JPS6231912B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6231912B2 JPS6231912B2 JP57194917A JP19491782A JPS6231912B2 JP S6231912 B2 JPS6231912 B2 JP S6231912B2 JP 57194917 A JP57194917 A JP 57194917A JP 19491782 A JP19491782 A JP 19491782A JP S6231912 B2 JPS6231912 B2 JP S6231912B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cah
- solution
- creatine
- stabilizer
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、クレアチンアミジノヒドロラーゼ
（以下CAHと略記）を安定な状態で含有するCAH
製剤に関するものである。 クレアチンは飢餓、熱疾患、腎疾患、筋肉疾
患、甲状腺機能亢進症等の発病に際して、又は妊
娠等に際して尿中に出現するアミノ酸であり、又
クレアチニンは尿の正常成分であるが、正常人の
１日当りの排出量はほぼ一定とされている。従つ
てクレアチンやクレアチニンの体液濃度を測定す
ることは、臨床検査において重要な指標を与える
ものと考えられており、これらの定量分析に供さ
れるCAH製剤は重要な診断用酵素剤としての位
置を占めている。 従来CAHは、他の酵素との共役、あるいは化
学的測定法との組合わせによつて分析に供されて
きたが、例えばピクリン酸を用いる化学的測定法
よりも、特異性の高い酵素法との組合わせによる
測定法が注目される様になつてきている。即ち後
者の方法は、
（以下CAHと略記）を安定な状態で含有するCAH
製剤に関するものである。 クレアチンは飢餓、熱疾患、腎疾患、筋肉疾
患、甲状腺機能亢進症等の発病に際して、又は妊
娠等に際して尿中に出現するアミノ酸であり、又
クレアチニンは尿の正常成分であるが、正常人の
１日当りの排出量はほぼ一定とされている。従つ
てクレアチンやクレアチニンの体液濃度を測定す
ることは、臨床検査において重要な指標を与える
ものと考えられており、これらの定量分析に供さ
れるCAH製剤は重要な診断用酵素剤としての位
置を占めている。 従来CAHは、他の酵素との共役、あるいは化
学的測定法との組合わせによつて分析に供されて
きたが、例えばピクリン酸を用いる化学的測定法
よりも、特異性の高い酵素法との組合わせによる
測定法が注目される様になつてきている。即ち後
者の方法は、
【表】
の反応によつて、クレアチニンをクレアチンと
し、更にクレアチンをザルコシンと尿素に分解
し、生成したザルコシンと尿素を、更に他の酵素
と組合わせるか、あるいは化学的な方法と組合わ
せて測定し、目的とするクレアチニン及びクレア
チンを定量するものであつて、CAHはこの方法
において重要な役割を果している。 しかしながらCAHを溶液状態で保存しておく
と、保存中に著しい変性が進んで濁りを発生する
こともあり、測定精度に重大な悪影響を及ぼすと
いう問題があつた。 本発明者等はこの様な事情を憂慮し、CAHを
含有する酵素製剤の安定化について種々検討した
結果、以下述べる様な組成からなる酵素製剤とす
れば、CAHを溶液状で保存しても前述の様な変
性や濁りが生じないことを見出し、本発明を完成
するに至つた。即ち本発明のCHA製剤とは、
CAHを必須成分として含有する他、HLB15以上
の非イオン性界面活性剤、又は該界面活性剤をキ
レート化剤及び／又は防腐剤より成る群から選択
される１種以上（以下これらを総称して安定化剤
と述べる）を含有させた点に要旨が存在するもの
である。 本明細書にいうCAHとは、その起源を問わず
全て安定化の対象となるが、特に繁用されるの
は、シユードモナス属やフラボバクテリウム属等
に属する微生物起源のCAHである。そして本発
明におけるCHA製剤とは、上述の如きCAHを単
独で含有するものに限定されず、他の物質、例え
ばクレアチニンやクレアチンの定量に必要な酵素
並びに補酵素、更には基質、又これらの安定化に
必要な安定剤成分等を含有するものを総称する。
尚CAH製剤は溶液状及び乾燥粉末状等任意の状
態で提供されるものを含むものとする。 ところで本発明に用いられる前記安定化剤のう
ちもつとも代表的なものは、HLB15以上の非イ
オン性界面活性剤（以下AA剤という）である。
該AA剤としては、HLBが15以上であること、並
びに非イオン性であることの２条件を満足するも
のである限り、構造式その他については全く制限
がなく色々のものを使用することができるが、代
表的なAA剤を例示すると、ポリオキシエチレン
アルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン
アルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン
アシルエステル等が挙げられ、これらにおけるア
ルキルとしては、炭素数７以上のアルキル、例え
ばオクチル、ノニル、ラウリル等が例示される。
又キレート化剤としては、一般的な金属キレート
化剤が使用され、金属イオンを捕捉して不活性化
できるものである限りその種類を問わないが代表
的なものとしては、エチレンジアミン４酢酸並び
にその塩が例示される。又防腐剤としては、酵素
製剤中に混入される微生物によるCAH等の変質
を防止する機能があればよく、微生物に対する静
菌的或は殺菌的作用を有するもの、あるいは微生
物の活性を不活化するものである限りどの様なも
のを用いても良いが、特に代表的なものを挙げる
と、アジ化物、抗生物質、サルフア剤、ほう酸、
有機酸等を例示することができる。 前述の様な安定化剤の配合割合は、安定化作用
の強弱、或は安定化剤自体の化学的安定性、更に
は上記各安定化剤の併用等を考慮して定めれば良
いが、一般的な目安を述べると、CAH100単位当
り0.01〜1000mgの範囲から選択すれば確実な効果
が得られる。 上記安定化剤を含有するCAH酵素製剤を得る
に当つては、CAH単独もしくはCAHに他の酵
素、補酵素、基質等の併用剤を配合して溶液を調
製する工程、該溶液に上記安定化剤を添加混合す
る工程、並びに必要であれば該溶液を乾燥する工
程を組み合わせるが、最初に述べたCAH溶液の
調製に際しては、適切な緩衝液を選択し、その濃
度を１〜500ｍＭ、PHを6.5〜9.0程度に設定する
ことが望まれる。次に安定化剤の添加混合に当つ
ては、上記CAH溶液に安定化剤粉末を直接配合
するか、該粉末をいつたん水あるいは緩衝液に分
散乃至溶解してから添加し、常法に従つて撹拌す
る。最後に、この混合液を乾燥させたいときは、
凍結乾燥や噴霧乾燥等の常用手段を利用すれば良
い。 本発明のCAH製剤は上記の様に構成されてい
るので、粉末状あるいは溶液状の如何を問わず、
CAHの活性を長期に亘つて保持することがで
き、クレアチンやクレアチニンの測定精度に対す
る信頼性を高度に維持できる様になり、極めて有
用な診断用酵素製剤が提供されることとなつた。 次に本発明の実施例を説明するが、実施例にお
ける酵素活性の測定は下記に従つた。 (A) 試薬組成 (1) 基質溶液：0.1Mクレアチン溶液［クレア
チンを0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に溶解］ (2) NaOH溶液：1N水酸化ナトリウム水溶液 (3) 発色液：１％ピクリン酸溶液 (B) 測定方法 基質溶液0.9mlに酵素溶液0.1mlを加え37℃で
10分間反応させた。反応液0.1mlを採取して冷
水0.9mlに加え、反応を停止させた。次に
NaOH溶液１ml及び発色液１mlを加え、室温で
20分間放置し、酵素反応で生じたクレアチンを
発色させた。この発色を、520nｍにおける吸
光度で測定し、酵素力価を求めた、尚酵素力価
の表示は、上記条件の下で１分間に１μモルの
クレアチニンを生成する酵素量を１単位とし
た。 実施例 １ シユードモナス属に属する微生物から得られた
CAHを用い、0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に、20
単位／mlとなる様に溶解した。この溶液に、第１
表の各化合物を加え、必要があればPH7.5に再調
整した。得られた酵素製剤溶液を第１表に示す条
件で保存し、濁りの発生を660nｍにおける吸光
度で測定したところ、第１表に併記する結果が得
られた。 第１表から明白な様に、HLB15以上のAA剤、
又は該AA剤とキレート化剤及び／又は防腐剤を
添加したものは、濁りの発生が少なかつたが、そ
れ以外のものは著しい濁りが発生した。
し、更にクレアチンをザルコシンと尿素に分解
し、生成したザルコシンと尿素を、更に他の酵素
と組合わせるか、あるいは化学的な方法と組合わ
せて測定し、目的とするクレアチニン及びクレア
チンを定量するものであつて、CAHはこの方法
において重要な役割を果している。 しかしながらCAHを溶液状態で保存しておく
と、保存中に著しい変性が進んで濁りを発生する
こともあり、測定精度に重大な悪影響を及ぼすと
いう問題があつた。 本発明者等はこの様な事情を憂慮し、CAHを
含有する酵素製剤の安定化について種々検討した
結果、以下述べる様な組成からなる酵素製剤とす
れば、CAHを溶液状で保存しても前述の様な変
性や濁りが生じないことを見出し、本発明を完成
するに至つた。即ち本発明のCHA製剤とは、
CAHを必須成分として含有する他、HLB15以上
の非イオン性界面活性剤、又は該界面活性剤をキ
レート化剤及び／又は防腐剤より成る群から選択
される１種以上（以下これらを総称して安定化剤
と述べる）を含有させた点に要旨が存在するもの
である。 本明細書にいうCAHとは、その起源を問わず
全て安定化の対象となるが、特に繁用されるの
は、シユードモナス属やフラボバクテリウム属等
に属する微生物起源のCAHである。そして本発
明におけるCHA製剤とは、上述の如きCAHを単
独で含有するものに限定されず、他の物質、例え
ばクレアチニンやクレアチンの定量に必要な酵素
並びに補酵素、更には基質、又これらの安定化に
必要な安定剤成分等を含有するものを総称する。
尚CAH製剤は溶液状及び乾燥粉末状等任意の状
態で提供されるものを含むものとする。 ところで本発明に用いられる前記安定化剤のう
ちもつとも代表的なものは、HLB15以上の非イ
オン性界面活性剤（以下AA剤という）である。
該AA剤としては、HLBが15以上であること、並
びに非イオン性であることの２条件を満足するも
のである限り、構造式その他については全く制限
がなく色々のものを使用することができるが、代
表的なAA剤を例示すると、ポリオキシエチレン
アルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン
アルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン
アシルエステル等が挙げられ、これらにおけるア
ルキルとしては、炭素数７以上のアルキル、例え
ばオクチル、ノニル、ラウリル等が例示される。
又キレート化剤としては、一般的な金属キレート
化剤が使用され、金属イオンを捕捉して不活性化
できるものである限りその種類を問わないが代表
的なものとしては、エチレンジアミン４酢酸並び
にその塩が例示される。又防腐剤としては、酵素
製剤中に混入される微生物によるCAH等の変質
を防止する機能があればよく、微生物に対する静
菌的或は殺菌的作用を有するもの、あるいは微生
物の活性を不活化するものである限りどの様なも
のを用いても良いが、特に代表的なものを挙げる
と、アジ化物、抗生物質、サルフア剤、ほう酸、
有機酸等を例示することができる。 前述の様な安定化剤の配合割合は、安定化作用
の強弱、或は安定化剤自体の化学的安定性、更に
は上記各安定化剤の併用等を考慮して定めれば良
いが、一般的な目安を述べると、CAH100単位当
り0.01〜1000mgの範囲から選択すれば確実な効果
が得られる。 上記安定化剤を含有するCAH酵素製剤を得る
に当つては、CAH単独もしくはCAHに他の酵
素、補酵素、基質等の併用剤を配合して溶液を調
製する工程、該溶液に上記安定化剤を添加混合す
る工程、並びに必要であれば該溶液を乾燥する工
程を組み合わせるが、最初に述べたCAH溶液の
調製に際しては、適切な緩衝液を選択し、その濃
度を１〜500ｍＭ、PHを6.5〜9.0程度に設定する
ことが望まれる。次に安定化剤の添加混合に当つ
ては、上記CAH溶液に安定化剤粉末を直接配合
するか、該粉末をいつたん水あるいは緩衝液に分
散乃至溶解してから添加し、常法に従つて撹拌す
る。最後に、この混合液を乾燥させたいときは、
凍結乾燥や噴霧乾燥等の常用手段を利用すれば良
い。 本発明のCAH製剤は上記の様に構成されてい
るので、粉末状あるいは溶液状の如何を問わず、
CAHの活性を長期に亘つて保持することがで
き、クレアチンやクレアチニンの測定精度に対す
る信頼性を高度に維持できる様になり、極めて有
用な診断用酵素製剤が提供されることとなつた。 次に本発明の実施例を説明するが、実施例にお
ける酵素活性の測定は下記に従つた。 (A) 試薬組成 (1) 基質溶液：0.1Mクレアチン溶液［クレア
チンを0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に溶解］ (2) NaOH溶液：1N水酸化ナトリウム水溶液 (3) 発色液：１％ピクリン酸溶液 (B) 測定方法 基質溶液0.9mlに酵素溶液0.1mlを加え37℃で
10分間反応させた。反応液0.1mlを採取して冷
水0.9mlに加え、反応を停止させた。次に
NaOH溶液１ml及び発色液１mlを加え、室温で
20分間放置し、酵素反応で生じたクレアチンを
発色させた。この発色を、520nｍにおける吸
光度で測定し、酵素力価を求めた、尚酵素力価
の表示は、上記条件の下で１分間に１μモルの
クレアチニンを生成する酵素量を１単位とし
た。 実施例 １ シユードモナス属に属する微生物から得られた
CAHを用い、0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に、20
単位／mlとなる様に溶解した。この溶液に、第１
表の各化合物を加え、必要があればPH7.5に再調
整した。得られた酵素製剤溶液を第１表に示す条
件で保存し、濁りの発生を660nｍにおける吸光
度で測定したところ、第１表に併記する結果が得
られた。 第１表から明白な様に、HLB15以上のAA剤、
又は該AA剤とキレート化剤及び／又は防腐剤を
添加したものは、濁りの発生が少なかつたが、そ
れ以外のものは著しい濁りが発生した。
【表】
【表】
実施例 ２
下記組成からなる酵素製剤を調整した。
CAH（シユードモナス属起源）200単位ザルコシ
ンオキシダーゼ（コリネバクテリウム属起源）
30単位 ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（シユードモ
ナス属起源） ３単位 NAD 7.2mg ポリエキシエチレンオレイルエーテル
（HLB16.2） 10mg アジ化ナトリウム 10mg EDTA・2Na 10mg 上記製剤を、0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に溶
解し、全量を10mlにした。 一方上記製剤から、ポリオキシエチレンオレイ
ルエーテル、アジ化ナトリウム及びEDTA・2Na
を除いた比較製剤を調製し、同様に0.05M燐酸緩
衝液（PH7.5）に溶解し、全量を10mlにした。 これらについて、調製直後、及び25℃で５日間
保存後に、夫々１mlを採取し、定量試験を行なつ
た。即ち酵素製剤１mlに、クレアチンを含む検体
50μを添加し、37℃で10分間反応させた。そし
て検体中のクレアチン量に応じて変化したNAD
量を、340nｍの吸光度（NADH）変化によつて
測定し、検体中のクレアチン量を求めた。 一方上記酵素製剤からCAHを除いたものを対
照用製剤として同様に操作し、検体のブランク値
を求め上記測定値との差から真のクレアチン量を
求めた（第２表）。
ンオキシダーゼ（コリネバクテリウム属起源）
30単位 ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（シユードモ
ナス属起源） ３単位 NAD 7.2mg ポリエキシエチレンオレイルエーテル
（HLB16.2） 10mg アジ化ナトリウム 10mg EDTA・2Na 10mg 上記製剤を、0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に溶
解し、全量を10mlにした。 一方上記製剤から、ポリオキシエチレンオレイ
ルエーテル、アジ化ナトリウム及びEDTA・2Na
を除いた比較製剤を調製し、同様に0.05M燐酸緩
衝液（PH7.5）に溶解し、全量を10mlにした。 これらについて、調製直後、及び25℃で５日間
保存後に、夫々１mlを採取し、定量試験を行なつ
た。即ち酵素製剤１mlに、クレアチンを含む検体
50μを添加し、37℃で10分間反応させた。そし
て検体中のクレアチン量に応じて変化したNAD
量を、340nｍの吸光度（NADH）変化によつて
測定し、検体中のクレアチン量を求めた。 一方上記酵素製剤からCAHを除いたものを対
照用製剤として同様に操作し、検体のブランク値
を求め上記測定値との差から真のクレアチン量を
求めた（第２表）。
【表】
第２表に見られる如く、安定化剤の添加された
実施例では調製直後も保存後もほぼ同様の結果を
与えたが、安定化剤の添加されていない比較例で
は、保存後の測定が実質上不可能であり、安定化
剤を添加することの効果（保存安定性）が確認さ
れた。
実施例では調製直後も保存後もほぼ同様の結果を
与えたが、安定化剤の添加されていない比較例で
は、保存後の測定が実質上不可能であり、安定化
剤を添加することの効果（保存安定性）が確認さ
れた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ クレアチンアミジノヒドロラーゼを含有し、
更に HLB15以上の非イオン性界面活性剤 又は 該界面活性剤と、キレート化剤及び／又は防腐
剤 を含有させてなることを特徴とする安定なクレア
チンアミジノヒドロラーゼ製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57194917A JPS5985290A (ja) | 1982-11-06 | 1982-11-06 | 安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼ製剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57194917A JPS5985290A (ja) | 1982-11-06 | 1982-11-06 | 安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼ製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5985290A JPS5985290A (ja) | 1984-05-17 |
| JPS6231912B2 true JPS6231912B2 (ja) | 1987-07-10 |
Family
ID=16332487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57194917A Granted JPS5985290A (ja) | 1982-11-06 | 1982-11-06 | 安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼ製剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5985290A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4810633A (en) * | 1984-06-04 | 1989-03-07 | Miles Inc. | Enzymatic ethanol test |
| JPH07110240B2 (ja) * | 1985-04-01 | 1995-11-29 | 小林製薬株式会社 | クレアチニンアミドヒドロラーゼ製剤 |
| US5032503A (en) * | 1988-06-22 | 1991-07-16 | Microgenics Corporation | Liquid single reagent for air enzyme complementation assay |
| JP2632391B2 (ja) * | 1988-11-16 | 1997-07-23 | 和光純薬工業株式会社 | ペルオキシダーゼの安定化方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2415928A1 (de) * | 1973-04-11 | 1974-10-24 | Hoffmann La Roche | Oxydationsmittel |
| JPS52128288A (en) * | 1976-04-15 | 1977-10-27 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Glucose isomerase solution |
-
1982
- 1982-11-06 JP JP57194917A patent/JPS5985290A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5985290A (ja) | 1984-05-17 |
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