JPS62272995A - 胆汁酸の裕定方法およびそれに用いる装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、　νの量　な量日 （産業上の利用分野） 本発明は体液中の胆汁酸を試験紙を用いて測定する方法
およびそれに用いる装置に関する。

（従来の技術） 胆汁に含有される胆汁酸は血液、尿などの体液中にもｉ
ｔ金含有れる。このような体液中の胆汁酸は肝胆道系疾
患によりその量が変化し、特に血液中の胆汁酸量はこの
ような疾患の鋭敏なマーカーとなることが知られている
。例えば、乳児の胆道閉塞症においては血液中もしくは
尿中の胆汁酸量が増加することが知られている。胆道閉
塞症は乳児約１万人あたり１人という高率で発生してお
り、患者は迅速な手術が必要とされる。疾病の認知が遅
れた場合には死亡率も高い。このような疾患を早期発見
するためにも体液中、特に、血液中や尿中の胆汁酸を集
団検診時などに精度良く測定することが望まれる。

胆汁酸を含有する試料溶液中の胆汁酸量を測定する方法
は１例えば、特公昭５９−１３１９７号、特開昭５６−
１４４０９６号および特開昭５６−１５１４９９号公報
に開示されている。それによれば、まず、胆汁酸を含む
試料を酸性下で熱処理しく特公昭５９−１３１９７号公
ｆｇ）　、あるいは、オキサミド酸、ピルビン酸などを
添加して（特開昭５６−１４４０９６４公報、特開昭５
６−１５１４９９号公報）乳酸脱水素酵素（ＬＤｌｌ　
）などの、測定を妨害する酵素を失活させる。次いで。

これに３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（
３α−Ｈ２Ｏ）　、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ”　）　、ジアホラーゼおよびテトラゾリ
ウム塩を含有する反応用溶液をｐＨ８〜９のアルカリ条
件下で反応させる。胆汁酸の水酸基は３α−Ｈ２Ｏの存
在下でＮＡＤゝと反応してカルボニル基となり次のよう
にケト型の胆汁酸を生じる。

ＮＡＤＨはジアホラーゼの存在下で電子受容性の色原体
であるテトラゾリウム塩と反応して次のようにホルマザ
ンを生じる。ＮＡＤＨは再び酸化されてＮＡＤ”となる
。テトラゾリウム塩の代わりにレザズリンを用いてもよ
く、この場合はレゾルフィンが生成する。

生じたホルマザン（レゾルフィン）のモル数はＮＡ［）
Ｈのモル数（つまり、胆汁酸のモル数）に相当する。

そのため、このホルマザンの吸光度（レゾルフィンの螢
光強度）を測定することにより胆汁酸を定量することが
可能である。

このような方法により試料中の胆汁酸を感度良く測定す
ることができるが、溶液系での反応を利用した測定法で
あるため煩雑な操作を必要とする。

そのため、マススクリーニングや簡便に胆汁酸を検出す
るためには不適当である。測定のために高価な吸光度測
定装置などが必要であることも欠点である。

このような欠点を解決するため１発明者は、上記方法に
おいて使用する試薬を適当な緩衝液に溶解し、これを濾
紙などの高分子素材からなる担体上に含浸・凍結乾燥し
て試験紙を作製し、胆汁酸の半定量を試みた。しかし、
上記テトラゾリウム塩が不安定であるため凍結乾燥を行
っても試験紙自体が約１６時間で赤紫〜紫色に発色する
。さらに。

時間経過とともに着色度が進むため、このような方法で
得られた試験紙を用いて胆汁酸を検出することはできな
い。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、肝胆道系疾患の重要なマーカ
ーである体液中の胆汁酸の量を測定しうる試験紙を調製
し、これを用いて体液中の胆汁酸を簡単な操作で短時間
に、安価にかつ精度良く測定する方法を提供することに
ある。本発明の他の目的は、上記方法に利用されうる装
置を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の胆汁酸の測定方法は、（１）胆汁酸測定用試薬
を担体に担持させた胆汁酸測定用試験紙に試料液を付与
し、該試料液中の胆汁酸と該胆汁酸測定用試薬とを反応
させ、生じた反応生成物固有の色に該試験紙を発色させ
る工程、および（２）該反応生成物の極大波長部を有す
る光を該発色試験紙に照射し、該試験紙からの反射光の
強度を測定する工程を包含し、そのことにより上記目的
が達成される。

本発明の胆汁酸測定装置は、（１）胆汁酸測定用試薬を
担体に担持させた胆汁酸測定用試験紙、（２）該試薬と
胆汁酸とが反応して生じる反応生成物の極大吸収波長部
を有する光を該試験紙に対して発する発光素子、（３）
該波長部に感度を有しかつ該発光素子の光の該試験紙か
らの反射光を受光する受光素子、および（４）試料液の
付与された該試験紙に該発光素子からの上記光を照射し
、該受光素子に受光された反射光強度の経時変化率およ
び／またはあらかじめ得られた反射光強度の経時変化率
と胆汁酸濃度との関係式に該受光素子に受光された反射
光強度の経時変化率をあてはめて算出された胆汁酸の濃
度を表示する表示手段を有し、そのことにより上記目的
が達成される。

本発明に用いられる胆汁酸測定用試験紙は、高分子素材
からなる担体に胆汁酸測定用試薬が担持されてなる。高
分子素材からなる担体としては。

天然もしくは合成繊維からなる抄紙や不織布のほかメン
ブレンフィルターなどが用いられる。試料が尿または血
清である場合には、市販の濾紙など天然もしくは合成繊
維からなる抄紙や不織布が好適に用いられる。試料が全
血である場合には２合成繊維からなる抄紙や不織布、メ
ンブレンフィルターなどが好適に用いられる。メンブレ
ンフィルターとしては、穴径が０．１〜０．４μｍの酢
酸セルロース系の膜が好ましい。合成紙としては１例え
ば、積木化学工業■製のセルポア（親水性タイプ）が好
適である。

担体に担持される胆汁酸測定用試薬は、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”　）　＋’　３α−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−Ｈ２Ｏ
）　、　　ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含有
する。試験紙を製造するには、まず、ＮＡＤ”。

３α−Ｈ２Ｏおよびジアホラーゼをアルカリ性緩衝液に
溶解した水溶液を調製する・。これを上記担体に含浸さ
せた後、凍結乾燥を行う。ここで用いられる酵素の由来
は特に限定されないが、耐有機溶剤性、経時安定性など
に優れた酵素が好ましい。

このような酵素として、３α−１１ｓＤとしてはシュー
ドモナス　テストステロ一二（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｔｅｓ　ｔｏｓ　ｔｅｒｏｎ　ｉ　）由来のものが、そ
してジアホラーゼとしてはバチルス　ステアロテルモフ
ィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）由来のものが好適に用いられる。ＮＡＤ
”の代わりにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフ
ォスフエイト（ＮＡＤＰ”　）が用いられてもよい。Ｎ
ＡＤＰ”もＮＡＤ＋と同様に補酵素として働き、還元さ
れると還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフ
ォスフエイト（ＮＡＤＰｌｌ）を生じる。３α−Ｈ２Ｏ
およびジアホラーゼは担体１００　ｃａｌあたりそれぞ
れ０．１〜１００ＯＯＩＵの割合で。

ＮＡＤ”　　（以下、　　ＮＡＤ”はＮＡＤＰ”であっ
てもよく。

ＮＡＤＨはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　１１であってもよい）は０
．１〜１００ｍｇの割合で担持される。過少であると胆
汁酸による発色が充分におこらず、過剰であるとその分
解生成物により酵素反応が阻害される。

上記水溶液中に添加剤が含有されていてもよい。

添加剤としては酵素や補酵素の活性化剤や安定化剤が挙
げられる。酵素活性化剤としては１例えばトリトンＸ−
１００（商品名）などの界面活性剤が好適に用いられる
。そして酵素安定化剤としては。

例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの蛋白質が好
適に用いられる。上記界面活性剤や蛋白質が添加されて
いると、　ＮＡＤ”や酵素（３α−Ｈ２Ｏおよびジアホ
ラーゼ）がこれら化合物に包含される。

このような界面活性剤や蛋白質は、後述のテトラゾリウ
ム塩を担持させる工程で使用される非水溶媒に溶解しな
いため、非水溶液中の色原体であるテトラゾリウム塩と
上記酵素や補酵素が直接接触するのが避けられる。その
結果、下地の発色がより効果的に抑制される。

さらに、添加剤として増粘剤が含有されていてもよい、
増粘剤により、いわゆる窓枠現象が抑制される。窓枠現
象とは１例えば、上記水溶液を担体に含浸させて乾燥さ
せるときに水溶液中の溶質が担体周辺部に移動して濃縮
されたり、得られた試験紙に検体溶液を滴下したときに
試験紙に含有されているＮＡＤ”　、　　３α−Ｈ２Ｏ
などの試薬が試験紙周辺部に移行して濃縮される現象を
いう、このような窓枠現象が起こると胆汁酸の測定が正
確になされない。上記増粘剤としては、メチルセルロー
ス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられ
る。増粘剤が含まれると担体（試験紙）に含浸された液
相の粘度が増大するため溶質の移動が抑制され、その結
果、窓枠現象が抑制される。上記酵素活性化剤、酵素安
定化剤、増粘剤などの添加剤は担体１００−あたりそれ
ぞれ２００■以下、好ましくは１〜１００■の割合で担
持される。

このように酵素などを含む水溶液が含浸された担体の凍
結乾燥工程では、充分に水分を除去することが重要であ
る。担体に水分が残留していると次工程で担持されるテ
トラゾリウム塩の安定性が極端に低下する。

次に、上記凍結乾燥後の担体にテトラゾリウム塩を非水
溶媒に溶解させた溶液を含浸させる。テトラゾリウム塩
としては、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）もし
くはニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と呼ばれる
３・３°　−（３・３゛　−ジメトキシ−４・４゛−ビ
フェニレン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５
−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライドが好適に
用いられる。

非水溶媒は、テトラゾリウム塩を溶解させることが可能
であればよく、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類；酢酸エチルなどが用いられる。

テトラゾリウム塩は担体１００−あたり０．１〜５００
１ｍｇの割合で担持される。過少であると胆汁酸による
発色が充分におこらず、過剰であると溶媒に溶けにくく
なり、また下地の色が濃くなるので色調の変色の判別が
難しくなる。テトラゾリウム塩溶液を含浸させた担体は
速やかに、好ましくは凍結乾燥により、乾燥される。こ
のようにして得られた試験紙は、適当な大きさの細片に
裁断しプラスチックフィルム製のスティックの端に接着
させて利用に供せられる。

上記試験紙を用いて尿、血清などの試料中の胆汁酸の測
定が行われる。試料として血液を用いる場合は、あらか
じめオキサミン酸、ピルビン酸などを加えておく。この
ような前処理により、胆汁酸検出のための酵素反応を阻
害する１００反応などを阻害させることができる。この
ように必要に応じて前処理された試料を試験紙に含浸さ
せると。

胆汁酸は３α−Ｈ２Ｏの存在下でＮＡＤ”と反応してケ
ト型の胆汁酸となりＮＡＤ”はＮＡＤＨとなる。ＮＡＤ
ｌｌはジアホラーゼの存在下でテトラゾリウム塩と反応
してホルマザンを生じる。これは、従来の技術の項で述
べた反応機構と同様である。試料を含浸させた後１通常
、１〜３００秒でホルマザンが生じ発色がおこる。生じ
るホルマザンの量は胆汁酸の量に対応するため２発色の
度合を目視観察することにより、あるいは既知濃度の胆
汁酸を試験紙に滴下して作製した標準比色表を用いる方
法により試料に含有される胆汁酸の概量を知ることがで
きる。標準比色表を用いると２５〜５０μｍｏｌ／　１
以上の胆汁酸の測定が可能である。

胆汁酸をより高精度で測定するには１例えば。

第１図に示す装置が使用される。この測定装置１は、試
薬を含浸させた胆汁酸測定用試験紙２を載置する透明板
３と、この透明板３の下方に配置された発光素子４と、
迷光防止板５を介してこの発光素子４の近傍に配置され
た受光素子６と、この受光素子６で検知された試験紙２
からの反射光の強度を数値表示する表示手段８とを有す
る。この反射光の強度を表示手段８にて精度よく表示さ
せるために１表示手段８は増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変換
器７を介して受光素子６に電気的に接続される。発光素
子４と増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変換器７とは測定用スイ
ッチ９にて接続されている。

発光素子４としては１例えば、５００〜６００ｎｍ付近
に発光スペクトルの極大を有する発光ダイオード（例え
ば、スタンレー社製のＥＢＧ５５０４Ｓ）が用いられる
。受光素子６としては、５００〜６００ｎｍ付近の波長
の光に感度を有する光検出素子１例えば。

シリコンホトダイオード（例えば、浜松ホトニクス社製
の５１２２６−５８Ｑ）が用いられる。反射光の強度を
数値表示する手段８にはマイクロプロセッサ−が内臓さ
れ、そのメモリー（ＲＯＭあるいはＲＡＭ）に反射光強
度の経時変化率と胆汁酸濃度との関係式をあらかじめ記
憶させておき２反射光強度の経時変化率を入力して得ら
れる試料中の胆汁酸濃度を表示することが可能である。

上記測定値Ｗ１を用い、胆汁酸は例えば次のようにして
測定される。白色プラスチック製のストリップ２１の先
端に、胆汁酸測定用試験紙２を貼着し、この試験紙２に
検体（尿、血清、検量線作成用標準液など）を滴下する
。検体の滴下と同時に図外のタイマーをオンとし、同時
にこの試験紙２側を透明体３に対向させるかたちで透明
板３上に載置する。遮光カバー２２を閉じる。そして、
経時的に測定用スイッチ９をオンにし発光素子４を発光
させる。担持体２にて反射された光を受光素子６にて受
け、増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変換器７を経て表示手段８
にて反射光強度および／または胆汁酸濃度を数値表示さ
せる。このような測定装置を用いると１０μｍｏｌ／　
１以下の胆汁酸の測定も可能である。

（作用） 本発明によれば、このように、酵素反応を利用した胆汁
酸測定用試験紙を用いて胆汁酸の測定が容易になされる
。試験紙には、ホルマザンを生じる色源体であるテトラ
ゾリウム塩を非水状態で担体上に担持させることができ
るため、試験紙の保存中にテトラゾリウム塩が変化して
下地が発色することがない。試料中の胆汁酸量に応じて
発色度合が変わるため、これを本発明の測定装置を用い
て測定することにより胆汁酸量を知ることができる。測
定機器を用いるため目視観察による判定に比べて個人差
がなくなり、正確にかつ低濃度領域まで精度良く胆汁酸
の測定が可能となる。このような方法により簡単な操作
で短時間のうちに、しかも安価に胆汁酸量を測定するこ
とができる。そのため、集団検診やベッドサイドでの緊
急検査に好適に用いられる。体液中の胆汁酸を測定する
ことにより肝胆道系疾患を早期発見することが可能であ
る。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

（Ａ）胆汁酸測定用試験紙の調製＝３α−１１ｓＤ　１
６３ＩＵ。

ジアホラーゼ６８００１０　、　　β−ＮＡＤ”　１０
．２ｍｇ、　ＰＥＧ１６ｍｇ、　ＢＳＡ　１００ｍｇお
よびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ（商品名）１０μβを１０ｍｍｏ
ｌ／　ｌのピロリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１０　ｍ
ｌに溶解した。この水溶液を３００　ｃ＋ａの濾紙（Ｗ
ｈａｔｍａｎＮｏ、３）に含浸させ、凍結乾燥した。次
に、ニトロブルーテトラゾリウムの０．０３４ｗ／ｗ％
エタノール溶液を調製し、これを上記凍結乾燥後の濾紙
に含浸させた後、速やかに乾燥させた。このようにして
得られた試験紙を５　ｍｍ　Ｘ　ＩＱｕ＋の小片に切断
し、６ｍｍＸ５Ｑ璽會のポリスチレンフィルレム製のス
ティックの端に両面テープで接着して試験紙片を得た。

（Ｂ）比色表の作成：生理食塩水に人血清アルブミンを
１％の割合で溶解させた溶液に胆汁酸（グリココール酸
ナトリウム）をその濃度が、それぞれ、　０．２５．５
０．１００および２００　ｕ　ｍｏｌ／　１になるよう
に添加し標準試料溶液を得た。これら濃度既知の標準試
料溶液を（Ａ）項で得られた試験紙片にそれぞれ２０μ
βずつ含浸させた。１〜２分後にその色度を目視観察し
たところ３表１に示す結果が得られた。この試験紙を用
いて５０μｍｏｌ／　１以上の胆汁酸の測定が正確にな
されうろことがわかった。

（以下余白） （Ｃ）測定装置を用いた胆汁酸の測定：（Ａ）項で得ら
れたスティック状の胆汁酸測定用試験紙に。

濃度既知の胆汁酸溶液２０μｌを滴下した。胆汁酸溶液
の滴下と同時に第１図に示す胆汁酸測定装置の図外のタ
イマーをオンとし、同時に上記スティック状試験祇２の
試験紙面を透明板３に対向させるかたちで透明板３上に
載置した。遮光カバー２２を閉じ、そして、経時的に測
定用スイッチ９をオンにし発光素子４を発光させた。担
持体２にて反射された光を受光素子６にて受け、増巾・
測定回路・Ａ−Ｄ変換器７を経て表示手段８にて反射光
強度を数値表示させた。

経過時間と反射光強度との関係を第２図に示す。

第２図から明らかなように、胆汁酸溶液の滴下後。

時間の経過につれて反射光強度が低くなっている。

特に、　３０秒までの反射光強度の低下が著しい。そこ
で、胆汁酸溶液の滴下後、１０秒後から３０秒後までの
２０秒間の反射光強度の変化値を反射光強度減少率（Δ
、３）とし、これを反射光強度の目安とした。胆汁酸濃
度を変え、それぞれの濃度について反射光強度減少率（
Δ１．）を測定した。反射光強度減少率（Δ１３）と胆
汁酸濃度（μｍｏｌ／　１　）との関係を第３図に示す
。回帰式は。

ΔＩ：１＝１９．４＋０．５３４　Ｘ　（＃ｍｏｌ／ｊ
り　。

（相関係数　Ｒ＝０．９９３） であった。

（Ｄ）胆汁酸試験紙を用いた測定法と従来法との比較：
検査試料として胆道閉塞症患者の尿（サンプルｌ）、正
常人血清（サンプル２および４）。

肝硬変患者血清（サンプル３および５）を準備した。こ
れらに含有される胆汁酸を（Ａ）項で得られた試験紙を
用い、（Ｂ）項で定めた基準に従って測、１定した。次
に（Ｃ）項で得られた回帰式を胆汁酸測定装置のメモリ
ーに入力し３上記各試料の胆汁酸濃度を（Ｃ）項の方法
に準じて測定した。別に、上記各試料をエンバザイル（
第一化学薬品（ｌ菊製）を用いて溶液法により測定し、
胆汁酸濃度を算出した。それぞれの結果を表２に示す。

表２ 表２から本発明の胆汁酸測定法による測定結果は、従来
の溶液法による測定結果とよく対応しており、試験紙を
用いた簡便法であるにもかかわらず高精度で胆汁酸の測
定が可能であることがわかる。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、試料液中の胆汁酸量が簡
便な方法により短時間のうちにしかも高精度で測定され
る。個人差による測定のバラツキもない。使用される試
験紙は長期間安定に保存され得５例えば、経時的に成分
が変化して下地が発色することがない。本発明方法によ
れば集団検診などで肝胆道系疾患を早期に発見すること
が可能であり、ベッドサイドでの緊急時の検査にも利用
価値が高い。

４、　゛の　　゛　なｉ′■ 第１図は１本発明の胆汁酸測定装置の一実施例を示す概
略図、第２図は胆汁酸測定用試験紙へ試料液を滴下し、
試験紙からの反射光強度減少率を本発明装置を用いて経
時的に測定して得られたグラフ、そして第３図は２本発
明装置により測定された反射光強度減少率と胆汁酸濃度
との関係を示すグラフである。

１・・・胆汁酸測定装置、２・・・胆汁酸測定用試験紙
。

３・・・透明板、４・・・発光素子、５・・・迷光防止
板、６・・・受光素子、７・・・増巾・測定回路・Ａ−
Ｄ変換器。

８・・・表示手段、９・・・測定用スイッチ、２１・・
・プラスチック製ストリップ、２２・・・遮光カバー。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（１）胆汁酸測定用試薬を担体に担持させた胆汁酸
   測定用試験紙に試料液を付与し、該試料液中の胆汁酸と
   該胆汁酸測定用試薬とを反応させ、生じた反応生成物固
   有の色に該試験紙を発色させる工程、および （２）該反応生成物の極大波長部を有する光を該発色試
   験紙に照射し、該試験紙からの反射光の強度を測定する
   工程、 を包含する胆汁酸の測定方法。 ２、前記（１）および（２）の工程からあらかじめ得ら
   れた反射光強度の経時変化率と胆汁酸濃度との関係式に
   該測定値から得られる反射光強度の経時変化率をあては
   めて前記試料液中の胆汁酸濃度を算出する特許請求の範
   囲第１項に記載の測定方法。 ３、前記胆汁酸測定用試薬がニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
   ナーゼ、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含有す
   る特許請求の範囲第１項に記載の測定方法。 ４、（１）胆汁酸測定用試薬を担体に担持させた胆汁酸
   測定用試験紙、 （２）該試薬と胆汁酸とが反応して生じる反応生成物の
   極大吸収波長部を有する光を該試験紙に対して発する発
   光素子、 （３）該波長部に感度を有しかつ該発光素子の光の該試
   験紙からの反射光を受光する受光素子、および （４）試料液の付与された該試験紙に該発光素子からの
   上記光を照射し、該受光素子に受光された反射光強度の
   経時変化率および／またはあらかじめ得られた反射光強
   度の経時変化率と胆汁酸濃度との関係式に該受光素子に
   受光された反射光強度の経時変化率をあてはめて算出さ
   れた胆汁酸の濃度を表示する表示手段、 を有する胆汁酸測定装置。 ５、前記胆汁酸測定用試薬がニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
   ナーゼ、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含有す
   る特許請求の範囲第４項に記載の測定装置。