JPS62285783A - キラー細胞の細胞障害性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔発明の背景〕 発明の分野 新しい工具、手段、技法及び試薬の連続した発展は、不
明瞭な生理学的過程に関する新規問題を問い、そして多
くの場合、その過程の成分及び該成分が作用する手段を
いくらか洞察することケ分子生物学者及び免疫学者に可
能にして来た。すべてのを棺動物が、病原山に対して自
己を守るための能力ｔ−Ｖすることは重要である。補乳
須において、免疫システムは多くの異なった進路に分け
られ、すなわちそｎ；ｆ：れの進路は、異なった防御機
能、異なった成分及び異なった調節の態様を有する。

多くのサブセットが存在するこのキラー細胞は、制限さ
れた又は制限されていない方法で、宿主の正常な細胞と
区別され得る細胞を殺すことかできる。これらの細胞は
、ウィルヌのトランスフェクシ１ン又はトランスダクシ
ョン、悪性形質転換又は同種間宿主力・らの移植（ここ
で、該移植された組織又は器官は、ｌ又はそれよりも多
くの異なった主要組織適合い止Ｃ）クラヌｌ又は宿主か
らの主要組織適合表面抗原を有する〕から生じることが
できる。

天然の生理学的工程を現解し、そして影響を及はすこと
かできることに実質的な興味がある。移植の場合、移植
片拒否反応を阻害する能力は、移植の成功を大きく増大
し、そしてたぶん、供与者のＭ）Ｉｃ抗原と受容者との
間に広い不均衡を与える。

キラー細胞が他の細胞を選択し、そして破壊する過程の
理解は、自己先便疾患の理ｗ４を助け、そして免役応答
を欠いている個人を助けることができるで必るり。

従って、構造遺伝子、該構造遺伝子に関係する調節領域
及び種々の免疫機櫓に関係する該構造遺伝子の発埃缶成
物’ｒ％に、ヒトにおいて同定することが実質的な興味
の対象でめる。診断及び治療に有意な効果をもたらす１
つの手段は、キラー細胞の溶菌過程での遺伝子及び成分
のＭ幼性でめろう。

関連する文献の説明 キラー細胞及びそれらの細胞質体Ｉｓｉ粒から放される
ポリペプチド、そのようなポリペプチドを含有するセリ
ンプロテアーゼ、毒性リンフ才力イン及び細孔を形成す
るポリ−ベルホリンが、キラー細胞の溶菌機構に、包言
されて来た。（ＨｅｎｋａｒＬなど、、４ヨＷａｄ−（
１９８４）１６０ニア５：Ｐｏｄａｃｋａｎｄ　Ｋｏｎ
ｉｇｓｂｅｒｇ、前記（１９８４）　１６０：６９５：
Ｐｏｄａｅｋ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　
（１９８５）６：２１：Ｈｅｎｋａｒｔ、　Ａｎｎ、　
Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　ｉ　１９８５　）３：３１
　：Ｍａｒｔｚ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ
（１９８４）５（９）：　２５４　）。

低及び高分子蓋のセリンプロテアーゼ阻害剤によるＣＴ
Ｌ又はＮＫＫ介標的細胞溶菌の阻害が示されて来た。（
Ｗｒｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｂｏｎａｖｉｄａ　ｉｓ　Ｎａ
ｔｕｒａｌＫｉｌｌｅｒ　Ａｃｈｖ［ｔ　　ａｎｄ　Ｉ
ｔｓ　Ｒａｇｕｌａｔｉｏｎ（ｇｄ。

Ｔ、　Ｈｏ５ｈｉｎｕ、など、　）　Ｅｘｃｅｒｐｔａ
　Ｍｅｄｉｃａ。

Ａｍ５ｔ＠ｒｄａｍ＋　１４５ページ（１９８４）；Ｃ
してこれを引用によりこの明細書中に組み入れる〕。

）ｉａｔｅｈｅｒ、　Ｊ、　Ｉｍｒｎｕｎｏｌ、（１９
７８）１２０：６６５は、刺激されていないヒト末梢血
液リン・９琢からおよ’ｃ　３０　ＫＢの分子量を有す
る細胞障害性セリングロデアーゼヲ１＄離した。Ｐａ５
ｔｅｒｎａｋ　ａｎｄ　Ｅｉａｅｎ。

Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ、　）（１９８５）３１４ニア
４３　ｆ：、ＣＴＬ細胞に対して特異的な２８ＫＤのト
リプシンのようなセリンプロテアーゼを報告した。Ｍａ
ｒｋｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１３６
７　は、細胞仲介細胞障害性に関する一般理論を記載す
る。また１９８６年５月６日に出願されたアメリカ特許
第８６０，０８５号（マウスキラー細胞プロテアーゼを
報告する）も参照のこと。

〔発明の要約〕

活性化されたキラー細胞によって産出され、約２０〜３
０ＫＤの範囲の分子ｉｔを有し、そして他のセリンプロ
テアーゼに類似する、活性部位″電荷リレー１残基金有
することも特徴とするヒトセリンプロテアーゼをコード
する新規ＤＮＡ配列を提供する。キラー細胞の他の成分
と共に対象のヒトセリンプロテアーゼが作用し、細胞溶
菌能力を提供する。

〔特定の態様の記載〕

ヒトキラー細胞によって産出される新規セリンプロテア
ーゼに関連する新規組成物及び方法が提供され、ここで
該組成物は、セリンプロテアーゼの生物学的活性なフラ
グメント、セリンプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼ
への前駆体をコードする核酸配列を含んで成る。他の組
成物は、そのような配列のクローニング及び発現のため
に他の核酸配列に連結された核酸配列を含む。またポリ
（アミノ酸）組成物も冨１れ、そしてこれはセリンプロ
テアーゼの生物学的活性なフラグメント、セリンプロテ
アーゼ、セリンプロテアーゼへの前駆体及び種々の目的
のための他の成分への種々のポリ（アミノ酸ンの接合体
を含む。

本発明のヒトセリンプロテアーゼは、ヒトキラー細胞の
種々のサラセット中に（但し、実質的には低量で）見出
され又は他の種類の細胞中に不在であることによって特
徴づけられる。本発明のセリンプロテアーゼはさらに、
約２０〜３０　ＫＤ　、　　より普通には約２３〜２８
　ＫＤ及び特に２５〜２６　ＫＤの範囲のポリペグチド
分子量を有することによって特徴づけられる。セリンプ
ロテアーゼはさらに、キモトリプシンの活性部位に、類
似する間隔及び配座による活性部位＠電荷リレー１ｔ−
有し、すなわちキモトリプシンに関して観察される場合
と同じように配置されたヒスチノ／、アスノ譬ルテート
及びセリンを有し、そしてトリプシンと同じ位置にトリ
プシン特異性アスパルテートを有することによって特徴
づけられる。本明細書において、間隔とは介在アミノ酸
の数に関する。轡にＭｌ　ｓ　−Ａａ　ｐの間隔は、約
４〜４７個の７ミノ虐、特に４４個のアミノ酸が存在し
、そしてＡｓｐ−８ｉｒ　の間隔は、約９４〜１００＠
のアミノ酸、特に９７個のアミノ酸が存在する。本発明
のセリンプロテアーゼは、Ｓｅｒ残基からＮ−末端に同
かって、約３〜８伽のアミノ酸、特に６個のアミノ酸の
Ａａｐ残基（トリプシンに類似する）を有する。このセ
リンプロテアーゼはさらに、キラー細胞の溶菌２１１程
の一部であることによって特徴づけられる。

天然に存在する本発明のセリンプロテアーゼは、キラー
細胞の多くのサプセ、ト、たとえばキラーで細胞、細胞
障害性Ｔ＋）７／４’球（Ｃ’ＴＬ八いくつかのＴヘル
パー細胞、ｙｃ細胞、Ｋ細胞（外来性細胞に基づいて標
的に抗体を使用する）及びリンフ才力インにより活性化
されたキラー細胞（ＬＡＫ細胞）に見出される。セリン
プロテアーゼの発現は、溶菌機構に関係する６活性化１
遺伝子を示唆する。

本発明のセリンプロテアーゼは、二価カチオン、すなわ
ちエネルギー源を要し、そして低及び高分子証セリンプ
ロテアーゼインヒビター、たとえばα−マクロクロプリ
ン及びダイズトリグシンインヒビターによる阻害に応答
するシステムに含まれる。

本発明のセリンプロテアーゼは、正常な筋肉細胞、肝臓
ａ胞、刺滅されていない末梢血液リンパ球細胞、及び胸
腺細胞並びに多くのＢＭＪＪ胞）４瘍細胞系のような細
胞においては、有意な量で見出されない。

第１図においては、本発明のプロテアーゼのアミノ酸配
列が、マウスキラー細胞のｆロチアーゼのアミノ酸配列
と比較して示されている。タンノクり質の活性酵素部分
内の相同アミノ酸は、対応する領域内のＤＮＡレベルで
７１％〜７７％相同である。全体の相同ＤＮＡは、完全
なコード領域及び３′非翻訳領域が含まれる場合、７２
％である。矢印は、活性１素を生成する切断の部位を示
す。電荷リレーシステムのアミノ酸、Ｈｉｓ　　、Ａｓ
ｐ　　及び５ｅｒ１８４　は星印でそれぞれマークされ
ている。＄でマークされた酸性残基Ａｓｐ　　　は、Ｌ
ｙｓ又はＡｒｇのための基質特異性を決定する。　ＡＡ
ＴＡＡＡポリアデニル化配列は、３′非コード領域にお
いて下ｌｌｌ１を引かれている。Ａｓｎ１４２　で生じ
るＡｓｎ−結合された炭水化物は十でマークされている
。

アミノ酸は、保存性変化によって置換され、そして、非
保存性変化が活性部位から除去される位置に一般的に制
限される。一方を他方のために置換され得るアミノ酸の
グループは、Ｇ、Ａ：Ｖ。

Ｉ、Ｌ：Ｓ、Ｔ、Ｍ：Ｄ、Ｅ：に、Ｒ：Ｎ、Ｑ：及びＦ
約、Ｔ、Ｈを営む。

アミノ酸３０〜アミノ酸７０、よジ好ましくはアミノ酸
４０〜アミノ酸６０のアミノ酸領域が特に興味の対象で
ある。また、アミノ酸９０〜アミノ酸１２０１より好ま
しくはアミノ酸１００〜アミノ酸１１０の領域も興味の
対象である。さらに、約１９０〜２５０、よｐ好ましく
は約２００〜２４０、よシ特定には約２２０〜約２４０
のアミノ酸配列も興味の対象である。上記のフラグメン
トに含まれる、少なくとも１０個のアミノ酸、晋通少な
くとも約１２個のアミノ酸及び約３０個のアミノ酸より
多くない、普通約２０個のアミノ酸より多くない保存さ
れたアミノ酸配列かさらに興味の対象である。これらの
対象領域からのアミノ酸から成るペプチドは、酵素の活
性部位と結合し、そして妨害する抗体１ｒ調製すること
に有用であろう。

本発明のセリンプロテアーゼ又はその油性フラグメント
をコードする、ヌクレオチド配列、すなわちＤＮＡ又は
ＲＮＡのいづれか、より特定にはＤＮＡ配列が、種々の
方法で使用され得る。セリンプロテアーゼのフラグメン
トは、咄乳類細胞に存在する変異されていない又は変異
されたセＩ）／ｆプロテアーゼ存在を検出するためのグ
ローブとして使用され得る。他方、その配列は、生物学
的活性を有するアミノ酸フラグメント又は第１図に示さ
れた配列内に生じる酵素活性を有する延長されたフラグ
メントの発現のために使用され得る。従って、種々の配
列が他のＤＮＡ配列と共に使用され、その示されたＤＮ
Ａ配列のクローニング又は発現のための構造体を提供す
ることができる。従ってそのコード配列は、天然のフラ
ンキング頭載よりも他のフランキング頌域に結合される
。セリンプロテアーゼ全コードする配列は、５　ｋｎｔ
　（キロヌクレオチド）よりも少なく、普通約２ｋｎｔ
よりも少ないであろう。発現のためには、　ＤＮＡ配列
は、調節領域及び天然の領域よりも他の機能的領域に連
結され、約８〜３０個のアミノ酸、よシ普通には約１０
〜２０個のアミノ酸のオリゴペグチド又は少なくとも約
３０個のアミノ酸〜２３５個のアミノ酸、普通約２３３
個のアミノ酸よシも多くなく、時に約２３２１１Ｍのア
ミノ酸よ）も多くないポリペプチドを含む目的とするポ
リ（アミノ酸）が生成され、そしてこれは、完全に天然
に存在するセリンプロテアーゼをコードすることができ
る。

転写の方向において、そのＤＮＡ構造体は、を通。

転写開始領域、開始コドン（Ｍｅｔ）から始まる読み取
り枠及び目的とするペプチド、次に転写終結領域を含む
であろう。その転写開始及び終結価書は１発現宿主にお
いて機能的であるように選択され、そしてその宿主は原
核又は真核生物、ｆｃとえば細独、たとえば月、塑（且
０皿旦）、菌類、たと類細胞、たとえばチャイニーズノ
・ムスターの卵果細胞、ハムスターの腎臓Ｉｖｔ１１胞
２等を含むことができる。クローニング及び発現のため
には、単細胞生物が特に興味の対象である。

発現構造体の他に、該発現構造体を含む宿主の選択を可
能にする１又はそれよりも多くのマーカーが存在する。

マーカーは、耐抗生物質、相補性。

グラーク形成又は同様のものを提供する。宿主中におい
て発現可能な構造遺伝子を含むことができる。

染色体外維持が所望される場合、複製システムの起点が
提供され、そしてこれは宿主中において発現構造体の染
色体外維持を可能にすることができるであろう。染色体
外複製システムは、プラスミド、ウィルス、染色体（セ
ントロメア及び自律複製システム）及び同様のものに由
来する。ある場合１発現構造体が、宿主ゲノム中への組
込みのために、トランスポゾン中に挿入され得る。その
発現構造体を含む細胞は適切な栄養培地中で増殖され、
そして生成管が分泌されるかいづれかに依存し、て、細
胞は溶解され、そして生成物は従来の方法によりて単離
され、又は上清液が単離され。

そして生成物が抽出される。

本発明のペプチドは、広虻囲の種類の目的のために使用
され得る。このペプチドは、ポリクローナル又はモノク
ローナル抗体のａｌｌ！製のために使用され得る。本発
明のセリンプロテアーゼのフラグメントのみが使用され
る場合、そのフラグメントは免疫原に連結され、抗体の
産出のためにを椎動物へ注入され、免疫源性生成物を提
供され得る。

免疫原性タン・９り質は、意図された宿主及びポリクロ
ーナル抗体が遭遇され又はされ得ない宿主に対して外来
性であろう。その免疫原は通常、３０ＫＤよシも大きい
であろう。

大きなペプチドへのバグテン性又は抗原性ペプチドの連
結は、当業界においては良く知られていて、そして種々
の結合群、たとえばホルムアルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、マレイミド安息香酸。

メチルジチオ酢酸、　Ｅｌ１ｍａｎ試薬又は同様のもの
が利用できる。本発明のセリンプロテアーゼの？リペプ
チドフラグメントが免疫原性タンパク質に連結する特定
の方法は、本発明に臨界ではない。

便利な免疫原性タン・量り實はウシ血清アルブミン。

テタヌストキソイド、キーボールリンペットのヘモシア
ニン、ウシβグロブリン及び同様のものを含む。

免疫原により注入され得る種々の宿主は、マウス、ウサ
ギ、鳥、ハムスター又は他の哨乳類、たとえば霊長類、
たとえばヒトを含む。ポリクローナル又はモノクローナ
ル抗体を注入する及び得ることの方法は１文献中に十分
に記載されているので、ここで詳しく説明する必要はな
い。通常、免疫原は、約１：３２〜１：２５６の範囲で
血球凝集反応性力価を十分に生成するために、約０．５
〜５づの体積の免疫感作効果量で、宿主の１又はそれよ
りも多くの部位に注入され、ここで１又はそれよりも多
くの注射が約２〜４週間隔で行なわれる。

最後の注射の後すぐに、宿主から血液を採取し。

そして免疫グロブリンを単離する。

、ｌｅ　ＩＪクローナル抗体のためには、免疫グロブリ
ング、広節囲の種類の方法、特にアフィニティクロマト
グラフィーによって精製され得る。モノクローナル抗体
のためには、肺臓が除去され、そしてハイプリドーマの
産出のために同系の骨髄腫細胞と共に融合され、そして
それは、目的のエピトープ部位に対して特異的な抗体の
産出のためにスクリーンされ得る。

酵素の活性に対する抗体の効果、複合体形成の目的又は
結果及び同様のものに依存して、抗体は中和することが
でき又は中和することができない。

本発明のセリンプロテアーゼに対する抗体は。

／（７ｅｄ？及び±Ｚ炙上ヱの両者に使用される。ヱン
Ｑ使用のためには、抗体は、免疫疾患を抑制し、移植片
拒否反応を抑制し、そして免疫システムを調整する受動
免疫による治療目的のために使用され得る。インビトロ
のためには、抗体は、病理学上の病巣を決定し、器官移
植片の拒否反応を決定し、そして種々の細胞の分化状態
を決定するために、細胞集団の性質を検出する診断目的
のために使用され得る。

本発明のヒトセリンプロテアーゼ及びそのフラグメント
は、それ自体で又は他の物質と共に、診断アッセイにラ
ベルとして使用され得る。たとえば、細胞が溶菌カスケ
ード又はＮＫ又はＣＴＬ細胞の他の抑制性生成物に影響
されやすい場合、セリンプロテアーゼ−含有の細胞が、
骨髄又は細胞の他の混合物から除去される。

本発明の組成物が使用される方法に依存して、それらは
種々の方法で配合され、そして水性培地。

たとえば、緩衝溶液（たとえばリン酸緩衝溶液。

Ｔｒｉｓ緩衝溶液又は同様のもの）に配合され、ここで
その濃度は約０１０５ｍＭ〜約５ｍＭである。他の添加
剤、たとえばタンパク質安定剤、不活性タンパク質、殺
菌剤、静菌剤及び同様のものが存在することができる。

特定の製剤が、その特定の適用に関係して選択されるで
あろう。

製剤は、細胞障害性のための溶菌機構の添加メンバー、
たとえばポリベルフォリンの前、躯体、対象プロテアー
ゼのための活性剤、対象プロテアーゼのだめの基質及び
同様のものを含むことができる。従って、キラー細胞の
分泌顆粒の成分のいくらか又はすべては、粗形で単離さ
れ、そして実質的に純粋な形で対象のセリンプロテアー
ゼと共に使用される。通常、対象のセリンプロテアーゼ
は。

少なくとも９０％のその本来の活性、好ましくは少なく
とも約９５俤のその本来の活性を供給され得る。

本発明の組成物は１種々の方法で使用され得る。

抗体はセリンプロテアーゼのフラグメント又は完全なプ
ロテアーゼから製造され、そしてこれはセリンプロテア
ーゼの酵素機能を中和するように作用する。さらに、セ
リンプロテアーゼは、自殺基質、天然のプロテアーゼイ
ンヒビター、基質の遷移状態の類似体又は他のインヒビ
ターを固定するために作用し、そしてこれは細胞障害性
細胞機能を阻止するために、哨乳類においてＨＦ遺伝子
生成物の活性部位を中和するのに作用することができる
。

セリンプロテアーゼを阻害する能力は、移植片拒否反応
の治療、免疫疾患の治療（ここで、キラー細胞の機能が
病理学的状態を導ひく）及び病理学上の病巣（ここでキ
ラー細胞の数、型又は活性が重要な特徴的症候として働
くことができる）において役立つことができる。

セリンプロテアーゼは、キラー細胞及び天然のキラー細
胞の精製に役立たせるために、ラベルされた基質、たと
えば螢光された又はウンベリフェリルによりラベルされ
た基質の開発に、治療に使用される場合、続く再注入の
ために膨張される前。

プラズマフェレシスによる細胞の除去のために自己免疫
疾患に使用され得る。さらに、チモーゲンペプチド又は
チモーゲンペプチドの結合体及び活性セリンプロテアー
ゼに対する抗体を調製することによって、該抗体は、血
液細胞又は組繊細胞（キラー細胞セットに存在する）の
頻度を固定するための診断用道具として役立つことがで
きる。

さらに、それ自体又はＴ−細胞の細胞溶解過程の他のメ
ンバー（分泌された顆粒の成分を含む）と−緒にセリン
プロテアーゼは、細胞のヱ２！＋１）及びインピメ溶菌
のために使用され１強力な生物学的な精製方法を可能に
する。ヒトセリンプロテアーゼはまた。遷移状態の類似
体及び他の低分子量プロテアーゼインヒビター（好まし
くは、この酵素の活性部位に対して特異的である）を固
定するのに役立ち、それによってＴ−細胞及び／又はＮ
Ｋ細胞障害性を阻害することができる分子を固定するこ
とができる。

以下余白 次の例は、例示的であって、限定的ではない。

ファージｃＤＮＡライブラリィを、フィトヘマグルチニ
ン（Ｐ）［Ａ）により、４日間刺激した後、ヒト末梢血
液リン・−球（ＰＢＬ）から調製した。このり、　Ｇｌ
ｏｖｅｒ）　ＩＲＬ　Ｐｒａａｓ　、　（）ｘｆｏｒｄ
　（１９８４）によって記載されたｅ　ＤＮＡ法の変法
によって、λｇｔ１０中に製造した。２種の変法が存在
し７（：（１）Ｈｏ　ｏｐ　ｓなど、　、　Ｎｕｃｌ、
　Ａｃ１ｄ　Ｒａｍ、　（１９８１）　９　：５４９３
によって記載されているようにして、ス（ルミン沈殿法
とのすべてのフェノール−クロロホルム抽出法の交換及
び（２］過剰のＥｃｏＲＩ　ＩＪンカー及びサイズ分別
性二重鎖ａ　ＤＮＡを除去するために、１％〜２％のア
ガロース水平ダル電気泳動とのＢｉｏｇ＊ｌ　Ａ−５０
ｍカラムの交換。二重Ｌ’１ｃＤＮＡは。

まず０．５Ｋｂよりも長い長さの鎖及び次に０．９５Ｋ
ｂよりも長い長さの鎖のためにサイズ選択された。

その選択されたアがローススライスを、透析パッグ中で
電気浴出し［Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｈｏｄａ　ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８０）　６５　：　３７１１
そしてスペルミン沈殿せしめた。ｅＤＮＡライブラリィ
、ノーザン及び８１分析のためのすべてのＲＮＡを、グ
アニジニウムチオシアネート抽出法（Ｃｈ　ｉ　ｒｇｗ
ｉ　ｎ　ｆｘに。

Ｂｌｏｃｈａｍ、（１９７９）１８　　：　　５２９４
］によって調製し、そしてｐｏｌｙ　Ａをオリゴ−ｄＴ
セルロースにより選択した。

ＰＨＡ　Ｋより刺激されたＰＢＬ　ｅＤＮＡライブラリ
ィの２×１０５組換え体プラークを、マウス血清プロテ
アーゼｃＤＮＡによりスクリーンした。プローブを、Ｍ
ｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌ、前記によって記載してい
るようにしてニックトランスレージ、ンによって虐製し
、そしてそのｃＤＮＡライブラリィを、Ｈｕｎｙｈなと
、、前記によって記載しているようにして、およそ５０
，０００　ｐｆｕ／１５０ｃ１ｎのプレートの密度でプ
レートした。１つのファージを取り、そしてハイブリダ
イゼーションのさらに２つの円形物を通して再スクリー
シ、プラーク−精製されたクローンを得た。そのａ製さ
れ之λファージは、１ウス血清プロテアーゼＨＦ遺伝子
のヒト等童物（ＨｕＨＦと命名された）をコードする１
、３キロベース（ｋｂ）のＦ、ｃｏ　ＲＩ　６ＤＮＡ　
挿入体を含んだ。ノザン分析によって、このｃＤＮＡは
、４日間の同種反応性混合リンパ球培養及びＪｕｒｋａ
ｔ　Ｍ瘍細胞中において生成されたヒ）ＣＴＩｊｆｆｌ
胞に存在する１、３ｋｂのｐｏｌｙ　Ａ−ＲＮＡ種にハ
イブリダイズした。ノザン分析によって、そのＲＮＡば
、正常なヒト筋肉、肝臓、扁桃腺又はリン・−組織に検
出されなかった。

さらに、ＲＮＡは、次の腫瘍：ＫＢ細胞（上咽頭癌）。

ＲＰＭＩ　４２６５及びＮＡ（Ｂ細胞腫瘍）及びＳＳ　
Ｕ（Ｔ細胞）Ｋ検出され得なかった。ＲＮＡドットブａ
ット実、瞼から、そのＲＮＡは、３）１のヒトＣＴＬ同
１重反応性クローン系（ＡＩ　５．１　、　ＡＩｖｌｓ
Ｂ　、　３　、　ＡＭＷ。

６）、刺故されていない、細胞選別されたＬｅｕ１１十
ＮＫ及びＬｅｕ　１ｌ−Ｌｅｕ　４＋ＴＪｊＭ大顆粒リ
ン・９球（ＬＧＬ）　（ＰＢＬからの）中において検出
可能であった。

画鋲のヌクレオチド配列を完全に決定しく但し、５１固
の主なほとんどの４００ヌクレオチドを除く）、単鎖の
読み取り枠を得た（第１図）。第１図において、ヒトｃ
ＤＮＡからのヌクレオチド配列及びアミノ酸翻訳が１ウ
ス配列と整列されている。アミノ酸配列は、推定の活性
酵素の子側されたアミノ末端から引き続いて番号をつけ
られている。矢印は、推定上の切Ｚ１部位を示し、相同
整合体に基づいて千両された活性酵素を生成する。電荷
リレーシステムのアミノ酸、Ｈｌｓ　　＋ＡＳｐ　　及
び５ｅｒ１８’は、星印によりそれぞれマークされてい
る。斗により７−りされた酸性残ｉ！、ＡａＰ”８　は
、他のセリンプロテアーゼから類推して基質の特異性を
決定する。ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化配列は、３′非
コード領域だおいて下線を引かれている。可能性あるＡ
ｓｎ−、Ｊ合された炭水化物は、＋によってマークされ
之Ａｓｎ　　　で生じる。

タン・卆り質配列相同体によって、そのＤＮＡ配列は、
グリコジル化されていない、約２５．８ＫＤのポリ＜グ
チｒ分子量を有する、２３４個のアミノ酸の活性セリン
プロテアーゼをコードする。他のセリンプロテアーゼか
ら類推して、その活性ｖＩｇの先に之ぶん、チモーゲン
ペプチドが存在し、そｎはＬｙｓ（−１）のＣ−末端で
切断される。セリンプロテアーゼ電荷リレー触媒機構の
アミノ酸は、保護され、そして、それぞれ４４及び９２
個のアミノ酸のキモトリプシン忙おける分離と比叡して
。

Ｈｌｓ及びＡｓｐが４４個のアミノ酸によって分離され
、そしてＡｓｐ及びＳｅｒが９７個のアミノ酸によって
分離される。ＨＦセリンプロテアーゼは、　トリノシン
のＡｓｐ　　　に等しいＡ　５ｐ１７　［４残基を含み
、トリプシンのような基質特異性を示唆する。

アミノ酸組成物は、切断されていないプロテアーゼ及び
切断された活性タン・ぐり質について第１表に示される
。

以下余白 第１表 完全なＨｕ式タンノ９り質 切断されていないタンパク質は２６２個のアミノ酸を含
む：Ａｉｍ　　　１３　　　（５，０）　　　Ｌｅｕ　
　　２７　　　　（１０，３）Ａｒｇ　　　１５　　　
（５，７）　　　Ｌｙｅ　　　１９　　　　　（７，３
）Ａｇｏ　　　１５　　　（５，７）　　　Ｍｅｔ　　
　　７　　　　（２，７）Ａａｐ　　　１３　　　（５
，０）　　　Ｐｈｅ　　　　５　　　　　（１，９）Ｃ
ｙｓ　　　１０　　　（３，８）　　　Ｐｒｏ　　　１
３　　　　　（５，０）Ｇｉｎ　　　４　　　（１，５
）　　　Ｓａｒ　　　１８　　　　　（６，９）Ｇｌｕ
　　　１１　　　（４，２）　　　Ｔｈｒ　　　１４　
　　　　（５，３）Ｇｌｙ　　　２２　　　（８，４）
　　　Ｔｒｐ　　　　４　　　　（１，５）Ｈｌｓ　　
　７　　　（２，７）　　　Ｔｙｒ　　　　７　　　　
（２，７）Ｉｔ＠　　　　　１８　　　　　（６，９）
　　　　　Ｖａｌ　　　　　２０　　　　　　　　（７
，６）Ｅｎｄ　　　Ｏ（０，０） 酸　　性（Ａｓｐ　＋Ｇ１ｕ　）　　　　　　２４　　
　　　（９，２）塩基性（Ａｒｇ−１−Ｌｙｍ　）　　
　　３４　　　（１３，０）芳香性（Ｐｈｓ　＋Ｔｒｐ
＋Ｔｙｒ　）　　１６　　　（６，１）疎水性（芳香性
＋Ｉｌｅ＋ Ｌｅｕ＋Ｍｓｔ＋Ｖａｌ）　　８８”””）分子量＝２
８９７２ 活性■ｕＨＦタンパク質　　限界二２９〜２６２切断さ
れたタンノリ質は２３４個のアミノ酸を含む：Ａｌａ　
　　１２　　　（５，１）　　　　Ｌｓｕ　　　２２　
　　（９，４）Ａｒｇ　　　１３　　　（５，６）　　
　　Ｌｙｓ　　　１８　　　（７，７）Ａｓｎ　　　１
４　　　（６，０）　　　Ｍａｔ　　　６　　　（２，
６）Ａｓｐ　　　１２　　　（５，１）　　　Ｐｈｅ　
　　４　　　（１，７）Ｃｙ＋ｖ＋　　　　９　　　（
３，８）　　　Ｐｒｏ　　　１２　　　（５，１）Ｇｉ
ｎ　　　　４　　　（１，７）　　　　Ｓｅｒ　　　１
３　　　（５，６）Ｇｌｕ　　　　９　　　（３，８）
　　　Ｔｈｒ　　　１４　　　（６，０）Ｇｌｙ　　　
２２　　　（９，４）　　　Ｔｒｐ　　　４　　　（１
，７）Ｈｌｓ　　　　７　　　（３，０）　　　Ｔｙｒ
　　　６　　　（２，６）ＩＩｓ　　　１７　　　（７
，３）　　　Ｖａｌ　　　１６　　　（６，８）Ｅｎｄ
　　　　Ｏ（０，０） 酸性（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）　　　　２１　　（９，０）塩
基性　（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ　）　　　　　　　　３１　　
　（１３０２ン芳香性　（Ｐｈｅ＋Ｔｒｐ＋Ｔｙｒ）　
　　１４　　　（６，０，）疎水性　（芳香性＋Ｉｌ＠
＋ Ｌａｕ＋Ｍｅｔ＋Ｖａｌ）　　７５（３２，”分子量＝
２５８２０ その切断された活性ヒ）ＨＦタンノ９り質は、そのアミ
ノ酸の７１−をそのマウス類似体と共有する。これは、
７７％ＤＮＡ類似性を表わす。完全なコード領域及び３
′非翻訳領域が含まれる場合、全体のＤＮＡ類似性は７
２％である。

この明細書に引用されたすべての出版物及び特許出願は
、本発明に関する当業者のレベルを示す。

すべての出版物及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々
の出版物又は特許出願が特【且つそれぞれ引用により組
み入れられて＾ることを指摘されているかのよう７′ｋ
ａ度まで引用によって本明細書に組み入れられている。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のヒトプロテアーゼ及びマウス干う−
細胞プロテアーゼのアミノ酸配列の比較を示すＤＮＡ配
列である。 ＦＩＧ、　Ｉ−１ ＦＩＧ、　ｌ−３ ７９９ＴＣＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣ
ＴＴＡＡＴＣ丁ＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＭＣＡＡＧ
ＴＴＧｅ　　　　　　　ａ５■ ＴＴＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧ
ＴＧＴｃＴＧＡＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡｒＣＡＡＣＴ
Ｔ６優先権主張＠１９８［４５月８日＠米１ｉ（ＵＳ）
＠８ｔ［相］１９８６？：１２月３１日［相］米国（Ｕ
Ｓ）■９・０発　明　者　　ハワード　グー。ジャ　　
アメリカ合名−ンジエンフェルト　　　り、エルム 亡国、カリフォルニア　９４０２５．メン口　パースト
リート１０２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、キラー細胞顆粒成分を実質的に含まないヒトセリン
   プロテアーゼ又は生物学的に機能的なそのフラグメント
   であって、活性化されたヒトキラ−Ｔ細胞の顆粒中に見
   られるセリンプロテアーゼと実質的に同じアミノ酸配列
   を有し、約２０〜３０ＫＤの範囲の分子量を有し、そし
   て細胞溶解性Ｔ細胞の細胞溶解活性の部材であることが
   できることを特徴とするヒトセリンプロテアーゼ又は生
   物学的に機能的なそのフラグメント。 ２、第１図に示されたヒトセリンプロテアーゼのアミノ
   酸配列に関して、少なくとも約９０％保存されるアミノ
   酸配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載のヒトセリンプロテアーゼ又は生物学的に機能的な
   そのフラグメント。 ３、細胞障害性Ｔ細胞中に見出されることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載のヒトセリンプロテアーゼ。 ４、天然のフランキング領域よりも他の領域に結合され
   る、特許請求の範囲第１項記載のセリンプロテアーゼ又
   は生物学的に機能的なそのフラグメントをコードするＤ
   ＮＡ配列。 ５、天然の転写開始領域よりも他の転写開始領域に５′
   −末端で結合されることを特徴とする特許請求の範囲第
   ４項記載のＤＮＡ配列。 ６、転写終結領域にその３′−末端で結合されたＤＮＡ
   配列を含む細胞であって、前記開始及び終結領域が前記
   細胞中において機能的である細胞。 ７、特許請求の範囲第１項記載のセリンプロテアーゼ又
   は生物学的に機能的なそのフラグメントに対して特異的
   な抗体組成物。 ８、前記抗体組成物がモノクローナルであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の抗体組成物。 ９、セリンプロテアーゼ又は生物学的に機能的なそのフ
   ラグメントを産出するための方法であって、転写終結領
   域にその３′−末端で結合されたＤＮＡ配列を含む細胞
   （該開始及び終結領域は該細胞中において機能的である
   ）を増殖し、それによって該ＤＮＡを発現し；そして細
   胞破壊物を含まない前記セリンプロテアーゼ又は生物学
   的に機能的なそのフラグメントを単離することを含んで
   成る方法。 １０、Ｔ−細胞又はＮＫ細胞障害性を阻害することがで
   きる分子を同定するための方法であって、キラー細胞顆
   粒成分を実質的に含まないヒトセリンプロテアーゼ（該
   ヒトセリンプロテアーゼは、活性化されたヒトキラーＴ
   細胞の顆粒中に見られるセリンプロテアーゼと実質的に
   同じアミノ酸配列を有し、約２０〜３０ＫＤの範囲の分
   子量を有し、そして細胞溶解性Ｔ細胞の細胞溶解活性の
   部材である）と前記分子とを接触し；そして前記分子の
   不在下で活性に対するプロテアーゼ活性を測定すること
   を含んで成る方法。