JPS62280A - 真核細胞の形質転換と転換体の直接選別法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

技監笈斃 この発明は抗原性の物質をコードしている外来のＤＮＡ
を真核細胞に取り込ませ発現させる組換えＤＮＡ技術に
関する。これら転換された細胞の選択はスクリーニング
の過程で転換された細胞を選び出すために、一連のモノ
クローナル抗体のような抗体を使うことで直接効果が上
げられる。 （ヨーー栗− 細胞の表面抗原のような特殊なタンパクをコードしてい
るＤＮＡまたはＲＮＡにみられるような外来の核酸配列
は、受取り側の真核細胞に移される。この特殊なタンパ
ク質を移入されたヒトＤＮＡタンパク生産物に特異的な
モノクローナル抗体のような一連の抗体によってスクリ
ーニングすることは、形質転換された細胞を直接選択さ
せられる。 澄」１Ｑ）５番 １９８０年スタンリー・コーエンとバーバート・ボイヤ
ーは外来のＤＮＡ物質を挿入されたプラスミドまたはウ
ィルスのＤＮＡを用いてバクテリアの細胞を形質転換す
ることに関するアメリカ特許Ｎα４，２３７，２２４を
取得した。この変換した複製体は外来のＤＮＡとその産
物を発現する細菌細胞を形質転換するのに使われた。 その発明の目的は例えばホルモンや抗生物質、特に天然
には産生されなかった分子や「外来の」生物によって十
分な量作られなかった分子を、作るための生きた工場と
して細菌の細胞を利用することである。 コーエンとボイヤーの技術では、形質転換体の選択はそ
れを選択するのに有用な表現型を示す複製するプラスミ
ドあるいはベクターに挿入された別のＤＮＡ−例えば抗
生物質耐性に対するもの−を利用して行なわれる。その
ために抗生物質を含も培地では形質転換された細胞だけ
が生ぎ残こる。そこで求めている産物を適切に発現して
いるコロニーがテストされる。生産物は培地の上澄みに
遊離されるか、または菌体内の場合には菌体をこわし生
産物を得るために抽出される。これらは面倒な生化学的
な過程であることが多い。かくして少くとも２つの外来
のＤＮＡ挿入−または同時に形質転換゛すること−が必
要で、１つは選択過程のために必要な表現型をコードす
るＤＮＡ断片であり、もう一つは求めているタンパク産
物をコードしているものである。 これらの形質転換された細胞は多数の遺伝子コピーを得
るために増殖させる。コーエンとボイヤーの方法は遺伝
物質を自然には変えない生物で遺伝物質を移入する方法
を示している。 しかしながら多くの真核細胞の生産物は、生物学的に有
効な分子になるために余分のステップを経る翻訳過程を
必要とする。これらの余分のステップはバクテリアには
ない、バクテリアのエンドトキシンの混入はヒトに−こ
れらの生産物を使うときにもう一つの面倒なことである
。 最近、アクセル等は真核細胞の同時形質転換の方法を特
許にした（アメリカ特許Ｎａ４，３９９，２１６、ここ
に参考文献とに取り上げる）。この過程は形質−転換細
胞の選択のための表現乳マーカーとして作用するＤＮＡ
断片に関係している。基本的にこの特許は外来のＤＮＡ
を連関した或いは連関していない断片の状態で真核細胞
に挿入する方法をカバーしている。この連関挿入は選択
過程で表現型マーカーを増加した量で生産する増復技術
をカバーしている。例えば選択培地中の抗生物質濃度を
増加することによって表現型ＤＮＡマーカーのコピーを
多数選択し、それ故求めているタンパク産物をコードし
ている外来のＤＮＡのコピーも多数得られる。 形質転換の選択に使われる連関したあるいは連関してい
ない表現型遺伝マーカーはアクセル等の方法の中に存在
しているにちがいない。アクセル等は特殊な求めている
タンパク産物を表現型マーカーを通してのみで直接選択
していない。 上記の改良において、本発明は求めるタンパク産物をス
クリーニングするためにモノクローナル抗体のような一
連の抗体の一つあるいはそれ以上を使い、それによって
表現型マーカーとして使われる遺伝子片を加える必要性
を除くものである。要約すれば形質転換細胞のタンパク
性産物はタンパク性産物としてばかりでなく、形質転換
細胞を選択するための抗原性マーカーとして働らく表現
型マーカーでもある。かくして、形質転換細胞を選択す
るもう一つの表現型マーカーを必要としない。この第２
のＤＮＡ片を包含することも（連関したあるいは連関し
ていないＤＮＡとして）本発明の方法によって陽性のク
ローンをスクリーニングする前に予めスクリーニングす
る選択手段として使うことができる。 本発明はこれまでの間接法でない形質転換体の新しい直
接選択法に関する。 殆んどのタンパク性生産物が抗原性であるので、選択法
は広汎に応用しろる免疫学的なものである。モノクロー
ナル抗体（ｍＡｂ）のような高度に特異的な抗体が望ま
しい。 １９７５年ケーラーとミルシュタイン（（１９７５年）
ネイチャー（ロンドン）２５６巻４９５頁〕は、殆んど
無制限の量の抗体を正確に再現性のある特異性をもって
生産させる雑種細胞（ハイブリドーマ）を使って、モノ
クローナル抗体（ｍＡｂ）を生産する方法を導入した。 動物を腫瘍細胞や他の抗原で免疫に作る従来の抗血清は
、その特異性や性質が異なる多種の抗体の混じり合った
ものであるが、ハイブリドーマは均一な性質をもつ一つ
の抗体を生産する。ケーラー・ミルシュタイン法は免疫
された動物からの肺臓細胞と継代培養できるミエローマ
細胞株とを融合することを要する。融合した細胞（ハイ
ブリドーマ）から求める特異性をもった抗体を産生ずる
クローンを選択する。ハイブリドーマ細胞は限りなく培
養しうる（あるいは液体窒素中で凍結して保存できる）
から抗体を絶えず供給することが保証される。 抗体は抗原として知られる他の分子を結合し。 また認識する力をもつタン六り質である。モノクローナ
ル抗体は、その特性において非常に均一で一つの抗原、
すなわち決定基といわれる抗原の一部分のみを認識する
以外は他の抗体と変らない。 細胞の場合には認識される決定基は、抗体と反応する細
胞の上または中にある抗原である。 特別な抗体が特殊な細胞を認識し、反応するのは、これ
ら細胞抗原を通してである。すなわち細胞抗原は細胞を
同定するマーカーである。 これら抗原性のマーカーは細胞分化の正常過程を観察し
たり、その細胞系にある異常の位置を知るために使われ
る。分化の過程は細胞表面抗原の表現型の変化を伴って
おり、特定の分化系列に属する細胞を分別し、または同
じ分化系列にある異なった時期の細胞を区別する抗原が
、的確な抗体を用ることによってＷＲ＊できる。分化抗
原の初期の確認はマウスのＴ細胞白血病細胞の表面抗原
の分析によって発生ル、ＴＬ、’ｒｈｙ−ｉ、Ｌｙｔの
記号をもった一連の抗原であった（ロイド・Ｊ・オール
ド、互Ｚ匪久４１巻３６１−３７５．１９８１年２月）
。これらのＴ細胞分化抗原の分析は、マウスやヒトの正
常Ｔ細胞やＢ細胞が使われることによって非常に簡便化
され一相当に進歩した（ヒトのＴ細胞抗原に対するｍＡ
ｂに関する特許面４，３６１，５４９〜５５０　；　Ｎ
ｃｉ４，３６４，９３２〜３７、Ｎｏ４　、３６３　、
７９９をみよ）。他の系列に属する正常及び新生細胞に
みられる分化抗原については殆んどわかっていない。 これはモノクローナル抗体の分野の気まぐれもあるが、
適当な正常細胞タイプの供給源を容易に得ることがむづ
かしいことにある。雑種細胞系統を作ることは、接種す
る細胞の性質、細胞の増殖条件、融合条件等のような実
験要因に左右されて成功したりしなかったりである。す
なわち一つの細胞株で成功したとしても別の株でハイブ
リドーマをうまく調製することを予言することは必ずし
もできない。 色素形成細胞（メラノサイト）の表面抗原に関して、正
常な皮膚からメラノサイトを培養する技術が最近みつけ
られたことによって進歩した〔アイジンガー等、アメリ
カ国立学術斗学院会震−７９巻２０１８頁（１９８２年
３月）、アメリカ特許出願Ｎα４６９，８５４）。この
方法はメラノサイトの分化抗原′の分析に増殖する細胞
を再生しうる源を提供している。 マウスのモノクローナル抗体で同定されるヒトの悪性化
したメラノーマの細胞表面抗原は既に記載されている〔
ディボールド等、アメリカ立＾　＾　Δ　７７巻６１１
４〜６１１８頁（１９８０年）アメリカ特許出願Ｎα３
０７，０６０）。メラノーマの仕事はヒユートン等（１
９８２年、去］■じ１１版１５６巻１７５５頁、アメリ
カ特許出願Ｎａ４４５，５６１）やアルピノ等［１９ｇ
３年、免疫学雑誌１３１巻１５９５頁、アメリカ特許出
願Ｎａ４ｇ１，３７８で１９８３年４月１日受理された
ｇｐ１３０（ディボールド等のｇＰ１５０と同じである
ことがわかった（前出の文献）〕に対するｍＡｂに関す
るもの］に続いている。ヒトの腎ガンに関するこれまで
の研究は、ヒト腎ガンの細胞表面抗原に対するモノクロ
ーナル抗体と題したアメリカ特許出願Ｎα２７７．８１
４及びＮα４７４，２２４にみられる。 大腸（アメリカ特許出願Ｎａ４７４，４１５）、膀胱（
ＮＱＳ６７　、０６６）、肺（Ｎｎ４７４，２２５）等
についてのアメリカ特許出願には、スクリーニングの目
的のためのｍＡｂパネルによって幅広い組織のタイプが
カバーされていることが示されている。上記の特許出願
や文献はここに参考文献として取り上げている。 それ故にマウスのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使っ
ての血清学的、生化学的解析をすることは、ヒトのメラ
ノーマや他の人工培養されたあるいは人工培養でない細
胞にある数多くの細胞表面分子を同定してきた。主要組
織適合性物質の中の成分に加えて、これらのｆｌｌＡｂ
は多くの分化抗原を規定しているが、これは特別な発生
系統や分化の段階や細胞増殖の新生か正常かの状態に関
わるマーカーとしての特殊な抗原の重要性を認識させて
いる。大抵のこれら抗原の詳細な構造は、その生物学的
機能とともにまだ未解明のままである。関連の表面抗原
をコードしている組換えＤＮＡクローンを単離すること
は、明らかにこれら分子の特徴づけやその発現の特殊性
を支配する制御機構を解きあかずのに大いに役立つであ
ろう。 これら抗原の構造や機能的性質を研究するために、我々
はメラノーマの表面抗原をコードしているヒトのＤＮＡ
配列を、外からの取りこみと選択的な遺伝子の発現に非
常に応答しゃすいＢ−１６マウスメラノーマ細胞のクロ
ーンである受けとり側の８７８旧細胞に移入した。我々
はクローン化した選択性ベクターのｐＧｃｃｏｓ３ｎｅ
ｏと共にヒトのメラノーマＤＮＡを含む混合共沈殿を適
用することを含むアクセル等（前出の文献）の方法と類
似の形質転換戦略を用いた。ヒトメラノーマ抗原に対す
る１８ケのマウス抗体と新しい抗原を発現する初代の転
換体を、その場で赤血球細胞のロゼツト形成と肉眼ｅｘ
ａとで迅速にスクリーニングする方法を用いて、我々は
分子量１３０゜０００のシアロ糖タンパク（ｇｐ１３０
）を＝コードしているＤＮＡ配列を８７８旧細胞に安定
に移すことに成功した。この抗原は培養したヒトメラノ
ーマ系統（４０／４３）、多くのアストロサイトーマの
培養株（７／１０）に存在しているが、他の異性化した
タイプや正常細胞の多くはもっと低い値である。第二次
の転換体をさらに解析すると、形質移入されたｇｐ１３
０はヒトのメラノーマの供与細胞からのｇｐ１３０にみ
られるように、同一の分子量、等電点、細胞内プロセシ
ング及び表面に露出した抗原決定基の空間配向性をもっ
ていることを示している。しかしながら、マウスの転換
体でのｇｐ１３０の細胞表面発現は、供与したヒトメラ
ノーマ細胞にあるよりも２〜４倍少なかった。 この例は本発明を限定することなく本発明の詳細な説明
するものである。本発明の方法は”一般に形質転限と転
換体の選択に広く適用される。 すなわち、インターフェロン、成長ホルモン等のような
抗原性のヒトのタンパクまたほのタンパク性物質をコー
ドしている遺伝子を取り込んだクローンを、この方法に
よって選択できる。 適当な真核細胞でも原核細胞でも、求める因子をコード
しているプラスミドまたはＤＮＡを受は入れるためのコ
ンピテント細胞（受容能力のある細胞）として使用され
る。 旦凡人血鼠聚 アクセル等（前出）によって記載された技術で知られる
方法によって培養したヒトまたはマウスのメラノーマ細
胞株から、高分子のＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡ
の分子量はラムダＤＮＡを一緒に電気泳動して比較する
ことにより判定して、５０キロベース（ｋｂ）を超える
ものであった。 プラスミドｐＢＲ３２７の誘導体であるプラスミドｐＧ
ｃｃｏｓ３ｎｅｏは、アミノグリコシド・ホスホトラン
スフェラーゼ（ＡＰＩＩ）をコードしているバクテリア
の遺伝子のｎｅｏ　（Ｇ、グルーズ、　ＮＣＩ、フレデ
リック・ガン研究施設、メリーランド州フレデリック）
を含むｐｓＶ２ｎｅｏ［リジンとバーブ、（１９８２年
）　　ｒ　遺−学　　１巻３２７〜３４１頁〕から得ら
れる断片を含んでいるが、アンピシリン選択とクロラム
フェニコール増殖させたＥ、ｃｏｌｉ宿主１１ＢＩＯＩ
で生育された。プラスミドＤＮＡは印刷された方法〔マ
ニアティス、フリッシュ、サムプルツク、　　　クロー
ニング（１９８２年〕Ｃ５旧コで精製され、密度勾配で
電気泳動された。 遺伝子の移入 生育培地の存在で共沈殿した細胞とプラスミドＤＮＡに
細胞を１６〜２４時間さらすことを含むアクセル等（前
出の文献）の方法が適用されたが。 さらにこれはグラーフ、カブラン、シラギ（１９８４年
、　　　　と　　′　−学１０巻１３９〜１５１頁）の
中にも記載されている。簡単には、８７８）ＩＩ細胞は
形質移入の２４時間前に１００ｍｍ径のペトリ皿当りｓ
ｏｏ、ｏｏｏ個の細胞数に播種された（１実験当り３０
枚のシャーレ）、高分子量のヒトまたはマウスのＤＮＡ
の６００　μｇを、３０〜６０μｇのｐＧｃｃｏｓ３ｎ
ｅｏと混ぜてカルシウム−燐酸沈殿を形成させた＊Ｉｒ
ａＱの沈殿をシャーレ当りに加え（ｚＯμｇのヒトＤＮ
Ａプラス１〜２μｇのｐＧｃｃｏｓ３ｎａｏ）　、シャ
ーレを３７℃で１６時間インキュベートした。培養液を
除きプレートを燐酸緩衝化生食水で洗い、それからｍＱ
当り１〜１．５■ｇのジェネテイシンを含む完全培地を
再び加えた。プレートには３日毎に培地を入れかえた。 ベクター依存性のコロニーが５〜８日以内に明らかにな
り、これらのコロニーにつき形質移入した抗原の発現に
ついてのスクリーニングを選択後はぼ２週間で実施した
。ヒトまたはマウスのＤＮＡを移入されたコードされた
シャーレについて免疫的選択を行った。 厭鼠穐蒼 メラノーマ細胞株は先に記載したように確立されている
（ディボールド等ＭＪＬ）。培養細胞は２ｍＭのグルタ
ミン、１％非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｓ　Ｑのペニシ
リン、１００　ｐ　ｇｅｍ　Ｑのストレプトマイシン及
び１０％の仔牛脂児血清（ＦＢＳ）を加えたイーグル最
少必須培地で維持された。 共沈殿したＤＮＡとウワバイン耐性の８７８旧サブクロ
ーンのＨＩＪＧＱによる遺伝子の移入のために非常に受
は入れやすい受容体であることが示されているＢ−１６
マウスメラノーマのサブクローンである８７８Ｈ１細胞
を、１０％の加熱不活化した仔牛脂児血清（マサチュセ
ッツ州バイオプロダクト社）、５０μｇｌ履Ｑのオーレ
オマイシン（レダリー）及びゲンタマイシン（シューリ
ング）を補添したアールの塩類を含むイーグル最少必須
培地で、５％ＣＯ２を含む調湿環境下で３７℃で培養し
た＠　ｎｅｏ遺伝子に対する形質移入体は１．５Ｂ／ｍ
Ｑのジェネテイシンを含む上記の培地（ギブロ社で調製
されている、ｍＱ当り６３０μｇの純抗生物質を含む）
で選択された。 凰星豊ｌ 腎ガン細胞株

【ウエダ等；尖１１ｆ　久笠１５０巻。 ５６４〜５８９（１９７９年）】と腫瘍細胞株〔ケアリ
ー等ヱメリカ　立学術科学　会報７３巻、３２７８〜３
２８２頁（１９７６年）〕は既に記載されている。正常
腎上皮細胞の短期間培養法もまた先にのべられている（
ウエダＭＪＬ）、培養細胞は２ａ＋Ｈのグルタミン、１
％の非必須アミノ酸、１００単位／ｙａＱのペニシリン
、１μｇ／ｍＱのストレプトマイシン及び１０％（Ｖ／
Ｖ）の仔牛脂児血清を補添したイーグル最少必須培地中
で維持した。培養細胞は定期的にマイコプラズマカビ、
バクテリアについてテストし、汚染された細胞は廃棄し
た。 Ｊ　：　（ＢＡＬＢ／ＣＸ　Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ、の雌
のマウスを樹立された正常またはガン細胞株で免疫した
。 初回免疫には例えばｌＸ１０７の腎ガン細胞をアジュバ
ントなしに皮下注射した。その後の免疫は３〜４週間隔
でｌＸｌ０’の細胞を腹腔投与することで行った。免疫
されたマウスは最終免疫後３日で殺された。 マウスの　　の　　：免疫した肺細胞のマウスのミエロ
ーマのＭＯＰＣ−２１Ｎ５−１細胞との融合は、既述の
方法で行われた〔ディボールド等（１９８０年）アメリ
カ　立学　゛学ｒ会　７７巻、６１１４頁及びケーラー
、ミルシュタイン、ネーチャー（ロンドン）２３６巻４
９５〜４９７　（１９７５））　（ウエダ等煎−散、ウ
エダ等、アメリカ国立学　科学　会報７８巻５１２２頁
（１９８１）も見よ〕。融合された細胞（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジンを含む選択培地のＩＩＩ
Ｑに５〜ａｘｔｏ’）を組織培養プレート（コースタ−
４３５２４，プレート当り２４ウエル）に加えた。ハイ
ブリドーマ細胞を１〜３×１０５のマウスの腹腔マクロ
ファージのフィーダ一層上で限界希釈法によって少くと
も３回サブクローン化した。培養上澄みをとり、一連の
培養細胞について抗体活性を調べた。抗体のサブクラス
は抗ＩｇＨ鎖特異試薬（パイオネティックス社、メリー
ランド州ケンシントン）を入れた寒天板で二重拡散法に
より決定した。クローン化したパイブリドーマの培養細
胞をｎｕ／ｎｕマウス（スイスをバックグランドにもつ
）に皮下投下し、また液体窒素中で保存した。次第に生
育する腫瘍をもったマウスからとった抗血清を集めて一
７０℃に保存し、血清学的及び生化学的なキャラクタリ
ゼーションに用いた。 ム１笠血友茎 ウサギの抗マウスＩｇ（ダコ社コペンハーゲン）のイム
ノグロブリン画分を、ヒトの０型赤血球と０．０１％の
塩化クロムで結合することで抗ＩｇＧ　（ＩｇＧ−ＭＩ
ＩＡ）指示細胞を調製した。０型ＲＢＣを冷ベロナール
緩衝液（ＶＢＭ）を用い穏やかな遠心分離で一回洗條す
る。すなわち １．０００　ｒｐ＋ｍ　　で　５分間 １．５０Ｏｒｐｍ　　で　５分間 ２．０００　ｒｐａ＋　　で　５分間。 穏やかな遠沈でＲＢＧを冷生食水により２回洗條する。 等量の生食水でペレットを再懸濁する。 それからゆっくり混合しながら底にたまったＲＢＣと同
等のウサギ抗マウス血清またはヤギ抗マウス血清及びプ
ロティンＡまたは一般にはマウスＩｇに反応する血清を
加える。ＰＡはいつも１ｍｇ／ｆｆ１Ｑである。すなわ
ちＲＢＣ：生食水：ＰＡは１：１：１の比率である。プ
ロティンＡはゆっくりと加えられる。１％のＣｒｙｆｆ
溶液を２０℃において生食水で０．０１％に希釈する。 保存液は光を入れないびんに保存する。再びゆっくりま
ぜながら底にかたまったＲＢＣの量の１０倍量と等しい
量の０．０１％ＣｒＣＱ　、を滴下して加える（例えば
もしＲＢＣの量が０．２５ｍ１２であれば、加えるＣｒ
ＣＱ　、の量は２．２５ｍＱである）。 この混液をサスペンションにして５分間２０℃に保つ。 ＶＢＭを加え、２回穏やかな遠沈で洗條する。 ＰＢＳ＋５％ＦＢＳまたは１％アルブミンで０．２％の
希釈まで希釈した１０％（Ｖ／Ｖ）サスペンションとし
てＶＢＭ中に再懸濁する。　ＰＢＣ−ＰＡの原液は１〜
２週間４℃で安定な１０％溶液である。それ故ＩｇＧの
吸収で標的細胞に直ちに用いる場合には５０倍に原液を
希釈する。 ｎｅｏに耐性の形質移入体を含むプレートを洗い、２０
℃で６０分間マウスｍＡｂのプールとインキュベートさ
れた。そのプレートを２回燐酸緩衝化した生食水で洗い
、プレートに抗マウスＩｇＧ指示細胞を加えて４５分間
２０℃でインキュベートした。プレートを２回洗い蛍光
灯箱下でみると。 赤いボタンのようにみえる赤血球を結合しているコロニ
ーを数えるか、または顕微鏡でみてコロニーの個々の細
胞に結合した赤血球を数えた。 ム疫孟凰仄 細胞を次のようにして放射能標識した：（１）１％のＦ
ＢＳを含む１２ｍＱのメチオニン不合最少必須培地（肛
Ｍ）に、２５０μＣｉの（Ｉ　Ｓ　ｓ　＞メチオニン（
二ニー・イングランド・ニューフレア社１０００Ｃｉ／
ｍＩＩｒａｌｅ：　Ｉ　Ｃ１＝３．７　Ｘ　１０”ベク
レル）を使って１６時間代謝的に取り込ませる。　（２
）１０％のＦＢＳを含むＭＥＭ１２ｍＱ中に１５０μＣ
ｉの（３Ｈ）グルコサミン（二ニー・イングランド・ニ
ュークレ７社、３０〜６０Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を使って
指示された時間代謝的に取り込ませる。標識した細胞を
０．１ａ＋Ｈのフェニルメチルスルホニルフルオリドを
含む０．１５Ｍ　ＮａＣＱ１０．０１Ｍトリス（トリス
緩衝液、ｐＨ７，２）に溶解した０、５％のノニデット
Ｐ−４０で抽出し、その液を１００、ＯＯＯＸｇで遠心
分離し、さらに０．２２μｍのフィルターを通すことに
よって清澄にした。細胞抽出液（５Ｘ　１０　Ｘ　１０
’ｃｐｍ）をＬμｌｌのｍＡｂ、１５Ｍ誌のウサギ抗マ
ウスＩｇ（カベル・ラボラトリーズ、ペンシルバニア州
コクランビル）血清及び５００μａの１％ガンマグロブ
リンネ含ＦＢＳを含むトリス緩衝液中の０．１％ノ二デ
ットＰ−４０と混合することによって免疫沈殿を行った
。免疫複合体をプロティンＡ結合のセファロースビーズ
（ファルマシア社′Ｉ！ｉ）を使って分離し、ラベルし
た成分をＳＯ３／ポリアクリルアミドゲル電気泳動と蛍
光法により、すでに述べられているようにして検出した
。 バ男ｍ遭葦一 対数増殖期にある細胞をｌＯｍ　Ｑのメチオニン不含Ｍ
ＥＭと３７℃、６０分間培養した。この培地を除き、並
行して行ったプレーＩ−の細胞を１００〜２００μＣｉ
の（”Ｓ）−メチオニンを加えた同培地２．５ｍΩで３
７℃、１５分間インキュベートした。それから培地を除
き、プレートを２回冷ＭＥＭで洗い、それから予め加温
したｌＯ％ＦＢＳをプラスしたＭＥＭを再び加えた。い
ろいろな培地時間で経時的に細胞を１回冷却した燐酸緩
衝化生食水（ＰＢＳ）で洗い、　０．２ｎ＋Ｈのフェニ
ルメチルスルホニルフルオリドを含むｐＨ７，４の０．
０５Ｍ　ＮａＣＱ含有０．０２阿１−リスに溶かした０
、５％づつのノニデットＰ−４０及び０．５％デオキシ
コール酸塩で可溶化した。この液は１０，０ＯＯＸ　ｇ
で清澄化され上澄みを上記のような免疫沈降反応に使っ
た。 実施例１ ８７８Ｈ１の多質転　体の細胞−８上のＧＰ−１３０の
高分子量のＳＫ−Ｍ［ＥＬ−１３１のＤＮＡとプラスミ
ドρＧＣｃｏｓ３ｎｅｏと混合共沈体を、＋１１７８旧
マウスメラノーマ受容細胞に加えたとき、選択培地を含
むジェネテイシンに生き残こるｎｅｏ　”のコロニーの
両分が１ケまたはその以上のヒトメラノーマ細胞表面抗
原を発現していることを認めた。これら抗原について陽
性のコロニーの同定は、個々のマウスモノクローナル抗
体と反応する１８の抗原の細胞表面でのみえ方が同時に
テストされる混合赤血球ロゼツト形成法によって、ｎｅ
ｏ耐性の形質転換体を含むシャーレについて行われた。 遺伝子の移入と一ロゼツト形成法は、ともに非常に特異
的であり、巨視的は試験で見えるようになる程度に赤血
球を結合しているコロニーは、共沈体がヒトメラノーマ
ＤＮＡを含むときのみ検出され、マウスのメラノーマＤ
ＮＡが用いられたときには検出されなかった。こうして
同定された大多数のコロニーは、クローンに単離された
ときにも大量培養生長を示し、また１８のモノクローナ
ル抗体の各々でヒトのメラノーマのシアロ糖タンパク質
ｇｐ１３０を発現しているという免疫化学的な特性を示
した。形質転換体を産生ずる３回の実験でヒトのメラノ
ーマＤＮＡ介在のｇｐ１３０遺伝子の転換の頻度は、８
７８旧受容細胞当り平均１．８　Ｘ　１０−’であり、
ジエネテイシン耐性コロニー当り平均４．３　Ｘ　１０
−’であった。マウスメラノーマＤＮＡを受けるコント
ロールシャーレの頻度は、８７８旧受容細胞当り５Ｘ１
０−”以下であった（１７のシャーレでｇｐ１３０陽性
のｎｅｏ遺伝子を移植されたコロニーはＯ）。ｇｐ１３
０はディボールド等のｇｐ１５０である（前記）〔アル
ピノ等：免疫学１版１３１巻１５９４（１９８３年〕〕
。 Ｇ１３０ＤＮＡ配列の二次的転換 Ｓに−ＭＥＬ−１３１またはＳＫ−ＭＥＬ−１４１のＤ
ＮＡで形質転換の結果として、　ｇｐ１３０を発現して
いる８７ｇ旧の２つの初代形質移入体から精製したＤＮ
Ａは、上記のように８７８１１１細胞の形質移入の第二
回転目にｇｐ１３０をコードしている配列を形質移入で
きた。ｇｐ１３０遺伝子の二次移入は２回の実験の２つ
で起こり、−回目のｇｐ１３０移入体のＤＮＡでのみｇ
ｐ１３０に陽性の表現型を移入しく６５０ニー／４．５
×１０′の８７８１１１細胞）、コントロールのマウス
ＤＮＡでは起らず（０コロニー／２Ｘ１０’の８７８旧
細胞）。 特異的であった。 放射性免疫沈澱による解析 放射性免疫沈澱実験によって、抗ｇｐ１３０モノクロー
ナル抗体Ｒ２３はヒトの供与体ラノーマ系統及び受容体
のマウスの二次的転換株からの１３０Ｋｄの蛋白を沈澱
させることが示された。二次元ゲル電気泳動では双方の
細胞タイプにおけるｇρ１３０が同一の等電点５．５を
もつことが示され、それ故形質移入した遺伝子のｇＰ１
３０タンパクの１訳がヒトの供与体のメラノーマ細胞に
おけると同じ程度のグリコジル化していることを示唆し
ている。 Ｉ質転換体における　１３０　　子の細胞内プロセシン
グｇＰ１３０陽性の８７８旧二次転換細胞を１５分間（
ｆｆｓｓ）−メチオニンでパルスし、それから非放射性
の培地で経時的に追跡した。細胞を洗い、自己消化し、
ｍＡｂＲ２３で免疫沈澱した。１５分間のパルスの後、
１００，０００の分子量に泳動するタンパク種（Ｐｒｌ
ＯＯｇｐと記される）のみがｍＡｂＲ２３で特異的に沈
澱した。３０分後にはρｒｌｏＯｇｐは１３０Ｋｄ成分
として泳動してその最終形態にプロセシングされた。 前駆体と最終産物の間の中間的な分子種は＃串されなか
った。マウスの二次転換体におけるプロセシングは、供
与体のヒトメラノーマ系統のＳＫ−ＭＥＬ−１３１にみ
られるものと同一であり、また別のメラノーマ系統のＳ
に−ＭＥＬ−２８にみられるものとも同一であった（デ
ィボールド等、前出）。 ｐｒ１００ｇｐ前駆体も最終産物であるｇｐＬ３０３も
、１ｌ−Ｄ−タルコサミンで放射能ラベルされる。我々
は以前にｐｒｌｏｏｇｐ前駆体の分子量が１３０，００
０Ｋｄに増加することに関わっている生化学的変化が。 Ｎ−結合オリゴ糖側鎖のプロセシングであり、８０Ｋｄ
のグリコジル化していない分子種がコードしているｍＲ
ＮＡの最初の閾訳産物であることを示している（Ａ、Ｐ
、アルピノ等（１９８３年）免疫学雑誌１３１巻１５９
５頁）。 ＧＰ１３０の吸収解析 形質転換された細胞が供与体のメラノーマ細胞と同レベ
ルのｇｐ１３０を発現するかどうかを調べるために、定
量的な吸収解析が行なわれた（ディボールド等、庇澁ム
又駄）。形質移入された８７８旧の二次的マウス細胞の
表面におけるｇｐ１３０の発現は、供与体のヒトメラノ
ーマ系統にみられるものより２〜４倍少ない。コントロ
ールの８７８旧は試験した細胞数の範囲ではｇｐ１３０
抗体の反応性を吸収しなかった。 この例はヒトメラノーマの染色体ＤＮＡから１３０にｄ
の細胞表面糖タンパクのような細胞性の抗原性物質をツ
ー下している配列を、この方法の特殊な例として受容体
の８７１旧マウスメラノーマ細胞に安定に移入する方法
を一記載している。その戦略は（１）クローン化した選
択性の遺伝子ベクターｐＧｃｃｏｓ　３　ｎｅｏをもっ
た全細胞ＤＮＡで形質転換すること、　（２）８７８１
１１細胞のような外来のＤＮＡの取りこみと発現に非常
に応答する受容細胞を使うこと、（３）転換された遺伝
子を発現している細胞を肉眼的に同定し、クローンとし
て迅速に選択させる迅速な免疫学的スクリーニング法を
使うことを包含している。 このアプローチは形質転換した遺伝子を分離するために
これまでに使われた蛍光活性化細胞システム（ＦＡＣＣ
）技術より、操作的または遺伝学的な利点をもっている
。すなわち（ａ）安価で最少の資源しか要らない；　（
ｂ）多数のコロニーが短時間にスクリーニングできる；
　（Ｃ）非常に低レベルの転換効率であってもｍＡｂで
の最初のスクリーニングによって推定される抗原の形質
転換体の同定と分離を可能にする；（ｄ）分離されたコ
ロニー各々がおそらくは独立した転換事象を表わしてい
る。抗原を発現する細胞に対して、増強するために何回
もくり返す必要がある方法（例えばＦＡＣ３や直接免疫
選抜法）と反対に、眼で見えるコロニーをその場でスク
リーニングすることによって新しい表面タンパクマーカ
ーを発現している転換体のコロニーを検出する遺伝子利
点は、別々のコロニー分離株によって表わされる転換の
行われ方に明瞭な独立性があることである。 例として我々は８７８Ｈ１細胞での形質転換実験で２つ
の独立した由来の培養メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ−１３
１とＳＫ−ＭＥＬ−１４１）　　と、１つの肺ガン細胞
（ＳＫ−ＬＵ−６）からとった染色体ＤＮＡを使った。 ｎｅ。 耐性の表現型をもったでき上った転換体をメラノーマに
対して調製された１８種のｍＡｂでスクリーニングした
が、その多くは悪性化した組織上に広く分布した抗原を
検出した。これら３つの染色体性ＤＮＡの各々から、ｐ
１３０をコードしている遺伝配列は８７８旧細胞に移入
された。ｇｐ１３０抗原に陽性の初代形質転換体の頻度
は、おおよそ供与ＤＮＡによらず２〜５Ｘ１０’に１ケ
であった。 ｇｐ１３０以外のａ＋Ａｂプールに表わされる１７の他
の抗原のどれも８７８旧形質転換体を分離することがま
ずできないことは、極端に低いレベルの抗原を示してい
る細胞コロニーを検出する方法がないことを反映してい
る。しかしながら、我々は現時点では多数の遺伝子が抗
原性の表現型に関与している、あるいは遺伝子が移入し
にくい。 ８７ｇ旧細胞で代表される種のちがいや分化の時期が適
合していないことによって、ある遺伝子の発現が制限さ
れる、移入された遺伝子から作られる本来もっている抗
原性産物を示すための母体としての８７８旧の細胞膜が
合っていないなどのような他に取るべき説明を排除する
ことはできない。 Ａｌｕタイプのくり返し配列のためのプローブ（検出試
薬）とリジンプロット解析を用いて多量のヒトＤＮＡが
ｇｐ１３０の発現に陽性の初代転換体のマウスの染色体
に組みこまれていることを示した。しかしながら、二代
目の転換体はＡｌｕ−タイプの配列を検出できなかった
。おそらく、このことはｇｐ１３０に関連の配列がユニ
ーク配列のＤＮＡであるか、他の非Ａｌｕ−タイプの反
復をもかであることを示している。検出可能な主要のヒ
トの反復群を欠いていることは、マウスの転換体が現に
マウスのｇｐ１３０と同じ、ものを発現していることを
意味している可能性がある一方、我々は次のような理由
はありそうもないと思う。すなわち（１）ｇｐ１３０分
子の異なるエピトープ（抗原決定基Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ
）に対する５つのモノクローナル抗体がマウスの抗体で
あり〔ディボールド等、前出の文献、しかしアルピノ等
、逸」【学］Ｅ詩−１３１巻、１５９５〜１５９９　（
１９８３年）で決められたようにｇｐ１５０がｇＰ１３
０であることを注目せよ〕、また各々が８７８旧細胞の
表面に示される形質転換されたｇｐ１３０分子と反応す
る。（２）マウスの８７８１１１の受入れ細胞のｇｐ１
３０に関係する分子の細胞表面か、または細胞質内での
発現を検出することは多くのテストが出来なかった。（
３）ヒトのＤＮＡからのｇｐ１３０遺伝子をマウスの細
胞に転移する頻度が単一コピーの遺伝子を予示させる範
囲にある。（４）ヒトの細胞とマウスの細胞に転換され
たと思われるものからのｇｐ１３０の分子量１等電点あ
るいは細胞内でのプロセシング等に差が見られなかった
。（５）８７８旧細胞でのｇｐ１３０の発現がヒトのＤ
ＮＡに８７８旧細胞を曝すことに絶対的に依存していた
。しかしながら、我々の移入されたｇｐ１３０をマウス
の細胞から分子的にクローン化する試みは、この分子が
ヒト起源であることを確実に証明し、マウスの同一性を
探りあてさせるだろう。 実施例■ 我々は最近８７８旧細胞に対するｇρ１３０分子とは生
化学的に関連のない腎ガン細胞の表面抗原をコードして
いる配列を移入することに成功している（カント−等軸
車を作成中）。 細胞表面糖タンパクｇｐ１７０／１４０／３０をコード
しているヒト腎ガン細胞株５Ｋ−ＲＣ−４１からのＤＮ
Ａ配列を、　ＤＮＡが介在した遺伝子の移入技術を使っ
て８１６マウスメラノーマ細胞のクローンである受入れ
側の８７８旧に安定に移入した。ｇｐ１７０／１４０／
３０は殆んどすべての培養細胞に見られた。腎糸球体、
甲状腺の微小腺や原皮細胞等の組織にのみ見られる。そ
の分子構造は１７０，０００．１４０，０００と６ケの
３０，０００の分子量の分子種を含んでいる。５Ｋ−Ｒ
Ｃ−４１とプラスミドベクターのｐＧｃｃｏｓ　３ｎｅ
ｏからのＤＮＡを燐酸カルシウムで共沈殿させることを
８７８旧の培養細胞に適用した。ジェーネティシンで選
択した後、細胞を混合血球吸収ロゼツト形成法（ウエダ
等アメ・リカ国立学術を学Ｒ鬼皿前出）に、マウスのモ
ノクローナル抗体を使ってｇｐ１７０／１４０／３０Ｆ
の発現を分析した。　Ａｌｕまたはヒトの全ニック復製
試薬のいずれかで初代転換をリジンブロッティングによ
る分析で多量のヒトの配列が明らかにされたが一方、二
代目の転換体は主要な反復要素を欠いていることがみつ
けられた。　５Ｋ−ＲＣ−４１と比べて二代目の転換体
についてｇｐ１７０／１４０／３０を生化学的解析をす
ることによって、（１）発現が１２０倍低い、（２）分
子量が１７０，０００と１４０，０００のポリペプチド
とわずかに異なる、（３）１４０，０００と３０，００
０の分子種に複数形がある等が示された。これらの差は
ｇｐ１７０／１４０／３０がちがうプロセシングをうけ
るか。 同じネズミ種で再結合したのいずれかを示唆している。 我々は現在コピー数を増やす研究をしているが、それは
導入したヒトの遺伝子を増幅するベクターと共に８７８
旧細胞に一緒に移入することによって、ヒトに遺伝子の
細胞での発現の全量を高めることである。この実験の結
果でｇｐ１３０以外の抗原について移入される表現型の
発現にみられる制限の程度についての知見が得られるだ
ろう。 特殊なｍＡｂが直接遺伝子のタンパク生産物を同定する
ので、形質転換された細胞を一般的に選択するためにモ
ノクローナル抗体のような特殊な抗体を使うことは、こ
の発明の教示に従ってこの技術に精通した者にとって明
白であろう。 最近の軸車はこの発明の方法を使っている〔リットマン
等１．ｕＬ４０巻、２３７〜２４６（１９８５年２月）
の２３８頁の第１列の第１及び第２文節〕。この著者は
本発明者によりスローン、ケタリング研究所においてこ
の方法を教えられた。この著者はマウスのＬ細胞に発現
されるいろいろなヒトＴリンパ球細胞の表面抗原を検出
するのにこの方法を適用している。著者らは形質転換し
ているＤＮＡがない場合には、ロゼツト形成が陽性であ
るクローンはみられず、従ってこの試験法の信頼性を確
認している。 すなわち、求めている外来の抗原性の産物の発現を選択
するために、例えば１０個、２０個あるいは１００個の
ｍＡｂのプールを使うような形質転換された細胞を迅速
に選択するために、１個またはいくつかをプールしたモ
ノクローナル抗体を使うこともできる。抗生物質耐性を
コードしているもののような選択性の遺伝マーカーを使
って予備スクリーニングをすることも可能である。 マルチコピーもいろいろな抗原をコードしているいくつ
かの異なったＤＮＡと同様に取り込ますことも可能であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）外来の抗原性物質をコードしている核酸でコ
   ンピテント細胞を形質転換し、（ｂ）その抗原性物質を
   発現する形質転換細胞をその抗原に特異的に抗原抗体反
   応を起こす一連のモノクローナル抗体の１つまたはそれ
   以上で選別し、（ｃ）免疫学的試験による抗原抗体反応
   の程度を検出することを含む細胞に発現している抗原性
   物質の表現型を直接識別する細胞中の外来の抗原物質を
   コードしている核酸を安定に取り込む方法。 ２、抗原が細胞表面抗原である特許請求の範囲１の方法
   。 ３、抗原がヒトの細胞表面抗原である特許請求の範囲１
   の方法。 ４、抗原がコトの腫瘍抗原である特許請求の範囲１の方
   法。 ５、抗原がコトの細胞表面腫瘍抗原である特許請求の範
   囲１の方法。 ６、抗原が蛋白性の抗原である特許請求の範囲１の方法
   。 ７、抗原が蛋白性の細胞性物質である特許請求の範囲１
   の方法。 ８、選別できる表現型マーカーがステップ（ｂ）に先立
   って予めスクリーニングするための外来の核酸に含まれ
   ている特許請求の範囲１の方法。 ９、選別される表面型マーカーが抗生物質に対する抵抗
   性をコードしている特許請求の範囲８の方法。 １０、免疫学的テストが吸収、免疫的付着、ＥＬＩＳＡ
   、蛍光性抗体、赤血球ロゼット、ＭＨＡ及びそれらの混
   合を構成する群から選ばれる特許請求の範囲１の方法。 １１、コンパテント細胞が真核細胞である特許請求の範
   囲１の方法。 １２、（ａ）ヒトの腫瘍細胞表層抗原をコードしている
   ヒト核酸で細胞を形質転換し、（ｂ）抗原性のヒト腫瘍
   細胞マーカーに特異的で抗原抗体反応を起こす一連のモ
   ノクローナル抗体の１つあるいはそれ以上でヒトの腫瘍
   細胞表面抗原を発現する細胞を直接選別し、（ｃ）免疫
   学的テストを使って抗原抗体反応の程度を検出すること
   を含む細胞に安定に取り込まれたヒト腫瘍細胞表層抗原
   をコードしている核酸の発現を直接選別する方法。 １３、選択される表現型マーカーがステップ（ｂ）に先
   立って予めスクリーニングするための外来の核酸に含ま
   れている特許請求の範囲１２の方法。 １４、選択される表現型マーカーが抗生物質への抵抗性
   をコードしている特許請求の範囲１３の方法。 １５、免疫学的テストが吸収、免疫的付着、ＥＬＩＳＡ
   、蛍光性抗体、赤血球ロゼット形成、ＭＨＡ及びそれら
   の混合からなる群から選ばれる特許請求の範囲１２の方
   法。 １６、形質転換細胞が真核細胞である特許請求の範囲１
   ２の方法。 １７、（ａ）外来の抗原をコードしているＤＮＡでコン
   ピテント細胞を安定に形質転換し、（ｂ）抗原に特異的
   でそれによって抗原抗体反応を起こす一連のｍＡｂのう
   ちの１つかそれ以上で上記の抗原を発現しているかどう
   かを選別し、（ｃ）免疫的手法で抗原抗体反応の程度を
   検出することを含む真核細胞の外来抗原の発現を検出す
   る方法。 １８、抗原が細胞表面抗原である特許請求の範囲１７の
   方法。 １９、抗原がヒトの細胞表面抗原である特許請求の範囲
   １７の方法。 ２０、抗原がヒトの腫瘍抗原である特許請求の範囲１７
   の方法。 ２１、抗原がヒトの細胞表面腫瘍抗原である特許請求の
   範囲１７の方法。 ２２、抗原が蛋白性抗原である特許請求の範囲１７の方
   法。 ２３、抗原が蛋白性の細胞成分である特許請求の範囲１
   ７の方法。 ２４、選択しうる表現型マーカーがステップ（ｂ）に先
   立って予めスクリーニングするための外来の核酸に含ま
   れている特許請求の範囲１７の方法。 ２５、選択しうる表現型マーカーが抗生物質に対する耐
   性をコードしている特許請求の範囲１７の方法。 ２６、免疫的手法が吸収、免疫的付着、ＥＬＩＳＡ、蛍
   光性抗体、赤血球ロゼット形成、ＭＨＡ及びそれらの混
   合からなる群から選ばれる特許請求の範囲１７の方法。 ２７、抗原性の蛋白性産物をコードしている外来のＤＮ
   Ａをとり込んでいる形質転換細胞をスクリーニングする
   方法に使われるモノクローナル抗体。