JPS6231720B2 - - Google Patents
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- JPS6231720B2 JPS6231720B2 JP51049756A JP4975676A JPS6231720B2 JP S6231720 B2 JPS6231720 B2 JP S6231720B2 JP 51049756 A JP51049756 A JP 51049756A JP 4975676 A JP4975676 A JP 4975676A JP S6231720 B2 JPS6231720 B2 JP S6231720B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pertussis
- antigen
- protective
- denaturing agent
- bordetella pertussis
- Prior art date
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- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はボルデテラ・ペルツシス
（Bordetellapertussis、百日咳菌）の保護抗原お
よび該保護抗原を含有する百日咳ワクチンに関す
る。
（Bordetellapertussis、百日咳菌）の保護抗原お
よび該保護抗原を含有する百日咳ワクチンに関す
る。
百日咳に対する能動免疫のための従来の百日咳
接種素は大抵の場合ボルデテラ・ペルツシスの死
菌を含有している。百日咳菌については接種の
際、しばしば局所的に接種部位に疼痛および炎症
を起こすほか発熱させたり、またまれにではある
が恐るべき脳脊髄膜炎のような神経学的合併症を
ひき起こすことのあることも知られている。
接種素は大抵の場合ボルデテラ・ペルツシスの死
菌を含有している。百日咳菌については接種の
際、しばしば局所的に接種部位に疼痛および炎症
を起こすほか発熱させたり、またまれにではある
が恐るべき脳脊髄膜炎のような神経学的合併症を
ひき起こすことのあることも知られている。
そのため、許容性を改良するために、菌含有接
種素の代りに抽出接種素を用いる試みが既になさ
れている。これまで幾度か報告されている塩類溶
液を用いた百日咳菌からの抽出物の製造によつて
は、実際には、わずかな部分の保護抗原複合体し
か溶出されない。すなわち、収率は比較的低く、
また抽出物は菌と同様多数の成分から成り、それ
ら成分は一部有毒でありまた接種の際の接種素の
許容性に何の改良を加えるものではない。
種素の代りに抽出接種素を用いる試みが既になさ
れている。これまで幾度か報告されている塩類溶
液を用いた百日咳菌からの抽出物の製造によつて
は、実際には、わずかな部分の保護抗原複合体し
か溶出されない。すなわち、収率は比較的低く、
また抽出物は菌と同様多数の成分から成り、それ
ら成分は一部有毒でありまた接種の際の接種素の
許容性に何の改良を加えるものではない。
その塩類抽出物を更に精製することは、抗原物
質の多分散性の故に著しく制限される。通常の生
化学的精製方法によつても、本質的に保護活性を
いくつかのフラクシヨンに分けるにすぎず、その
場合、特異的保護活性を本質的に高めることはで
きない。
質の多分散性の故に著しく制限される。通常の生
化学的精製方法によつても、本質的に保護活性を
いくつかのフラクシヨンに分けるにすぎず、その
場合、特異的保護活性を本質的に高めることはで
きない。
収率を改善するために、百日咳菌を例えば超音
波で可溶性にする試みもすでになされている。装
置費の増大は別としても、この方法はやはり満足
すべきものではない。何故なら、この方法によつ
ては、保護抗原の純度を高めるという問題は解決
できなかつたからである。
波で可溶性にする試みもすでになされている。装
置費の増大は別としても、この方法はやはり満足
すべきものではない。何故なら、この方法によつ
ては、保護抗原の純度を高めるという問題は解決
できなかつたからである。
ここで4M尿素を含む水性食塩溶液を用いて処
理することによりいわゆる百日咳菌のヒスタミン
感作因子を得ることができるということに触れて
おく価値がある。その場合、ヒスタミン感作に関
する活性低下なしには尿素を除去することはでき
なかつた。このヒスタミン感作活性が保護抗原に
全面的にまたは部分的に相当するかどうかは疑問
である。各種の成分が関係しているという指摘の
ほかに、22S−百日咳抗原の尿素処理により保護
活性が破壊されるということも報告されている
（Symp.Series Immunobiol.Standard.，13巻、
214〜220頁参照）。
理することによりいわゆる百日咳菌のヒスタミン
感作因子を得ることができるということに触れて
おく価値がある。その場合、ヒスタミン感作に関
する活性低下なしには尿素を除去することはでき
なかつた。このヒスタミン感作活性が保護抗原に
全面的にまたは部分的に相当するかどうかは疑問
である。各種の成分が関係しているという指摘の
ほかに、22S−百日咳抗原の尿素処理により保護
活性が破壊されるということも報告されている
（Symp.Series Immunobiol.Standard.，13巻、
214〜220頁参照）。
本発明は保護抗原複合体を可溶性の形で百日咳
菌から、従来よりも高い収率および場合により従
来より高い純度で得、そしてその精製抗原を本質
的に有効な割合で百日咳接種素に用いることを目
的としている。
菌から、従来よりも高い収率および場合により従
来より高い純度で得、そしてその精製抗原を本質
的に有効な割合で百日咳接種素に用いることを目
的としている。
今般、百日咳菌を変性剤の溶液で処理しそして
該菌を分離する方法によりこの目的を達成できる
ことを見出した。可溶化された物質は直接または
変性媒体中でさらに精製した後に非水溶性担体に
吸着させてもよい。
該菌を分離する方法によりこの目的を達成できる
ことを見出した。可溶化された物質は直接または
変性媒体中でさらに精製した後に非水溶性担体に
吸着させてもよい。
それ故、本発明の対象はボルデテラ・ペルツシ
スの菌（病原体）を、蛋白分子のサブユニツトへ
の解離を特に水素結合の解裂を通して行うことの
できる変性剤および中性塩の水性溶液と混合し、
液状上澄み液を菌残渣から分離し次いで前記変性
剤を保護抗原の水性懸濁液から分離することによ
り得られたボルデテラ・ペルツシスの保護抗原お
よび該保護抗原を含有する百日咳ワクチンであ
る。
スの菌（病原体）を、蛋白分子のサブユニツトへ
の解離を特に水素結合の解裂を通して行うことの
できる変性剤および中性塩の水性溶液と混合し、
液状上澄み液を菌残渣から分離し次いで前記変性
剤を保護抗原の水性懸濁液から分離することによ
り得られたボルデテラ・ペルツシスの保護抗原お
よび該保護抗原を含有する百日咳ワクチンであ
る。
実際上菌の抽出につながる前述の溶液による百
日咳菌処理は、最も簡単な場合には、該溶液に可
及的均一に懸濁された菌を放置することにより行
なわれる。しかしながらこの手段には極めて長い
抽出時間を考慮に入れる必要がある。菌をゆるや
かに動かす（これは例えば簡単な撹拌により達成
することができる）だけで抽出効率は改善され
る。ホモゲナイズする目的に対して知られている
ような装置も収率増大および時間の短縮の目的に
有利に用いることができる。適用した揺動手段に
より差はあるが、抽出時間は約0.5〜48時間であ
る。平均的には、18時間の抽出時間を考慮する必
要がある。
日咳菌処理は、最も簡単な場合には、該溶液に可
及的均一に懸濁された菌を放置することにより行
なわれる。しかしながらこの手段には極めて長い
抽出時間を考慮に入れる必要がある。菌をゆるや
かに動かす（これは例えば簡単な撹拌により達成
することができる）だけで抽出効率は改善され
る。ホモゲナイズする目的に対して知られている
ような装置も収率増大および時間の短縮の目的に
有利に用いることができる。適用した揺動手段に
より差はあるが、抽出時間は約0.5〜48時間であ
る。平均的には、18時間の抽出時間を考慮する必
要がある。
抽出温度は１〜40℃が都合がよい。室温以下の
温度、約１〜10℃の温度範囲が好ましい。
温度、約１〜10℃の温度範囲が好ましい。
混合物は前記抽出時間の間６〜10のPH値、好ま
しくはPH８に保たれる。このPH値に単独では調整
されない場合は適当な緩衝液を添加することによ
りそのPH値にすることもできる。
しくはPH８に保たれる。このPH値に単独では調整
されない場合は適当な緩衝液を添加することによ
りそのPH値にすることもできる。
抽出液と菌残渣の分離は遠心分離により行なわ
れる。微生物の通過を阻止し得る過装置もまた
菌体不含抽出液を得るのに適している。
れる。微生物の通過を阻止し得る過装置もまた
菌体不含抽出液を得るのに適している。
驚くべきことに、変性剤を含む溶液中の保護抗
原が比較的単一に構成された物質の性質を示すこ
とを見出した。それ故該抗原を更に精製すること
は変性剤の存在下に行なえば可能である。そのた
めの適切な手段としては例えばゲルクロマトグラ
フイーが挙げられ、その場合変性剤を含有する緩
衝液で展開すれば保護抗原から有毒成分を分離す
ることができる。このゲルクロマトグラフイーの
ための媒体としては、特にエピクロルヒドリンで
網状化したデキストラン（ウプサラのフアルマシ
ア社からSephadex（商品名）として市販されて
いる）またはアクリルアミドとメチレンビスアク
リルアミドとの共重合体（米国リツチモンドのバ
イオーラド・ラボラトリーズ社からBio−Gel Ｐ
（商品名）として市販されている）が特に適して
いる。
原が比較的単一に構成された物質の性質を示すこ
とを見出した。それ故該抗原を更に精製すること
は変性剤の存在下に行なえば可能である。そのた
めの適切な手段としては例えばゲルクロマトグラ
フイーが挙げられ、その場合変性剤を含有する緩
衝液で展開すれば保護抗原から有毒成分を分離す
ることができる。このゲルクロマトグラフイーの
ための媒体としては、特にエピクロルヒドリンで
網状化したデキストラン（ウプサラのフアルマシ
ア社からSephadex（商品名）として市販されて
いる）またはアクリルアミドとメチレンビスアク
リルアミドとの共重合体（米国リツチモンドのバ
イオーラド・ラボラトリーズ社からBio−Gel Ｐ
（商品名）として市販されている）が特に適して
いる。
本発明方法の範囲に包含される緩衝物質として
は、生化学的操作において溶液のPH値安定化に用
いられる化合物が挙げられ、有利には、
Handbook of Biochemistry.（オハイオ洲、クリ
ーブランド）、第２版、J238頁に記載されている
化合物、例えばトリスー（ヒドロキシメチル）−
アミノメタンなどが挙げられる。使用緩衝液に少
量（約１〜20mM）のいわゆるキレート形成剤ま
たは錯体形成剤、例えばエチレンジアミン−テト
ラアセテート（EDTA）を添加するのが好都合で
あることが判明した。
は、生化学的操作において溶液のPH値安定化に用
いられる化合物が挙げられ、有利には、
Handbook of Biochemistry.（オハイオ洲、クリ
ーブランド）、第２版、J238頁に記載されている
化合物、例えばトリスー（ヒドロキシメチル）−
アミノメタンなどが挙げられる。使用緩衝液に少
量（約１〜20mM）のいわゆるキレート形成剤ま
たは錯体形成剤、例えばエチレンジアミン−テト
ラアセテート（EDTA）を添加するのが好都合で
あることが判明した。
吸着剤の使用に際してのその選択は本質的に、
所望する保護抗原の使用目的に依存する。百日咳
接種素の好ましい適用範囲に対しては、吸着剤と
しては、ワクチン製造において試験、確認されて
いる免疫学的アジユバントを用いるのが好まし
い。これは無機系のもの、例えばりん酸カルシウ
ムまたは酸化アルミニウムなどがあつてもよく、
また好ましくはAlPO4および（または）Ｃγ−水
酸化アルミニウムを0.05％〜0.4％好ましくは0.05
％〜0.2％（ｗ／ｖ）の最終濃度（完成品中の固
体物質濃度）として用いる。しかしながら有機ポ
リマー、特に変性剤の存在する溶液に不溶である
多陰イオン性アジユバント、例えばポリアクリル
酸の誘導体なども挙げることができる。人間およ
び動物への適用を意図しない場合にはあらゆる任
意の、蛋白吸着に用いられるアジユバントを保護
抗原に添加することができる。
所望する保護抗原の使用目的に依存する。百日咳
接種素の好ましい適用範囲に対しては、吸着剤と
しては、ワクチン製造において試験、確認されて
いる免疫学的アジユバントを用いるのが好まし
い。これは無機系のもの、例えばりん酸カルシウ
ムまたは酸化アルミニウムなどがあつてもよく、
また好ましくはAlPO4および（または）Ｃγ−水
酸化アルミニウムを0.05％〜0.4％好ましくは0.05
％〜0.2％（ｗ／ｖ）の最終濃度（完成品中の固
体物質濃度）として用いる。しかしながら有機ポ
リマー、特に変性剤の存在する溶液に不溶である
多陰イオン性アジユバント、例えばポリアクリル
酸の誘導体なども挙げることができる。人間およ
び動物への適用を意図しない場合にはあらゆる任
意の、蛋白吸着に用いられるアジユバントを保護
抗原に添加することができる。
変性剤の除去は好都合には透析によつて行なわ
れる。生理学的媒体中の保護抗原は透析膜を通過
できないので、変性剤が膜を通して出て行くにつ
れて吸着剤上の保護抗原は沈殿する。
れる。生理学的媒体中の保護抗原は透析膜を通過
できないので、変性剤が膜を通して出て行くにつ
れて吸着剤上の保護抗原は沈殿する。
滅菌製剤を所望する場合には、抽出から、場合
により吸着された完成物質に至るまでの操作を滅
菌条件下に行なうことができる。あるいは変性剤
を除去する前、および場合により吸着剤を添加す
る前に、除菌過を行なう。その場合、以後の操
作を滅菌条件下に行なう必要がある。
により吸着された完成物質に至るまでの操作を滅
菌条件下に行なうことができる。あるいは変性剤
を除去する前、および場合により吸着剤を添加す
る前に、除菌過を行なう。その場合、以後の操
作を滅菌条件下に行なう必要がある。
本発明方法に用いる変性剤としては、それによ
つて蛋白分子のサブユニツトへの解離を特に水素
結合の溶解を通して行なうことのできる化合物が
挙げられる。この目的に対しては尿素またはグア
ニジンおよびその塩、特に塩酸グアニジンなどが
適している。変性剤は全溶液に対し２〜６モル／
ｌ、好ましくは４〜６モル／ｌの濃度で用いられ
る。
つて蛋白分子のサブユニツトへの解離を特に水素
結合の溶解を通して行なうことのできる化合物が
挙げられる。この目的に対しては尿素またはグア
ニジンおよびその塩、特に塩酸グアニジンなどが
適している。変性剤は全溶液に対し２〜６モル／
ｌ、好ましくは４〜６モル／ｌの濃度で用いられ
る。
中性塩について水溶性ハロゲン化アルカリ、例
えばNaClまたはKClが好ましく、また全溶液に
対し0.5〜３モル／ｌ、特に１モル／ｌの濃度で
用いるのが好ましい。変性剤と中性塩とは保護抗
原の抽出に際し相剰効果を示す。
えばNaClまたはKClが好ましく、また全溶液に
対し0.5〜３モル／ｌ、特に１モル／ｌの濃度で
用いるのが好ましい。変性剤と中性塩とは保護抗
原の抽出に際し相剰効果を示す。
本発明方法のための出発材料としてはボルデテ
ラ・ペルツシス菌が挙げられる。その菌は、既知
の方法により、例えば約35℃で撹拌下にCohen−
Wheeler栄養液中で培養することによつて増殖さ
れ、そして酸析、有機溶媒による析出、または遠
心分離により得られる。菌の富化に際しては例え
ば、ボルデテラ・ペルツシス培養液を、PH３〜
５、好ましくはPH４での酸析に付して処理する。
この酸処理にはあらゆる鉱酸（好ましくは1N塩
酸）、および有機酸（例えば酢酸）が適してい
る。遠心分離により培地から分離された菌も、ア
セトンまたは酸により沈殿させた菌と同様十分適
している。菌は有利には水性懸濁液として用いら
れる。濃度は50×109〜1000×109、好ましくは
100×109〜400×109／mlであつてもよい。
ラ・ペルツシス菌が挙げられる。その菌は、既知
の方法により、例えば約35℃で撹拌下にCohen−
Wheeler栄養液中で培養することによつて増殖さ
れ、そして酸析、有機溶媒による析出、または遠
心分離により得られる。菌の富化に際しては例え
ば、ボルデテラ・ペルツシス培養液を、PH３〜
５、好ましくはPH４での酸析に付して処理する。
この酸処理にはあらゆる鉱酸（好ましくは1N塩
酸）、および有機酸（例えば酢酸）が適してい
る。遠心分離により培地から分離された菌も、ア
セトンまたは酸により沈殿させた菌と同様十分適
している。菌は有利には水性懸濁液として用いら
れる。濃度は50×109〜1000×109、好ましくは
100×109〜400×109／mlであつてもよい。
百日咳接種素の活性はKendrickが1947年に報
告した方法により動物実験で測定される（P.L.
Kendrick.G.Eldering.M.K.DixonおよびJ.
Misner.Amer.J.Publ.Health37803（1947）およ
びFed.Reg.33，No.118，8818、パラグラフ73.404
（1968）参照）。その場合、各18匹のマウスを、百
日咳抗原を３種の希釈段階で用いて免疫しそして
負荷し得る免疫力を、ボルデテラ・ペルツシスの
生菌のLD50の200倍量を脳内感染させることによ
り検査する。標準製剤として常に、保護価の分つ
ているワクチンを並行的に用いる。この試験で得
られる保護価は人間における接種素の保護作用の
尺度となる（Medical Res.Council Brit.Med.J.
No.5128，994（1959）参照）。
告した方法により動物実験で測定される（P.L.
Kendrick.G.Eldering.M.K.DixonおよびJ.
Misner.Amer.J.Publ.Health37803（1947）およ
びFed.Reg.33，No.118，8818、パラグラフ73.404
（1968）参照）。その場合、各18匹のマウスを、百
日咳抗原を３種の希釈段階で用いて免疫しそして
負荷し得る免疫力を、ボルデテラ・ペルツシスの
生菌のLD50の200倍量を脳内感染させることによ
り検査する。標準製剤として常に、保護価の分つ
ているワクチンを並行的に用いる。この試験で得
られる保護価は人間における接種素の保護作用の
尺度となる（Medical Res.Council Brit.Med.J.
No.5128，994（1959）参照）。
菌密度100×109個／mlの百日咳菌懸濁液を抽出
する場合、本明細書に記載の本発明方法の適用条
件に応じて25〜75IE／mlの値が認められた。少
なくとも8IE／mlの接種素は、有効接種素として
一般に認められている。
する場合、本明細書に記載の本発明方法の適用条
件に応じて25〜75IE／mlの値が認められた。少
なくとも8IE／mlの接種素は、有効接種素として
一般に認められている。
毒性は米国健康教育福祉省（U.S.Department
of Health，Education and Welfare）の基準に
従つて測定する。
of Health，Education and Welfare）の基準に
従つて測定する。
10匹のマウスに、１：２に希釈した供試百日咳
ワクチン0.5mlを投与した。国立健康研究所
（National Institutes of Health，略称NIH）の要
求するところによれば（Federal Reg.33，No.
118，8818，（1968）パラグラフ73.403参照）、３
ｇ／７日の重量増加が必要とされる。本発明によ
り製造された抗原の場合、動物の平均重量増加は
72時間後で１〜３ｇそして７日後で５〜6gであ
る。それ故この抗原は百日咳菌の有毒部分を全く
含んでおらず、また十分許容性がある。
ワクチン0.5mlを投与した。国立健康研究所
（National Institutes of Health，略称NIH）の要
求するところによれば（Federal Reg.33，No.
118，8818，（1968）パラグラフ73.403参照）、３
ｇ／７日の重量増加が必要とされる。本発明によ
り製造された抗原の場合、動物の平均重量増加は
72時間後で１〜３ｇそして７日後で５〜6gであ
る。それ故この抗原は百日咳菌の有毒部分を全く
含んでおらず、また十分許容性がある。
前述の百日咳保護抗原の製造法のほか、本発明
の対象は、本発明方法による製造により明らかと
なるパラメータにより特徴付けられる保護抗原で
ある。
の対象は、本発明方法による製造により明らかと
なるパラメータにより特徴付けられる保護抗原で
ある。
最後に、本発明の対象は、本発明の百日咳保護
抗原を含有する剤、特に百日咳予防のための、ま
たは治療的にまたは診断的に用いることのできる
百日咳抗血清を製造するための百日咳接種素、お
よび百日咳保護抗原またはそれより得られた抗血
清を含有する診断用製剤である。本発明により製
造できる百日咳接種素は非経口および経口適用に
適している。
抗原を含有する剤、特に百日咳予防のための、ま
たは治療的にまたは診断的に用いることのできる
百日咳抗血清を製造するための百日咳接種素、お
よび百日咳保護抗原またはそれより得られた抗血
清を含有する診断用製剤である。本発明により製
造できる百日咳接種素は非経口および経口適用に
適している。
本発明の抗原の溶液または懸濁液は抗微生物性
保存剤（例えばナトリウムチメルフオネート）と
混合することができる。本発明の百日咳抗原は多
価接種素を製造するために、他の抗原および（ま
たは）トキソイドと常法により混合することがで
きる。
保存剤（例えばナトリウムチメルフオネート）と
混合することができる。本発明の百日咳抗原は多
価接種素を製造するために、他の抗原および（ま
たは）トキソイドと常法により混合することがで
きる。
本発明は百日咳保護抗原または百日咳接種素の
製造において本質的進歩を意味する。本発明の方
法は簡便である。達成される、吸着された抽出抗
原の保護活性は従来から文献に知られているデー
タに比べて著しく高い。抽出における収率の高い
ことは6M尿素抽出に付された菌はその保護活性
の80％またはそれ以上を失つてしまうことからも
明らかである。それに対し塩類抽出した菌の場
合、抽出液分離後10〜20％の保護活性喪失をみる
にすぎない。変性性媒体中の抗原抽出液が本質的
多分散性を全く示さないことから、有毒成分の分
離が可能である。従つてこの抗原を人間、特に小
児に適用した場合に著しい抗原許容性を期待する
ことができる。
製造において本質的進歩を意味する。本発明の方
法は簡便である。達成される、吸着された抽出抗
原の保護活性は従来から文献に知られているデー
タに比べて著しく高い。抽出における収率の高い
ことは6M尿素抽出に付された菌はその保護活性
の80％またはそれ以上を失つてしまうことからも
明らかである。それに対し塩類抽出した菌の場
合、抽出液分離後10〜20％の保護活性喪失をみる
にすぎない。変性性媒体中の抗原抽出液が本質的
多分散性を全く示さないことから、有毒成分の分
離が可能である。従つてこの抗原を人間、特に小
児に適用した場合に著しい抗原許容性を期待する
ことができる。
次に本発明を実施例によつて説明する。
実施例 １
100×109個／ml濃度の百日咳菌懸濁液40lに、
50mMのEDTAを含有するPH8.0の1Mトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン−HCl緩衝液1lを
添加する。その混合後、14.4Kgの尿素および3.48
KgのNaClを添加し、容量を水で60lの容量に調節
し、そしてその懸濁液を一夜磁気撹拌器を用いて
撹拌する。菌を遠心分離（Sharpless−
Durchlauf遠心分離、45000rpm（50000gに相
当）、処理量10l／ｈ）により除去後、１％Al
（OH）3の懸濁液と混合したAlPO4の２％懸濁液3l
を添加する。次いで、アミコン（Amicon）社製
中空繊維装置において滅菌0.15M NaClに対して
透析することにより尿素を除去する。吸着物の沈
着後、全容量を等張食塩溶液で40lに調節する。
このように調製した免疫原はKendrick法による
保護試験において、25IE／mlを示した。
50mMのEDTAを含有するPH8.0の1Mトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン−HCl緩衝液1lを
添加する。その混合後、14.4Kgの尿素および3.48
KgのNaClを添加し、容量を水で60lの容量に調節
し、そしてその懸濁液を一夜磁気撹拌器を用いて
撹拌する。菌を遠心分離（Sharpless−
Durchlauf遠心分離、45000rpm（50000gに相
当）、処理量10l／ｈ）により除去後、１％Al
（OH）3の懸濁液と混合したAlPO4の２％懸濁液3l
を添加する。次いで、アミコン（Amicon）社製
中空繊維装置において滅菌0.15M NaClに対して
透析することにより尿素を除去する。吸着物の沈
着後、全容量を等張食塩溶液で40lに調節する。
このように調製した免疫原はKendrick法による
保護試験において、25IE／mlを示した。
同じ出発材料から、菌を0.5M NaCHで処理す
ることにより調製した免疫原は前記保護試験にお
いて4.5IE／mlを示すにすぎなかつた。
ることにより調製した免疫原は前記保護試験にお
いて4.5IE／mlを示すにすぎなかつた。
マウスで測定した毒性：３日目＋3.2g；７日目
＋5.8g。
＋5.8g。
実施例 ２
200×109個／mlの濃度および6M塩酸グアニジ
ン＋1M NaClの水性溶液から出発するほかは実
施例１と同様に行なつた抽出法では、免疫原の保
護価は76IE／mlであつた。
ン＋1M NaClの水性溶液から出発するほかは実
施例１と同様に行なつた抽出法では、免疫原の保
護価は76IE／mlであつた。
マウスで測定した毒性：３日目＋1.0g；７日目
＋5.2g。
＋5.2g。
実施例 ３
尿素を14.4Kgではなく9.6Kg用いるほかは実施
例１と同様にして得られた免疫原を限外過器で
2lに濃縮し、そして抽出緩衝液（4M尿素を含
有）で平衡にしたSephadex Ｇ−150（商品名）
のカラムにかける。前記濃縮され抽出液はクロマ
トグラフイーにかける前は、80×109個／mlに等
しい量において8.25IE／ml（130IE／mg蛋白に相
当）を示した。カラムの排出容量に相当する物質
を約90.000の分子量となるまでプールし、そして
0.15M食塩溶液に対し透析することにより尿素を
除く。クロマトグラフイー後に得られる分画は
360×109個／mlの菌密度に等しい容量となるまで
濃縮したところ、保護試験において84.3IE／ml
（525IE／mg蛋白に相当）を示した。
例１と同様にして得られた免疫原を限外過器で
2lに濃縮し、そして抽出緩衝液（4M尿素を含
有）で平衡にしたSephadex Ｇ−150（商品名）
のカラムにかける。前記濃縮され抽出液はクロマ
トグラフイーにかける前は、80×109個／mlに等
しい量において8.25IE／ml（130IE／mg蛋白に相
当）を示した。カラムの排出容量に相当する物質
を約90.000の分子量となるまでプールし、そして
0.15M食塩溶液に対し透析することにより尿素を
除く。クロマトグラフイー後に得られる分画は
360×109個／mlの菌密度に等しい容量となるまで
濃縮したところ、保護試験において84.3IE／ml
（525IE／mg蛋白に相当）を示した。
以下に本発明により開示された新規な技術的事
項を要約して示す。
項を要約して示す。
１ ボルデテラ・ペルツシスの菌（病原体）を変
性剤のおよび中性塩の水性溶液と混合し、液状
上澄み液を菌残渣から分離し次いで前記変性剤
を吸着された保護抗原の水性懸濁液から分離す
ることを特徴とするボルデテラ・ペルツシスの
保護抗原の製造方法。
性剤のおよび中性塩の水性溶液と混合し、液状
上澄み液を菌残渣から分離し次いで前記変性剤
を吸着された保護抗原の水性懸濁液から分離す
ることを特徴とするボルデテラ・ペルツシスの
保護抗原の製造方法。
２ 変性剤を分離する前に非水溶性吸着剤を添加
する前記第１項の方法。
する前記第１項の方法。
３ 菌を水性溶液中50×109〜1000×109／mlの濃
度で用いる前記第１〜２項の方法。
度で用いる前記第１〜２項の方法。
４ 変性剤として尿素またはグアニジン、または
尿素塩またグアニジン塩を用いる前記第１〜３
項の方法。
尿素塩またグアニジン塩を用いる前記第１〜３
項の方法。
５ 液状上澄み液を変性剤の存在下に、非水溶性
吸着剤の添加前に精製する前記第１〜４項の方
法。
吸着剤の添加前に精製する前記第１〜４項の方
法。
６ 変性剤を２〜６モル／ｌの濃度で用いる前記
第１〜55項の方法。
第１〜55項の方法。
７ 中性塩として塩化ナトリウムおよび（また
は）塩化カリウムを用いる前記第１〜６項の方
法。
は）塩化カリウムを用いる前記第１〜６項の方
法。
８ 中性塩を0.3〜３モル／ｌの濃度で用いる前
記第１〜７項の方法。
記第１〜７項の方法。
９ ６〜10のPH値で操作する前記第１〜８項の方
法。
法。
10 １〜40℃の温度で操作する前記第１〜９項の
方法。
方法。
11 非水溶性吸着剤としてAlPO4および（また
は）Ｃγ−水酸化アルミニウムを0.05〜0.2％
好ましくは0.05〜0.2％の濃度で用いる前記１
〜10項の方法。
は）Ｃγ−水酸化アルミニウムを0.05〜0.2％
好ましくは0.05〜0.2％の濃度で用いる前記１
〜10項の方法。
12 前記第１〜11項の方法により得られるパラメ
ータにより特徴付けられる保護用百日咳抗原。
ータにより特徴付けられる保護用百日咳抗原。
13 前記第12項の百日咳抗原を含有する剤。
14 前記第12項の百日咳抗原を含有する百日咳ワ
クチン。
クチン。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ボルデテラ・ペルツシスの菌（病原体）を、
蛋白分子のサブユニツトへの解離を特に水素結合
の解裂を通して行うことのできる変性剤および中
性塩の水性溶液と混合し、液状上澄み液を菌残渣
から分離し次いで前記変性剤を保護抗原の水性懸
濁液から分離することにより得られたボルデテ
ラ・ペルツシスの保護抗原。 ２ ボルデテラ・ペルツシスの菌（病原体）を、
蛋白分子のサブユニツトへの解離を特に水素結合
の解裂を通して行うことのできる変性剤および中
性塩の水性溶液と混合し、液状上澄み液を菌残渣
から分離し次いで前記変性剤を保護抗原の水性懸
濁液から分離することにより得られたボルデテ
ラ・ペルツシスの保護抗原を含有する百日咳ワク
チン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4975676A JPS52134018A (en) | 1976-04-30 | 1976-04-30 | Antigen for protecting pertussis and vacczne containing same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4975676A JPS52134018A (en) | 1976-04-30 | 1976-04-30 | Antigen for protecting pertussis and vacczne containing same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS52134018A JPS52134018A (en) | 1977-11-09 |
| JPS6231720B2 true JPS6231720B2 (ja) | 1987-07-09 |
Family
ID=12840021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4975676A Granted JPS52134018A (en) | 1976-04-30 | 1976-04-30 | Antigen for protecting pertussis and vacczne containing same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS52134018A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5835121A (ja) * | 1981-08-20 | 1983-03-01 | ビラス・ヴィー・リクハイト | 免疫刺激性補助剤からなる抗原及び免疫療法におけるその使用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3395219A (en) * | 1964-12-11 | 1968-07-30 | Merck & Co Inc | Process for production of pertussis antigen |
| US3405218A (en) * | 1965-09-22 | 1968-10-08 | Parke Davis & Co | Extracting bordetella pertussis antigens with lithium bromide |
-
1976
- 1976-04-30 JP JP4975676A patent/JPS52134018A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS52134018A (en) | 1977-11-09 |
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