であることを示唆した、他の種では、一
定の平衡状態のオーキシンおよびサイトカイニンにさら
すことが器官形成（新芽、ついで根）の発生を導く。ト
ウモロコシの数種の遺伝学型はこれらの技術を用いて再
生されたが、トウモロコシの大部分の遺伝学型に対して
一般的に適用できる方法はなかった。多数の遺伝学型は
、先行技術を用いる培養がたとえ不可能でないとしても
、極めて困難であった。

トウモロコシの組織培養に対する標準方式になっている
方法は、グリーンら、クラブ・サイエンス（ｃｒｏｐ、
　５ｃｉｅｎｃｃ）、第１５巻、４１７頁（１９７５年
）により記述されている。本方法において、未分化胚は
ＭＳ無機塩類、シュドラウスのビタミンおよびアミノ酸
（グリシン、アスパラギン、ナイアシン、チアミン、ピ
リドキシンおよびパントテン酸）、２％蔗糖、０．８％
寒天および２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−
Ｄ）、パラ−クロロフェノキシ酢酸（ＰＣＡ）、アルフ
ァーナフタリン酢酸（ＮＡＡ）、２−イソペンチルアデ
ニン（２−ｉｐ）またはそれらの混合物から選ばれたホ
ルモンから成るカルス生産培地上へ置かれた。苗は低い
ホルモン濃度をもった培地にカルスを継代培養すること
により再生された。有効であったホルモン濃度基２肩９
／Ｑ２．４−Ｄ、並びに１所／（！２゜４−Ｄ１４１１
ｇ／ｆ２　ＮＡＡおよび０．０５ｍ？／ｆ２２−ｉｐの
混合物であった。再生は次に０．２５ｘｇ／Ｑ２．４−
Ｄ、またはｌ巧／ＱＮＡＡおよび０５０５＊ｔｉ／Ｑ　
２−ｉｐの混合物と含有する培地で実施された。全ての
培養は縫代前に３−４週間の間隔で明１６時間／暗８時
間の周期で行われた。本参考文献はカルス誘導が試験さ
れた５つの遺伝学型の１つでは起こらなかったことを報
告している。

同様の結果が他の研究者により報告されている。

フリリングら、メイデカ（Ｍａｙｄｉｃａ）第２１巻、
９７頁（１９７６年）は、２まタハ５１９／（１２、４
−Ｄ、２％蔗糖を含有し、イノ７トールを欠＜ＲＭ培地
でカルス誘導し、ついで０〜０．１ｊ！９／Ｑ２゜４−
Ｄをもつ同一培地での再生することにより、トウモロコ
シの再生を得た。バシルら、セオレテイカル・アンド・
アプライド・ジエネティクス（Ｔｈｃｅｒ、　Ａｐｐｌ
、　Ｇｅｎｅｘ）第６６巻、２８５頁（１９８３年）は
、３〜１２％蔗糖および０．２５〜２゜０ｔｐｇ／Ｑ２
．４−Ｄを含有しているＭＳ培地を用いたとき、３週間
の培養後カルス形成および新芽形成を得た。高い蔗糖濃
度は胚発生カルスにもっとも有効であった。板形成は（
ａ）３％蔗糖をもち、１７１９／Ｑジベレリン酸（ＧＡ
３）をもつかまたはもたないＭＳ培地または（ｂ）２％
蔗糖をもつ１／２ＭＳ培地に継代後達成された。

エダロら、メゾイカ（Ｍａｙｄｉｃａ）第２６巻、３９
頁（１９８１年）は、２巧／１２２．４−Ｄをもつグリ
ーンら（前出）の培地を用いて、未分化のトウモロコノ
の胚からカルスの誘導を得た。培養は３０日の継代によ
り、同一培地で維持されることができた。再生は２．４
−Ｄをもたない培地を用いて達成された。新芽は根形成
のため５１１９／ＱＮＡＡの１ｊＩｊ！重層のある培地
に継代培養された。苗を土壌に継代するのに先だって、
苗は２％、１％および最終的に０％の蔗糖をもつ培地を
一巡された。

２．４−Ｄによるカルス誘導の同一系列を使用してのト
ウモロコシ植物の再生および２．４−Ｄを用いないかま
たは低濃度での再生がルーら、セオレティカル・アンド
・アプライド・ジュネティクス（Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐ
ｌ、　Ｇａｎｅｘ）第６２巻、１０９頁（１９８２年）
；ハイバードら、プロシージンゲス・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンスズ・ＵＳＡ（Ｐｒｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第７９
巻、５５９頁（１９８２年）；ゲゲンバら、プロシージ
ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスズ・ＵＳＡ（Ｐｒｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第７４巻
、５１１３頁（１９７７年）およびグリーンら、クラブ
・サイエンス（ｃｒｏｐ　　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）第１４
巻、５４頁（１９７４年）らにより示されている。後者
の参考文献はまたカルス誘導に対する遺伝学型の影響を
論証している。

この先行技術のどれもまだ、組織および細胞培養からト
ウモロコシ：ゼア・メイズ（Ｚ　ｅａ　　ａ＋ａｙｓ）
の大部分の遺伝学型の再生の方法を記述していない。こ
れらの先行技術方法により、再生されることができない
かまたは低頻度でかろうじて再生されることができる培
養物の例は、Ｂ７３、Ａ６３２、Ａ６１９、ＣＭｌ　０
５、Ｂ３７、Ｂ８４、Ｂ１４、Ｍｏｌ？およびＲ１６８
を包含する。本発明は高頻度、高生長率でトウモロコシ
の培養物の再生について、広範に一般的に応用し得る最
初の方法である。

ダンカンら、プランタ（Ｐ　１ａｎｔａ）第１６５巻、
３２２頁（１９８５年）は本発明に従うと、トウモロコ
シの多数の栽培変種がカルス誘導培地中にホルモンとし
てジカムバ（ｄｉｃａＩＩｂａ：　３，６−ジクロロ−
２−メトオキシ安息香酸）を用いて再生されることがで
きることを論証している。ダンカンらはこれらの結果を
得るため、無機塩およびビタミンの種々の組合せの培地
を利用した。

トウモロコシ植物および種子が末法により生産される。

末法から生じろトウモロコシ植物は、体細胞クーロン変
異の結果として、元の植物材料と異なることがある。こ
の経路は、別の変異をもたらすための種々の選択方法の
使用を可能にするという点でら有用である。生産される
植物は従来法による繁殖プログラムに用いることができ
る。

［発明の要旨コ 本発明の方法は、トウモロコシ植物の組織から誘導培地
上で、カルス形成を誘導し、カルスを維持し、再生培地
上で新芽および根を形成し、および所望により成熟培地
上で苗を成熟さ仕る段階を含んでいる。

さらに詳細にいえば、末法は （ａ）カルス形成を確保するのに十分な量の無機塩類、
ビタミン類、蔗糖およびホルモンを含む第一培地上でト
ウモロコシ植物から得られる組織を培養し、 （ｂ）カルス維持を確保するのに十分な量の無機塩類、
ビタミン類、蔗糖およびホルモンを含む第二培地上でカ
ルスを継代培養し、 （ｃ）新芽形成および根形成を確保するのに十分な曵の
無機塩類、ビタミン類、蔗糖および所望によりホルモン
を含む第三培地上でカルス継代培養し、 （ｄ）所望により、余分の根形成を含めて苗の成熟を確
保するのに十分な量の無機塩類、ビタミン類、蔗糖およ
び所望によりホルモンを含む第四培地上で上記の新芽を
継代培養し、それにより植物を得る段階を含んでいる。

組織の供給源は、好ましくはゼア・メイズ（Ｚｃａ　　
ｍａｙｓ）の栽培変種からの未分化胚である。

培地は、好ましくはＮ６無機塩および改良されたＭＳビ
タミンを含有する。好ましいホルモンは第一、第二およ
び第三培地中では３．６−ジクロロ−２−メトキシ安息
香酸（ジカムノりまたは３−アミノ−２，５−ジクロロ
安息香酸（クロラムベン）および第四培地中ではジカム
バ、クロラムベンま１こはジカムバまたはクロラムベン
および２．４−Ｄの混合物である。

［実施態様の説明］ 本発明は細胞または組織培養により、トウモロコシ、ゼ
ア・メイズ（Ｚ　ｃａ　　ａ＋ａｙｓ）を再生する方法
である。本法により、土壌に植え、成熟するまで生育さ
れ得る再生トウモロコシ苗が得られる。本発明はまた、
本法により得られるトウモロコシ植物およびこれらの植
物から得られる種子も含む。

一般的に、方法は（ａ）カルスを生成するために培地で
トウモロコシ植物組織を培養し、（ｂ）カルスを維持す
るために培地でカルスを培養し、（ｃ）新芽および根を
生産するために培地でカルスを培養し、（ｄ）所望によ
り、移植用の苗を成熟させるために培地で根をもった新
芽を培養することから成る。苗が発育した後、それらは
土壌で生育させることができる。

カルスの形成開始に用いることが好ましい植物組織は、
未分化胚である。未分化胚は受粉倹約１０日で穂軸から
分離されるが、そのとき、胚は１．５〜２．０１１ＩＩ
の長さである。穂軸を採取し、表面を殺菌する。未分化
胚は各校から分離される。胚は、以下第一培地と称され
るカルス誘導培地上に胚の軸柱が培地と接触するように
、すなわち杯盤側が上にあるように置く。

第一培地は無機塩、ビタミンおよび蔗糖から成っている
。無機塩は多量要素（成分）および微量要素（成分）か
ら成りでいる。第一培地に用いられる多量要素は次の化
合物の組合せであり得る：硫酸マグネシウム、塩化カル
シウム、燐酸−カリウム、硝酸カリウム−硝酸アンモニ
ウムおよび硫酸アンモニウム。第一培地に含有される微
量要素はニホウ素、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ヨウ化カ
リウム、硫酸鉄（ｎ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）ジナトリウム芝エチレンジアミン四酢酸第二鉄塩
、モリブデン（■）酸ナトリウム、硫酸銅（ＩＩ）およ
び塩化コバルトの組合せである。無機塩のいくつかの組
合せは、それらがカルス誘導に悪影響がない限りは用い
ることができる。無機塩の組合せの例はＭＳ、改良され
たＭＳ、Ｎ６、改良されたＮ６、ヘルレル（Ｉ）ｅｌｌ
ｅｒ）、ニチェ（Ｎ　１ｔｓｈ）およびニチェ、Ｂ５お
よびホワイト（Ｗｈｉｔｅ）、およびそれらによる組合
せを包括することがこれらに限定しない。

無機塩の組合せのある例はダンカンら（前掲）に発表さ
れている。

多量要素および微量要素の１つの好ましい組合せはＮ６
塩である。これらの塩類の１リツトルは次のものから調
製される二　Ｉ８５Ｒｇ硫酸マグネシウム７水化物、１
６６ｍｇ塩化カルシウム２水化物、４００ｔｇ燐酸−カ
リウム、２８３０９硝酸カリウム、４６３３１９硫酸ア
ンモニウム、１　、６１９ホウ酸、３．３１硫酸マンガ
ン！水化物、１．５１９硫酸亜鉛７水化物、０　、８　
ｍｇヨウ化カリウム、２７．８！Ｉｇ硫酸鉄（■）７水
化物および３７．３ｍｇエチレンジアミン四酢酸ジナト
リウム。

さらに好ましくは、多量要素および微量要素の他の組合
せは改良されたＮ６塩類である。これらの塩類は先に記
述された塩類と同一であるが、さらに、培地１リットル
当り、０．２５ｍｙモリブデン（Ｖｌ）酸ナトリウム２
水化物、０．０２５ｘ９硫酸銅（■）５水化物および０
．０２５１ｇ塩化コバルト６水化物を含有している。

多量要素および微量要素の他の好ましい組合せは、培地
ｌリットル当り次のものから成っているＭＳ塩である：
３７０ｍ９硫酸マグネシウム７水化物、４４０ｊ＋９塩
化カルシウム２水化物、１７０所燐酸−カリウム、１９
００ｘｙ硝酸カリウム、１６５０次９硝酸アンモニウム
、６　、２　ｍ９ホウ酸、１５゜６罪硫酸マンガン１水
化物、８　、６　ｍｇ硫酸亜鉛７水化物、０．８３肩９
ヨウ化カリウム、２７．８次９硫酸鉄（ｎ）７水化物、
３７．３３１９エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム、
０．２５ｉ９モリブデン（■）酸ナトリウム２水化物、
０．０２５．ｙり硫酸銅（Ｉ［）５水化物および０．０
２５ｏ塩化コバルト６水化物。

以下、“Ｎ６：多量／Ｂ５微量”と称する多量要素およ
び微量要素の他の好ましい組合せは、１８５１ｇ硫酸マ
グネレウム７水化物、１６６ｘｙ塩化カルシウム２水化
物、４００ｖｙ燐酸−カリウム、２８３８ｍｇ硝酸カリ
ウム、４６３ｊ９硫酸アンモニウム、３．７９ポウ酸、
１０．７１１？硫酸マンガン１水化物、２．＋１９硫酸
亜鉛７水化物、０．７５ｙ１ｇヨウ化カリウム、０．２
５１１１９モリブデン（ＶＩ）酸ナトリウム２水化物、
０．０２５１硫酸銅（■）５水化物、０．０２５屑９塩
化コバルト６水化物および４３巧エチレンジアミン四酢
酸ナトリウム第二鉄塩から成っている。

第一培地は、またビタミンを含有する。次のビタミンの
組合せを使用することができる：　ミオイノシトール、
ニコチン酸、アミノ安息香酸、ジアノコバラミン、ピリ
ドキシン、葉酸、チアミン、コリン、リボフラビン、ビ
オチンおよびパントテン酸。

ビタミンの好ましい組合せは、第一培地１リットル当り
ｌ１０ＯＲミオイノシトール、０．５屑９ニコチン酸、
２ｊ１９グリシン、０　、５　ｔｔｔｇ塩酸ピリドキシ
ンおよび０　、１１９塩酸チアミンおよび０．２５ｕパ
ントテン酸カリウムから成っている。

ビタミンの他の好ましい組合せは、ＲＴビタミンである
。この組合せは培地１リットル当り０゜７５μＭ塩酸コ
リン、０．■３μＭ３μフラビン、０．４１μＭＤ−ビ
オチン、０．１１μＭ葉酸、１．６２μＭニコチン酸、
０．３０μＭ塩酸チアミン、’０．２１μＭパントテン
酸カルシウム、０．９７μＭ塩酸ピリドキシン、０．１
０μＭジアノコバラミンおよび０．３６μＭパラアミノ
安息香酸から成っている。

さらに、他の好ましい組合せはＮ６ビタミンである。こ
の組合せは培地ｌリボフラビン当り１１１４９塩酸チア
ミン、０．５　ｍｇ塩酸ピリドキシンおよび０．１０μ
Ｍニコチン酸から成っている。

多量要素、微量要素およびビタミンの好ましい組合せは
次表に要約される。

カルス誘導に用いられる培地の一覧表 ＢＣＤＥ 多量要素　　Ｎ６　　　Ｎ６　　ＭＳ　　　Ｎ６　　　
Ｎ６微遣要素　改良型Ｎ６Ｎ６　　ＭＳ　　　８５　　
　Ｎ６第−培地は１．５〜１２％蔗糖、好ましくは９％
を含有している。蔗糖の若干分をマンニトールで置換す
ることは可能である。寒天またはゲルライトＴ〜Ｉ（Ｇ
　ｅｌｒｉｔｅ　Ｔ　Ｍ）［商標、ケルコ・コマーシャ
ール・デベロブメント、Ｐ、Ｏ，ボックス２３０７６、
サンディエゴ、カリフォルニアコのよう戸ケル化剤ら培
地に含有している。０．１８％の層間でゲルライトＴＭ
を使用することが好ましい。

培地はｐＨ５，５〜６．０であり、ｐＨ５、８が好まし
い。培地の所望による成分はエヂレンジアミン四酢酸ノ
ナトリウム鉄塩、し−プロリン、カゼイン酵素水解物、
カザミノ酸、グルコース、硝酸カリウムおよび塩酸チア
ミンを含む。

上記の化合物のほかに、第一培地はまたホルモンら含有
している。この明細書では、ホルモンとは、植物また植
物組織に調節効果がある任意の天然ま１こは合成化合物
を意味する。植物ホルモンはオーキシンおよびサイトキ
ニンを包含している。

、本発明において、カルス誘導に有用であるホルモンは
式（１）のらのであることが見出された。

（式中、Ｒ，およびＲ１は同じ基で、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒお
よび■から成る群から選ばれ、Ｒ３はＮ　Ｈｔ、ＮＯ３
，０Ｈ１ＣｌおよびＨから成る群から選ばれ、Ｒ４はＣ
ｌ、ＯＣＨ３およびＨから成る群から選ばれる。好まし
くは、Ｒ１およびＲ５は両基とらＣｌまたはＢｒである
ごとである） 存在するホルモンの量はカルス形成を確保するのに十分
な量である。一般的に、５〜６０μＭ、好ましくは５〜
３０μＭで十分である。第一培地のホルモンとして５〜
３０μＭクロラムベン（すなイつち、Ｒ１およびＲ８が
Ｃｌ、Ｒ，がＮＨＩ、Ｒ４がＨである）を使用すること
がもつとも好ましい。

アブシジン酸の使用が２〜３％蔗糖におけるカルス誘導
の頻度を増大することがまた見出されている。０．１〜
２．０μＭ好ましくは０．１〜１，０８Ｍを用いること
かできる。培地はビタミンおよびホルモンを除いた全て
の成分を加圧滅菌により滅菌する。ビタミンおよびホル
モンは加圧滅菌した培地への添加に先立って、微孔性膜
濾過により滅菌される。

クロラムベンをホルモンとして用いると８０〜１０Ｏ％
の開始頻度が次の遺伝子型に可能であることが見出され
ている。Ａ１８８、Ａ６３２、Ａ６１９、Ｂ１４、Ｂ３
７、Ｂ６８、Ｂ７３、Ｂ８４、Ｂ７９、Ｃ１０３，０Ｍ
１０５、Ｂ９８、Ｍｏ１７、ＭＳ７１．Ｒ１６８、Ｖａ
２６、Ｖａ５９、Ｗｆ９、Ｗ６４Ａ、Ｗｌ１７およびＷ
１８２Ｂｎ。

未分化胚を第−培地上に置き、２〜４週間好ましくは２
〜３週間１日当り１６時間の光周期で拡散光により培養
する。この期間に、胚は脱分化およびカルス形成を受け
る。第一培地における未分化胚の培養後、以下、第二培
地と称する維持培地上にカルスを移し継代培養する。カ
ルスは４〜８週間拡散光下に第二培地で継代培養する。

所望により、カルスより長期間第二培地で維持すること
ができる。２〜４週間後カルスは新鮮な第二培地に移す
。形成した根はすべてのカルスの各継代の際に除去され
る。

第二培地はカルスを維持するのに十分な量の無機塩、ビ
タミン、蔗糖およびホルモンから成っている。無機塩、
ビタミンおよびホルモンは第一培地で述べたものから選
ぶことができる。第二培地に使用する無機塩、ビタミン
およびホルモンは第一培地と同じものであってもまたは
異なったらのてあってら韮いが、同じ培地を用いるのが
好ましい。第一培地の場合と同様に、１培地の機能に悪
影響がない無機塩類は用いることができる。蔗糖の濃度
は１．５〜６％で、好まし、くけ３％である。

ホルモンは第一培地で使用したしのと同じ一般式（１）
のものである。好ましくは、ホルモンはクロラムベンお
よびジカムバ（すなわち、Ｒ１およびＲ３かＣ１ｌ！、
Ｒ２かＨＳＲ，がＯＣＨ３のものである）。

一般に、５〜１５μＭ１好ましくは５〜！０μＭで十分
である。最も好ましくは、クロラムベンは５〜１０μＭ
の量で使用され、５μＭが最適である。ゲルライトＴＭ
は培地を固化するために用いられる。０．１８％の濃度
が十分である。培地は、５．５〜６．０のｐＨをもって
おり、５．８が好ましい。培地は先に記述したよう（ζ
滅菌される。

維持のための蔗糖濃度は、直ちにまたは段階的に所望の
レベルに低めることができる。たとえば、９％蔗糖を含
有する第一培地からのカルスは３％蔗糖を含有する第二
培地に継代することができる。

別法として、カルスを先ず６％蔗糖を含有する第二培地
に継代し、２〜４週間培養し、次いで３％蔗糖を含んで
いる第二培地に継代することができろ。

組織の成長を緩慢にするために、第二培地にアブシジン
酸を添加することがまた好ましい場合がある。このこと
ばカルスの長期間の維持に好ましい。アブシジン酸を用
いる場合、０．１〜２．０μＭ１好ましくは０」〜ｌ、
０μＭで用いる。

第二培地におけるカルスの培養後、以下第三培地と称す
る再生培地にカルスを移し、散乱光で培養する。第三培
地は第一培地と同じまたは異なった無機塩類およびでビ
タミンを含有することができる。好ましくは、同じ培地
が使用される。第一培地におけると同様に、培地の機能
に悪影響がない無機塩の種々の組合せが利用される。加
えるに、この培地は新芽形成を確保するためにホルモン
を含有することができる。第一培地および第二培地に使
用されるのと同じ一般式（Ｉ）のホルモンが、単独また
は２．４−Ｄとの混合で新芽および板形成を推進するの
に有用であることが見出されている。２．４−Ｄは板形
成を推進するために添加することができる。一般的に、
θ〜５μＭ１好ましくはｌμＭの式（１）のホルモンが
単独または０〜０．１μＭ、２．４−Ｄとの混合物で用
いられる。

ホルモンを存在させる場合には、クロラムベンを使用す
ることが好ましい。　　： 第三培地が１．５〜６％蔗糖、、好ましくは３％、およ
び第一培地と同じゲル化物質の量を含有し、同じｐＨで
あることが好ましい：。この培地はまた、先に述べたの
と同じ加圧滅菌および膜濾過により滅菌される。

第三培地における植物再生の効果を高めるため、維持さ
れているカルスを第三培地に継代する１〜２週間前に高
濃度の蔗糖をもう新鮮な第二培地に先ず継代することが
好ましい。：たとえば、カルスが３％蔗糖をもつ第二培
地において維持されている場合、カルスは第三培地に継
代される前に、６％蔗糖をもつ新鮮な第二培地に先ず継
代することができる。

一旦新芽および根が形成しさえすれば、新芽および根は
土壌に継代することができるが、また所望により以下第
四培地と称する維持培地に継代し、拡散光で培養するこ
とができる。第四培地は、１〜３％、好ましくは２％蔗
糖を含有することを除いて第三培地と同一である。この
培地にはホルモンを用いないことが好ましい。ホルモン
を用いるとすれば、０〜１．０８Ｍの式（１）のホルモ
ンおよび好ましくはθ〜０．１μＭ、２．４−Ｄと混合
するかまたはしないジカムバまたはクロラムベンを使用
することができる。

根が形成した後、苗は土壌に継代される準備をする。十
分株化した根をもつ新芽は試験管から移　′され、ゲル
ライトＴＭは洗い落とされる。植物は植木鉢用の土壌２
に対してヒル石１の割合の土壌に継代され、高湿度の部
屋で湿気を保たれる。植物は次いで大きな鉢に移植され
る。

本法はトウモロコシの多数の栽培変種の組織から苗を再
生するのに有用である。本法は先行技術の方法が植物を
再生するのに成功していない苗を再生するのに殊に有用
である。これらの栽培変種の例はＢ７３、Ａ６３２、Ｃ
Ｍｌ　０５、Ｂ３７、Ｂ８４、Ｂ１４、Ｍｏ１７、Ｒ１
６８を包含する。

これらの栽培変種に加えて、本法は以前に先行技術によ
り再生されている栽培変種を再生するのにも有用である
。これらの栽培変種の例はＭＳ７１、Ａ１８８、ＰＡ９
１．Ａ６４１ＳＷｌ　１７を包含かる。

トウモロコシの各種の栽培変種の再生についての先行技
術系のもつ第一の障害はカルス形成を誘導するのに無力
であることである。一般的にカルスがトウモロコシ組織
から誘導されることができるならば、カルスはついで植
物を再生する段階に付することかできた。すなわち、カ
ルス形成を誘導する技術はトウモロコシの数種の栽培変
種の再生に制限を加える段階である。本発明はカルス形
成および植物再生を包含する方法を開示する。この植物
再生の方法は、一旦カルス組織が形成されたならば、全
てのトウモロコシ栽培変種に適用できる。したがって、
次に示す実施例において、一般的方法をＢ７３、Ｂ３７
、Ａ６１９、Ａ６３２、Ｍｏ１７およびＭＳ７１を含め
たトウモロコシの数種の栽培変種について示した。各栽
培変種のカルスはＢ７３からのカルスと同じ一般的外見
を示す。植物はここで記述された方法に従って、これら
の栽培変種の各々から得られることができる。

以下、本発明をさらに次の実施例によって説明するが、
これらは本発明を制限するものではない。

これらの実施例において、照明下の培養は特に断らなけ
れば、２５℃で１日当り１６時間の光周期をもつ拡散光
での培養を指す。８時間の暗段階の間、温度は特に断ら
なければ２５℃である。

実施例１ 溶液の調製 次の原液または溶液は、以下さらに詳細に記述される培
地作製用に調製した。

！、無機塩 Ａ、燐酸−カリウム ２００Ｘ原液は蒸留イオン交換水１００３１１２中に８
９燐酸二カ・功ムを溶解して調製した。

Ｂ、他の無機塩 １０ｘ原液は蒸留イオン交換水３６００ｍ１２中に７．
４０９硫酸マグネシウム７水化物、６．６４９塩化カル
シウム２水化物、１１３．２９硝酸カリウム、１８゜５
２ｇ硫酸アンモニウム、６４肩９ホウ酸、１３２Ｍ９−
水酸化硫酸マンガン、６０次９硫酸亜鉛７水化物、３３
．２ｔｔｔｇヨウ化カリウム、１０３１９モリブデン酸
（ＶＩ）ナトリウム２水化物、１０ｚｇ硫酸銅（■）５
水化物および１　、　Ｏｔｔｔｇ塩化コバルト６水化物
を溶解して調製した。１．１１２ｇ硫酸鉄（ＩＩ）７水
化物および１．４９２９エチレンジアミン四酢酸ジナト
リウムを加熱により蒸留イオン交換水２００ｍ（ｌ中に
別個に溶解し、次に攪拌によりゆっくり混合した。この
混合物は次いで塩の残りに添加した。基原液は１００ｍ
（／量づつに分割し、使用するまで冷凍した。

２、ビタミン ビタミンの１００＋［原液は、蒸留イオン交換水１００
ｚｉ７中に１０９ミオイノシトール、５０巧ニコチン酸
、２００ｒ９グリシン、５０１９塩酸ピリドキシン、１
００Ｒ９塩酸チアミンおよび２５μｇパントテン酸カル
シウムを溶解して調製し、原液を調製するために、蒸留
イオン交換水で１０倍に希釈した。１００ＪＩＩ２アリ
コートを作り使用するまで暗容器に凍結した。

３、ホルモン Ａ、ジカムバＡ １１１９／ＩＩＱ原液は、ベルシコル・ケミカルズ（Ｖ
ｅｌｓｉｃｏｌ　Ｃｈｅｎｉｆｃａｌｓ）から得た０、
２１Ｒ（ジカムバを蒸留イオン交換水で１００ｍ１２に
希釈することにより調製した。この溶液は冷蔵庫に貯蔵
した。

Ｂ、２．４−Ｄ ０　、５　ｍＭ原液ハ０　、５〜１　、　ＯＲ（１１、
５Ｎ　＋、：　ＯＨに１１．０５１９２．４−Ｄを溶解
して調製し、蒸留イオン交換水で１００ｍ１２に希釈し
た。ｐＨは１．ＯＮ　ＨＣｌで５　、８　ｔ：：調製し
、溶液は冷蔵庫に貯蔵した。

Ｃ，クロラムベン ０．５５ｍＭ原液はクロラムベン１０．３０戻りを用い
て２．４−Ｄで記述したように調製した。

Ｄ、ジカムバ、Ｂ ０．５５μＭ原液はジカムバ１１．０５ｍｇを用い□ て２，４−Ｄｒｍ己述したように調製した。

Ｅ、その他１ ここで記述した他のホルモンのそれぞれの０゜５ａ＋Ｍ
原液は、＋ルモンの適量を用いて２．４−Ｄで記述した
のと同様に調製した。

実施例２　　　′ 培地の調製・ １、第一培地またはカルス誘導培地 第一培地は蒸留イオン交換水８００ｚＱに蔗糖および１
０Ｘ原Ｑ１００ｍ（を添加するこ°とにより調製した。

次いで、２００！硫酸−カリウム原液′５ｚＱを添加し
、容量を蒸留イオン交換水で１ｆ２にした。ｐＨは１．
ＯＮ　ＫＯＨで５．９５に調製した。

ｐ）（は加圧滅菌の間に通常起こる約０．１５の低下に
対する補正のために高めに調製し、ゲルライトＴＭ１．
８ｇを添加し、混合物を（１５ボンド／平方インチ）で
１５分間加圧滅菌した。１００Ｘビタミン原液１０ＴＩ
ＱおよびジカムバＡ原液２Ｍ＆は、０．２μＭゲルマン
・フィルターを通して濾過により滅菌し、ついで冷却し
つつある培地に加え、その後、ベトリ皿または試験管に
分法した。

ジカムバの種々の濃度をもつ第一培地を調製するために
原液の適量を用いた。たとえば、３ｍｇ／Ｑジカムバを
もつ第一培地を調製するため、ジヵムバ原液３ｉ＆を用
いるが、または１０μＭを望むならば、ジカムバＢ原液
２０ｒｔｒ（ｌを用いる。

種々のホルモンをもつ第一培地を調製するため、ホルモ
ン原液の適量を用いた。たとえば、１０μＭクロラムベ
ンをもつ第一培地を調製するため、クロラムベン原液２
０ｒｔｔＱを用いた。

２、第二培地または維持培地 第二培地は、ジカムバＡ原液１ｇ（を用いる以外は、第
一培地て記述したのと同様に調製した。ジカムバの他の
濃度をもつ第二培地は、先に記述したように調製した。

種々のホルモンをもつ第二培地は先に記述したのと類似
の方法で調製した。

３、第三培地または再生培地 第三培地は、・（ａ）ジカムバ原液０　、１３１１２を
使用し、（ｂ）２．４−Ｄ原液０　、２　ｍＱを２００
ｘ燐酸−カリウムの添加後、：培地に添加したことを除
いて、第一培地で先に記述したように調製した。ホルモ
ンの種々の濃度をもち、種々のホルモンを含有するか、
または単独でジカムバまたはクロラムベンまたはジカム
バおよびクロラムベンの混合物を含有する第三培地を調
製するために、原液の適量を先に記述されたように添加
した。

４　第四培地または成熟培地 第四培地は、（ａ）蔗１１２０９、（ｂ）ジカムバ原液
０　、１　ｘ（ｌを使用したことを除いて、第一培地で
先に記述したように調製した。２．４−Ｄと共に式（１
）のホルモンをもつ第四培地は第三培地と類似の方法で
調製じた。

χ１鯉１１ トウモロコシの再生 未分化胚を受粉後１０〜１１日のトウモロコシ、ゼア・
メイズＬ（Ｚｅａ　　ｍａｙｓ　　Ｌ）、　Ｒ７３、Ｒ
３７、Ａ６３２、Ａ６１９、Ｍｏ１７またはＭＳ７１の
穂軸から分離した。各穂軸を採集し、表面を３０％クロ
ロクス（商標、Ｃ１ｏｒｏｘ）［クロロクス・カンパニ
ー、オークランド、カリフォルニアコ漂白剤（１，６％
次亜塩素酸ナトリウム）およびリチノクス（商標、Ｌｉ
ｑＵｉｎＯＸ耳アルコックス・インコーポレイテッド、
、８５３プロトウェイ、ニューヨーク、ニューヨーク］
洗浄剤を含有する溶液で１５分間殺菌した。穂軸を無菌
イオン交換水で４時間水洗した。未分化胚は、メスで各
校の頂端を薄切りすることおよび胚乳をすくうことによ
り分離した、ついで、未分化胚を取り出し、ペトリ皿に
入れた第一培地上に胚軸が培地と接触するように置いた
。すなわち、杯盤側が上であった。第一培地は２ｘｑ／
Ｑジカムバまたは２ｗ９／（ｌクロラムベンを使用して
、府の実施例に記述したように調製した。ベトリ皿を照
明下に置き、４週間培養した。

４週間後、各カルスを第二培地に継代したが、第二培地
は２３！９／（！ジカムバまたは２所／σクロラムベン
を使用して先の実施例に記述したように調製しペトリ皿
に入れた。カルスは３週間後新鮮な培地に継代すること
により照明下６週間この培地で培養した。各継代におい
て形成した根はいずれも各カルスから除去した。

各カルスを次に第三培地に継代した。第三培地は０．１
ｍ９／（ｌのジカムバまたはクロラムベンおよび０．１
μＭ２．４−Ｄを用いて、実施例２に記述したように調
製した。カルスは５日間照明下第三培地上で培養した。

カルスは分化して新芽および根を形成した。

根をもつ新芽は次に培養管に入れた第四培地に継代し、
第四培地は０．１ｍｇ／Ｑのジカムバまたはクロラムベ
ンを用いて先に記述したように調製した。根をもつ新芽
は１〜２週間照明下で培養したが、その間にさらに根が
生成した。

苗は温室中の土壌に継代した。十分株化された根をもつ
新芽は試験管から移し、ゲルライトＴＭを十分に水道水
で洗い落とした。苗を植木鉢用の土壌２にヒル石１の割
合で含有している植木鉢に入れた。植木鉢は高湿度の箱
に入れ、５日間保湿した。ついで箱のフタを取り除いた
。さらに３日後、植物を約３０センチ（１２インチ）径
の鉢に移植した。植物は１週間当り２〜３回給水し、２
週間毎に施肥した。植物がジカムバまたはクロラムベン
を使用している各再生系からの栽培変種から得られた。

実施例４ トウモロコシの再生 未分化胚をトウモロコシの次の栽培変種から分離し、蔗
糖が３％または９％であった点以外は、実施例３に記述
したように第一培地上に置いた。

ゼア・メイズＬ、　（Ｚｅａ　　ｍａｙｓＬ、　）Ａ６
３２、Ａ６１９．０Ｍ１０５、Ｒ３７、Ｒ８４、Ｂ１０
、Ｍｏ１７、Ｒ１６８、ＭＳ７１およびＷ１１７゜カル
スが得られ、各栽培変種とも実施例３のカルスと同じか
またはよりよい一般的外観を示した。

実施例３の一般的方法に従って、植物が栽培変種Ａ６３
２、Ａ６１９、Ｒ３７、Ｒ８４、Ｍｏ１７、ＭＳ７１お
よびＡ６４１について得られた。植物は他の栽培変種に
ついても同じ一般的方法により得られろことができた。

実施例５ トウモロコシの再生 未分化胚を実施例３に記述したようにゼア・メイズＬ、
　（Ｚｅａ　　ｍａｙｓＬ、　）Ｂ　３７同じＭＳ７１
から分離した。胚は１０μＭクロラムベンまたは１０μ
Ｍジカムバおよび（ａ）３％、（ｂ）６％。（ｃ）９％
または（ｄ）１２％の蔗糖を含有している第一培地上に
置いた。カルスは３％蔗糖での８３７を除いて、各例と
も実施例３のカルスと同じ一般的外観を示した。９％ま
たは１２％蔗糖をもつ第一培地はカルス誘導に特によい
ことが見出された。実施例３の一般的方法に従って、植
物はクロラムベンまたはジカムバを使用して各栽培変種
について得られた。

実施例６ トウモロコシの再生 未分化胚を実施例３および実施例４に示したトウモロコ
シ栽培変種から実施例３で記述した上うに分離した。胚
を１０８Ｍクロラムベンまたは１０μＭジカムバおよび
９％または３％の蔗糖を含有している第−培地上に置い
た。カルスは３％蔗糖での８３７を除いて各栽培変種に
ついて得られ、実施例３のカルスと同じ一般的外観を示
した。実施例３の一般的方法に従って、植物がクロラム
ベンまたはジカムバを使用して得られた。

実施例７ トウモロコシの再生 実施例３〜６の方法に従って、カルスをホルモンの下記
量（μＭ）を含有している培地でのゼア・メイズ（Ｚｅ
ａ　　ｍａｙｓ）Ｂ　７３、Ｐａ７およびＭＳ７１培養
物の未分化胚から創生した： ホルモン　　　　　　　８７３　　８３７　　Ｍ８７１
２．５ジクロロ安息香酸　５−１５　　５−１５　　　
ｔ。

２．５ジブロモ安息香酸　　ｔｏ　　　　ｔｏ　　　ｔ
。

３−アミノ−２，４−５−６０５−６０５−６０ジクロ
ロ安息香酸 ３−ニトロ−２，５−５−１５５−１５１０−２０ジク
ロロ安息香酸 ２．３．５−トリクロロ　　５−１５　　５−１５　　
１０安息香酸 ２−メトキシ−３，６−５−６０５−６０５−６０ジク
ロロ安息香酸 ３−ニトロ−２，５−ジクロロ安息香酸の存在下でのＢ
７３およびＢ３７栽培変種を除いて、カルスが上記ホル
モンの濃度で各栽培変種について得られた。実施例３の
一般的方法に従って、植物が各栽培変種について得られ
た。

Ｘ鬼氏ｌ トウモロコシの再生 実施例３〜６の方法に従って、カルスをゼア・メイズ（
Ｚｅａ　　ｌ１ｌａｙｓ）Ｂ　７３、Ｐａ４、Ｍｏ１７
、Ａ６１９、ＭＳ７１およびＰａ９１の未分化胚から創
生し、植物が改良型Ｎ６無機塩の代りにＭＳ無機塩を含
有した培地において再生された。　”実施例９ トウモロコシの再生 実施例３〜６の方法に従って、カルスをゼア・メイズ（
Ｚｅａ　　ｌｌ１ａｙｓ）Ｂ　７３、Ｐａ４、Ｍｏ１７
、Ａ６１９、ＭＳ７１．Ｃ１０３、Ｐａ７、Ｐａ９１お
よび０ｈ４３の未分化胚から創生し、植物が改良型Ｎ６
無機塩の代りにＮ６無機塩を含有した培地において再生
された。

以上発明を特別な具体例に基づいて記載したが、発明を
さらに修正することが可能であることはいうまでもない
。本発明は本発明の原理な基づくあらゆる変形、用途お
よび適応を包含することを意図するものであり、当技術
範囲内の既知および常用実施形態を越えないようなあら
ゆる変更方法を包含するものである。

特許出願人　サンジエン・チクノロシーズ・インコーホ
レイテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の段階を含む細胞または組織からトウモロコ
   シ苗を再生する方法。 （ａ）カルス形成のため、無機塩類、ビタミン類、蔗糖
   および（ｉ）式（ I ）のホルモン ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１およびＲ＿２は同一基で、Ｆ、Ｃｌ、Ｂ
   ｒおよびＩから成る群から選ばれ、Ｒ＿２はＮＨ＿２、
   ＮＯ＿３、ＯＨ、ＣｌおよびＨから成る群から選ばれ、
   Ｒ＿４はＣｌ、ＯＣＨ＿３およびＨから成る群から選ば
   れる）および（ｉｉ）式（ I ）のホルモンおよびアブ
   シジン酸の混合物から成る群から選ばれるホルモンを含
   む第一培地でトウモロコシ植物から得た組織を培養し、 （ｂ）カルス維持のため、無機塩類、ビタミン類、蔗糖
   および（ｉ）式（ I ）のホルモンおよび（ｉｉ）式（
   I ）のホルモンおよびアブシジン酸の混合物から成る
   群から選ばれるホルモンを含む第二培地で上記のカルス
   を継代培養し、 （ｃ）新芽および根を形成して植物を得るため、無機塩
   類、ビタミン類および蔗糖を含む第三培地で上記のカル
   スを継代培養すること。 （２）Ｒ＿１およびＲ＿３が同一基で、ＣｌおよびＢｒ
   から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）組織が未分化胚から得られる特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の方法。 （４）新芽および根が無機塩類、ビタミン類および蔗糖
   を含む第四培地で継代培養される特許請求の範囲第１〜
   ３項のいずれか１項記載の方法。 （５）第三培地がさらに（ｉ）式（ I ）のホルモンお
   よび（ｉｉ）式（ I ）のホルモンおよび２，４−Ｄ（
   ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）の混合物から成る群
   から選ばれるホルモンを含む特許請求の範囲第１〜３項
   のいずれか１項記載の方法。 （６）第四培地がさらに（ｉ）式（ I ）のホルモンお
   よび（ｉｉ）式（ I ）のホルモンおよび２，４−Ｄの
   混合物から成る群から選ばれるホルモンを含む前述の特
   許請求の範囲第４項または第５項記載の方法。 （７）培地中の上記のホルモンの濃度が （１）第一培地中では５〜１０μＭの式（ I ）のホル
   モン、または５〜１０μＭの式（ I ）のホルモンおよ
   び０．１〜１．０μＭのアブシジン酸の混合物 （２）第二培地中では５〜１５μＭの式（ I ）のホル
   モン、または５〜１５μＭの式（ I ）のホルモンおよ
   び０．１〜１．０μＭのアブシジン酸の混合物 である特許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項記載の
   方法。 （８）培地中のホルモンの濃度が （１）第一培地中では５〜１５μＭの式（ I ）のホル
   モン、または５〜１５μＭの式（ I ）のホルモンおよ
   び０．１〜１．０μＭのアブシジン酸の混合物 （２）第二培地中では５〜１０μＭの式（ I ）のホル
   モン、または５〜１５μＭの式（ I ）のホルモンおよ
   び０．１〜１．０μＭのアブシジン酸の混合物 （３）第三培地中では約０．１〜５．０μＭの式（ I
   ）のホルモン、または約５〜１５μＭの式（ I ）のホ
   ルモンおよび約０．１μＭの２，４−Ｄの混合物 である特許請求の範囲第１〜７項のいずれか１項記載の
   方法。 （９）培地中のホルモンの濃度が （１）第一培地中では５〜１５μＭの式（ I ）のホル
   モン、または５〜１５μＭの式（ I ）のホルモンおよ
   び０．１〜１．０μＭのアブシジン酸の混合物 （２）第二培地中では５〜１０μＭの式（ I ）のホル
   モン、または５〜１５μＭの式（ I ）のホルモンおよ
   び０．１〜１．０μＭのアブシジン酸の混合物 （３）第四培地中、約０．１〜１．０μＭの式（ I ）
   のホルモン、または約０．１〜１．０μＭの式（ I ）
   のホルモンおよび約０．１μＭの２，４−Ｄの混合物 である特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項記載の
   方法。 （１０）培地中のホルモンの濃度が （１）第一培地中では５〜１５μＭの式（ I ）のホル
   モン、または５〜１５μＭの式（ I ）のホルモンおよ
   び０．１〜１．０μＭのアブシジン酸の混合物 （２）第二培地中では５〜１０μＭの式（ I ）のホル
   モン、または５〜１５μＭの式（ I ）のホルモンおよ
   び０．１〜１．０μＭのアブシジン酸の混合物 （３）第三培地中では約０．１〜５．０μＭの式（ I
   ）のホルモン、または約０．１〜５．０μＭの式（ I
   ）のホルモンおよび約０．１μＭのアブシジン酸の混合
   物 （４）第四培地中では約０．１〜１．０μＭの式（ I
   ）のホルモン、または約０．１〜１．０μＭの式（ I
   ）のホルモン、および約０．１μＭのアブシジン酸の混
   合物 である特許請求の範囲第１〜９項のいずれか１項記載の
   方法。 （１１）蔗糖の濃度が （１）第一培地中では１．５〜１２％ （２）第二培地中および第三培地中では１．５〜６％ である特許請求の範囲第１〜１０項のいずれか１項記載
   の方法。 （１２）蔗糖の濃度が （１）第一培地中では１．５〜１２％ （２）第二培地中および第三培地中では１．５〜６％ （３）第四培地中では１〜３％ である特許請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項記載
   の方法。