JPS62294601A - １，４−ナフトキノン誘導体を含有する殺鼠組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ｌｌ上立旦ユ遣１ 本発明は、２−りＯロー１．４−ナフトキノン及び密接
に関連したその誘導体を含む殺鼠組成物に関する。本発
明は、本明細書に開示されている化合物を用いて誓歯動
物を殺す方法にも関する。 従来の技術 誓歯動物の撲滅は世界中の多くの地域で問題となってい
る。誓歯動物は人間の食糧を襲うだけでなく、誓歯動物
を媒介してヒト及び家畜の多くの病気が伝染する。誓歯
動物を媒介する病気には、ペスト腺腫、ワイル病、地方
病性発疹チフス、つつが虫病、ロッキー山紅斑熱及び冨
歯動物の尿や糞で汚染された物体に触れたために生ずる
各種サルモネラ性疾患が挙げられる。 鼠ペストを撲滅するために多数の慢性前（ｃｈｒｏｎｉ
ｃ　ｐｏｉｓｏｎ）が開発されてきた。慢性前とは、通
常致死効果を生じさせるために数種の食餌を必要とする
毒である。ある種の慢性前は抗凝固活性を有する。多数
の慢性抗凝固殺鼠剤があり、これらの各殺鼠剤はビタミ
ンに作用に対する拮抗作用を含む一般的な作用モードを
示す。 ビタミンに１は重要な血液凝固補因子である。 ビタミンに１は、カルシウムと結合し得且つト［１ンビ
ンを形成し、よって血液を凝固させる多段階機構に必須
の４種の凝塊タンパク質の合成の際に機能するので、凝
固にかかせないものである。抗凝固剤はビタミンに１の
代謝を阻害して、凝塊因子（ｃｌｏｔｔｉｎｇ　ｆａｃ
ｔｏｒ）のビタミンに一依存力ルボキシル化を抑える。 補因子として作用するビタミンに１がないと、トロンビ
ン形成が抑制され、血液の凝固能力が欠くなり、自発的
出血により死に至ることがありうる。 ビタミンＫに構造的に関連した多数の化合物は抗凝固剤
として作用し得る。なかでも、クマリン環を有する化合
物が有名である。例えば、ジクマロール（臨床的に有効
な抗凝固剤）及びワルファリン（臨床的にまた殺鼠剤と
１）で使用される）が挙げられる。 天然の抗凝固性ジクマロールを殺鼠剤として使用するこ
とはＯ’Ｃ０ｎｎ０ｒによって１９４８年に初めて提案
された（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　１．３３４（１９４８）
　）　、他の４−ヒドロ１シクマリンについても記載さ
れており、そのうちの幾つかはワルファリンよりも有効
である（Ｋｉｒｋ　Ｏｔｈｍｅｒ’ｓ　［ｎｃｙｃｌｏ
ｐｅｄｉａ　ｏｆ　ＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇＶ、　ｖｏｌ、１８，３０２−３２０参照）。上記し
た文献の内容は参照により本明細書中に包含されるもの
とする。 別のタイプの抗凝固性殺鼠剤として、インダンジオンを
ベースとするものがある。これら化合物の幾つかはワル
ファリンあるいは他の４−ヒドロ１シクマリンと同程度
に有効であるが、市販されているものは橿めて僅かであ
る。 ＬＯＷＱｎｔｈａ＋は一連のレポートの中で、ヒドロキ
シクマリンでもインダンジオンでもない競合的なビタミ
ンに拮抗物質も有効な抗凝固剤であると報告している（
Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒ、　１５７
（３）、６７２−８０、１９６７；　［ｘｐｅｒｉｅｎ
ｔｉａ　１６，４２８−９，１９６０；Ｃａｎａｄｉａ
ｎＪｏｕｒｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　４８．　
３９５７−５８．１９７０参照）。 上記文献で言及されている化合物はビタミンに１のメチ
ル基が塩素原子で置換されているビタミンに１類似体、
主に２−クロロ−３−フィチル−１８４−ナフトキノン
である。Ｌｏｗｅｎｔｈａｌの研究は５ｕｔｔｉｅらに
よって引継がれ、５ｃｉｅｎｃｅ、ユ８０．７．１１−
４３．１９７３やＵＳＰ　４，０２１，５６８　　（Ｓ
ｕｔｔｉｅ）に開示されている。 ５ｕｔｔｉｅ′ｈ（開示している殺鼠剤はビタミンに１
の塩素類似体をベースとし、クマリンやインダンジオン
誘導体の抗凝固作用に対して耐性を示す野生うット系統
に対して有効である旨が記載されている。 ５Ｕｔｔｉ８は前記化合物を単独であるいはワルファリ
ンと組合わせて使用することができると述べている。し
かしながら、前記化合物は合成しにくく、化学的に不安
定であることが知られている。従って、前記化合物はワ
ルファリン耐性ラットに対して比較的高い毒性を示すに
もかかわらず、上記したような欠点があるため余り使用
されていない。本明細書に開示されている化合物には、
Ｌｏｗｅｎｔｈａ　ｌや５ｕｔｔｉｅに開示されティる
化合物のようにフィチル側鎖がない。 本発明化合物の１つである２−クロロ−１，４−ナフト
キノンは公知化合物であるが、殺鼠剤としての用途は知
られていない。例えば、ＰｅｒｕＩＱａｌはこの化合物
の比較的簡単な合成法を記載している（Ｔｅｔｒａｈａ
ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　　３３．３０９９−３１０
０．１９７８）。 しかしながら、この文献には化合物の用途は全く記載さ
れていない。 Ｇｕｅｒｉ　Ｉ　１ｏｔ−Ｖｉｎｅｔには、抗ビタミン
に剤のバクテリアに対する活性に関する研究が記載され
ている。この文献には２−クロロ−１，４−ナフトキノ
ンが出血作用を有する旨も記載されているが、化合物に
ついてそれ以上の情報は記載されていないし、この化合
物が殺鼠剤として適しているか否かはこの文献からは不
明である。 出血作用を有する特定の化合物が殺鼠剤として使用でき
るか否かを決定する際には幾つかの因子が考慮される。 例えば、（食）餌もしくは毒餌中での化合物の安定性、
化合物の合成し易さ、化合物のｉｎ　ｖｉｖｏ活性、毒
殺すべき動物に対する化合物の誘引性、ヒトや誓歯動物
以外の野生動物に比較した齧歯動物に対する化合物の選
択毒性度のような因子が考慮される。Ｇｕｅｒｉ　ｌ　
１ｏｔ−Ｖｉｎｅｔには前記化合物の殺鼠剤として使用
可能性については何も記載されていないので、この文献
に基いて前記化合物が殺鼠剤として使用しうろことを予
見することは不可能である。本発明者らの驚くべき知見
によれば、２−クロロ−１，４−ナフトキノン（及び密
接に関連した誘導体）は殺鼠剤としてｉｎ　ｖｉｖ。 で使用ｉ１能であり、この化合物の江」且」及びｉｎ　
ｖｉｖｏ活性はワルファリン及びＬＯＷｅｎｔｈａｌや
ｓｔ＋ｔｔｉＱに記載されているクロロ−に１化合物に
比較して格別顕著である。 （本明細書の実験例に記載されている）ｉｎｖｉｔｒｏ
のラット肝ビタミンに依存カルボキシル化システム（ｒ
ａｔ　ｈｅｐａｔｉｃ　Ｖｉｔａｍｉｎに−ｄｅｐｅｎ
ｄｅｎｔｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）
を使用して、２−クロロ−１，４−ナフトキノンがワル
ファリンよりも４５倍強力であることが判明した。ラッ
トに＋ｆ；　ｍｉ　（ｂｏｌｕｓｄｏｓｅ　）を１回静
脈内投与した２−クロロ−１，４−ナフトキノンのｉｎ
　Ｖ！ＶＱ　Ｊ性テストで、この化合物の急性致死ｆｌ
（ｉ、Ｖ、）は１〜１０００ｎＯ／　Ｋｇであることが
判明した。従って、この化合物は静脈内投与されたりル
フ？リンよりも約２×１０５〜２ｘ１０８倍強力である
（ワルファリンのＬ　Ｄ　５ｏ＝０．２Ｒｇ／　Ｋｇと
仮定して、但しラットにおけるワルファリンのＬＤ５０
は実際には１０〜５０１ｎ９／に９であるから効力の差
はより大きいであろう）。 多くの系統の誓歯動物が既知の殺鼠剤に対して耐性を示
すようになったため、誓歯動物の撲滅のために新規でよ
り有効な薬剤が絶えず求められている。 発明の要旨 本発明の目的は、殺鼠活性を有する新規な組成物を提供
することにある。 本発明の別の目的は、ターゲットの誓歯動物に殺鼠組成
物を投与」ノて奮歯動物を撲滅させる方法を提供するこ
とにある。 上記及びその他の目的は本明細書の記載から明らかとな
るであろう。 本発明の目的は、必須の殺鼠成分が次式を有する化合物
であるＭ歯動物に対して適当な殺鼠組成物を提供するこ
とにより達成される。 上記式中、ＸはＣｊ、Ｂｒ、ＦまたはＩであり、ＹはＨ
，Ｃｊ　、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ　、−８０３Ｈ。 −８ｏ　　Ｎａまたは−８０３にであり、Ｒ１〜Ｒは夫
々Ｈ，ハロゲン、Ｃアルキル。 ４　　　　　　　　　　　１〜６ ０１〜６アルコキシまたは０１〜６アルコキシアルヤル
である。 本発明には、上記化合物のヒドロキノン誘導体が包含さ
れる。前記誘導体は次式を有する。 上記式中、Ｘ、Ｙ及びＲ１−Ｒ４は前記と同義である。 本発明は、上記式を有する化合物を致死量もしくは致死
量以下の看含む飲食組成物を貿歯動物に摂取させるべく
　（ｆｏｒ　ｃｏｎｓｕｔｐｔｉｏｎ）与えることから
なる誓歯動物を撲滅する方法にも係わる。

【図面の簡単な説明】

本発明及び本発明の作用効果をより完全に理解するため
に、図面を参照しながら説明する。 第１図は、ラット随３８（上部パネル）及びラットＮα
４８（下部パネル）における内因性基質のビタミンに一
依存力ルボキシル化の時間的変化を示す図であり、左側
のグラフ中、口は総カルボキシル化、△はビタミンに非
存在下でのカルボキシル化、・は生じたビタミンに一依
存力ルボキシル化を丞し、ビタミンに一依存データにつ
いて非直線最小自乗回帰曲線が示されている。右側のグ
ラフには、積累積速度（ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｃｃｌｌｍ
ｌｊｌａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ）プロットに従って対応プ
ロットが示されている（いずれもｒ＞０．９９０）。 第２図は、ビタミンに一依存力ルボキシル化のｉｎ　Ｖ
ｉｔｒＯ抑制率対抑制率製阻害剤濃度示す図であり、上
部パネルにはラットＮＱ３１におけるワルファリンの場
合、下部パネルにはラットＮｏ、３５における２、６−
ジクロロインドフェノールナトリウムの場合を示す。左
側のグラフには、阻害剤濃度の増加に伴って積累積速度
が低下する（即ち抑制率が珊大する）スロープが示され
ている。直＄１最小自乗回帰曲線が示されている。右側
のグラフには、（対応するシンボルと合せて）抑制率対
濃度がプロットされている。非直線最小自乗回帰曲線も
示されている。コントロール（・）ポイントが右側のグ
ラフにプロットされていないことに注目されたい。 第３図はビタミンに一依存力ルボキシル化のｉｎ　Ｖｉ
ｔｒＯ抑制率対６種のビ１タミンに拮抗物質濃度の関係
を示す図である。調べた拮抗物質は、２．３゜５．６−
テトラクロロビリジン−４−オール（ＴＣＰ）、フェニ
ンジオン、２．６−ジクロロインドフエノールナトリ「
ンム、２−クロロ−１，４−ナフトキノン、２−クロロ
−３−フィチル−１，４−ナフトキノン及びワルファリ
ンである。各阻害剤について代表的な２つのカーブを示
した。非直線最小自乗回帰曲線も示した。 第４図はビタミンに一依存力ルボキシル化のｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ抑制率対抑制率製阻害剤濃度示す図であり、２，
３，５．６−テトラクロロピリジン−４−オール（ＴＣ
Ｐ）　、フェニンジオン、２．６−ジクロ口インドフェ
ノールナトリウム（２，６−ＤＩＰ）、２−クロロ−１
，４−ナフトキノン（クロロ−に３）、２−クロロ−３
−フィチル−１，４−ナフトキノン（クロロ−に１）及
びワルファリン（効力の強い順にリストした）について
調べた。第１表に示した平均パラメータに基いて曲線を
作成した。水平バーは各ＩＣ５ｏの平均モＳ、０．を示
し、付点バーはクロロ−に３、長めのバーはクロロ−に
１に関する。 第５図は、正常、へＮＩＴ−子処置、四塩化炭素子処置
及びフエノバルビタール予処置ラットにおけるプロトロ
ンビン時間−プロトロンビン複合体活性に関する標準曲
線を示す。代表的な直線最小自乗回帰曲線も示した（ｒ
値＞０．９９０　）。 第６図は、正常、四基化炭素子処置及びフエノバルビタ
ール予処置ラットにおけるプロトロンビン複合体（ＰＣ
Ａ）の減成のための一次指数速度定数を決定する図であ
る。各直線最小自乗回帰曲線も示す（ｒの絶対値＞０．
９９０　）。 第７図はｉｎ　ｖｉｖｏでのブレーワルファリンプロト
ロンビン複合体活性（ＰＣＡ”　）とカルボキシル化ビ
タミンに一依存タンパク質のｉｎ　ＶｉｔｒＯでの固有
形成速度（Ｖ／ＫＨ）の関係を示す図である。 図中、φは正常ラット、口はＡＮＩＴ処置ラット及びは
ＣＣｌ４処置ラットにおけるパラメータを示ず。直線最
小自乗回帰曲線も示す（ｒ＝０．７１５［０，０１＜　
ｐ　＜　０．０５］　：τｂ＝０．５００）。 第８図は、プロトロンビン複合体活性の１ｎｖｉｖｏで
の合成速度（Ｒｏ　　）とカルボキシル化ｙｎ ビタミンに一依存タンパク質のｉｎ　ＶｉｔｒＯでの固
有形成速度（Ｖ／ＫＭ　”）の関係を示す図である。図
中、・は正常ラット、口はＡＮＩＴ処置ラット及びはＣ
Ｃｌ４処置ラットにおけるパラメータを示す。直線最小
自乗回帰曲線も示す（ｒ＝０．７８７［０，０１＜　ｐ
　＜０．０５］　　；τｐ＝ｏ、６４３）。 好ましい具体例の説明 本発明では、殺鼠組成物の活性成分として２−クロロ−
１，４−ナフトキノン及び！接に関連したその誘導体を
使用する。また、本発明では、本発明化合物を少なくと
も１種含む組成物を誓歯動物に摂取させるべく与えるこ
とからなる新規な誼歯動物の撲滅方法が提供される。 本発明は、本明細占に２伐されている化合物が有効な殺
鼠剤であるという知見に基づく。本発明化合物は当業者
に公知の方法によって奮歯動物に投与される。口歯動物
が摂取する機会が増えるような任意の成分を化合物と組
合わせてらよい。また、致死効果を高める任意の成分、
例えば（下記の）公知の毒物を化合物と組合わせてもよ
い。 本発明において固体食餌を殺鼠剤と組合わせるべき毒餌
として使用するときには、固体食餌は誓歯動１勿に適し
た任意の食料、例えば砕いたコーン。 コーンミール、各種穀類の混合物（コーン、オート麦、
小麦の混合物）、粉末ミートやミートと穀類の混合物答
であり得る。安全性の点から、誓歯動物にとっては魅力
的ではあるが、子供やベット動物にとっては魅力的でな
い穀類ベースを毒餌として使用することが好ましい。最
終の毒餌混合物はそのまま使用されるか又は当業界で一
般的な方法に従ってペレット化もしくは成形される。 食料は液体であっても半固体であってもよい。 液体は殺鼠化合物と反応せず且つ冨歯動物が摂取するの
に適した液体であればよい。水、ミルク。 シロップ、ＴＩＡ味付炭酸飲料等が使用される。半固体
としては、脂肪質、ガムベースもしくはゼラチン質材料
、例えば動物性脂肪、炭水化物ガム等が挙げられる。 誓歯動物とは、コルデータ（Ｃｈｏｒｄａｔａ）門に属
するをａ動物を指す。撲滅が望まれる最も重要な有害動
物（１）ｅＳｔ　５ｔ）ｅＣｉ（３３）は、哺乳類網、
誓歯目に馬する。本発明で特に撲滅が望まれる誼歯動物
は、クマネズミ（ｂｌａｃｋ　ｏｒ　５ｈｉｐ　ｒａｔ
）［Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓｌ、エジプトネズミ［
Ｒａｔｔｕｓ　ａｌｅｘａｎｄｒｉｎｕｓ　］　、Ａツ
カネズミ［）ｌｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ］　、ドブネズ
ミ［ＩｔａｔｔｕＳｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ　］及び南東
アジアのオニネズミ［Ｂａｎｄｉｃｏｔａ　ｂｅｎｇａ
ｌｅｎｓｉｓ　］である。生育中の作物を襲ったり牧場
を台無しにする動物の中には、ハタヶネズミ、ポリネズ
ミ、リス（ｇｒｅａｔ　ｔｒｅｅｓｑｕｉｒｒｅｌ、　
ｇｒｏｕｎｄ　５ｑｕｉｒｒｅｌ）も含まれる。ある種
のウサギも含まれる。最も一般的には、ラット又はマウ
スが撲滅（毒殺）させたい貿歯動物である。 ターゲットの誓歯動物に対して有効な本発明化合物の量
は、種々の量の物質を誓歯動物に与え、所定の適当な期
間が経過侵有害な効果（例えば死亡、衰弱）が現れるか
否かを観察することによりｉｎ　ｖｉｖｏで簡単に決定
することができる。慢性中毒量の殺鼠剤が含まれている
ときには、所要期間は数日のオーダ（即ち２〜１０日、
通常約３〜５日）であろう。急性中毒但が含まれている
ときには、正確な投与量に応じて数分（即ち１〜３０分
）で効果が現れるであろう。 一般に、殺鼠剤を慢性毒物として使用するときの殺鼠化
合物の１間％は、固体食餌もしくは液体に対して０．０
０００１〜ｏ、ｉｗｔ％である。好ましくは、固体食餌
もしくは液体に対してｏ、　ｏｏｏｓ〜０．０５ｗｔ％
である。より好ましくは、固体食餌もしくは液体に対し
て０．００１〜０．０１ｗｔ％でる。 本発明化合物は構造的に上記の如く定義される。 Ｒ−Ｒ４は夫々炭素数１〜６のアルキルであり、直鎖９
分岐鎖もしくは環式アルキル、例えばメチル、エチル、
プロピル、イソプロピル、ブチル。 イソブチル、　５ｅｃ−ブチル、ヘキシル及びシクロヘ
キシルであり得る。また、Ｒ−Ｒ４は炭素数１〜６のア
ルキコキシであり、例えばメトキシ、エトキシ、プロポ
キシ、イソプロポキシ、ブトキシ。 ５ｅｃ−ブトキシ、ペントキシ及びシクロヘキシルオキ
シ等であり得る。更に、Ｒ−Ｒ４は炭素数１〜６のアル
キコキシアルキルであり、例えばＣＨ３−０−ＣＨ２−
、ＣＨ３ＣＨ２−０−ＣＩ−１−ＣＨ−、ＣＨＣＨ２Ｃ
Ｈ２−０−ＣＨ２−並びに分岐鎖及び／又は環式誘導体
であり得る。上記した各基は最高３個のハロゲン、アミ
ノ、ヒドロキシル基及び／又はケト部分で置換されてい
てもよい。 ＸはＣＦ、ＢｒまたはＦである。Ｙは）−１，ＣＩ。 Ｂｒ、Ｆ、１．−８ｏ３Ｈ，−３０３Ｎａ及び−８０３
Ｋから選択される。 これらの基を存在させてＲ終化合物の溶解度を調整して
もよい。例えば、所望ならば、側鎖をアミノ基及びヒド
ロキシル基で置換して水に対する溶解度を高めることが
できる。 好ま（）い具体例では、Ｒ１−Ｒ４の少なくとも３個が
水素である。より好ましい具体例では、Ｒ１−Ｒ４及び
Ｙが水素である。 本発明に包含される化合物は次の通りである。 ２−クロロ−１，４−ナフトキノン；２−クロロ−１，
４−ナフトヒドロキノン；２−ブロモ−１，４−ナフト
キノン；２−ブロモ−１，４−ナフトヒドロキノン；２
−フロ［］−１，４−ナフトキノン；２−フロロ−１，
４−ナフトヒドロキノン；２−ヨード−１，４−ナフト
キノン及び２−ヨード−１，４−ナフトヒドロキノン： 本発明にＪ３いて最も好ましい化合物は２−クロロ−１
，４−ナフトキノンである。 本発明化合物は公知の方法によって合成され得る。２種
の適当な方法がＢｒａｔｔ及び５ｕｓｃｈｉ　ｔｚｋｌ
／。 Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、１６．　Ｐｅｒｋｉｎｓ
　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　１，１６８９−１６９３　
（１９７３）並びにＰｅｒｕｍａｌ、　ｔｌ−びＢｈａ
ｔｔ。 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔｅｒｓ、Ｎｏ、３３
．３０９９−３１０　（１９７９）に記載されている。 上記文献の内容は参照により本願明細書に包含されるも
のとする。上記した２種の文献には、２−クロロ−１，
４−ナフトキノン誘導体の合成が記載されている。他の
２−ハロゲノ誘導体も、適切なハロゲン化出発物質を使
用して同様にして合成され得る。 ナフトヒドロキノン類は、ｔｏｗｅｎｔｈａ＋、　Ｃａ
ｎ、　Ｊ。 ＣｈｅＩＩｌ、　、　４８．３９５７−３９５８．１９
７０　（この文献の内容も参照により本願明細書に包含
されるものとする）に記載されているように、２−クロ
ロ−３−フィチル−１，４−ナフトヒドロキノンの合成
と同様の方法で合成される。重亜硫酸塩付加物（Ｙ＝−
８ｏ３Ｈ。 −８Ｏ３Ｎａまたは−５Ｏ３Ｋ）は、Ｍｅｎｏｔｔ＋。 Ｊ、　Ａｍ、　ＣｈｅｃＳｏｃ、、　６５．１２０９−
１１（１９４３）に報告されている方法により製造され
得る。他の求核物質との生成物も本発明に包含される。 更に本発明は、水和化合物例えば本発明化合物のモノ、
セスキ。 ジ及びトリ水和物も包含する。 文献に記載されている方法やその後これら化合物の合成
のために開発された方法を使用することもできる。 本発明の食餌組成物は、上記した化合物を溶媒に溶解さ
せた後溶媒を食餌組成物に添加して製造される。または
、単に食餌組成物に未溶解化合物を補給するだけでも製
造される。他の殺鼠剤に本発明の殺鼠剤を配合してもよ
い。 他の殺鼠剤としては、本明ａａに記載されているもの又
はＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ’ｓ　　［、ｎｃｙｃｌｏｐ
ｅｄｉａ　ｏｆＣｈｅａｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、Ｖｏｌｕｍｅ　１８，３０２−３２０（１９８１）
にリストされているものが例示されている。他の殺鼠剤
を本発明化合物の１種もしくはそれ以上と組合わせて使
用するときには、本発明化合物の１種もしくはそれ以上
の粗分は食餌組成物の総量ａのｏ、　ｏｏｏｏ１〜０．
１％である。より好ましくは、０、０００５〜０．０５
％テアル。最も好ましくは、０．００１〜０．０１％で
ある。 他の成分を本発明の食餌組成物に配合してもよい。例え
ば、発香誘引性（ｏｄｏｒ−ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）化
学物質のような各種誘引剤、殺菌剤、結合剤、酸化防止
剤、甘味剤、充填剤及び伯の不活性成分を本発明の食餌
組成物に配合してもよい。この種の成分は当業界で公知
である。 本発明の活性化合物が食餌組成物中に前記した重分％含
まれているならば、食餌組成物が任意のｗｔ％の液体成
分を含んでいてもよい。液体成分は、水、低級アルコー
ル、ミルク、（ｌ！！の有機溶媒、水と有機溶媒との混
合物、甘味飲料等である。 本発明方法は、前記した食餌組成物を調製してターゲッ
トの誓ｉ動物にとって魅力的な形態に処方することを含
む。特殊な食餌組成物の大きさ及び形は、当業者に公知
の、殺鼠材料を分配するのに魅力的であり且つ適当なも
のであればよい。 以上本発明を一般的に説明してきたが、以下幾つかの非
限定的実施例を参照しながら更に説明する。これら実施
例は本発明の具体例を示すためのものであって、これら
によって本発明が限定されないことは自明である。 （以ト余白） 実験例 ビタミンに１　（フィロキノン；フィトナジオン：２−
メチル−３−フィチル−１，４−ナフトキノン）は、止
血系の４種の典型的なビタミンに一依存タンパク質（Ｖ
ｉｔａｌｌｌｉｎ　Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ）における特殊なグルタミル残塁の翻訳後ガン
マ−カルボキシル化に対する補因子である（ＣＲＣＣｒ
ｉｔ、　ＲｅＶ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、８，１９１−２
２３；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　　Ｃｅ１ｌｕｌａ
ｒ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、３８．７７−１２１及び３９゜
１９１−２０７；　Ｄｒｕｑｓ　ａｎｄ　　Ｎｕｔｒｉ
ｅｎｔｓ　　ＴｈｅＩ　ｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ　　Ｅ　
ｆｆｅｃｔｓ、４２９−４７３）。他のグループの研究
から、ラット肝ミクロソーム系がビタミンに一依存力ル
ボキシル反応の研究に有用であることが判明している。 アツセー法ではビタミンに一依存力ルポキシラーゼの基
質として、合成ベブチｔ’　（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃ
　ｈｅｍ、２５１．５８２７−５８３０；Ｆ　Ｅ　Ｂ　
ＳＬ　ｅｔｔ、７５，２２６−２３０）　又ハビタミン
に欠乏食ｆｉｌヲ接取中もしくはワルファリン投与後ラ
ット肝に蓄積する内因性先駆物質（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ
、ｃ　ｈｅｍ、２５０．４７４４−４７４８）を使用し
た。ラット肝ミクロソーム系を利用してビタミンに一依
存力ルボキシル化の各種特性及び要件について多くの研
究がなされているが、前記系はビタミンに拮抗物質とし
て作用する抗凝固剤の生化学的薬理学的研究手段として
余り利用されてはいない。ワルファリンの研究では、清
浄剤を含まないミクロソーム系（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ。 ２５１　、２７７０−２７７６）及び清浄剤を溶解した
ミクロソーム系（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７，
１３７１−１３７１）を用いて内因性基質のビタミンに
一依存力ルボキシル化の抑制パーセンテージを単一時間
（ｓｉｎｇｌｅ　−ｔｉｍｅｐｏｉｎｔ）測定している
。溶解系におけるワルファリンの効率はかなり悪い。抗
凝固剤の効力の比較データでは、清浄剤を含まないミク
ロソーム細胞質ゾル系におけるプロトロンビン合成抑制
率を２段階プロトロンビン時間アッセーを用いて各種ク
マリン及びインダンジオン抗凝固剤と比較している。 これらのビタミンに拮抗物質の効力は次のようにランク
付けられる。３−フェニル−４−ヒドロキシクマリン〉
フェニンジオン〉ジクマロール〉クマテトラリルニマル
クマ−（ｍａｒｃＯｕｆｆｌａｒ）ｚインダンジオン〉
　４−ヒドロキシクマリン＞８　（−）ワ　、ルファリ
ン＞Ｒ（・ト）ワルファリン（Ｂ　１Ｏｃｈｏｎ＋。 Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒａｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、７２，
６１９−６２５　；　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。 Ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌ、３０．１９５３−１９５８）。 ｉｎ　ｖｉｔｒｏのビタミンに一依存力ルボキシル化に
関する研究から得られた抗凝固剤の効力の比較データは
、各種クマリン及びインダンジオン化合物については有
用でない。 下記実験の第１の目的は、内因性基質を用いてｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏのラット肝ミクロンームビタミンに一依存力ル
ボキシル化を定１化するために再現可能な動力学的方法
（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ）を開発することにあ
り、加えて特定のビタミンに拮抗物質について濃度と抑
制率の関係を調べることにある。拮抗物質は各種グルー
プの化学物質から選択された次のものであった。 ワルファリン（クマリン）、フェニンジオン（インダン
ジオン）、２−クロロ−１，４−ナフトキノン及び２−
クロ０−、−３−フィチル−１，４−ナフトキノン（夫
々ビタミンＫ　及びに１の塩素化同族体）、２，３，５
．６−チトラクロロビリジンー　４−オール（実験的殺
鼠剤）及び２．６−ジク１コロインドフエノールナトリ
ウム（強力なりＴジアフォラーゼ阻害剤）。これらの化
学的に代表的な拮抗物質は、ビタミンに一依存力ルボキ
シル化の調部機種の選択的撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉ
ｏｎｓ）ヲ特徴付ケル際に有用な手段として作用する。 下記実験の第２の目的は、内因性基質を用いるミクロソ
ームビタミンに一依存力ルボキシル化のｉｎ　Ｖｉｔｒ
Ｏ９１３力学的パラメータと循環ビタミンに一依存凝…
囚子の１ｎｖｉ′Ｊｏ血漿活性及び生成速度との間に関
連があ０か否かを調べることにある。そのような関連の
存在から、ビタミンに一依存凝固タンパク質の合成を調
節する機構が示唆されるであろう。 礼−上 ＯＣ８及びＮＣ８はＡｍｅｒｓｈａｍ　ＣＯｒｐＯｒａ
ｔｉＯｎ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　　Ｈｅ１ａｈｔｓ、　
　ＩＬ）から入手した。 １４Ｃ−重炭酸ナトリウム（比活性・・４１−５４　ｍ
ｃ　ｉ／ｍｍｏりはＮ　ｅ＊　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　
Ｎ　ｕｃｌｅａｒ　（Ｂ　ｏｓｔｏｎ。 ＭＡ）又はＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
から入手した。 ワルファリン、フェニンジオン、２，６−ジクロロイン
ドフェノールナトリウム（２，６−Ｄ　Ｉ　Ｒ）　。 α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮ　ＩＴ＞。 ＮＡＤＨ，ホスホクレアチン、ＡＴＰ、クレアチンホス
ホキナ−ぜ及びＴｗｅｅｎ　ａｏはＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、　（Ｓｔ、　　Ｌ　ｏｕｉｓ、　ＭＯ
）から入手した。ジチオトレイトールはＢ　ａｃｈｅｍ
（Ｔ　ｏｒｒａｎｃｅ。 ＣＡ）から入手した。フェノパルビタールナトリウムｕ
、ｓ、ｐ、はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、　Ｉ　ｎｃ。 （Ｐ　ａｒｉｓ、　Ｋ　Ｙ　）から入手した。Ａｑｕａ
ＭＥＰＨＹＴＯＮ　（ＭＳＤ、Ｗｅｓｔ　Ｐｏｎ１ｔ、
ＰＡ）　はビタミンに源として使用した。２，３，５．
６−テトラクロロビリジン−４−オール（ＴＣＰ）及び
２−クロロ−１，４−ナフトキノン（クロロ−に３）は
公知の方法（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、Ｎｕｍｂｅｒ
　１６．　ＰｅｒｋｉｎｓＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　　
１，１６８９−１６９３　；　　ＴｅｔｒａｈｅｄｒＯ
ｎｌ　ｅｔｔｅｒｓ、　Ｎｕｍｂｅｒ　３３．３０９９
−３１００）に従って合成した。２−クロロ−３−フィ
ヂルー・　１．４−ナフトキノン（りＯローに１）はＬ
　０Ｗｅｎｔｈａｌ及びＣｈｏｗｄｈｕｒｙ（Ｃａｎａ
ｄ、　　Ｊ、　　Ｃｈｅｍ、４８．３９５７−３９５８
）に従ってその他（Ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ
　　ＲａｔＨｅｐａｔｉｃ　　Ｖ　ｉｔａｍｉｎ　　Ｋ
　−Ｄ　ｅｐｅｎｄｅｎｔＣａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ
、　　Ｄｏｃｔｏｒａｌ　　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ
。 Ｄｕｋｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）に記載されている
如く変更して合成した。その他の試薬は全て分析試薬グ
レードの市販品であった。 動物 体重２００−４５０ｇの成熟１１ｔ　Ｓ　ｐｒａｇｕｅ
−［）　ｏｗｌｅｙラット＜Ｃｒｌ：　ＣＤ”　　（Ｓ
Ｄ）ＢＲ異系交配ラット、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ
　Ｃｏ、、　Ｗｉｌｍｉｎｏｔｏｎ　、　ＭＡ）を夫々
、一段と高い金網フロアを有するポリカーボネートケー
ジに収容した。水は自由に摂取させた。食餌ベレット（
Ｒａｔ　　ＣｈＯＷ　５０１２．　Ｒａ１ｓｔｏｎＰｕ
ｒｉｎａ　Ｃｏ、、　Ｒ１ｃｈｒｏｎｄ、　Ｉ　Ｎ　）
も、屠殺の２０〜２２時間前から始まる熱良期間前には
自由に抜取させた。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究のために、屠
殺前約１９時間２ＩＱ　／　ＫＦｊのワルファリンナト
リウムを（軽くエーテル麻酔をかけながら尾静脈に）静
脈内投与して薬理学的ビタミンに欠乏状態を生起さけた
（　Ａ　ｎｎａｌｅｓ　　Ｍ　ｅｄｉｃｉｎａｅ　　Ｅ
　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ　ｅｔＢ　１ｏｌｏａｉ
ａｅ　　Ｆｅｎｎ１ａｅ　　４３　　（５ｕｐｐ、３　
　）　　、１−９９＞　　。 この合成阻害隋のワルファリンによって、屠殺峙の血漿
プロトロンビン複合体活性は正常の約６％となるであろ
う（Ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　　ＲａｔＨｅ
ｐｔａｔｉｃ　Ｖｉｔａｍｉｎ　　Ｋ−Ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔＣａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ、　Ｄ　０ＣｔＯｒａ
ｌ　Ｄ　１ｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ。 Ｄｕｋｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）　、　館記したビ
タミンに欠乏の薬理学的状態は十分に特徴付けられてお
り（Ａ　ｒｃｈ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂ　１ｏｐ
ｈｙｓ、　１５０．９１−９５及び１９１．５７１−５
７７）、発現まで最低１０日を要する食餌ビタミンに欠
乏に凹敵するものである（　Ｐ　ｒｏｃ。 ＳＯＣ，ＥＸＤ、　　Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、１０１．　４
６７−４６８　　）。 ビタミンＫ・−依存力ルポキシラーゼのｈ′成ビタミン
Ｋ・−依存力ルポキシラーゼの作成方法及びカルボキシ
ル化のアッセ一方法は、他の研究文献（Ｊ　、　Ｂ　ｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５１．２７７０−２７７６　；３
　ｉｏｃｈｉｍ、　　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　
４９９、１８１−１９３）に記載されている方法と同様
であった。各動物をコントロール状態と抑制状態で研究
した。ラットを窒素を用いて無意識状態とし、肝をすぐ
に切除し、肝１ｇ当り２．０−の水冷緩衝液１　（０，
２５Ｍシミ糖、０．０２５Ｍイミダゾール、１）８７．
２０）中に切刻んだ。肝を４個のテフロン乳棒パス（ク
リアランス０．１５−０．２３ｍｍ；　Ａｒｔｈｕｒ　
Ｈ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｃｏ、。 Ｐ　ｈｉ　１ａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐ　Ａ　）を用い３
００ｒｐｍでホモジナイズした。ポスト−ミトコンドリ
ア上清及びミクロソームベレットを公知の方法ＬＪ、Ｂ
ｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、２５１．２７７０−２７７６）　ニ従ッＴ　
１　造Ｌ　ｔｃ。ミクロソームベレットを緩衝液Ｉ［（
０，２５Ｍシｄ糖、０、０２５Ｍイミダゾール、０．０
８０Ｍ　Ｋ　Ｃρ、ｐＨ７，２０）中に再懸濁させた。 この懸濁液を酵素（ビタミンに一依存力ルポキシラーゼ
及びビタミンに生体内変換用酵素）並びに内因性基質（
ビタミンに一依存タンパク賀の先駆物質）に供給した。 ミクロソーム懸濁液のタンパク質濃度をＢｉｂ−Ｒａｄ
試薬について記載されている如き３　ｒａｄｆｏｒｄの
方法（Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　７２．２４
１２５４）により測定し、緩衝液■巾約１５４ｔ９／−
に調整した。 ビタミンに一依存力ルボキシル　の　ツセー各実験で゛
コントロール、ブランク及び実験用反応混合物を作成し
た。コントロール及びブランク反応混合物は夫々ビタミ
ンＫを用いて或いは用いずに作成した。実験反応混合物
にはビタミンにとビタミンに拮抗物質の両方を含有させ
た。コントロールの反応混合物は、ミクロソーム懸濁液
３，００ｄ、緩衝液ＩＩＯ，８１厩、ＡＴＰ−発生系（
最終ｆ４度：１１１１Ｍ　　ＡＴＰ、　１０１１１Ｍホ
スホクレアヂン、　２．５ｍＭＭＣｌ　　［７ｔ’テｈ
１２　・４Ｈ２０，２０１１９／ｌｎｌ’）レアチンホ
スホキナーゼ［５２ＬＪ／ｄ］　）　１．２０ｄ。 ＮＡＤＨ（最終濃度２ｍＭ　）　０．６０ｍ　、緩衝液
■に溶解させたジチオトレイトール（最終濃度７ｍＭ　
）０．３０ｄ、　Ｎａ　ＨＣｏ３（１，０μＣｉ　／Ｌ
Ｎ　：反応開始０．５分曲に添加）　　０．０６０＃ｌ
ｉ２及び０．８５％塩化ナトリウム溶液に希釈したビタ
ミンに１　（ｉ終濃度２０／１１１９／ｄ：反応開始時
に添加）　　０．０３０７から構成させた。このビタミ
ンＫ１１度は、転化されたＨ１４ＣＯ３がビタミンに２
−依存１Ｍタンパク質にｉｎ　ｖｉｔｒｏで取り込まれ
る最大量と結びついている（　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、２５１．２７７０−２７７６）　、ブランク
の反応混合物は、ビタミンＫを同容量の等仮性食塩水で
置換した以外は同一・成分から構成させた。 実験用反応混合物は、 １）！ＩＩ液■を同−容１のビタミンに一依存カルボキ
シル化阻害剤を含有する緩衝液で置換させた；２）各成
分の客用を全てコントロールの反応混合物の場合の２／
３とした； 以外はコントロール反応混合物と同一であった。 ＴＣＰ、フェニンジオン及びワルファリンのナトリウム
塩は水酸化ナトリウム水溶液の形態にあり（Ｊ　、　Ａ
　ＩＩｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ　ｏｃ、８３．２６７６−
２６７９）　、本実験で使用した全陰る濃度で緩衝液■
に可溶性であった。クロロ−に１はＴ　ｗｅｅｎ８０を
用いて水中油型エマルジョン（最終ｍＢ　５％Ｖ／Ｖ）
として、クロロ−に３はＴ　ｗｅｅｎ８０中の懸濁液（
最終濃度５％Ｖ／Ｖ）として作成した（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｃ＋ｙ　１０゜３７３−
３８０　）。 反応混合物を２７℃の往復振盪水浴を用いて３０行程／
分の゛割合で５分間インキュベートした。ビタミンＫ又
は食塩水を添加後、コントロール及びブランクの反応チ
ューブのときには２，４，６，８，１０，１２゜１４、
１６．３０．６０．９０．１２０分に、実験用反応チュ
ーブのときには２，４，６，８，１０，１２，１４．１
６分にサンプル（各々０．４５ｍ）を採取した。各０．
４５ｄのサンプルを氷冷１０％ＴＣＡ　１戒を収容する
チューブに移した。 次イＴ’、前記シタ如＜　（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈ
ｅｍ、２５１゜２７７０−２７７６）　Ｔ　ＣＡ−沈降
１４Ｃ−含有タンパク質ベレットを作成し、クエンチン
グ補正の外部標準法を用いたインターテクニック（Ｐ　
Ｉａｉｓｉｒ。 ＦｒａｎＣｅ）液体シンチレーシコンスペクトロメータ
で放射能を測定した。 カルボキシル　−−の 各サンプルのビタミンに一依存力ルボキシル化を、［ビ
タミンに一含有反応チューブにおけるミクロソームタン
パク質１ｊ１ｇ当りの取り込まれた”Ｃｄｐｍ（ｄａｍ
／ＩｙＪ）　］マイナス［対応のブランク反応チューブ
においてのｄｐｍ／ｌｌ１ｇ］として算出した。 ２時間の観察時間に亘るビタミンに一依存力ルボキシル
化の時間的変化は、−次指数関数Ｐ＝Ｐｏ。 （１−ｅｘｐ［−Ｋｔｌ）により十分説明付けられる。 なお、パラメータＫ及びＰ。０を概算するためにＭ　ａ
ｒＱｕａｒｄｔの非直線回帰算法（Ｓ　ＩＡＭ　　Ｊ、
　１１゜４３１−４４１）を使用した。前記式において
Ｋは一次速度定数であり、ｔはインキュベート時間、Ｐ
はビタミンに一依存力ルボキシル化のｄｐｍ／Ｉｒｒｇ
、ＰｏＯはＰの漸近値である。ラット、牛及び馬のビタ
ミンに一依存力ルボキシル化系における観察結果と同様
に（Ａ　ｒｃｈ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　ｉ＊ｐｈ
ｙｓ、　１９１，５７１−５７７；Ｂ　１ｏｃｈｉｎ＋
、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　７１４．３６１−
３６５；Ｔ　ｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、２８．　１７１−
１７７）、Ｐｏｏはｉｎ　ＶｉｔｒＯでのビタミンに一
依存力ルボキシル化に利用されうる内因性基質の最大量
である。 ビタミンに一依存力ルボギシル化はラット肝カルボキシ
ラーゼの内因性基質に対して不飽和状態にある（　Ａ　
ｒｃｈ、　Ｂ　１Ｏｃｈｅｔｎ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、
　１９１．５７１−５７７及びＢｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　ｃｏｍｍｕｎ、ａｅ。 ５００−５０７）ので、記載されている反応条件下での
内因性基質カルボキシル化の速度論（動力学部）は明ら
かに一次である。この速度次数（ｋｉｎｅｔｉｃｏｒｄ
ｅｒ）では、基質限定形態の積分されたＭ　１ｃｈａｅ
ｌ　ｉｓ　−Ｍ　ｅｎｔｅｎ式（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏｃ＋ｙ　６３．１５９−１８３）、
即ちＩｎ（Ｐ　　／［Ｐ　　−ＰＩ）対ｔに従って直線
的なプロットを示ず。この積累積速度プロット（ｐｒｏ
ｄｕｃｔ　ａｃｃｕｍｕ−１ａｔｉＯｎ　ｒａｔｅ　ｐ
ｌｏｔ）のスロープはＶ／ＫＨ１，：等しい（Ｍｅｔｈ
ｏｄ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｏｙ　６３，１５９−
１８３）。 ・−１ ■７ＫＨの値はｍａｎ　　の単位で報告され、Ｐｏｏの
値はｄｐＨｌ／ｌｌＩ！Ｆで報告されている。正規化さ
れたＰ　値は、計重量及びミクロソームタンパク質の改
組の動物間差異を調整すべく各ラットで得られたミクロ
ソームタンパク質の量で割り算して算出した。 ビタミンに一依存力ルボキシル化の抑制率は、積累積速
度プロットのスロープのコントロールスロープからの差
異として算出される。但し、各ス［コープはｙ切片をＯ
として直線最小自乗回帰により算出された。 濃度一応答関係は、各動物についての抑制率（Ｉ）対抑
制濃度（Ｃ）のデータを次式の算定式（Ａｎ＋ｅｒ、Ｊ
、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、２３５．　Ｅ９７−Ｅ１０２　）
に合ではめて算出した。 上記式中、ＩｏはＣ＝Ｏのときの抑制率であり、■　　
は最大に達しうる抑制率であり、Ｉｃ５ｏはａｘ ５０％抑制率を示すときの抑制濃度であり、Ｓはスロー
プパラメータである。この非直線的回帰は、Ｍ　ａｒｑ
ｕａｒｄｔ算法（Ｓ　Ｉ　Ａ　Ｍ　　Ｊ　、１１，４３
１−４４１）によりＴｅｋｔｒｏｎｉｘ４０５２　Ｄン
ピュータ（Ｂ　ｅａｖｅｒｔｏｎ。 ＯＲ）を用いて行った。 側ｖｉｖｏ旦１ ビタミンに一依存力ルボキシル化のｉｎ　ｖｉｔｒｏ速
度とプロトロンビン複合体活性（ＰＣＡ）のｉｎｖｉｖ
ｏ合成速度とＰＣＡの定常レベルとの考えられうる関連
を説明すべく研究した。４０匹の正常ラットにおいてカ
ルボキシル化ビタミンに一依存タンパク質のｉｎ　Ｖｉ
ｔｒＯ固有形成速度（Ｖ／にＨ）が比較的狭い範囲の値
を示した［四分位範囲＝０．０８９６−０．１２３４　
ｗｉｎ−’　（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏａｙ　ｏｆ　　Ｒ
ａｔＨｅｐａｔｉｃ　　Ｖ　ｉｔａｍｉｎ　　Ｋ　−Ｄ
　ｅｐｅｎｄｅｎｔＣａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ、　Ｄ
ｏｃｔｏａｌ　　Ｄ　１ｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ。 Ｄｕｋｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｔｙ）　］ことから、こ（Ｄ
パラメータとｉｎ　ｖｉｖｏのＰＣＡ合成速度との関連
を正常ラットと肝機能障害ラットについて研究したなら
ば上記関連をかなり広い範囲のｖｌＫＨ値に亘って説明
することができると予測された。肝機能障害は、何れも
公知の肝臓毒素でありラットにおいてビタミンに一依存
凝血因子活性を急激に低下させるＡＮＩＴ及び四塩化炭
素を用いて化学的に生起させた（Ｔｏｘｉｃｏｌ、　Ａ
Ｉ）１１１．ＰｈａｒｌｌａＣＯｌ、４８．４４５−４
５８　：　Ａｍｅｒ、Ｊ　、　Ｈｅｍａｔｏｌ、８，２
４９−２５５）。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖ
ｉｖｏの反応速度を高めるために、公知の肝ミクロソー
ム酵素誘導物質でありラットにおいて循環ビタミンに一
依存因子の活性を高めると報告されている（　Ｌ　ｉｒ
ｅ　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅｓ　２６．１３７９−１３８３）
フエノバルビタールで処置した。こうした予処置後、動
物に合成阻害量のワルファリンを投与してＰＣＡのｉｎ
　ｖｉｖｏパラメータを決定し、次いで肝ビタミンに一
依存力ルボキシル化のｉｎ　ＶｉｔｒＯパラメータを決
定すべく屠殺した。 ワルファリン投与４８時間前にＡＮＩＴの：」−ン油溶
液（３７，５■／ｄ）４ｍｌ！／ｋＶをラットに注入す
ることにより、Ａ　Ｎ　Ｉ　７１５０Ｉ１ｇ／／（９を
１回腹腔内投与した。他のラットには、コーン油に溶解
させた四塩化炭素溶液（５％もしくは１０％Ｖ／Ｖ溶液
１０ｄ／　Ｋ９　）を１回腹腔内投与（０，５もしくは
１．Ｏ，ｄ／Ｋｇ＞した（　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、Ｐ　ｈ
ａｒｍａｃｏｌ、１８．２０１９−２０２７）。 ＣＣｌ４はワルファリン投与１４時間もしくは２４時間
前に１回投与した。フエノバルビタールで予処買した動
物には、０．８５％塩化ナトリウム溶液に溶解させた溶
液を１日用ｆｆｉ　１１００１Ｒ／ｋｇで４回腹腔内投
与したく５０〜／−溶液２ｍ１／Ｋｙ）。ワルファリン
ナトリウム２ｍ９／Ｋｇを、最終′ａ度１■／ｄとなる
ように０．８５％塩化ナトリウムに溶解後尾脈脈に静脈
内投与した。 １２時間に亘り尾動脈から経皮穿刺して血液サンプルを
採取し、シュウ酸ナトリウムを用いて抗凝固させ、直ち
に２−・４℃で１５分間１５００ｘ　ｇで遠心分離させ
た（　Ｊ　、　Ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌ、　　Ｅ　ＸＤ、
　Ｔ　ｈｅｒ、　１８４゜２５３−２６０　）。上清血
漿を水冷ポリプロピレンチューブに吸引して、プロトロ
ンビン時間を測定した。 プロトロンビン　４　゛　の濱 血漿ＰＣＡをプロトロンビン時間測定により求めた（Ｊ
、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｅｘａ、　Ｔｈｅｒ、　１
８４，２５３−２６０＞。プロトロンビン時間（ＰＴ）
は、Ｆ　ｉｂｒｏｍｅｔｈｅｒ　　ｃｏａｇｕｌａｔｉ
ｏｎ　ｔｉｍｅｒ（Ｂ　Ｂ　Ｌ　。 Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉ　Ｉ　ｌｅ、　Ｍ　Ｄ　）を用いて
、適切な血漿希釈液１００μρに３７℃に保持したトロ
ンボプラスチン。 第Ｖ因子及びフィブリノーゲンの標準溶液（ＳｉｌｌＤ
ｌａＳｔｉｎ　−Ａ、　Ｇｅｎｅｒａｌ　　ＤｉａＱｎ
Ｏ３ｔｉＣ３゜Ｍｏｒｒｉｓ　Ｐｌａｉｎｓ、Ｎ、　Ｊ
、　）を添加して測定した。 全てのサンプルについて２回測定した。ＰＴ及びＰＣＡ
に関するプールされた動物標準曲線は前記の如く作成し
た［１．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｅｘａ、　Ｔｈｅｒ
。 １８４．２５３−２６０及び２０１．５０７−５１７）
。ＰＴ及びＰＣＡのベースライン相関関係はｐ　７　＝
　ａ　＋　ｍ（１／ＰＣＡ）の関数に従って直線であっ
た。なお、パラメータａ及びｍの値は直ｔａ最小自乗回
帰により算出した。このプールされた動物標準曲線を用
いてＰＣＡ”　、即ちワルファリン投与直前に測定され
たＰＣＡの定常値を算出した。 各ラットについて同様の方法にして、ワルファリン投与
前に採取した血漿についてＰＴ及びＰＣＡの標準曲線を
作成した。各動物の標準曲線を使用して、各ラットの各
時間で得られたＰ’ＣＡ値を算出し、ワルファリン投与
後のＰＣＡ減成に関する見かけ一次速度定数（Ｋｄ　）
を求めた。ＰＣＡ”及びＫｄの値をＲ″　５Ｖ１１＝　
Ｐ　ＣＡ″′ＸＫｄ（ｌ　ｉｒｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　
　２６，１３７９−１３８３；　ＡＣｔａＨａｅＩｌｌ
ａｔ、１９．２０−２９　；　　Ｃｆｉｎ、Ｐ　ｈａｒ
ｍａｃｏｌ、　　Ｔ　ｈｅｒ。 １０、２２−３５）にあてはめて、ワルファリン投与前
のＰＣＡ合成の定常速度を計算した。 ｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ＶｉｔｒＯ活性の相関関数ｉ
ｎ　ｖｉｖｏ研究終了後、肝ミクロソームビタミンに一
依存力ルボキシル化のパラメータをｉｎ　ｖｉｔｒ。 で調べた。合成阻害Ｍのワルファリンを投与後約２２時
間に動物を層殺し、肝ミクロソームビタミンに一依存力
ルボキシル化のパラメータ　Ｖ／にＨ（固有形成速度）
及びＰ。０（カルボギシル化に利用されうる先駆物質の
か）を前記の如く測定した。 ｉｎ　ｖｉｖｏビタミンに一依存止血機能のパラメータ
とビタミンに一依存力ルボキシル化のｉｎ　ＶｉｔｒＯ
パラメータとに関連があるかを確認するために、分散プ
ロットを作成して調べた。変数間の一致度をＫｅｎｄａ
ｌｌのτＤ相関係数として量化しく　Ｒａｎｋｃｏｒｒ
ｅｌａｔｉｏｎ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３４−９３）　
、変数の直線相関度をｐ　ｅａｒｓｏｎの積−モーメン
ト相関係数（τ）として量化した。 ビタミンに一依存力ルボキシル化 ビタミンに一依存力ルボキシル化の時間的変化を各ラッ
トについて調べたく第１図、左側グラフ）。Ｋ及びＰ。 ０の変動係数（Ｃ，Ｖ、）が夫々８．７９％±３．８８
％（平均Ｃ，Ｖ、±ｓ、ｏ、、ｎ＝４０）　、３．０１
％±１．１６％と低いことから、この式のＫ及びＰ。０
パラメータが極めて正確に推定されることが判明した。 平均Ｐ。０値は１，６１１±４９＆　ｄｐｍ／■であっ
た。Ｐ　を推定後、ビタミンに一依存力ルボキシ化の時
間的変化を積累積速度式に従ってプロットした（第１図
、右グラフ）。−次指数関数式のＫと同じであるこのプ
ロットのスロープ（Ｖ／にＨ）を直線最小自乗回帰分析
により求めた。 −次指数関数式から得られたスロープ値よりも積累積速
度式から得られたスロープ値を使用する理由は、後福の
方法により拮抗物質の存在下でのスロープ値の変化をよ
り好都合に測定できるからである。このデータ分析方法
が４０匹の正常ラットについて定量的に再現可能である
ことが判明している。積累積速度プロットの平均スロー
プは０．１０７４±０．０２８９　ｍ１ｎ−１（平均±
３．［）、；４０のうら２８のｒ値＞０．９９０　　；
　４０のうちの３８のｒ　Ｉａ＞、０．９００：最小ｒ
直−一０．８７５）であった。 ビタミンに一依存力ルボキシル　の　　　の　」６種の
拮抗物質の存在下もしくは非存在下でのビタミン−に依
存カルボキシル化の時間的変化を積累積速度プロットに
従ってプロットしたく第２図、左側グラフ）。スロープ
のコントロールスロープとの差異はビタミンに一依存力
ルボキシル化の抑制率に等しい。これを利用して、抑ｉ
１ｉ＋１　率と濃度との関係をプロットすることができ
る（第２図、右側グラフ）。前記プロットをＴＣＰ、フ
ェニンジオン、２．６−ＤＩＰ、クロロ−に３．クロロ
−に１またはワルファリンを用いてｉｎ　ＶｉｔｒＯで
処置した各マウスについて作成した。第３図には、上記
した６種の阻害剤について抑１１す率と濃度との関係が
プロットされている。 ワルファリンの場合を除いて、抑制率対潜度のプロット
は典型的なＳ字状を示し、ＩＯ及びＩ　　を夫々Ｏ％及
び１００％で固定したときの紳ａｘ 定量数により説明付けらだ。ＩＣ５Ｑ及びＳパラメータ
の平均変動係数が夫々１６．９％±１３．６％（平均Ｃ
，Ｖ、±Ｓ、Ｄ、、ｎ−２１）及び１２．３±８．３％
と比較的小さいことから明らかな如く、ＩＣ５ｏ及びＳ
パラメータの値は非直線最小自乗回帰法により十分に推
定された。これらの十分特徴的なＳ字状相関関係と対照
的に、ワルファリンのときの抑！ＩＩ率対ｓｔｉのプロ
ットは以下の２点で異なっていた：第１は論理式に最良
に適合させるためにパラメータとしてＩＱ　　（平均Ｉ
□＝８．９％）を使用しなければならない（最終値は明
らかにＯより小さい）ことであり、第２はラットによっ
ては抑制率対濃度のプロットに明らかな屈曲点が存在し
ないことである。この挙動について考えられうる説明を
以下に記す。 抑制率対濃度の相関関係のパラメータを第１表と第４図
に要約して示す。 第１表 ビタミンに一依存力ルボキシル化の抑制率対阻害剤１１
１度の相１１Ｑ１！！数を特徴付けるＩＣ５ｏ及びスロ
ープパラメータ。値は平均上Ｓ、Ｄ、であり、カッコ内
の値は範囲である。 ａ：９度は全てμＨある。但しワルファリンのときはｍ
Ｍである。 ｂ＝ニスロープ２端（ｔａｉｌｅｄ）スチュデントｔ−
テストとは明らかに異なる。フェニンジオンスロープ：
叶弓、０５：クロローに１スロープ：　　０．００１＜
ｐ＜０．０１ Ｃ：最終値・・８．８９±３．７７％（平均士Ｓ、Ｄ、
、範囲一２．７４−１３．１％）で第３のパラメータと
してＩｏを使用すると関数は適合する。パラメータＩＣ
５ｏの変動係数：４３．１±２６．０％（平均Ｃ，Ｖ。 ±Ｓ、Ｄ、、ｎ＝６）；パラメータＳの変動係数：４１
．８％±１２．３％（平均Ｃ，Ｖ、±ｓ、ｏ、、ｎ＝こ
れら化合物の１０５０値はＩＣ５Ｑが高くなる順にＴＯ
Ｐ、フェニンジオン、２．６−ＤＩＲ，クロロ−Ｋ　、
クロロ−に１及びワルファリンとランり付けられる。４
種の拮抗物質ではスロープパラメータは殆んど１であっ
たが、フェニンジオン（ｐ　＝　０．０５）及びクロロ
・−Ｋ　１　（０，００１＜　ｐ　＜　０．０１）の場
合には明らかに１未満であった。阻害剤間のＩＣ５Ｑの
変動差は最も強力なＴＣＰと最も効力の弱いワルファリ
ンとで、約５０００倍であった。各化合物についてラッ
ト間でＩＣ５ｏ値が２〜４倍の幅があることから、ラッ
トにおけるワルファリン。 フェニンジオン及びＴＣＰに対するｉｎ　ｖｉｖｏ抗凝
固剤応答が個体間で差異があることが示された（Ｊ、　
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、２０１．
５０１．−５１７；Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、　ＥＸＤ、　Ｂ
ｉｏｌ、Ｍｅｄ、１３９，８０６−８１０　；５ｃａｎ
ｄ、　Ｊ　、　ＣＩｉｎ、Ｌａｂ、　　Ｉ　ｎｖｅｓｔ
、２．８３−９１）　、。 ｉｎ　ｖｉｖｏ研究 ｉｎ　ｖｉｖｏで研究した動物の場合、プールされた動
物及び各動物のＰＴ、ＰＣＡに関する標準曲線を、正常
ラット、ＡＮＩＴ処置ラット、四塩化炭素処置ラット及
びフエノバルビタール処置ラットについて逆関数式で示
した（第５図）。前記した予装置を受けたラット間で切
片パラメータに著しい遠いはなかったが、スＤ−ブパラ
メータは正常ラット間でかなりの動物間変動がみられ、
予装置によるスＤ−ブの変化は著るしかった（第２表及
び第５図参照）。 第２表 各動物の標準曲線パラメータ及び ＰＣＡ”　、Ｋ　　及びＲｏ　　値 ｄ　　　　　Ｓｙｎ 最も強力な肝臓毒素である四塩化炭素のときスロープの
上昇率が最大であった。スロープの上昇率が最も小さい
のはＡＮＩＴ処置ラットであった。 以前の研究から、ラットに合成阻害量のワルファリンま
たはジクマールを投与後のＰＣＡ減成は見かけ一次速度
を示すことが判明している（Ｊ。 Ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌ、Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、１８４．
２５３・−２６０：２０１゜５０７−５１７及び１８７
．１７６−１８４）。この所見が本実験で正常ラットに
おいて立証された（第６図、第２表）。正常ラットにお
けるＰＣＡの平均Ｋｄは３．７１±０．６７ｄａｙであ
り、平均回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）時間は６．６３±１
．１９時、生物学的半減時間は４．５９±０．８３時で
あった。見かけ一次速度（ａｐｐａｒｅｎｔ　ｆｉｒｓ
ｔ　−ｏｒｄｅｒ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、胆汁分泌停
止した＜ＡＮＩＴ予処置に関連する）肝機能障害や肝細
胞（四基化炭素子処置に関連する）肝機能障害を呈して
いる場合にも認められた（第２表）。ＰＣ八へ成の速度
定数は、正常ラット、フェノバルビタール処置ラット及
びＡＮＩＴ処置ラットの場合と定量的に同様であった（
第２表）。対照的に、四塩化炭素処置ラットの場合Ｋｄ
値は著るしく高く（第２表）、平均８．４９±４．６９
　ｄａｙ’ｒあった。その平均回転時間は３．２７±１
．３４時であり、生物学的半減時間は２，２７±０．９
４時であった。上記所見は、四塩化炭素処置ラットが比
較的重大な肝異化状態にあり肝ミクロソームタンパク質
合成率が著るしく低下していること（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ
　１４０，３０８−３１０；Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　４．６７１＝６７９）と一致しテイル。 ＰＣＡ”とＫｄとに有意な負の相関関係があった（０．
００１＜　ｐ　＜　０．０５）。 ＰＣＡの合成速度（Ｒｏ　　）は測定されたＳｙｎ ＰＣＡ”及びＫｄパラメータから誘導された（第２表）
。正常ラットで得られたＲｏ　　値は平均ｙｎ ３３１±７３％／　ｄａｙであり、以前報告されている
値と一致シティた（　Ｊ　、　Ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌ、
　Ｅ　ｘｐ、　Ｔ　ｈｅｒ。 １８４．２５３−２６０；２０１，５０７−５１７及び
１８７，１７６−１８４）。２匹のペンドパルビタール
処置ラットのＰＣＡ’値は４匹の正常ラットの平均値に
比べて平均３８％高く、Ｋｄ値は本質的に正常であるか
ら、Ｒｏ　　は正常ラットに比べて平均４４％高い（第
ｙｎ ３表参照）。 第３表 ｉｎ　ｖｉｖｏでのビタミンに一依存止血機能評価後の
コントロール、ＡＮＩＴ予処置、四基化炭素子処置及び
ベンドパルビタール予処Ｓラットにおけるｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏでのビタミンに〜依存カルボキシル化のパラメータ Ｒｏ　　の増加率は、正常ラットと比較してフｙｎ ニッパルビタール処置ラット場合肝部分重量（即）う肝
重沿／総体重）が２６％増加しているという所見に比べ
てやや高い。ＡＮＩＴ処置した１匹のラットではＰＣＡ
’″が５６％に減少しており、よってＲｏ　　は約り３
％小さい。四塩化炭素で処置したｓｙｎ 例についてのみ、ＰＣＡ”及びＫｄが前出血様に（ｐｒ
Ｏ−ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　ｆａｓｈｉｏｎ）影響を
受けた。この結果、四塩化炭素処置動物めＲｏ　　は平
均で３１／ｎ 約６２％低下した。全体的に、ＰＣＡ’　と”ｓｙｎと
には極めて有意な正の相関関係があった（ｐ＜０．００
１）。 ビタミン　−　　カルボキシル　に　ぼの影響 ＡＮＩＴ、四塩化炭素もしくは゛ノエノバルビタールで
予装置したラットにおけるラット肝ビタミンに一依存力
ルボキシル化をｉｎ　ｖｉｔｒｏで特徴付けたところ、
正常ラットと幾つかの差異がみられた（第３表）。四塩
化炭素の予装置により、１．０ｄＣＣｊ４／Ｎｙ投与し
た２匹のラットでＶ／に□が約２０−３０％小さかった
。これら同じ２匹のラットの場合、正規化（ｎｏｒｍａ
ｌｉｚｅｄ）　Ｐｏｏにより測定された如く内因性基質
の量が少なかった。ＡＮＩＴ及びフエノバルビタール予
処置ラットの場合Ｖ／にＨは本質的に正常値を示した。 しかしなから、フエノバルビタール予処置ラットの場合
総ミクロソームタンパク質の分数として測定したとぎ内
因性の基質の１が少なく、ミクロソーム部分の非ビタミ
ンに一依存タンパク質が相対的に増殖していることが示
された。一方、ＡＮＩＴ処置ラットの正規化Ｐ　は約５
０％高く、総ミクロソームタンパク質の分数として測定
したとき内因性基質の吊が多いことが示された。このよ
うな増加は、ＡＮＩＴ投与後投与後向平滑内質網ｐａｔ
ｉｃ　ｓｍｏｏｔｈ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔ　
ｉｃｕ　ｆｕｌＩｌ）が全体的に肥大した結果であろう
（Ｌ　ａｎＣｅｔ　２．３５５−３５９；Ｌ　ａｂ、　
Ｉ　ｎｖｅｓｔ、２８，３２１−３３１）。 ｉｎ　ＶｉｔｒＯ活性とｉｎ　ｖｉｖｏ　？　　どのｍ
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのビタミンに一依存力ルボキシル化
の２個の各パラメータ（Ｖ／に８及び正規化Ｐ。）とｉ
ｎ　ｖｉｖｏでのビタミンに一依存止血機能の３個の各
パラメータ（ＰＣＡ’　、Ｋｄ及びＲ″′　　）とｙｎ の個々の相関関係を、ノンパラメトリックの一致度（即
ちＫ　ｅｎｄａｌ　ｌのτｂ）及び−・般的な直線相関
度（即ちｐｆ３８ｒｓＯｎの積モーメント相関係数ｒ）
を計算することにより定量化した。これらの計算結果を
第４表に要約する。 第４表 ビタミンに一依存のｉｎ　ｖｉｔｒｏカルボキシル化と
ｉｎ　ｖｉｖｏ止血機能との相関関係 帰無仮設のテストに対する確率は次の通りである。 ｎ−８でｒ＝ｏもしくはτｂ＝ｏとすると”０．０１＜
　ｐ　＜０．０５ 加、０５＜　ｐ　＜０．１０ ｉｎ　ｖｉｖｏパラメータＰＣＡ’　とＲ６は夫々ｙｎ Ｖ／ＫＭと有意な相関関係にあった。即ち、カルボキシ
ル化ビタミンに一依存タンパク質のｉｎ　ＶｉｔｒＯ肝
固有形成速度とＰＣＡのｉｎ　ｖｉｖｏ定常レベルとＰ
ＣＡ合成速度とは正の相関関係を示ずく第７図及び第８
図）。ＲｏｓｙｎとＶ／ＫＨの相関関係は、一致度から
みて直線相関よりもなお特徴的である。 なぜならば、８匹の動物のうち７匹が相互に一致するｆ
−タボインドを有しているからである。 ｉｎ　ｖｉｖｏビタミンに一依存止血機能（ｈｅｍｏｓ
ｔａｔ　１ｃｆｕｎｃｔｉｏｎ）のパラメータは何れも
ｉｎ　ｖｉｔｒｏビタミンに一依存力ルボキシル化の正
規化Ｐ８パラメータと有意な相関関係を示さず、基質の
有効性よりもカルボキシル化速度がｉｎ　ｖｉｖｏでの
ＰＣＡのレベル及び形成速度を決定する主因子であるこ
とが示唆される。 フエノバルビタールで５日間予処置したラットはこれら
ｉｎ　ｖｉｖｏ　−ｉｎ　ｖｉｔｒｏ相関関係の分析か
ら除外した。何枚ならば、これらのラットは正常。 ＡＮＩＴ及び四塩化炭素グループのラットに比べてｉｎ
　ＶｉＶＯ−ｉｎ　ｖｉｔｒｏが不一致であるからであ
る。 特に、フェノバルビタール処置ラットの場合、Ｒ”　　
　　（正常ラットに比べて平均４４％大）及びｙｎ ＰＣＡ’　　（正常ラットに比べて平均３８％大）は著
しく高かったが、これら同じラットからの肝における；
ｎ　ｖｉｔｒｏ固有形成速度は正常ラットと本質的な差
がなく、ミクロソーム部分の非−ビタミンに一依存タン
パク質は相対的に増殖していた（第３表）。 上記実験結果から明らかなように、ビタミンに一依存凝
固因子の先駆物質のｉｎ　ｖｉｔｒｏでのビタミンに一
依存力ルボキシル化は１次指数速度論に従い、典型的な
Ｓ字状濃度一応答関係に従って各種ビタミンに拮抗物質
により阻害され、且つビタミンに一依存凝固因子のｉｎ
　ｖｉｖｏ回転パラメータと相関関係にある。内因性ミ
クロソーム基質のカルボキシル化の時間的変化を調べる
ために、抽ＶｉｔｒＯの清浄剤を含まないラット肝ミク
ロソーム系を使用した。天然基質を使用することにより
、天然の基質と外部から添加される合成基質問の潜在的
な競合問題及びペンタペプチド基質に比べて天然の基質
タンパク質のカルボキシル化の配座依存性が高いことに
基因する非類似運動性（ｄｉｓｓｉｌｌｌｉｌａｒ　ｋ
ｉｎｅｔｉｃ　Ｉ）ｒｏｔ）ｅｒｔｉｅｓ）の可能性が
避けられる。前記した配座依存性（ｃｏ口ｆｏｒｌｌａ
ｔｉｏｎａｌｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　）の違いは、トロ
ンビンに対する合成基質の場合について十分に説明され
ている（　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　７，１０９−１１
２）。現在のアツセーシステムでは、動物間で応答に差
異が生ずるように各動物をそれ自身のコントロールとし
て使用して各ビタミンに拮抗物質を調べることができた
。また、内因性先駆基質を用いるこのアツセーシステム
により、ビタミンに一依存凝固因子の特異なｉｎ　Ｖｉ
ｔｒＯ及びｉｎ　ｖｉｖｏパラメータの関係を調べるこ
とができた。 ｉｎ　Ｖｉｔ、ｒＯの実験システムでは、異なる化学物
質群に属する６種のビタミンに一拮抗物質に対してＳ字
状濃度応答を示す。これらビタミンに拮抗物質の効力は
強い順にＴＣＰ、フェニンジオン。 ２．６−ＤＩＲ，クロロ−Ｋ　、クロロ−・Ｋ１及びワ
ルファリンとランク付けられた（第４図参照）。 ＴＣＰの平均１Ｃ５ｏは１．２３Ｍであり、ワルファリ
ンは６．６３５ｌｙｌであった（第１表）。ワルファリ
ンで得られたＩＣ，、ｏは、ブＯトロンビン凝血促進剤
活性の抑制度を調べるｉｎ　ＶｉｔｒＯシステムで得ら
れたデータとよく一致している（　ｆ３　ｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、７２
，６１９−６２５）　。各種拮抗物質に対する活性が広
範囲に亘っていることに加えて、ビタミンに一依存力ル
ボキシル化システムは所与の阻害剤に対する感度が動物
間で大きく変動することも示した（第１表）。ラットに
おけるＫ及びＰ。０値の頻度分布は、動物門変動性を洞
察する作業中に別個に研究されてきた（　Ｐ　ｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｙｏｆ　　Ｒａｔ　　Ｈｅｐｔａｔｉｃ　
Ｖｉｔａｍｉｎ　　Ｋ−ｏｅｐｅｎｄｅｎｔＣａｒｂｏ
ｘｙｌａｔｉｏｎ、　Ｄ　ｏｃｔｏｒａｌ　Ｄ　１ｓｓ
ｅｒａｔｉｏｎ。 Ｄ　ｕｋｅ　Ｕ　ｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ）。 ビタミンに拮抗物質の抗凝固作用メカニズムは十分解明
されていない（ＣＲＣＣｒ１ｔ、Ｒｅｖ。 Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　８，１９１−２２３；Ｄｒｕｇｓ　
ａｎｄ　　ＮｕｔｒｉｅｎｔｓＴ　ｈｅ　　１　ｎｔｅ
ｒａＣｔｉＶｅ　　Ｅ　ｆｆｅｃｔｓ、４２９−４７３
）。ビタミンＫ・−依存力ルボキシル化に含まれる各種
Ｓ素、即ちジチオトレイトール−感受性ビタミンにレダ
クターゼ、Ｄ−「−ジアフオラーゼ、ビタミンにエポキ
シダーゼ及びビタミンに２．３−エボキシドレダターゼ
は全て薬理学的に阻害されつる。最近の研究では、ワル
ファリンの抗凝固作用は恐らくジチオトレイトール、−
感受性レダクターゼ及びビタミンに２．３−エポキシド
レダクターゼの両方が阻害されるためであろうと示唆さ
れる（Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、　２５７．４８９Ｌ−４９０１及び２５７．
１１２１０−１１２１２）。 ワルファリンの阻害率対濃度プロットの純粋なＳ字状関
数との偏差（第３図）は、２種のワルファリン対掌体の
効力差または各種阻害率対濃度の関係を伴う２Ｆｌの異
なる作用部位により説明されるであろう。後者の機構は
、両異性体がビタミンにレダクターゼ及びビタミンに２
，３−エポキシドレダクターゼの同等な阻害剤であると
いう最近のｉｎ　ＶｉｔｒＯな所見と−・致する（　Ｊ
　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。 ２５７、４８９４−４９０１　）。しかしこの提案され
た機構では、２種のワルファリン異性体のｉｎ　ｖｉｖ
ｏでの効力が異なることを説明できない（Ｊ　、　Ｂ　
ｉｏｌ、ｃｈｃｍ。 ２５７．４８９４−４９０１　：　Ｊ　、　　Ｐｌ＋ａ
ｒｍ、　　Ｐｈａｒｍａｃ、２４゜６６１−６６２）。 従って、ワルファリンの作用メカニズムは他の薬理学的
阻害剤を含んでいるであろう。 フェニンジオン及びクロロ−Ｋｉに対する結果は、他の
４種の拮抗物質と比較して実質的に異なる阻害率−濃度
ブ０ットのスロープを示す。このスロープの差から、こ
れら２種の化合物が他の４種の拮抗物質（Ｄｒｕｇ　Ｄ
ｅｓｉｎｏ、ｖｏｌ、１．１−２７０）と幾つかの作用
メカニズムの点で、例えばビタミンに一依存力ルボキシ
ル化に含まれる各種ＩＦ素を阻害したり同じ酵素の別の
部位に作用することにより異なることが示唆される。ｉ
ｎ　ＶｉｔｒＯ研究では、フェニンジオンとワルファリ
ンが共通の作用メカニズムを有する即ちビタミンＫｉ　
、２．３−エポキシドレダクターゼを阻害することが示
唆された（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ
ｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、７２，６１９−６２５；　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　　ＰｈａｒｌｌｌａＣＯＩＯ（Ｊｌ／　
１０，３７３−３８０：Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄｉａｔｈ、　
Ｈａｅｍｏｒｒｈ、１９，６１１）が、ｉｎ　ｖｉｖｏ
研究ではビタミンにエポキシドレダクターゼの限られた
阻害の存在下でフェニンジオン後のプロトロンビン合成
が完全にブロックされることが知見され（Ｊ、　Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ。 １５７．６７２−６８０）、フェニンジオンには別の作
用メカニズムがあることが示唆された。りロローに１に
類似している前記作用機構は、Ｌ　０Ｗｅｎｔｈａｌら
（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄｉａｔｈ、　Ｈａｅｍｏｒｒｈ、１
９，６１１；　Ｊ。 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　ＥＸＩｌ、　Ｔｈｅｒ　１４３
，２７３−２７７；５ｃｉｅｎｃｅ１６４、８ｌ−１８
３）により最初に提案され且つＷ　ｈｉｔｌｏｎら（Ｂ
　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７，１３７１−１３７７
）及びＦ　ａｓｃｏら（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ
、２５７．４８９４−４９０１及び２５７．１１２１０
−１１２１２）の生化学的研究により裏付けられたビタ
ミンに作用の修正仮説に基いて仮定されうる。 ビタミンには、可逆的に結合し且つ２種の別々のルート
を介するビタミンに一依存力ルポキシラーゼに対する本
質的な補因子であるヒドロキノン形態に活性化されつる
。第１のルートはジチオトレイトール依存ビタミンにレ
ダクターゼから構成され、前記酵素は比較的低いビタミ
ンＫ１１度で作用しく低いＫＨを有し）、３−置換−４
−・ヒドロキシクマリンによる非可逆的阻害を受けやす
い。一方、第２のルートはＮＡＤＨ−依存ＤＴジアフオ
ラーゼから構成され（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、　　
１６９．９５−１０１及び１９４．９８３−９８８）、
前記酵素は比較的高いビタミンＫ１１度で作用しく高い
ＫＨを有し）、ワルファリンによる阻害を余り受けにく
い（Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、１０４．
８７−１９２）　。しかしながら、２０ローに１はワル
ファリン−阻害可能な機構に対して本質的な影響を示す
ことなくビタミンに一依存凝固因子合成の競合的阻害剤
として作用することが知見されており（Ｊ　、　Ｐ　ｈ
ａｒｍａｃｏｌ。 Ｅ　ｘｐ、　Ｔ　ｈｅｒ、　１４３，２７３−２７７）
、クロロに１はビタミンに一依存力ルポキシラーゼのレ
ベルで作用すると示唆された。クロロ−に１及びフェニ
ンジオンはビタミンに一依存力ルポキシラーゼのレベル
で競合的拮抗物質であるのに対して、ＴＣＰ、２．６−
〇ＩＰ、クロロ−に３及びワルファリンは１種もしくは
それ以上の機構によってビタミンに、ヒドロキノンのプ
ールを低下させることによりその主たる効果を発揮する
と仮定することは合理的である。 ビタミンに一依存機能のパラメータのｉｎ　ｖｉｔｒ。 −ｉｎ　ｖｉｖｏ相関関係に対する証拠は上記に示した
。 特に、プロトロンビン複合体活性のｉｎ　ｖｉｖｏでの
合成速度はカルボキシル化ラット肝ビタミンに一依存タ
ンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの固有形成速度と−・致
していた。循環血漿プロトロンビン複合体活性とカルボ
キシル化ラット肝ビタミンに一依存タンパク質のｉｎ　
ｖｉｔｒｏでの固有形成速度との相関度は低かった。こ
れらの所見から、ビタミンに一依存力ルボキシル化のよ
り迅速な速度がビタミンに一依存プロトロンビン複合体
活性の比較的大きなｉｎ　ｖｉｖｏ合成速度及び比較的
高い凝固可能なベースライン状態と実際間通していると
いうことが明らかである。このｉｎ　ｖｉｖｏ　−ｉｎ
　ｖｉｔｒｏの相関関係が確立されたことから、内因性
基質のビタミンに一依存力ルボキシル化の−・次指数速
度定数を決定しうろことに因る現在のｉｎ　ｖｔｔｒｏ
システムの有用性が裏付けられる。これとは対照的に、
ビタミンに一依存凝固因子の有効肝先駆物質厖は、プロ
トロンビン複合体活性のｉｎ　ｖｉｖｏでの合成速度パ
ラメータとは相関関係を示さなかった。このことから、
少なくとも肝障害がみられる開基質の利用度（５ｕｂｓ
ｔｒａｔｅ　ａＶａｉｌａｂｉｌｉｔｌ／）よりむしろ
ビタミンに一依存力ルボキシル化速度がプロトロンビン
複合体活性の形成のｉｎ　ｖｉｖｏでのレベル及び速度
を決定する主因子であることが示唆される。循環ビタミ
ンに一依存凝固因子の活性に対する正のフィードバック
調節に含まれると考えられる所謂凝固ボイエチン類（ｃ
ｏａｇｕｌｏｐｏｉｅｔｉｎｓ）　（Ｂ　ｒｉｔ、　Ｊ
　。 Ｈａｅｍａｔｏｌ、２４，５５３−５６２；　　Ａｎｎ
ａｌｓ、Ｎ、　　Ｙ、　　Ａｃａｄ。 Ｓ　Ｃｉ、３７０，２８１−２９０）は明らかにビタミ
ンに一依存力ルボキシル化を増強することにより作用す
る（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、１９，１１１−１１８）こ
とは興味深い。このことから、カルボキシル化速度はビ
タミンに一依存凝固因子のレベル及び活性を全体的に調
節する際に密接にかかわることが更に示唆される。 以上本発明を説明してきたが、本発明の思想、趣旨を逸
脱しない限り多くの変更、改変を行いうろことは当業者
に自明の通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は内因性基質のビタミンに一依存力ルボキシル化
の時間的変化を示すグラフであり、第２図はビタミンに
一依存力ルボキシル化のｉｎ　ＶｉｔｒＯでの抑制率と
阻害剤濃度との関係を示すグラフであり、第３図はビタ
ミンに一依存カルボキシル化のｉｎ　ＶｉｔｒＯでの抑
制率とビタミンに拮抗剤濃度との関係を示すグラフであ
りい第４図はビタミンに一依存力ルボキシル化のｉｎ　
ＶｉｔｒＯでの抑制率と阻害剤濃度との関係を示すグラ
フであり、第５図はプロトロンビン時間−プロトロンビ
ン複合体活性を示す標準曲線であり、第６図はプロトロ
ンビン複合体活性の時間的変化を示すグラフであり、第
７図はｉｎ　ｖｉｖｏでのプレーワルファリンプロトロ
ンビン複合体活性とカルボキシル化ビタミンに一依存タ
ンパク質のｉｎ　ＶｉｔｒＯでの固有形成速度との関係
を示ずグラフであり、第８図はプロトロンビン複合体活
性のｉｎ　ｖｉｖｏでの合成速度とカルボキシル化ビタ
ミンに一依存タンパク質のｉｎＶ＋ｔｒＯでの固有形成
速度との関係を示すグラフである。 代理人弁理士　中　　　村　　　　至 圃面の浄書（内容に変更なし） Ｆ工ＧＵＲＥ　ｌ　　（＜め１） Ｆ工ＧＵＲＥ　　Ｉ ＩＮＣＵＢＡＴＩＯＮ　ＴＩＭＥ　（ｍｉｎｕｔｅｓ）
（４の２） ＩＮＣＵＢＡＴＩＯＮ　ＴＩＭＥ　（ｍ１ｎｕｔｅｓ　
）Ｆ工ＧＵＲＥ　　５ Ｆ工ＧＵＲＥ　　７ Ｖ／Ｋｙ　（ｍｒｎｕｊｅｉ’） 手続補正書 昭和６２年６月３日 ２、発明の名称　　　１．４−ナフトキノン誘導体を含
有する殺鼠組成物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　デユーダ・ユニヴアーシティ４、代　理
　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビ
ル５、補正命令の日付　　　自　発 ８、補正の内容 手続補正書 昭和６２年６月１８日 １、事件の表示　　　昭和６２年特許願第９９５９９号
２、発明の名称　　　１．４−ナフトキノン誘導体を含
有する殺鼠組成物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　デユーダ・ユニヴアーシティ４、代　理
　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビ
ル５、補正命令の日付　　　自　発 ８、補正の内容 （１）　　明細書中、第２５頁第１２行目に「×は・・
・・・・である。Ｊとあるを、ｒＸｌ、ｔＣｌ、Ｂｒ、
ＦまたはＩである。」と補正する。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）齧歯動物の餌と活性殺鼠剤として式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＸはＣｌ、Ｂｒ、ＦまたはＩであり、ＹはＨ、
   Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、−ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿３Ｎａま
   たは−ＳＯ＿３Ｋであり、Ｒ＿１〜Ｒ＿４は夫々Ｈ、Ｃ
   ｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｃ＿１＿〜＿６アルキル、Ｃ＿１＿
   〜＿６アルコキシまたはＣ＿１＿〜＿６アルコキシアル
   キルである） を有する化合物を致死量もしくは致死量以下の量含む齧
   歯動物を毒殺するための食餌組成物。
2. （２）活性殺鼠剤として式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＸはＣｌ、Ｂｒ、ＦまたはＩであり、ＹはＨ、
   Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、−ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿３Ｎａま
   たは−ＳＯ＿３Ｋであり、Ｒ＿１〜Ｒ＿４は夫々Ｈ、Ｃ
   ｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｃ＿１＿〜＿６アルキル、Ｃ＿１＿
   〜＿６アルコキシまたはＣ＿１＿〜＿６アルコキシアル
   キルである） を有する化合物を致死量もしくは致死量以下の量含有す
   る齧歯動物の餌からなる齧歯動物を毒殺するための食餌
   組成物。
3. （３）前記化合物においてＲ＿１〜Ｒ＿４およびＹが夫
   々Ｈである特許請求の範囲の範囲第１項に記載の組成物
   。
4. （４）前記化合物においてＲ＿１〜Ｒ＿４およびＹが夫
   々Ｈである特許請求の範囲の範囲第２項に記載の組成物
   。
5. （５）前記齧歯動物がラットまたはマウスである特許請
   求の範囲第１項に記載の組成物。
6. （６）前記齧歯動物がラットまたはマウスである特許請
   求の範囲第２項に記載の組成物。
7. （７）前記化合物が２−クロロ−１，４−ナフトキノン
   である特許請求の範囲第１項に記載の組成物。
8. （８）前記化合物が２−クロロ−１，４−ナフトキノン
   である特許請求の範囲第２項に記載の組成物。
9. （９）前記食餌組成物中に前記殺鼠組成物が０．０００
   ０１〜０．１重量％の量含まれている特許請求の範囲第
   １項に記載の組成物。
10. （１０）前記食餌組成物中に前記殺鼠化合物が０．００
    ５〜０．０５重量％の量含まれている特許請求の範囲第
    ２項に記載の組成物。
11. （１１）齧歯動物に式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＸはＣｌ、Ｂｒ、ＦまたはＩであり、ＹはＨ、
    Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、−ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿３Ｎａま
    たは−ＳＯ＿３Ｋであり、Ｒ＿１〜Ｒ＿４は夫々Ｈ、Ｃ
    ｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｃ＿１＿〜＿６アルキル、Ｃ＿１＿
    〜＿６アルコキシまたはＣ＿１＿〜＿６アルコキシアル
    キルである） を有する化合物を致死量もしくは致死量以下の量含む食
    餌組成物を摂取させるべく与えることからなる齧歯動物
    を毒殺する方法。
12. （１２）齧歯動物に式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＸはＣｌ、Ｂｒ、ＦまたはＩであり、ＹはＨ、
    Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、−ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿３Ｎａま
    たは−ＳＯ＿３Ｋであり、Ｒ＿１〜Ｒ＿４は夫々Ｈ、Ｃ
    ｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｃ＿１＿〜＿６アルキル、Ｃ＿１＿
    〜＿６アルコキシまたはＣ＿１＿〜＿６アルコキシアル
    キルである） を有する化合物を致死量もしくは致死量以下の量含む食
    餌組成物を摂取させるべく与えることからなる齧歯動物
    を毒殺する方法。
13. （１３）前記齧歯動物がラットまたはマウスである特許
    請求の範囲第１１項に記載の方法。
14. （１４）前記齧歯動物がラットまたはマウスである特許
    請求の範囲第１２項に記載の方法。
15. （１５）前記化合物が２−クロロ−１，４−ナフトキノ
    ンである特許請求の範囲第１１項に記載の方法。
16. （１６）前記化合物が２−クロロ−１，４−ナフトキノ
    ンである特許請求の範囲第１２項に記載の方法。
17. （１７）前記食餌組成物が前記化合物を含浸させた齧歯
    動物の餌または毒餌を含む特許請求の範囲第１１項に記
    載の方法。
18. （１８）前記食餌組成物が前記化合物を含浸させた齧歯
    動物の餌または毒餌を含む特許請求の範囲第１２項に記
    載の方法。
19. （１９）前記餌または毒餌が０．００００１〜０．０１
    重量％の前記化合物を含む特許請求の範囲第１１項に記
    載の方法。
20. （２０）前記餌または毒餌が０．００５〜０．０５重量
    ％の前記化合物を含む特許請求の範囲第１２項に記載の
    方法。