JPS6229997A

JPS6229997A - Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法

Info

Publication number: JPS6229997A
Application number: JP61074063A
Authority: JP
Inventors: Hidetsune Tamaoki; 玉沖　英恒
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1985-04-08
Filing date: 1986-03-31
Publication date: 1987-02-07
Also published as: DE3667490D1; ATE48646T1; ES553792A0; EP0197794B1; US4709014A; CA1251153A; JPH0570433B2; EP0197794A2; ES8800265A1; EP0197794A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＣ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製
法に関する。生体内に存在するある種の蛋白質やホルモ
ンは、そのペプチド鎖のＣ末端アミノ酸のα−カルボキ
シル基がアばド化されており、酸アミドが形成されてい
る。そして、この酸アずド基は、一般にその蛋白質やホ
ルモンの活性発現に重要力投側を行なっている。

生体内におけるこのようなＣ末端酸アミド基の形成は、
ペプチド鎖が生合成された後、酵素的に行なわれると言
われている（Ａ、、Ｆ、　Ｂｒａｄｂｕｒｙ　ｅｔａｌ
　：　Ｎａｔｕｒｅ、　２９８．６８６　（１９８２）
　）。

一方、近年遺伝子工学的手法により、蛋白質やペプチド
が生産されるようになったが、Ｃ末端酸アミドをもつペ
プチドを得る場合、ペプチド鎖が合成された後に、人為
的にＣ末端α−カルボキシル基のアミド化反応を行なわ
々ければならない。したがって生産工程の中で、このア
ミド化反応は重要な位置をしめるのである。アミド化反
応において化学合成による方法は種々の副反応をともな
うこと、′ｔた過激な反応により蛋白質やペプチドのも
つ生理活性が消失する可能性がある等の欠点を有する。

一方、酵素を利用した方法も知られており、例えばブタ
脳下垂体由来のアミド化酵素による方法（Ａ、Ｆ。

Ｂｒａｄｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ：　Ｎａｔｕｒｅ　、　
２９８．６８６（１９８２）　）がある。

しかしながら、本反応は副反応のない反応であるが、酵
素原料の入手が困難なこと、現在未だ完全な精製品が得
られていないこと、酵素が不安定であり、取扱いにくい
という欠点を有する。

他の酵素を利用したペプチドの合成法としてＢｒｅｄｄ
ａｍらの方法（Ｋ、　Ｂｒｅｄｄａｍ　ｅｔ　ａｌ　：
Ｃａｒｌｓｂｅｒｙ　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、４６．１２１（１９８１）　）が知られ
ている。

本発明の方法はカルボキシベノチ〆−ゼＹを使用する。

カルボキシペプチダーゼＹはイーストから得られ、蛋白
質やホルモンのペプチド鎖のＣ末端ペプチド結合を切断
し、Ｃ末端から順次アミノ酸を遊離させる作用を有する
。一方でペプチド結合の合成能も有する（森原和之：蛋
白質・核酸・酵素、亜、　１９７９（１９８１）　）。

しかし、カルボキシペプチダーゼＹがペプチドのＣ末端
ゾロリンのα−カルボキシル基のアミド化を行うことは
未だ知られていない。

本発明者はカルボキシ（ブチダーゼＹがペプチドのＣ末
端プロリンに特宇のアミノ酸が結合している場合にのみ
、Ｃ末端ゾロリンのα−カルボキシル基のアミド化を行
うことを見出して本発明を完成した。

本発明は化学合成による方法やブタ脳下垂体由来のアミ
ド化酵素による方法の欠点を解決し、かつコスト面から
も実用的な方法である。

本発明はＣ末端ゾロリンにロイシン、イソロイシン、バ
リン、フェニルアラニンおよびアラニンから選ばれたア
ミノ酸の一種を有するペプチドに、カルボキシペプチダ
ーゼＹを作用させることによるＣ末端にプロリンアミド
を有するペプチドの製法に関する。

（式中、Ｐｒｏはプロリン、Ｚはロイシン、イソロイシ
ン、バリン、フェニルアラニンオヨびアラニンから選ば
れたアミノ酸の一種を示す。各結合は互にペプチド結合
である。）で表わされる。

反応は基質にアンモニアの存在下でカルボキシペプチダ
ーゼＹを作用させることによって達成される。

Ｃ末端プロリンアミド生成のためのペプチドのアミド化
反応は、あらかじめ調製した基質溶液、カルボキシペプ
チダーゼＹ溶液およびアンモニア溶液を混合して行々う
。最初に基質水溶液を調製する。基質が水に難溶の場合
は、４０チジオキサン水溶液で溶解することができる。

次にカルボキシペプチダーゼＹ酵素標品水溶液を調製す
る。

カルボキシペプチダーゼＹの使用量は１　ｍＭ基質に対
して最終濃度５μＩノヲ使用する。これ以上にカルボキ
シペプチダーゼＹの使用量を増加させた場合、アミド化
生成物量は増加するが副反応も多くなるので有効ではな
い。またカルボキシペプチダーゼＹの使用量を一定にし
て基質量を５倍に増加させるとアミド化生成物量は２倍
に増加するが、収率は低下する。

アミド化反応を行なう一領域は、８．５以上のアルカリ
側であり、その最適−は９．０〜９．５の範囲に存在す
る。ｐＨ８，５以下ではカルボキシペプチダーゼＹのペ
プチダーゼ活性がアミド化反応活性よりも優先し、殆ん
どアミド化生成物を得ることができない。

アミド化反応を効率よく行なうためには、より高濃度ア
ンモニア溶液を使用するのが好ましく、その調製時に反
応の目的−も調整する。アンモニア溶液の調製には、■
あらかじめ用意したアンモニウム塩水溶液をアルカリで
ＰＨ調整する方法と■アンモニア水を塩酸々との酸で一
調整する方法とがある。前者の場合、各種のアンモニウ
ム塩を使用することができるが、特に塩化アンモニウム
が最適である。１００ｉｊの５Ｍ塩化アンモニウム水溶
液に８．１９の固形水酸化ナトリウムを添加し−（’ｅ
９．２に調整することにより、最終濃度４．５Ｍのアン
モニア溶液を得ることができる。また、同じ塩化アンモ
ニウム水溶液を２７ｍ１の２５チアンモニア水で−１９
２に調整すると、最終濃度７．１Ｍのアンモニア溶液が
得られる。一方、後者の調製法では、水で希釈した２５
％アンモニア水を塩酸でｐ）！　９．２に調整すること
により、７Ｍ程度のアンモニア溶液が得られる。

ここで、ｄ（９２の条件でアンモニウム溶液トして、４
．５Ｍ塩化アンモニウム−水酸化ナトリウム溶液と７．
０Ｍアンモニア水・塩酸溶液を用いて、実際にアミド化
反応を行々い比較してみると、前者の方がアンモニア濃
度が低いのにも、かかわらず、アミド化生成物の収率は
１５倍程高い。これは、塩化アンモニウム水溶液のＩＩ
Ｊ１調整に水酸化ナトリウムのかわりに水酸化カリウム
または水酸化リチウムを使用しても同様な結果を与える
。アミド化反応は基質浴液、酵素溶液及びアンモニア溶
液全混合して行なうので、４．５Ｍのアンモニア溶液を
使用したとき、反応溶液の最終アンモニア濃度は３．６
Ｍになっている。しかし基質溶液や酵素溶液を使用する
４、５Ｍアンモニア溶液で調製することもでき、この場
合は最終アンモニア濃度は４．５Ｍであり、より高い収
率でアミド化生成物を得ることができる。反応は基質溶
液、カルボキシペプチダーゼＹ溶液およびアンモニア溶
液を好ましくは１：１：８の割合で混合し、３７℃で３
〜５時間反応を実施する。この時、基質の最終濃度は１
ｍＭ程度、カルボキシベゾチダーゼＹのそれは５μＭ１
アンモニアのそれは３．６Ｍ程度が好ましい。アミド化
反応の生成物の同定及び精製は、イオン交換カラムクロ
マトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーなとで行
なうことができる。また反応中、遊離アミノ酸の同定は
アミノ酸自動分析針を使用して行々うことができる。

次に実施例および参考例をあげて本発明の方法をさらに
詳細に説明する。

なお、実施例および参考例中、ＣＢＺ　：カルボベンゾ
キシ、Ａ１．ａ　：アラニン、Ｌｅｕ　：ロイシン、１
１ｅ　：イソロイシン、Ｖａｌ：バリン、Ｐｈｅ　：フ
７一エニルアラニン、Ｇｌｙニゲリシン、ヲ示ス。

Ｐｒｏは前述したものと同意義を示す。

実施例１合成ペゾチド基質ＣＢＺ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅ
ｕ　−ＯＨを７．１ｍＭになるように４０％ジオキサン
水溶液に溶解した。本ペプチド基質は水難溶のために４
０％ジオキサン水溶液を使用した。以下のアミド化反応
において、この程度のジオキサン量は反応に影響しなか
った。カルボキシペゾチダーゼＹ（ペゾチド研究所製）
を３．５　ｍＱ／ｒｎｌ　（５０μＭ）になるように水
に溶解した。５Ｍの塩化アンモニウム水溶液に固形水酸
化ナトリウムを加え、ｐＨ９，５に調整し、４．５Ｍの
アンモニア溶液を調製した。２００μｌの基質溶液、２
００μｌのカルボキシペプチダーゼＹ溶液および１６０
０μｌのアンモニア溶液を混和しく最終アンモニア濃度
は３．６ｋＡ）、３７℃で５時間放置した。反応終了後
、３００μｌの反応溶液に等菫の酢酸エチルを加え混和
し、酢酸エチル層を減圧乾固した。

酢酸エチル抽出物を２００μぎの５０％メタノ−ルー０
．１　％　）　ＩＪフルオロ酢酸に溶解し、その１００
μｌをμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（０，３９Ｘ
３０ｃｒｎ）を用いた高速液体クロマトグラフィーに付
した。

５０チメタノール−０，１＊　）リフルオロ酢酸を用い
て１　ｍ６１分の流速で溶出し、紫外部２６０ｎｍで検
出すると４分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２を認め
た。

また３００μｌの反応溶液に６０μｌの濃塩酸を加えｐ
）１２〜３に調整し、その１８０μｌ’ｃ酢酸エチルで
抽出することなく直接μＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ］　８カ
ラム（０，３９Ｘ３０ｍ）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーに付した。３０％メタノール−０１％トリフル
オロ酢酸で１　ｍｌ１分の流速で溶出し、紫外部２６０
　ｎｍで検出することにより、７．９分にＣＢＺ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２，１０分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−ＯＨ。

２０７分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＨを認
めた。

以上から、各々の生成量を高速液体クロマトグラム上の
標準品に対する面積の値から算出した結果、アミド化生
成物ＣＢＺ　−Ａ−１ａ　−Ｐｒ　ｏ　−ＮＨ２の初期
基質に対する収率は３５．１％、反応副産物ＣＢＺ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨのそれは１９．５％、また残存チ基
質量け約４５俤であった。一方１０μＩの反応溶液をそ
のまま日立膜８３５型高速アミノ酸分析計を用いてアミ
ノ酸分析を行なったところ、初期基質に対して約５５チ
の収率で遊離ロイシンを検出した。このロイシンの収率
はアミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌ　ａ−Ｐｒ　ｏ　−ＮＨ
２及び反応副産物ＣＢＺ−Ａ１．ａ−Ｐｒ。

−ＯＨそれぞれの収率の和に等しかった。

実施例２５Ｍの塩化アンモニウム水溶液に固形水酸化ナトリウム
を加え、ｐｉｆ　９．２に調整し、４．５Ｍのアンモニ
ア溶液を調製した。合成ペプチド基質ＣＢＺ−Ａ１．ａ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＨを７．１　ｍＭになるように４
０チジオキサンーアンモニア溶液に溶解した。カルボキ
シペプチダーゼＹ（ベゾチド研究所製）を３．５　Ｗ／
ｍｌ　（５０μＭ）になるようにアンモニア溶液で溶解
した。２００μｌの基質溶液、２００μｊのカルボキシ
ペプチダーゼＹ溶液および１６００μｌのアンモ；ア溶
液を混和しく最終アンモニア濃度は４．３２Ｍ）、３７
℃で５時間放置した。反応終了後、反応溶液に等量の酢
酸エチルを加え混和［ッ、酢酸エチル層を減圧乾固した
。酢酸エチル抽出物をｌ　ｍｅの５０チメタノール−０
１チドリフルオロ酢酸に溶解し、μＢｏｎｃｉａｐａｋ
　Ｃ１８カラム（０，３６Ｘ３’Ｏｍ）を用いた高速液
体クロマトグラフィーに付ｌ−タ。５０％メタノール−
０，１％）リフルオロ酢酸を用いてｌ　ｒＲ１／分の流
速で溶出し、精製を行々つだ。初期基質に対する収率４
３％アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２を
得た。

実施例３合成ベゾチド基質ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、−
ＯＨを７．１ｍＭになるように４０チジオキサン水溶液
に溶解した。カルボキシペプチダーゼＹ（ベゾチト研究
所製）　ｆ：３．５　ｔｎｙ／ｍｌ　（５０ｐＭ）にな
るように水に溶解した。５Ｍの塩化アンモニウム水溶液
に固形水酸化す）　ＩＪウムを加えｐＨ９，５に調整し
、４、５　Ｍのアンモニア溶液ｆ：調製した。２００Ｈ
の基質溶液、２００μｌのカルボキシペプチダーゼＹ溶
液および１６００μｌのアンモニア溶液を混和ｌ〜（最
終アンモニア濃度は３６Ｍ）、３７℃で５時間放置した
。反応終了後、３０Ｃ１ｌの反応溶液に等量の酢酸エチ
ルを混和１〜、酢酸エチル層を減圧乾固した。酢酸エチ
ル抽出物を２００μＩの５０％メタノール−０１％トリ
フルオロ酢酸に溶解し、その１００μａをμＢｏｎｄａ
ｐａｋＣ１８カラム（０゜３９Ｘ３０ｃｒｎ）を用いた
高速液体クロマトグラフィーに付した。５０饅メタノー
ル−０，１１）　ＩＪフルオロ酢酸でｌ　ｌｌｌ１１分
の流速で溶出し、紫外部２６０　ｎｍで検出すると、４
分にアミド化生成物ＣＢＺ−Ａ、１ａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２
を得た。生成収率は１５．４俤であった。

実施例４合成ペプチド基質ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｈを７．１ｍＭになるように４０チジオキサン水溶液に
溶解した。カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド研究新
製）を３．５　Ｗ／ｍｌ（５０μＭ）になるように水に
溶解した。５Ｍの塩化アンモニウム水溶液に固形水酸化
ナトリウムを加え−（９５に調整し、４．５Ｍのアンモ
ニア溶液を調製した。２００μｌの基質溶液、２００μ
ｌのカルボキシペプチダーゼＹ溶液および１６００μｅ
のアンモニア溶液を混和しく最終アンモニア濃度は３．
６　Ｍ　）　３７℃で５時間放置【７た。反応終了後、
３００μｌの反応溶液に等量の酢酸エチルを混和し、酢
酸エチル層を減圧乾固］７た。酢酸エチル抽出物を２０
０μｅの５０％メタノール−０１ｃＩＩトリフルオロ酢
酸に溶解し、その１００　ｐｅをμＢｏｎｄｐａｋ：　
ＣＩ　８カラム（０，３９Ｘ３０ｃＩｎ）　を用いた高
速液体クロマトグラフィーに付した。５０％メタノール
−０１チドリフルオロ酢酸で１　ｍｌ１分の流速で溶出
し、紫外部２６０　ｎｍで検出すると、４分にアミド化
生成物Ｃ’ＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒ　ｏ−ＮＫ、を得た。生
成収率は１３４チであった。

実施例５合成ベゾチド基質ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌ、ａ−
ＯＨを用いて、実施例１に準じて同様に実施したところ
、アミド化生成物ＣＢＺ”Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２が得
られた。

生成収率は８．０チであった。

実施例６合成ペプチ゛ド基質ＣＢＺ−Ａ、ｌａ−’Ｐｒｏ−１１
ｓ−ＯＨを用いて、実施例１に準じて同様に実施したと
ころ、アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２
が得られた。

生成収率は２２．６％であった。

実施例７ヒトカルシトニンけＣ末端にＰｒｏ−）ＪＨ２を有する
３２個のアミノ酸から構成されるペプチドホルモンであ
る。人工的にこれを生産する場合も同方法によりＣ末端
をアミド化し、ヒトカルシトニン完成品を得ることがで
きた。

遺伝子工学的手法により得られたヒトカルシトニンＩＴ
Ｊｅｕベゾチドを、先ずＲ，Ｄａｖｉｄ、　Ｃｏ１ｅの
方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
ｖｏｌ、　ｌ、　Ｅｄ、ｂｙＣ，Ｈ，Ｗ。

Ｈｌ、ｒｓ　、　ｐｐ２０６　（１９６７）　、　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋａＨｄ　
１，０ｎａＯｎ　）に従って可逆的Ｓ−スルホン酸酸化
性行った。このジスルフィド結合のＳ−スルホン酸化は
、反応液中での試料の不溶化を防ぐためのものである。

５Ｍの塩化アンモニウム水浴液に固形水酸化ナトリウム
を加えｐＨ９，５に調整し％４．５Ｍのアンモニア溶液
を調製した。Ｓ−スルホン酸化ヒトカルシトニン・Ｌｅ
ｕベプチＰを１．７　ｍｌＪになるように４０％ジメチ
ルスルホキサイド−アンモニア溶液に溶解した。ジメチ
ルスルホキサイドは基質の溶解度を高めるために使用し
た。以下のアミド化反応において、この程度のジメチル
スルホキサイド量は反応に影響しなかった。カルボキン
ペプチダーゼＹ（ペプチド研究断裂）を３，５９々１（
５０ＭＭ）に々るようにアンモニア溶液に溶解した。５
０Ｍｇの基質溶液、５０μｌのカルボキシペプチダーゼ
Ｙ溶液および４００μｌのアンモニア溶液を混和しく最
終アンモニア濃度は４．３２Ｍ）　、３７℃で３０分間
放置した。反応は１００μｌの濃ギ酸および１５００μ
ぎの８Ｍ尿素溶液を加え停止させた。

得られた反応溶液の２１０μｌをＴＳＫｇｅｌ　０ＤＳ
−１２０Ｔ　（４，６Ｘ２５０ｘ：東洋曹達工業（ａ）
社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーに付した。

溶媒Ａ　：　１０　ｍＭ重炭酸アンモニウム、溶媒Ｂニ
アセトニトリルによる溶媒Ｂの直接濃度勾配法（０−１
０％（０〜４分）、１０−５５チ（４〜６０分））を用
いて０．８　ｔｔｒｌ／＋の流速で溶出し、紫外部２２
５ｎｍで検出することにより、３７．１５分にアミド化
生成物、３６１６分に未反応の基質、３５．１７分にア
ミド化されなかった反応副産物を認めた。以上から、各
々の生成量を高速液体クロマトグラム上の標準品に対す
る面積の値から算出した結果、アミド化生成物Ｓ−スル
ホン酸化ヒトカルシ）＝ンの初期基質に対する収率は２
４．７％であり、残存基質量け５７チであり、反応副産
物は１７．２％であった。アミド化生成物Ｓ−スルホン
酸化ヒトカルシトニンを２７還元型グに夕ｆオン、Ｉｍ
Ｍエチレンジアミンニ酢酸ナトリウムの存在下、１０　
ｍＭ重戻酸アンモニウム（ｐｉ（７，９）中で室温で７
時間反応することにより、ヒトカルシトニンを得た。

参考例１合成ペプチド基質ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｈを用いて、実施例１に準じて同様に実施したところ、
アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ２は得ら
れなかった。

％許出願人　三共株式会社

Claims

【特許請求の範囲】１、Ｃ末端プロリンにロイシン、イソロイシン、バリン
、フェニルアラニンおよびアラニンから選ばれたアミノ
酸の一種を有するペプチドにアンモニアの存在下、カル
ボキシペプチダーゼＹを作用させることを特徴とする、
Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法。２、使用するアンモニア溶液が塩化アンモニウム−水酸
化ナトリウム、塩化アンモニウム−水酸化ナトリウムま
たは塩化アンモニウム−水酸化リチウムである特許請求
の範囲第１項記載の製法。