JPS6231918B2 - - Google Patents
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- JPS6231918B2 JPS6231918B2 JP54045233A JP4523379A JPS6231918B2 JP S6231918 B2 JPS6231918 B2 JP S6231918B2 JP 54045233 A JP54045233 A JP 54045233A JP 4523379 A JP4523379 A JP 4523379A JP S6231918 B2 JPS6231918 B2 JP S6231918B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D301/00—Preparation of oxiranes
- C07D301/02—Synthesis of the oxirane ring
- C07D301/03—Synthesis of the oxirane ring by oxidation of unsaturated compounds, or of mixtures of unsaturated and saturated compounds
- C07D301/04—Synthesis of the oxirane ring by oxidation of unsaturated compounds, or of mixtures of unsaturated and saturated compounds with air or molecular oxygen
- C07D301/06—Synthesis of the oxirane ring by oxidation of unsaturated compounds, or of mixtures of unsaturated and saturated compounds with air or molecular oxygen in the liquid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
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Description
本発明は低級α−オレフインのエポキシドへの
転化に関する。特に、本発明は酸素とメチロトロ
フ微生物（Methylotrophic microorganisms）ま
たはそれから誘導される酵素製剤との作用によ
る、プロピレンまたはプロピレン含有流からのプ
ロピレンオキシドの製造に関する。 エポキシドは親核的反応物質（例えばアンモニ
ア、有機酸、アルコール、水など）の活性水素原
子と付加などの多数の化学反応を行う能力がある
ので極めて有用な生成物である。エポキシ化生成
物（すなわち１・２−エポキシドであり、α−エ
ポキシドおよびオキシラン化合物としても知られ
ている）は熱、イオンおよび遊離基触媒作用下で
重合してエポキシ単独重合体ならびに共重合体を
生成する能力があるので工業的にも重要である。
エチレンオキシドとプロピレンオキシドが２つの
最も重要な商業的エポキシドである。広く用いら
れている方法はレフオート（Lefort）の銀触媒に
よる「直接酸化」方法〔米国特許第1998878号
（1935）ならびに再発行特許第20370号および第
22241号〕である。 シエル・インターナシヨナル・リサーチ社
（Shell International Research Corp.Inc.）のオ
ランダ国特許第291163号（1965年６月25日付公
開）には、α−オレフインを、炭化水素で生長し
且つ炭化水素からの炭素を同化する能力のある微
生物と酸素とに接触させることによる１・２−エ
ポオキシドの製造方法が記載されている。この特
許には、微生物を、エポキシ化されるα−オレフ
インと実質的に同数の炭素原子を有する炭化水素
で生長させることが好ましいと記載されている。
この特許の一般的説明は２〜30個の炭素原子を有
するα−オレフインを含んでいるが、特許中の唯
一の実施例はｎ−ヘプタンで生長させた縁膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）（菌株473）と空気
との存在下における１−オクテンのエポキシ化を
示しているだけである。 ホイツテンベリー（Whittebury）、ドルトン
（Dalton）、エクレストン（Eccleston）およびリ
ード（Reed）〔C1化合物による微生物の生長
（Microbal Growth on C1 Compounds）：C1化
合物による微生物の生長に関する国際シンポジウ
ム講演要旨集（Proceedings of the
International Symposium on Microbial Growth
on C1 Compounds）、ソサエテイ・オブ・フアー
メンテーシヨン・テクノロジー（Society of
Fermentation Technology）、pp.1〜11（1975）〕
は、メタン酸化性菌は基質を酸化する能力はある
が利用する能力はないという興味ある特徴をもつ
ており、例えばそれらの菌はエタンでは生長しな
いが、メタンで生長しつゝあるかあるいは前以つ
てメタンで生長させておくとエタンを酸化すると
報告している。 デボント（DeBont）〔アントニー・フアン・リ
ーウウエンホエク（Antonie ven
Leeuwenhoek）、42、59−71（1976）〕はエチレ
ンがミコバクテリウム（mycobacterium）属に属
すると思われるグラム陽性菌で酸化されると報告
している。デボントは、自分が分離した菌株はメ
タンの存在下では生長しないと述べており、土壌
中にあるこれらの菌はメタン酸化性菌ではないと
推論している。デボントとアルバーズ
（Albers）〔アントニー・フアン・リーウウエン
ホエク、42、73〜80（1976）〕はデボント
（1976）のエチレン酸化性菌株の酸化生成物がエ
チレンオキシドであるという説を立てた。 ハチンソン（Hutchinson）、ホイツテンベリー
（Whittenbury）およびドルトン（Dalton）〔J.
Theor.Biol.、58、325〜335（1976）「メチロコツ
カス・カプスラタスによるメタンの酸化における
遊離基の可能な役割」（Ａ Possible Role of
Free Redicals in the Oxidation of Methane
by Methylococcs capsulatus）〕ならびにコルビ
ー（Colby）およびドルトン（Dalton）〔J.
Biochem.157、495−597（1976）「メチロコツカ
ス・カプスラタスBath株から得た可溶性メタン
モノオキシゲナーゼの性質」（Some Properties
of ａ Soluble Methane Mono−Oxygenase
from Methylococcus capsulatus Strain
Bath）〕は、メチロコツカス・カプスラタスBath
株から誘導された可溶性メタンモノオキシゲナー
ゼによつてエチレンが酸化されると報告してい
る。後者の研究者らはメチロコツカス・カプスラ
タスBath菌株の“粒状膜製剤（particulate
membrane preparations）”はブロムメタン消失
試験で測定されるメタンオキシゲナーゼ活性をも
つていないと報告している。 プセウドモナス・メタニカ（Pseudomonas
methanica）の細胞成分中への 18O2からの 18O
の導入に基づいて、リードベターおよびフオスタ
ー（Leadbetter and Foster）〔Nature184、1428
〜1429（1959）〕はメタンに対する初期の酸化的
攻撃にオキシゲナーゼが関与することを示唆し
た。ヒズギンズおよびクエイル（Higgins and
Quayle）〔J.Biochem.、118、201−208（1970）〕
は、プセウドモナス・メタニカまたはメタノモナ
ス・メタノーオキシダンス（Methanomonas
methano−oxidans）の懸濁液が 18O2に富む雰囲
気中でメタンを酸化させたとき、CH3 18OHをメ
タン酸化の生成物として単離した。その後のリボ
ンズ（Ribbons）〔J.Bacteriol.、122、1351−1363
（1975）〕ならびにリボンズおよびミカロバー
（Ribbons and Michalover）〔FEBS Lett.11、41
−44（1970）〕によるメチロコツカス・カプスラ
タスあるいはフエレンチ（Ferenci）（FEBS
Lett.、41、94−98（1974）〕によるメチロモナ
ス・カプスラタス（Methylomonas capsulatus）
の抽出物によつて触媒されたメタン刺激NADH酸
化の観察は、この酸素付加反応を起こさせる酵素
はモノオキシゲナーゼであることを示唆した。こ
れらの研究者は分光光度計によつてメタン刺激
NADH消失を測定するか、あるいはポーラログラ
フによつてメタン刺激O2消失を測定する間接的
酵素分析に頼つていた。最近、メチロシヌス・ト
リコスポリウムOB3b（Methylosinus
trichosporium OB3b）〔トンゲ、ハリソンおよび
ヒギンズ（Tonge、Harrison and Higgins）、J.
Biochem.161、333〜344（1977）ならびにトン
ゲ、ハリソン、ノウルズおよびヒギンズ
（Tonge、Harrison、Knowles and Higgins）、
FEBG Lett.、58、293−299（1975）〕ならびに
メチロコツカス・カプスラタス（Bath）〔コルビ
ーおよびドルトン（Colby and Dalton、J.
Biochem.、171、461−468（1978）ならびにコル
ビー、スターリングおよびドルトン（Colby、
Stirling and Dalton）、J.Biochem.、165、395−
402（1977）〕からメタンモノオキシゲナーゼ系が
部分的に精製された。 本発明者らは今回、メタンまたはジメチルエー
テルを含む無機栄養培地中で培養した微生物また
はこの微生物から誘導された酵素製剤の存在下に
おいてC2〜C4n−アルケンまたはブタジエンを酸
素と接触させることから成る低エネルギー集約方
法（low energy intensive process）によつてC2
〜C4n−アルケンおよびブタジエン、特にプロピ
レンのエポキシドを製造することができることを
発見した。本発明の方法で用いられる微生物は好
ましくは偏性または通性メチロトロフ菌
（obligative or facultative methylotrophs）であ
り、より好ましくはメチロシヌス
（Methylosinus）属、メチロシスチス
（Methylocystis）属、メチロモナス
（Methylomonas）属、メチロバクテル
（Methylobacter）属、メチロコツカス
（Methylococcus）属およびメチロバクテリウム
（Methylobacterium）属から誘導される。 銀触媒によるエチレンオキシドの「直接酸化」
製造方法と異なり、メタン生長メチロトロ微生物
（methane−grown
methylotrophicmicroorganisms）またはそれか
ら誘導される酵素製剤は２〜４個の炭素原子を有
するα−オレフインおよびブタジエンをエポキシ
化する能力はあるが、C5以上のα−オレフイン
をエポキシ化する能力（少なくとも通常の分析方
法で容易に検知できる量で）はないことも発見さ
れた。１つの好ましい実施態様として、メタン誘
導メチロトロフ微生物（methaneinduced
methylotrophic microorganisms）またはそれか
ら誘導される酵素製剤をプロピレンのプロピレン
オキシドへの酸化的転化に用いる。 「微生物」という用語は、本明細書中では広義
に用いており、細菌だけでなく、酵母、糸状菌、
放線菌、原生動物をも含む。好ましくは、微生物
は細菌を意味し、より好ましくはメタンを酸化す
る能力のある細菌を意味する。 「酵素製剤」（enzyme preparation）という用
語は所望のオキシゲナーゼ酵素活性を示す組成物
を意味するために用いる。この用語は、例えば生
の全細胞、乾燥細胞、細胞抽出物ならびに細胞か
ら誘導される精製および濃縮製剤を意味するため
に用いる。酵素製剤は乾燥形であつても液状であ
つてもよい。酵素製剤という用語は酵素の固定化
形をも含み、例えば共有化学結合、吸着ならび
に、基質および生成物の分子は自由に通過できる
ように十分大きいが酵素は通過できないように十
分小さい孔を有するゲル格子内への酵素の捕獲に
よつて、不溶性マトリツクスに結合させた、すな
わち固定化させたメタン生長微生物の全細胞また
は酵素抽出物をも含む。「酵素製剤」という用語
は中空繊維膜内に保持された酵素〔ロニー
（Rony）、ビオテクノロジー・アンド・ビオエン
ジニアリング（Biotechnology and
Bioengineering）、1971年６月号〕をも含む。 「粒状画分」（particulate fraction）という用
語は、10000Xg〜80000Xgで１時間遠心分離した
後のメタン生長微生物の無細胞（cell−free）抽
出物の沈澱または沈降した画分におけるオキシゲ
ナーゼ酵素活性に関して用いられている。 本発明は以下の特徴を含む。 ○イ 本発明のメタン利用性微生物の分離物
（isolates）は偏生菌（obligate bacteria）（
型および型）および通性菌（facultative
bacteria）ならびにメタン利用性酵母を含む。 ○ロ 幾つかの特定の型のメタン生長菌（例えば偏
性菌型、偏生菌型）の静止細胞懸濁液およ
び通性菌は、メタンをメタノールに酸化させる
能力に加えて、C2〜C4n−アルケンおよびブタ
ジエンをそれぞれ対応する１・２−エポキシド
に酸化させる。 ○ハ 生成物の１・２−エポキシドはそれ以上代謝
されず、細胞外に蓄積する。 ○ニ メタノール生長細胞はエポキシ化活性もヒド
ロキシル化活性ももつていない。基質の気状ア
ルケン中では、プロピレンが最高の速度で酸化
される。 ○ホ メタンはプロピレンのエポキシ化を抑制す
る。 ○ヘ プロピレンおよび酸素の消費ならびにプロピ
レンオキシドの生成の化学量論は１：１：１で
ある。 ○ト 抑制研究の結果は同一のモノオキシゲナーゼ
系がヒドロキシル化反応およびエポキシ化反応
の両方を触媒することを示す。 ○チ 10000Xg〜80000Xgで１時間遠心分離して沈
澱または沈降させた無細胞（cell−free）（酵素
抽出物）粒状画分中にヒドロキシル化活性およ
びエポキシ化活性の両方がある。 ○リ 偏性および通性メチロトロフ微生物
（obligate and faeultive methylotroph
microorganisms）からの無細胞粒状画分はメ
タンのメタノールへのヒドロキシル化、酸素と
還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NADH）との存在下におけるC2〜C4n−アル
ケンおよびジエン（例えばエチレン、プロピレ
ン、１−ブテンおよびブタジエン）のエポキシ
化ならびにC1〜C4n−アルカン（例えばメタ
ン、エタン、プロパンおよびブタン）のヒドロ
キシル化を触媒する。 ○ヌ メタン生長メチロトロフ菌（methane−
grown methylotrophs）のヒドロキシル化およ
びエポキシ化活性は貯蔵中同時に失われ、種々
の金属結合剤によつて強く抑制される。 ○ル 基質（プロピレンまたはメタン）、酸素、
NADHの消費および生成物生成の化学量論は約
１：１：１：１であることがわかつた。 R.ホイツテンベリー、K.C.フイリツプおよびJ.
F.ウイルキンソン（R.Whilttenbury、K.C.
Phillips and J.F.Wilkinson）〔J.Gen.
Microbiology、61、205−218（1970）〕（以下ホイ
ツテンベリーらと称す）が提案したメタン酸化性
菌の分類方式は今日用いられている最も広く認め
られている方式である。この分類方式では、メタ
ン利用性菌を形態学的特徴から次の５群に分けて
いる。すなわちメチロシヌス（Methylosinus）、
メチロシスチス（Methylocyshis）、メチロモナ
ス（Methylomonas）、メチロバクテル
（Methylobacter）およびメチロコツカス
（Methylococcus）である。ホイツテンベリーら
が報告したこれら５群の菌はメタン、ジメチルエ
ーテルおよびメタノールを生長エネルギーのため
に利用し、且つこれらの菌はすべて厳密に好気性
でグラム陰性菌だと報告されている。これらの菌
は非内性胞子性（non−endosporing）、すなわち
嚢子と複雑な微細構造および複雑な内部構造を有
する外生胞子とを生成する能力をも特徴としてい
る。 本発明の１つの実施態様として、ホイツテンベ
リーらが記載している微生物は、メタンの存在下
で培養するとき、低級α−オレフイン特にプロピ
レンを酸素の存在下でエポキシ化する能力がある
ことが発見された。これらのメタン利用性微生物
は一般に「メチロトロフ菌」（methylotrophs）
として知られている。これらの微生物から誘導さ
れる酵素系または製剤を本明細書中では「エポキ
シ化性酵素系」と称するが、これらの酵素系は
「メタンモノオキシゲナーゼ」および（あるい
は）「メタンヒドロキシラーゼであると思われ
る。従つて、本明細書中で、α−オレフインを
１・２−エポキシドに転化させるために用いる
「アルケンエポキシダーゼ」または「プロピレン
エポキシダーゼ」と称する酵素系または酵素製剤
は、メタンモノオキシゲナーゼまたはメタンヒド
ロキシラーゼ酵素であると思われる「エポキシ化
性酵素系」であると解すべきである。 本発明の実施においては、ホイツテンベリーら
（この文献の記載は本明細書中に参照として含ま
れるものとする）が報告したメチロトロフ微生物
の使用を意図している。特に、ホイツテンベリー
らの報文の214頁、第４表中に挙げられているメ
チロトロフ微生物すなわちメチロシヌス・トリコ
スポリウム（Methylosinus trichosporium）、メ
チロシヌス・スポリウム（Methylosinus
sporium）、メチルシヌス・パルブス
（Methylocystis parvus）、メチロモナス・メタ
ニカ（Methylomonas methanica）、メチロモナ
ス・アルブス（Methylomonas albus）、メチロモ
ナス・ストレプトバクテリウム（Methylomonas
streptobacterium）、メチロモナス・アギレ
（Methylomonas agile）、メチロモナス・ルブル
ム（Methylomonas rubrum）、メチロモナス・ロ
サセウス（Methylomonas rosaceus）、メチロバ
クテル・クロオコツカム（Methylobacter
chroococcum）、メチロバクテル・ボビス
（Methylobacter bovis）、メチロバクテル・カプ
スラタス（Methylobacter capsulatus）、メチロ
バクテル・ビネランジイ（Methylobacter
vinelandii）、メチロコツカス・カプスラタス
（Methylococcus capsulatus）およびメチロコツ
カス・カプスラタス、Texas株（Methylococcus
capsulatus Strain Texas）〔D.W.リボンズ（D.
W.Ribbons）、J.Bacteriol.、122、1351−1363
（1975）によつて引照された〕およびメチロコツ
カス・ミニムス（Methylococcus minimus）と
して確認された微生物を用いることができる。こ
れらのメチロトロフ微生物は、全細胞またはその
酵素抽出物の形で使用することができ、あるいは
DEAEセルロースまたはイオン交換樹脂あるいは
多孔性アルミナ担体の使用によるなどの全細胞ま
たは酵素抽出物の固定化製剤（immobilized
preparations）の形で用いることもできる。 ホイツテンベリーらが記載した幾つかのメチロ
トロフ微生物の継代培養は、米国農務省のアグリ
カルチヤー・リサーチ、サービス、ノーザン・レ
ジヨナル・リサーチ・ラボラトリー
（Agriculture Research Serrice、Northern
Regional Research Laboratory、Peoria、
Illinois 61604）の公立寄託機関（official
depository）におのおの継代培養を寄託すること
によつて寄託されており、以下に示す個々の
NRRL菌株をこの寄託機関から受けとつた。これ
らの継代培養は、米国民および西独国民を含むが
これら国民に限定されることなく公衆にこれら菌
株の後代が利用できるというように、何らの制限
もなく、米国農務省の手続きに従つて寄託されて
いる。寄託されたメチロトロフ微生物の菌株は次
の名称で呼ばれる。
転化に関する。特に、本発明は酸素とメチロトロ
フ微生物（Methylotrophic microorganisms）ま
たはそれから誘導される酵素製剤との作用によ
る、プロピレンまたはプロピレン含有流からのプ
ロピレンオキシドの製造に関する。 エポキシドは親核的反応物質（例えばアンモニ
ア、有機酸、アルコール、水など）の活性水素原
子と付加などの多数の化学反応を行う能力がある
ので極めて有用な生成物である。エポキシ化生成
物（すなわち１・２−エポキシドであり、α−エ
ポキシドおよびオキシラン化合物としても知られ
ている）は熱、イオンおよび遊離基触媒作用下で
重合してエポキシ単独重合体ならびに共重合体を
生成する能力があるので工業的にも重要である。
エチレンオキシドとプロピレンオキシドが２つの
最も重要な商業的エポキシドである。広く用いら
れている方法はレフオート（Lefort）の銀触媒に
よる「直接酸化」方法〔米国特許第1998878号
（1935）ならびに再発行特許第20370号および第
22241号〕である。 シエル・インターナシヨナル・リサーチ社
（Shell International Research Corp.Inc.）のオ
ランダ国特許第291163号（1965年６月25日付公
開）には、α−オレフインを、炭化水素で生長し
且つ炭化水素からの炭素を同化する能力のある微
生物と酸素とに接触させることによる１・２−エ
ポオキシドの製造方法が記載されている。この特
許には、微生物を、エポキシ化されるα−オレフ
インと実質的に同数の炭素原子を有する炭化水素
で生長させることが好ましいと記載されている。
この特許の一般的説明は２〜30個の炭素原子を有
するα−オレフインを含んでいるが、特許中の唯
一の実施例はｎ−ヘプタンで生長させた縁膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）（菌株473）と空気
との存在下における１−オクテンのエポキシ化を
示しているだけである。 ホイツテンベリー（Whittebury）、ドルトン
（Dalton）、エクレストン（Eccleston）およびリ
ード（Reed）〔C1化合物による微生物の生長
（Microbal Growth on C1 Compounds）：C1化
合物による微生物の生長に関する国際シンポジウ
ム講演要旨集（Proceedings of the
International Symposium on Microbial Growth
on C1 Compounds）、ソサエテイ・オブ・フアー
メンテーシヨン・テクノロジー（Society of
Fermentation Technology）、pp.1〜11（1975）〕
は、メタン酸化性菌は基質を酸化する能力はある
が利用する能力はないという興味ある特徴をもつ
ており、例えばそれらの菌はエタンでは生長しな
いが、メタンで生長しつゝあるかあるいは前以つ
てメタンで生長させておくとエタンを酸化すると
報告している。 デボント（DeBont）〔アントニー・フアン・リ
ーウウエンホエク（Antonie ven
Leeuwenhoek）、42、59−71（1976）〕はエチレ
ンがミコバクテリウム（mycobacterium）属に属
すると思われるグラム陽性菌で酸化されると報告
している。デボントは、自分が分離した菌株はメ
タンの存在下では生長しないと述べており、土壌
中にあるこれらの菌はメタン酸化性菌ではないと
推論している。デボントとアルバーズ
（Albers）〔アントニー・フアン・リーウウエン
ホエク、42、73〜80（1976）〕はデボント
（1976）のエチレン酸化性菌株の酸化生成物がエ
チレンオキシドであるという説を立てた。 ハチンソン（Hutchinson）、ホイツテンベリー
（Whittenbury）およびドルトン（Dalton）〔J.
Theor.Biol.、58、325〜335（1976）「メチロコツ
カス・カプスラタスによるメタンの酸化における
遊離基の可能な役割」（Ａ Possible Role of
Free Redicals in the Oxidation of Methane
by Methylococcs capsulatus）〕ならびにコルビ
ー（Colby）およびドルトン（Dalton）〔J.
Biochem.157、495−597（1976）「メチロコツカ
ス・カプスラタスBath株から得た可溶性メタン
モノオキシゲナーゼの性質」（Some Properties
of ａ Soluble Methane Mono−Oxygenase
from Methylococcus capsulatus Strain
Bath）〕は、メチロコツカス・カプスラタスBath
株から誘導された可溶性メタンモノオキシゲナー
ゼによつてエチレンが酸化されると報告してい
る。後者の研究者らはメチロコツカス・カプスラ
タスBath菌株の“粒状膜製剤（particulate
membrane preparations）”はブロムメタン消失
試験で測定されるメタンオキシゲナーゼ活性をも
つていないと報告している。 プセウドモナス・メタニカ（Pseudomonas
methanica）の細胞成分中への 18O2からの 18O
の導入に基づいて、リードベターおよびフオスタ
ー（Leadbetter and Foster）〔Nature184、1428
〜1429（1959）〕はメタンに対する初期の酸化的
攻撃にオキシゲナーゼが関与することを示唆し
た。ヒズギンズおよびクエイル（Higgins and
Quayle）〔J.Biochem.、118、201−208（1970）〕
は、プセウドモナス・メタニカまたはメタノモナ
ス・メタノーオキシダンス（Methanomonas
methano−oxidans）の懸濁液が 18O2に富む雰囲
気中でメタンを酸化させたとき、CH3 18OHをメ
タン酸化の生成物として単離した。その後のリボ
ンズ（Ribbons）〔J.Bacteriol.、122、1351−1363
（1975）〕ならびにリボンズおよびミカロバー
（Ribbons and Michalover）〔FEBS Lett.11、41
−44（1970）〕によるメチロコツカス・カプスラ
タスあるいはフエレンチ（Ferenci）（FEBS
Lett.、41、94−98（1974）〕によるメチロモナ
ス・カプスラタス（Methylomonas capsulatus）
の抽出物によつて触媒されたメタン刺激NADH酸
化の観察は、この酸素付加反応を起こさせる酵素
はモノオキシゲナーゼであることを示唆した。こ
れらの研究者は分光光度計によつてメタン刺激
NADH消失を測定するか、あるいはポーラログラ
フによつてメタン刺激O2消失を測定する間接的
酵素分析に頼つていた。最近、メチロシヌス・ト
リコスポリウムOB3b（Methylosinus
trichosporium OB3b）〔トンゲ、ハリソンおよび
ヒギンズ（Tonge、Harrison and Higgins）、J.
Biochem.161、333〜344（1977）ならびにトン
ゲ、ハリソン、ノウルズおよびヒギンズ
（Tonge、Harrison、Knowles and Higgins）、
FEBG Lett.、58、293−299（1975）〕ならびに
メチロコツカス・カプスラタス（Bath）〔コルビ
ーおよびドルトン（Colby and Dalton、J.
Biochem.、171、461−468（1978）ならびにコル
ビー、スターリングおよびドルトン（Colby、
Stirling and Dalton）、J.Biochem.、165、395−
402（1977）〕からメタンモノオキシゲナーゼ系が
部分的に精製された。 本発明者らは今回、メタンまたはジメチルエー
テルを含む無機栄養培地中で培養した微生物また
はこの微生物から誘導された酵素製剤の存在下に
おいてC2〜C4n−アルケンまたはブタジエンを酸
素と接触させることから成る低エネルギー集約方
法（low energy intensive process）によつてC2
〜C4n−アルケンおよびブタジエン、特にプロピ
レンのエポキシドを製造することができることを
発見した。本発明の方法で用いられる微生物は好
ましくは偏性または通性メチロトロフ菌
（obligative or facultative methylotrophs）であ
り、より好ましくはメチロシヌス
（Methylosinus）属、メチロシスチス
（Methylocystis）属、メチロモナス
（Methylomonas）属、メチロバクテル
（Methylobacter）属、メチロコツカス
（Methylococcus）属およびメチロバクテリウム
（Methylobacterium）属から誘導される。 銀触媒によるエチレンオキシドの「直接酸化」
製造方法と異なり、メタン生長メチロトロ微生物
（methane−grown
methylotrophicmicroorganisms）またはそれか
ら誘導される酵素製剤は２〜４個の炭素原子を有
するα−オレフインおよびブタジエンをエポキシ
化する能力はあるが、C5以上のα−オレフイン
をエポキシ化する能力（少なくとも通常の分析方
法で容易に検知できる量で）はないことも発見さ
れた。１つの好ましい実施態様として、メタン誘
導メチロトロフ微生物（methaneinduced
methylotrophic microorganisms）またはそれか
ら誘導される酵素製剤をプロピレンのプロピレン
オキシドへの酸化的転化に用いる。 「微生物」という用語は、本明細書中では広義
に用いており、細菌だけでなく、酵母、糸状菌、
放線菌、原生動物をも含む。好ましくは、微生物
は細菌を意味し、より好ましくはメタンを酸化す
る能力のある細菌を意味する。 「酵素製剤」（enzyme preparation）という用
語は所望のオキシゲナーゼ酵素活性を示す組成物
を意味するために用いる。この用語は、例えば生
の全細胞、乾燥細胞、細胞抽出物ならびに細胞か
ら誘導される精製および濃縮製剤を意味するため
に用いる。酵素製剤は乾燥形であつても液状であ
つてもよい。酵素製剤という用語は酵素の固定化
形をも含み、例えば共有化学結合、吸着ならび
に、基質および生成物の分子は自由に通過できる
ように十分大きいが酵素は通過できないように十
分小さい孔を有するゲル格子内への酵素の捕獲に
よつて、不溶性マトリツクスに結合させた、すな
わち固定化させたメタン生長微生物の全細胞また
は酵素抽出物をも含む。「酵素製剤」という用語
は中空繊維膜内に保持された酵素〔ロニー
（Rony）、ビオテクノロジー・アンド・ビオエン
ジニアリング（Biotechnology and
Bioengineering）、1971年６月号〕をも含む。 「粒状画分」（particulate fraction）という用
語は、10000Xg〜80000Xgで１時間遠心分離した
後のメタン生長微生物の無細胞（cell−free）抽
出物の沈澱または沈降した画分におけるオキシゲ
ナーゼ酵素活性に関して用いられている。 本発明は以下の特徴を含む。 ○イ 本発明のメタン利用性微生物の分離物
（isolates）は偏生菌（obligate bacteria）（
型および型）および通性菌（facultative
bacteria）ならびにメタン利用性酵母を含む。 ○ロ 幾つかの特定の型のメタン生長菌（例えば偏
性菌型、偏生菌型）の静止細胞懸濁液およ
び通性菌は、メタンをメタノールに酸化させる
能力に加えて、C2〜C4n−アルケンおよびブタ
ジエンをそれぞれ対応する１・２−エポキシド
に酸化させる。 ○ハ 生成物の１・２−エポキシドはそれ以上代謝
されず、細胞外に蓄積する。 ○ニ メタノール生長細胞はエポキシ化活性もヒド
ロキシル化活性ももつていない。基質の気状ア
ルケン中では、プロピレンが最高の速度で酸化
される。 ○ホ メタンはプロピレンのエポキシ化を抑制す
る。 ○ヘ プロピレンおよび酸素の消費ならびにプロピ
レンオキシドの生成の化学量論は１：１：１で
ある。 ○ト 抑制研究の結果は同一のモノオキシゲナーゼ
系がヒドロキシル化反応およびエポキシ化反応
の両方を触媒することを示す。 ○チ 10000Xg〜80000Xgで１時間遠心分離して沈
澱または沈降させた無細胞（cell−free）（酵素
抽出物）粒状画分中にヒドロキシル化活性およ
びエポキシ化活性の両方がある。 ○リ 偏性および通性メチロトロフ微生物
（obligate and faeultive methylotroph
microorganisms）からの無細胞粒状画分はメ
タンのメタノールへのヒドロキシル化、酸素と
還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NADH）との存在下におけるC2〜C4n−アル
ケンおよびジエン（例えばエチレン、プロピレ
ン、１−ブテンおよびブタジエン）のエポキシ
化ならびにC1〜C4n−アルカン（例えばメタ
ン、エタン、プロパンおよびブタン）のヒドロ
キシル化を触媒する。 ○ヌ メタン生長メチロトロフ菌（methane−
grown methylotrophs）のヒドロキシル化およ
びエポキシ化活性は貯蔵中同時に失われ、種々
の金属結合剤によつて強く抑制される。 ○ル 基質（プロピレンまたはメタン）、酸素、
NADHの消費および生成物生成の化学量論は約
１：１：１：１であることがわかつた。 R.ホイツテンベリー、K.C.フイリツプおよびJ.
F.ウイルキンソン（R.Whilttenbury、K.C.
Phillips and J.F.Wilkinson）〔J.Gen.
Microbiology、61、205−218（1970）〕（以下ホイ
ツテンベリーらと称す）が提案したメタン酸化性
菌の分類方式は今日用いられている最も広く認め
られている方式である。この分類方式では、メタ
ン利用性菌を形態学的特徴から次の５群に分けて
いる。すなわちメチロシヌス（Methylosinus）、
メチロシスチス（Methylocyshis）、メチロモナ
ス（Methylomonas）、メチロバクテル
（Methylobacter）およびメチロコツカス
（Methylococcus）である。ホイツテンベリーら
が報告したこれら５群の菌はメタン、ジメチルエ
ーテルおよびメタノールを生長エネルギーのため
に利用し、且つこれらの菌はすべて厳密に好気性
でグラム陰性菌だと報告されている。これらの菌
は非内性胞子性（non−endosporing）、すなわち
嚢子と複雑な微細構造および複雑な内部構造を有
する外生胞子とを生成する能力をも特徴としてい
る。 本発明の１つの実施態様として、ホイツテンベ
リーらが記載している微生物は、メタンの存在下
で培養するとき、低級α−オレフイン特にプロピ
レンを酸素の存在下でエポキシ化する能力がある
ことが発見された。これらのメタン利用性微生物
は一般に「メチロトロフ菌」（methylotrophs）
として知られている。これらの微生物から誘導さ
れる酵素系または製剤を本明細書中では「エポキ
シ化性酵素系」と称するが、これらの酵素系は
「メタンモノオキシゲナーゼ」および（あるい
は）「メタンヒドロキシラーゼであると思われ
る。従つて、本明細書中で、α−オレフインを
１・２−エポキシドに転化させるために用いる
「アルケンエポキシダーゼ」または「プロピレン
エポキシダーゼ」と称する酵素系または酵素製剤
は、メタンモノオキシゲナーゼまたはメタンヒド
ロキシラーゼ酵素であると思われる「エポキシ化
性酵素系」であると解すべきである。 本発明の実施においては、ホイツテンベリーら
（この文献の記載は本明細書中に参照として含ま
れるものとする）が報告したメチロトロフ微生物
の使用を意図している。特に、ホイツテンベリー
らの報文の214頁、第４表中に挙げられているメ
チロトロフ微生物すなわちメチロシヌス・トリコ
スポリウム（Methylosinus trichosporium）、メ
チロシヌス・スポリウム（Methylosinus
sporium）、メチルシヌス・パルブス
（Methylocystis parvus）、メチロモナス・メタ
ニカ（Methylomonas methanica）、メチロモナ
ス・アルブス（Methylomonas albus）、メチロモ
ナス・ストレプトバクテリウム（Methylomonas
streptobacterium）、メチロモナス・アギレ
（Methylomonas agile）、メチロモナス・ルブル
ム（Methylomonas rubrum）、メチロモナス・ロ
サセウス（Methylomonas rosaceus）、メチロバ
クテル・クロオコツカム（Methylobacter
chroococcum）、メチロバクテル・ボビス
（Methylobacter bovis）、メチロバクテル・カプ
スラタス（Methylobacter capsulatus）、メチロ
バクテル・ビネランジイ（Methylobacter
vinelandii）、メチロコツカス・カプスラタス
（Methylococcus capsulatus）およびメチロコツ
カス・カプスラタス、Texas株（Methylococcus
capsulatus Strain Texas）〔D.W.リボンズ（D.
W.Ribbons）、J.Bacteriol.、122、1351−1363
（1975）によつて引照された〕およびメチロコツ
カス・ミニムス（Methylococcus minimus）と
して確認された微生物を用いることができる。こ
れらのメチロトロフ微生物は、全細胞またはその
酵素抽出物の形で使用することができ、あるいは
DEAEセルロースまたはイオン交換樹脂あるいは
多孔性アルミナ担体の使用によるなどの全細胞ま
たは酵素抽出物の固定化製剤（immobilized
preparations）の形で用いることもできる。 ホイツテンベリーらが記載した幾つかのメチロ
トロフ微生物の継代培養は、米国農務省のアグリ
カルチヤー・リサーチ、サービス、ノーザン・レ
ジヨナル・リサーチ・ラボラトリー
（Agriculture Research Serrice、Northern
Regional Research Laboratory、Peoria、
Illinois 61604）の公立寄託機関（official
depository）におのおの継代培養を寄託すること
によつて寄託されており、以下に示す個々の
NRRL菌株をこの寄託機関から受けとつた。これ
らの継代培養は、米国民および西独国民を含むが
これら国民に限定されることなく公衆にこれら菌
株の後代が利用できるというように、何らの制限
もなく、米国農務省の手続きに従つて寄託されて
いる。寄託されたメチロトロフ微生物の菌株は次
の名称で呼ばれる。
【表】
【表】
これらの菌株の後代はその菌株を要求するどん
な人にも利用に関する何らの制限もなく利用する
ことができる。上記菌株の継代培養は、初め英国
ワーウイツク大学生物科学部のR.ホイツテンベ
リー（R.Whittenbury、Department of
Biological Science、University of Warwick、
Warwickshire、Coventry、England）から得た
ものである。 上記メチロトロフ菌株の形態学的および分類学
特徴は下記の通りである。 メチロシヌス・トリコスポリウム OB3b NRRL
Ｂ−11、196 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で白色コロニーを生じる。この菌は運
動性、棒状、グラム陰性、好気性菌である。ロゼ
ツト（rosette）をしばしば形成する。型の膜
構造を有する。 メチロシヌス・スポリウム ５ NRRL Ｂ−
11、197 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で白色コロニーを生じる。この菌は運
動性、棒状、グラム陰性、好気性菌である。しば
しばロゼツトを形成する。この菌は耐熱性の外生
胞子をつくり、菌の無鞭毛極から分離した胞子は
ビブリオ形をとる。メタンおよびメタノール以外
の有機化合物は生長を支持しない。型の膜構造
を有する。 メチロシスチス・パルブス OBBR NRRL Ｂ−
11、198 メタンまたはメタノールの存在下において、食
塩寒天平板上で粘液様白色コロニーを生じる。こ
の菌は非運動性、球桿菌形状、グラム陰性、好気
性菌である。この菌は耐乾燥性であるが耐熱性で
はない嚢子を形成する。メタンまたはメタノール
を費消して生長する。メタンおよびメタノール以
外の有機化合物は生長を支持しない。型の膜構
造を有する。 メチロモナス・メタニカ S1 NRRL Ｂ−11、
199 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で桃色のコロニーを生じる。この菌は
運動性、棒状、グラム陰性、好気性菌である。ス
ライム状カプセルを生成する。この菌はメタンお
よびメタノールを費消して生長する。メタンおよ
びメタノール以外の有機化合物は生長を支持しな
い。型の膜構造を有する。 メチロモナス・アルブス BG8 NRRL Ｂ−11、
200 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で白色コロニーを生じる。この菌は運
動性、棒状、グラム陰性、好気性菌であり、スラ
イム状カプセルを生成する。メタンおよびメタノ
ールを費消して生長する。メタンおよびメタノー
ル以外の有機化合物は生長を支持しない。型の
膜構造を有する。 メチロバクテル・カプスラタス Ｙ NRRL Ｂ
−11、201 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で白色〜褐色コロニーを生じる。この
菌は運動性、棒状、グラム陰性、好気性菌であ
り、スライム状カプセルを生成する。メタンおよ
びメタノールを費消して生長する。メタンおよび
メタノール以外の有機化合物は生長を支持しな
い。型の膜構造を有する。 最近、パット、コールおよびハンソン（Patt、
Cole and Hanson）〔International J.Systmatic
Bacteriology、27、(2)226−229（1976）〕は、メ
チロトロフ菌は１個以上の炭素原子を含むが炭素
−炭素結合を含まない炭素化合物を利用して非自
家栄養的に生長することができる菌であることを
開示した。パツトらはメチロトロフ菌を、それら
が炭素−炭素結合を含まない炭素化合物（例えば
メタン、メタノール、ジメチルエーテル、メチル
アミンなど）だけしか唯一の炭素源およびエネル
ギー源として利用することができない場合には
「偏性」菌と考えるべきであるが、「通性」メチロ
トロフ菌は炭素−炭素結合を含まない化合物およ
び炭素−炭素結合を含む複雑な化合物を唯一の炭
素源（Sole sources of carbon）およびエネルギ
ー源として利用することができる菌であると提案
している。パツトらは上記報文の中で、自分達が
メチロバクテリウム・オルガノフイルム
（Methylobacterrium organophilum）sp nov.
（ATCC27886）であると確認したメタン酸化性菌
株を開示している。この菌は炭素−炭素結合を有
する種々の有機基質を炭素源およびエネルギー源
として利用する能力があるので、おそらく前述し
たメタン酸化性菌の属および種とは異なるであろ
う。 本発明のもう一つの実施態様として、この微生
物（メチロバクテリウム・オルガノフイルム
sp nov.ATCC27886）および他の通性メチロトロ
フ微生物もC2〜C4アルケンをエポキシ化する能
力があることが発見された。換言すると、これら
の微生物はメタンの存在下で培養するときアルケ
ンエポキダーゼ酵素活性を示す。ホイツテンベリ
ーらのメチロトロフ微生物に関して上述したよう
に、通性メチロトロフ菌は、本発明の方法で使用
するとき、その粗製抽出物（すなわち破壊細胞を
10000Xgで30分間遠心分離した後の上澄液）の形
で使用することができ、あるいは固定化形にする
ことができ、あるいは細胞結合形で用いることが
できる。 本発明の方法で使用できる他の公知のメチロト
ロフ菌株には、例えば米国特許第3930947号中明
細書に引用され、日本（千葉）の通商産業省、工
業技術院微生物工業技術研究所から自由に入手で
きるメチロモナス（Methylomonas）sp.AJ−
3670（FERM Ｐ−2400）；および米国特許第
4042458号明細書中に引用され、NCIB
Accession No.11083を有するメチロコツカス
（Methylococcus）999ならびにNCIB Aecession
No.11084を有するメチロモナス
（Methylomonas）SM3（オランダ国特許出願第
74／16644号明細書中に記載されている）があ
る。米国特許第3996105号および第4042458号明細
書中に記載されているようなメチロトロフ微生物
と非メチロトロフ微生物との混合物も利用するこ
とができる。 商業的な微生物の繁殖方法においては、一般に
段階によつて進行させる必要がある。これらの段
階は方法の性質ならびに微生物の特性により、少
ない場合も多い場合もあり得る。通常、細胞を培
養の斜面から通常フラスコ中に入つている予め減
菌済みの栄養培地中へ接種することによつて繁殖
を開始させる。フラスコ中の微生物の生長は種々
の方法、例えば完全通気のための振盪および適当
な温度の保持によつて促進される。この工程すな
わち段階を、同じまたはより多量の栄養培地を含
むフラスコまたは容器中で１回以上反復する。こ
れらの段階を便宜上培養発育段階と呼ぶことがで
きる。最終発育段階からの、培地を伴つた、ある
いは伴わない微生物を大規模醗酵器中へ導入また
は接種して商業的な量の微生物を生成させあるい
は微生物から酵素を生成させる。 何段階かで微生物を生長させる理由は種々ある
が、主として微生物の生長ならびに（あるいは）
それからの酵素の製造のために必要な条件に依存
している。これらは発酵中の微生物の安定性、適
当な養分、PH、浸透圧関係、通気度、温度および
純粋培養条件の保持を含む。例えば、最高収率の
アルケンエポキシダーゼを得るため、最終段階に
おける発酵条件を、培養発育段階で微生物の生長
を得るために実施される条件から幾らか変化させ
ねばならないこともありうる。 培地の純度を保持することも非常に重要な考慮
すべきことであり、メチロトロフ微生物の場合の
ように好気条件下で発酵を行う場合には特に重要
である。大発酵器中で初め発酵を開始する場合、
微生物ならびに（あるいは）微生物からのアルケ
ンエポキシダーゼ酵素のかなりの収率を得るため
には比較的長時間が必要である。勿論、このこと
は培地の汚染ならびに微生物の突然変異の可能性
を高める。 メチロトロフ微生物を生長させ且つオキシゲナ
ーゼすなわちエポキシ化酵素系を誘導するために
用いる培地は燐酸塩、硫酸塩および硝酸塩のよう
な無機塩ならびに酸素およびメタン源を含む。発
酵は一般に５〜約55℃の温度、好ましくは約25〜
50℃の温度で行われる。培地のPHは約４〜９、好
ましくは約5.5〜8.5、より好ましくは6.0〜7.5の
範囲に調節すべきである。発酵は常圧で行うこと
ができるが、約５気圧までおよびそれより高い圧
力も使用することができる。 典型的にはメチロトロフ微生物を生長させ且つ
オキシゲナーゼすなわちエポキシ化酵素系を誘導
するため、メタンおよび酸素を含む混合ガスと接
触している培地にメチロトロフ微生物を接触す
る。メタンは天然ガスの形で供給することができ
る。連続流動培養（continuous flow culture）
のため、メチロトロフ微生物は、適当に適応させ
た発酵器、例えば内部冷却または外部循環冷却環
状管を備えた撹拌式邪魔板付き（stirred
baffled）発酵器またはスパージ塔式発酵器中で
生長させることができる。新鮮な培地を毎時0.02
〜１培養物容積に等しい速度で培養物中へ絶えず
ポンプで供給し且つ培養物の容積が一定に保たれ
るような速度で培養物を取り出すことができる。
メタンおよび酸素を含み且つ二酸化炭素または他
のガスを含む可能性がある混合ガスを、好ましく
は発酵器の底部からスパージヤーにより絶えずバ
ブリングさせることによつて培地と接触させる。
培養のための酸素源は空気でも酸素でも酸素に富
む空気でもよい。使用済みガスは発酵器の頂部か
ら除去することができる。使用済みガスは外部環
状管を通して循環させてもよく、あるいはガスイ
ンデユーサーインペラー（inducer impeller）に
より内部的に循環させてもよい。ガス流および循
環流は菌の最大生長ならびにメタンの最高利用が
得られるように設定される。 オキシゲナーゼ酵素系は、上述のように、粗製
抽出物として得ることができ、あるいは無細胞粒
状画分、すなわち破壊細胞を10000Xgで30分間遠
心分離した後の上澄液を10000Xgまたはそれ以上
で１時間遠心分離するときに沈澱または沈降する
物質として得ることができる。通常用いられる標
準的方法、例えば凝集、沈降および（あるいは）
沈澱させた後、遠心分離および（あるいは）過
することによつて微生物細胞を増殖培地から採取
することができる。この細胞塊（biomass）は凍
結または噴霧乾燥によつて乾燥されまたエポキシ
化反応にさらに用いるためこの形で使用すること
もできる。無細胞酵素を用いる場合、酵素活性も
増強させるためにNADHおよびび金属（例えば銅
または鉄）を添加することができる。 本発明の方法を実施するため、例えば上記のよ
うにして酸化条件下でメタンをメタノールに転化
させるオキシゲナーゼ酵素系を得る。酵素源は臨
界的ではないが、ホイツテンベリーらの報文中に
記載された５属の微生物の１つまたは通性メチロ
トロフ菌（メチロバクテリウム）から、微生物を
上記のようにメタンおよび酸素を含む栄養培地中
で生長させてかかる製剤を得ることが好ましい。
栄養培地はホイツテンベリーらが記載しているも
のでよく、あるいはより好ましくはフオスターお
よびデービス（Foster and Davis）〔J.Bacteriol.
91、1924〜1931（1966）〕が記載している培地で
よい。次に、この酵素製剤を、酸素の存在下、緩
衝液中または栄養培地（例えば、メタンの代りに
オレフインを用いる以外は微生物の生成に用いた
ものと同じ栄養培地を用いることができる）中
で、C2〜C4アルケン、例えばエチレン、プロピ
レン、ブテン−１または共役ブタジエンあるいは
それらの混合物と接触させて、所望の転化率が得
られるまで混合物を培養する。その後で、常法、
例えば蒸留などによつてエポキシドを回収する。 必要な酸素と酵素（酵素製剤またはメチロトロ
フ微生物）との有効接触を容易にするため、最良
の結果を得るには、一般に水および緩衝剤を含み
且つ酵素製剤または微生物培養物が中に懸濁して
いて、激しく撹拌されているエポキシ化培地中の
オレフイン分散液中へ強力な微細空気流を導入す
ることが好ましい。次に酵素製剤を好ましくは
過または遠心分離によつて液体培地から分離する
ことができる。次に、一般に、生成したエポキシ
ドを得ることができる。 本発明の方法はバツチ式または半連続式または
連続式で実施することができ、あるいは並流式ま
たは向流式で実施することができる。随意に、酵
素製剤またはメチロトロフ微生物および緩衝液を
含む懸濁液を、管状反応器中を上昇する空気流に
対して向流的に激しく撹拌しながら流下させる。
流下する懸濁液の上層を除去し、培養物および残
りの緩衝液成分（少なくとも一部分）をさらにオ
レフインと共に、必要に応じて新鮮な酵素製剤ま
たはメチロトロフ微生物を加えて再循環させる。 メチロトロフ微生物の生長工程およびエポキシ
化工程は同時に行うことによつて便宜上結合させ
ることができるが、別々に行い且つエポキシ化工
程でずつと高度の通気（例えば生長用に所要な通
気の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍
の過剰空気）を用いて行うこともできる。生長工
程およびエポキシ化工程の両方を、同一反応器中
で、正常通気および強力通気を交互に用いること
により、逐次操作または同時操作で行うこともで
きる。 以下実施例によつて本発明をさらに説明する
が、これら実施例は本発明を限定するためのもの
ではない。実施例中、部および％は特に断わらな
い限り、すべて重量による。 下文において、本発明で使用する微生物の
NRRL番号と微工研受託FERM Ｐ−番号との対
応を示す： NRRL FERM Ｐ− Ｂ−11202 5098 Ｂ−11208 5104 Ｂ−11219 5115 Ｂ−11222 5118 実施例 １ 下記組成（１中）を有する、フオスターおよ
びデービス（Foster and Davis）〔J.Bacteriol
91、1924−1931（1966）〕記載の栄養培地を調製
した。 Na2HPO4 0.21ｇ NaH2PO4 0.09ｇ NaNO3 2.0ｇ MgSO4・7H2O 0.2ｇ KCl 0.04ｇ CaCl2 0.015ｇ FeSO4・7H2O 1.0mg CuSO4・5H2O 0.01mg H3BO4 0.02mg MnSO4・5H2O 0.02mg ZnSO4 0.14mg MoO3 0.02mg 酸または塩基を添加して栄養培地のPHを7.0に
調節し、この栄養培地各50mlの部分標本を複数個
の300ml振盪フラスコに入れた。平板上に微生物
の均一コロニーを含む寒天平板（分離物の純度は
顕微鏡検査で確認した）から１接種ループ（an
inoculating loop）の細胞を各振盪フラスコに接
種した。分離物を１：1v／ｖガス比のメタンお
よび空気の雰囲気下で寒天平板上に保持し、２周
間毎に移した。次に、接種フラスコの気相を１：
1v／ｖ比のメタンおよび空気から成る混合ガス
で置換した。接種フラスコを気密に密閉し、軌道
半径2.5cm、250rpmの回転振盪機で、30℃におい
て２日間、培地中に濁りが生じるまで培養した。 ４℃において10000Xgで30分間遠心分離して細
胞を採取した。細胞ペレツトをPH7.0の0.15M燐
酸塩緩衝液002M MgCl2含有）で２回洗浄した。
次に、洗浄済み細胞をPH7.0の0.15M燐酸塩緩衝
液に懸濁せしめた。 おのおのの洗浄済み細胞懸濁液0.5ml（細胞２
mg）の部分標本を４℃で10mlびんに入れ、ゴム栓
で密栓した。減圧してびんの気相を除去した後、
１：1v／ｖ比のアルケンおよび酸素の混合ガス
で置換した。次に、300rpmの回転振盪機で30℃
において培養した。生成物の試料（３μ）をマ
イクロシリンジで定期的に取り出し、ガスクロマ
トグラフイー（イオン化フレーム検出器カラム）
により分析した。 第１表はメタンのヒドロキシル化の転化率なら
びに上記実験方法によりメタンで生長させた数種
の微生物菌株の洗浄済み細胞懸濁液によるプロピ
レンのエポキシル化の転化率を示す。表中のデー
タから、メタンのメタノールへのヒドロキシル化
の能力があるメタン生長微生物はプロピレンのプ
ロピレンオキシドへの転化の能力もあることがわ
かる。
な人にも利用に関する何らの制限もなく利用する
ことができる。上記菌株の継代培養は、初め英国
ワーウイツク大学生物科学部のR.ホイツテンベ
リー（R.Whittenbury、Department of
Biological Science、University of Warwick、
Warwickshire、Coventry、England）から得た
ものである。 上記メチロトロフ菌株の形態学的および分類学
特徴は下記の通りである。 メチロシヌス・トリコスポリウム OB3b NRRL
Ｂ−11、196 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で白色コロニーを生じる。この菌は運
動性、棒状、グラム陰性、好気性菌である。ロゼ
ツト（rosette）をしばしば形成する。型の膜
構造を有する。 メチロシヌス・スポリウム ５ NRRL Ｂ−
11、197 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で白色コロニーを生じる。この菌は運
動性、棒状、グラム陰性、好気性菌である。しば
しばロゼツトを形成する。この菌は耐熱性の外生
胞子をつくり、菌の無鞭毛極から分離した胞子は
ビブリオ形をとる。メタンおよびメタノール以外
の有機化合物は生長を支持しない。型の膜構造
を有する。 メチロシスチス・パルブス OBBR NRRL Ｂ−
11、198 メタンまたはメタノールの存在下において、食
塩寒天平板上で粘液様白色コロニーを生じる。こ
の菌は非運動性、球桿菌形状、グラム陰性、好気
性菌である。この菌は耐乾燥性であるが耐熱性で
はない嚢子を形成する。メタンまたはメタノール
を費消して生長する。メタンおよびメタノール以
外の有機化合物は生長を支持しない。型の膜構
造を有する。 メチロモナス・メタニカ S1 NRRL Ｂ−11、
199 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で桃色のコロニーを生じる。この菌は
運動性、棒状、グラム陰性、好気性菌である。ス
ライム状カプセルを生成する。この菌はメタンお
よびメタノールを費消して生長する。メタンおよ
びメタノール以外の有機化合物は生長を支持しな
い。型の膜構造を有する。 メチロモナス・アルブス BG8 NRRL Ｂ−11、
200 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で白色コロニーを生じる。この菌は運
動性、棒状、グラム陰性、好気性菌であり、スラ
イム状カプセルを生成する。メタンおよびメタノ
ールを費消して生長する。メタンおよびメタノー
ル以外の有機化合物は生長を支持しない。型の
膜構造を有する。 メチロバクテル・カプスラタス Ｙ NRRL Ｂ
−11、201 メタンまたはメタノールの存在下において食塩
寒天平板上で白色〜褐色コロニーを生じる。この
菌は運動性、棒状、グラム陰性、好気性菌であ
り、スライム状カプセルを生成する。メタンおよ
びメタノールを費消して生長する。メタンおよび
メタノール以外の有機化合物は生長を支持しな
い。型の膜構造を有する。 最近、パット、コールおよびハンソン（Patt、
Cole and Hanson）〔International J.Systmatic
Bacteriology、27、(2)226−229（1976）〕は、メ
チロトロフ菌は１個以上の炭素原子を含むが炭素
−炭素結合を含まない炭素化合物を利用して非自
家栄養的に生長することができる菌であることを
開示した。パツトらはメチロトロフ菌を、それら
が炭素−炭素結合を含まない炭素化合物（例えば
メタン、メタノール、ジメチルエーテル、メチル
アミンなど）だけしか唯一の炭素源およびエネル
ギー源として利用することができない場合には
「偏性」菌と考えるべきであるが、「通性」メチロ
トロフ菌は炭素−炭素結合を含まない化合物およ
び炭素−炭素結合を含む複雑な化合物を唯一の炭
素源（Sole sources of carbon）およびエネルギ
ー源として利用することができる菌であると提案
している。パツトらは上記報文の中で、自分達が
メチロバクテリウム・オルガノフイルム
（Methylobacterrium organophilum）sp nov.
（ATCC27886）であると確認したメタン酸化性菌
株を開示している。この菌は炭素−炭素結合を有
する種々の有機基質を炭素源およびエネルギー源
として利用する能力があるので、おそらく前述し
たメタン酸化性菌の属および種とは異なるであろ
う。 本発明のもう一つの実施態様として、この微生
物（メチロバクテリウム・オルガノフイルム
sp nov.ATCC27886）および他の通性メチロトロ
フ微生物もC2〜C4アルケンをエポキシ化する能
力があることが発見された。換言すると、これら
の微生物はメタンの存在下で培養するときアルケ
ンエポキダーゼ酵素活性を示す。ホイツテンベリ
ーらのメチロトロフ微生物に関して上述したよう
に、通性メチロトロフ菌は、本発明の方法で使用
するとき、その粗製抽出物（すなわち破壊細胞を
10000Xgで30分間遠心分離した後の上澄液）の形
で使用することができ、あるいは固定化形にする
ことができ、あるいは細胞結合形で用いることが
できる。 本発明の方法で使用できる他の公知のメチロト
ロフ菌株には、例えば米国特許第3930947号中明
細書に引用され、日本（千葉）の通商産業省、工
業技術院微生物工業技術研究所から自由に入手で
きるメチロモナス（Methylomonas）sp.AJ−
3670（FERM Ｐ−2400）；および米国特許第
4042458号明細書中に引用され、NCIB
Accession No.11083を有するメチロコツカス
（Methylococcus）999ならびにNCIB Aecession
No.11084を有するメチロモナス
（Methylomonas）SM3（オランダ国特許出願第
74／16644号明細書中に記載されている）があ
る。米国特許第3996105号および第4042458号明細
書中に記載されているようなメチロトロフ微生物
と非メチロトロフ微生物との混合物も利用するこ
とができる。 商業的な微生物の繁殖方法においては、一般に
段階によつて進行させる必要がある。これらの段
階は方法の性質ならびに微生物の特性により、少
ない場合も多い場合もあり得る。通常、細胞を培
養の斜面から通常フラスコ中に入つている予め減
菌済みの栄養培地中へ接種することによつて繁殖
を開始させる。フラスコ中の微生物の生長は種々
の方法、例えば完全通気のための振盪および適当
な温度の保持によつて促進される。この工程すな
わち段階を、同じまたはより多量の栄養培地を含
むフラスコまたは容器中で１回以上反復する。こ
れらの段階を便宜上培養発育段階と呼ぶことがで
きる。最終発育段階からの、培地を伴つた、ある
いは伴わない微生物を大規模醗酵器中へ導入また
は接種して商業的な量の微生物を生成させあるい
は微生物から酵素を生成させる。 何段階かで微生物を生長させる理由は種々ある
が、主として微生物の生長ならびに（あるいは）
それからの酵素の製造のために必要な条件に依存
している。これらは発酵中の微生物の安定性、適
当な養分、PH、浸透圧関係、通気度、温度および
純粋培養条件の保持を含む。例えば、最高収率の
アルケンエポキシダーゼを得るため、最終段階に
おける発酵条件を、培養発育段階で微生物の生長
を得るために実施される条件から幾らか変化させ
ねばならないこともありうる。 培地の純度を保持することも非常に重要な考慮
すべきことであり、メチロトロフ微生物の場合の
ように好気条件下で発酵を行う場合には特に重要
である。大発酵器中で初め発酵を開始する場合、
微生物ならびに（あるいは）微生物からのアルケ
ンエポキシダーゼ酵素のかなりの収率を得るため
には比較的長時間が必要である。勿論、このこと
は培地の汚染ならびに微生物の突然変異の可能性
を高める。 メチロトロフ微生物を生長させ且つオキシゲナ
ーゼすなわちエポキシ化酵素系を誘導するために
用いる培地は燐酸塩、硫酸塩および硝酸塩のよう
な無機塩ならびに酸素およびメタン源を含む。発
酵は一般に５〜約55℃の温度、好ましくは約25〜
50℃の温度で行われる。培地のPHは約４〜９、好
ましくは約5.5〜8.5、より好ましくは6.0〜7.5の
範囲に調節すべきである。発酵は常圧で行うこと
ができるが、約５気圧までおよびそれより高い圧
力も使用することができる。 典型的にはメチロトロフ微生物を生長させ且つ
オキシゲナーゼすなわちエポキシ化酵素系を誘導
するため、メタンおよび酸素を含む混合ガスと接
触している培地にメチロトロフ微生物を接触す
る。メタンは天然ガスの形で供給することができ
る。連続流動培養（continuous flow culture）
のため、メチロトロフ微生物は、適当に適応させ
た発酵器、例えば内部冷却または外部循環冷却環
状管を備えた撹拌式邪魔板付き（stirred
baffled）発酵器またはスパージ塔式発酵器中で
生長させることができる。新鮮な培地を毎時0.02
〜１培養物容積に等しい速度で培養物中へ絶えず
ポンプで供給し且つ培養物の容積が一定に保たれ
るような速度で培養物を取り出すことができる。
メタンおよび酸素を含み且つ二酸化炭素または他
のガスを含む可能性がある混合ガスを、好ましく
は発酵器の底部からスパージヤーにより絶えずバ
ブリングさせることによつて培地と接触させる。
培養のための酸素源は空気でも酸素でも酸素に富
む空気でもよい。使用済みガスは発酵器の頂部か
ら除去することができる。使用済みガスは外部環
状管を通して循環させてもよく、あるいはガスイ
ンデユーサーインペラー（inducer impeller）に
より内部的に循環させてもよい。ガス流および循
環流は菌の最大生長ならびにメタンの最高利用が
得られるように設定される。 オキシゲナーゼ酵素系は、上述のように、粗製
抽出物として得ることができ、あるいは無細胞粒
状画分、すなわち破壊細胞を10000Xgで30分間遠
心分離した後の上澄液を10000Xgまたはそれ以上
で１時間遠心分離するときに沈澱または沈降する
物質として得ることができる。通常用いられる標
準的方法、例えば凝集、沈降および（あるいは）
沈澱させた後、遠心分離および（あるいは）過
することによつて微生物細胞を増殖培地から採取
することができる。この細胞塊（biomass）は凍
結または噴霧乾燥によつて乾燥されまたエポキシ
化反応にさらに用いるためこの形で使用すること
もできる。無細胞酵素を用いる場合、酵素活性も
増強させるためにNADHおよびび金属（例えば銅
または鉄）を添加することができる。 本発明の方法を実施するため、例えば上記のよ
うにして酸化条件下でメタンをメタノールに転化
させるオキシゲナーゼ酵素系を得る。酵素源は臨
界的ではないが、ホイツテンベリーらの報文中に
記載された５属の微生物の１つまたは通性メチロ
トロフ菌（メチロバクテリウム）から、微生物を
上記のようにメタンおよび酸素を含む栄養培地中
で生長させてかかる製剤を得ることが好ましい。
栄養培地はホイツテンベリーらが記載しているも
のでよく、あるいはより好ましくはフオスターお
よびデービス（Foster and Davis）〔J.Bacteriol.
91、1924〜1931（1966）〕が記載している培地で
よい。次に、この酵素製剤を、酸素の存在下、緩
衝液中または栄養培地（例えば、メタンの代りに
オレフインを用いる以外は微生物の生成に用いた
ものと同じ栄養培地を用いることができる）中
で、C2〜C4アルケン、例えばエチレン、プロピ
レン、ブテン−１または共役ブタジエンあるいは
それらの混合物と接触させて、所望の転化率が得
られるまで混合物を培養する。その後で、常法、
例えば蒸留などによつてエポキシドを回収する。 必要な酸素と酵素（酵素製剤またはメチロトロ
フ微生物）との有効接触を容易にするため、最良
の結果を得るには、一般に水および緩衝剤を含み
且つ酵素製剤または微生物培養物が中に懸濁して
いて、激しく撹拌されているエポキシ化培地中の
オレフイン分散液中へ強力な微細空気流を導入す
ることが好ましい。次に酵素製剤を好ましくは
過または遠心分離によつて液体培地から分離する
ことができる。次に、一般に、生成したエポキシ
ドを得ることができる。 本発明の方法はバツチ式または半連続式または
連続式で実施することができ、あるいは並流式ま
たは向流式で実施することができる。随意に、酵
素製剤またはメチロトロフ微生物および緩衝液を
含む懸濁液を、管状反応器中を上昇する空気流に
対して向流的に激しく撹拌しながら流下させる。
流下する懸濁液の上層を除去し、培養物および残
りの緩衝液成分（少なくとも一部分）をさらにオ
レフインと共に、必要に応じて新鮮な酵素製剤ま
たはメチロトロフ微生物を加えて再循環させる。 メチロトロフ微生物の生長工程およびエポキシ
化工程は同時に行うことによつて便宜上結合させ
ることができるが、別々に行い且つエポキシ化工
程でずつと高度の通気（例えば生長用に所要な通
気の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍
の過剰空気）を用いて行うこともできる。生長工
程およびエポキシ化工程の両方を、同一反応器中
で、正常通気および強力通気を交互に用いること
により、逐次操作または同時操作で行うこともで
きる。 以下実施例によつて本発明をさらに説明する
が、これら実施例は本発明を限定するためのもの
ではない。実施例中、部および％は特に断わらな
い限り、すべて重量による。 下文において、本発明で使用する微生物の
NRRL番号と微工研受託FERM Ｐ−番号との対
応を示す： NRRL FERM Ｐ− Ｂ−11202 5098 Ｂ−11208 5104 Ｂ−11219 5115 Ｂ−11222 5118 実施例 １ 下記組成（１中）を有する、フオスターおよ
びデービス（Foster and Davis）〔J.Bacteriol
91、1924−1931（1966）〕記載の栄養培地を調製
した。 Na2HPO4 0.21ｇ NaH2PO4 0.09ｇ NaNO3 2.0ｇ MgSO4・7H2O 0.2ｇ KCl 0.04ｇ CaCl2 0.015ｇ FeSO4・7H2O 1.0mg CuSO4・5H2O 0.01mg H3BO4 0.02mg MnSO4・5H2O 0.02mg ZnSO4 0.14mg MoO3 0.02mg 酸または塩基を添加して栄養培地のPHを7.0に
調節し、この栄養培地各50mlの部分標本を複数個
の300ml振盪フラスコに入れた。平板上に微生物
の均一コロニーを含む寒天平板（分離物の純度は
顕微鏡検査で確認した）から１接種ループ（an
inoculating loop）の細胞を各振盪フラスコに接
種した。分離物を１：1v／ｖガス比のメタンお
よび空気の雰囲気下で寒天平板上に保持し、２周
間毎に移した。次に、接種フラスコの気相を１：
1v／ｖ比のメタンおよび空気から成る混合ガス
で置換した。接種フラスコを気密に密閉し、軌道
半径2.5cm、250rpmの回転振盪機で、30℃におい
て２日間、培地中に濁りが生じるまで培養した。 ４℃において10000Xgで30分間遠心分離して細
胞を採取した。細胞ペレツトをPH7.0の0.15M燐
酸塩緩衝液002M MgCl2含有）で２回洗浄した。
次に、洗浄済み細胞をPH7.0の0.15M燐酸塩緩衝
液に懸濁せしめた。 おのおのの洗浄済み細胞懸濁液0.5ml（細胞２
mg）の部分標本を４℃で10mlびんに入れ、ゴム栓
で密栓した。減圧してびんの気相を除去した後、
１：1v／ｖ比のアルケンおよび酸素の混合ガス
で置換した。次に、300rpmの回転振盪機で30℃
において培養した。生成物の試料（３μ）をマ
イクロシリンジで定期的に取り出し、ガスクロマ
トグラフイー（イオン化フレーム検出器カラム）
により分析した。 第１表はメタンのヒドロキシル化の転化率なら
びに上記実験方法によりメタンで生長させた数種
の微生物菌株の洗浄済み細胞懸濁液によるプロピ
レンのエポキシル化の転化率を示す。表中のデー
タから、メタンのメタノールへのヒドロキシル化
の能力があるメタン生長微生物はプロピレンのプ
ロピレンオキシドへの転化の能力もあることがわ
かる。
【表】
【表】
第２表はメタンのヒドロキシル化およびプロピ
レンのエポキシ化の転化率（第１表より）ならび
に上記方法により、メタンで生長させた２種の微
生物菌株の洗浄済み細胞懸濁液によるエチレン、
ブテン−１およびブタジエンのエポキシ化の転化
率を示す。これらのメタン生長微生物は、空気の
存在下においてペンテン−１およびヘキセン−１
と接触させたとき、検知できるエポキシドを生成
しなかつた。第２表のデータからは、それぞれの
メタン生長微生物についてプロピレンのプロピレ
ンオキシドへの転化率が他の転化率より高いこと
もわかる。
レンのエポキシ化の転化率（第１表より）ならび
に上記方法により、メタンで生長させた２種の微
生物菌株の洗浄済み細胞懸濁液によるエチレン、
ブテン−１およびブタジエンのエポキシ化の転化
率を示す。これらのメタン生長微生物は、空気の
存在下においてペンテン−１およびヘキセン−１
と接触させたとき、検知できるエポキシドを生成
しなかつた。第２表のデータからは、それぞれの
メタン生長微生物についてプロピレンのプロピレ
ンオキシドへの転化率が他の転化率より高いこと
もわかる。
【表】
上記実験操作をメチロシスチス・パルブス
OBBP（NRRL Ｂ−11198）、メチロモナス・メ
タニカ S1（NRRL Ｂ−11199）およびメチロモ
ナス・アルブス BG8（NRRL8−11200）の各菌
株の場合に繰り返し、これらメタン生長微生物の
洗浄済み細胞懸濁液を培養液基準に対する細胞の
軽燥重量0.2ｇ／100mlでメタンのエチレンオキシ
ドへの転化に成功裏に使用し、それぞれ0.9、
0.95および1.2μモル／時／mg蛋白質の転化率を
得た。 上で示したように、メタンの存在下で生長させ
た微生物の細胞または無細胞抽出物（あるいはそ
れから誘導される酵素）の存在下においてプロピ
レンを培養することによつてプロピレンオキシド
が得られる新規方法が発見された。これらの微生
物は短鎖アルカンをヒドロキシル化する（例えば
メタンをメタノールにする）ことができることも
知られており、幾人かの研究者はこれらの微生物
がエチレンをエポキシ化する能力があるかもしれ
ないことを示唆している。今回、本発明者らは、
これらのメタン生長微生物およびその酵素製剤が
エチレン、ブテン−１およびブタジエンの場合よ
りも相対的に高い転化率でプロピレンをエポキシ
化する能力があることを発見した。洗浄済みのメ
タン生長細胞を用いるバツチ式実験において、エ
ポキシ化反応は少なくとも２時間直線的に進行す
る。エポキシド生成物のそれ以上の酸化は検出さ
れなかつた。 メタン生長微生物のエポキシ化酵素系は誘導酵
素（メタンによる）であり、エポキシド生成物は
細胞外に蓄積する（すなわち、反応後、反応混合
物を遠心分離すると、エポキシド生成物は上澄液
画分中にのみ見いだされ、細胞ペレツト中には見
いだされなかつた）。g.l.c.分析の結果、プロピレ
ンの酸化生成物としてのプロパナールの可能性は
なかつた。 比較実験において、メタノールで生長させた微
生物、メチロシヌス・トリコスポリウムOB3b
（NRRL Ｂ−11196）、メチロシスチス・パルブス
OBBP（NRRL、Ｂ−11198）、メチロモナス・メ
タニカS1（NRRL Ｂ−11199）およびメチロバク
テル・カプスラタスＹ（NRRL Ｂ−11201）の各
菌株はメタンのヒドロキシル化能力もC2〜C4ア
ルケンのエポキシ化能力ももつていなかつた。こ
れらの証拠から、メタン生長微生物のみがメタン
ヒドロキシル化能力およびC2〜C4アルケンエポ
キシ化能力を有することがわかる。 前述したように、メタン生長メチロトロフ菌の
全細胞およびオキシゲナーゼ酵素活性を含む無細
胞抽出物は空気の存在下においてヒドロキシル化
およびエポキシ化反応に使用することができる。
無細胞または純酵素製剤を用いる場合には、活性
を高めるためNADHおよび金属（鉄または銅）を
加えてもよい。本発明の無細胞酵素系を利用する
場合、酵素製剤は次のようにして調製する。 細胞画分の調製 総炭素およびエネルギー源としてのメタン（メ
タンおよび空気、１：１容量部）と共に実施例１
記載の無機塩培地700mlを含む2.8フラスコ中
で、30℃で微生物を生長させた。指数増殖中に、
４℃で15分間12000Xgで遠心分離して細胞を採取
した。細胞を５ｍＭ MgCl2を含有するPH7.0の
25ｍＭの燐酸カリウム緩衝液で２回洗浄した。こ
の細胞懸濁液を、４℃で、フレンチ・プレツシヤ
ー・セル（French Pressure cell）〔1054.5Kg／
cm2（15000lb／in2）を１回通レすことによつて破
壊（disintegrate）し、非破壊菌を除去するため
5000Xgで15分間遠心分離を行つた。上澄液（粗
製抽出物）をを次に40000Xgで30分間遠心分離し
て粒状Ｐ（40）画分と可溶性Ｓ（40）画分とを得
た。Ｓ（40）画分は次に8000Xgで60分間遠心分
離して、粒状Ｐ（80）画分と可溶性Ｓ（80）画分
とを得た。粒状画分〔Ｐ（40）およびＰ（80）〕
を５ｍＭのMgCl2を含むPH7.0の25ｍＭ燐酸カリ
リウム緩衝液中に懸濁し、４℃でホモジナイズし
た。 酵素検定 粒状画分〔Ｐ（40）およびＰ（80）〕画分およ
び可溶性画分〔Ｓ（80）〕画分によるメタンおよ
びプロピレンの酸化を、それぞれメタノールおよ
びプロピレンオキシドの生成量を概算することに
より30℃で測定した。1.0ml中に含まれる反応混
合物：５のｍＭのMgCl2を含む、PH7.0の150ｍＭ
燐酸カリウム緩衝液0.6ml；10μモルNADHおよ
び細胞画分。 反応混合物を４℃で10mlびんに入れた。各びん
はゴムキヤツプで密封した。減圧により各びんの
気相を除去した後、メタンまたはプロピレンと酸
素との１：1v／ｖ比混合ガスで置換した。他の
ガス状ｎ−アルカンおよびｎ−アルケンの酸化は
上記のようにして試験した。液状基質では、10μ
の基質を直接用いた。次に各びんを200rpmの
回転振盪機で、30℃で培養した。 ｎ−アルケンのエポキシ化およびｎ−アルカン
のヒドロキシル化の生成物を、80／100クロモソ
ーブ（Chromosorb）Ｗおよびポラパツク
（Porapak）Ｑカラム上に10％カーボワツクス
20Mで充填したステンレス鋼製カラム〔365.76cm
×0.3175cm（12′×1/8″）〕を用いるフオームイオ
ン化ガスクロマトグラフイーによつて分析した。
カラム温度は120℃の恒温に保つた。キヤリヤー
ガスの流速はヘリウム30ml／分であつた。保持時
間の比較および真正標準の同時クロマトグラフイ
ーによつて種々の生成物を確認した。 比活性は１時間当たり１mg蛋白質当たりの生成
物のμモルで示した。種々の画分中の蛋白質の濃
度はローリー（Lowry）ら〔J.Biol.Cham.193、
265−275（1951）〕の方法で測定した。 細胞画分中のｎ−アルカン酸化活性およびｎ−ア
ルケン酸化活性の分布 全く異なる３群のメタン利用性微生物を選んで
無細胞系におけるｎ−アルカン（C1〜C4）および
ｎ−アルケン（C2−C4）の酸化の試験を行つた。
型偏性メタン利用性微生物、メチロモナス
（Methylomonas）sp.（CRL−17、NRRL Ｂ−
11208）およびメチロコツカス・カプスラタス
（Methylocsccus capsulatus）（Texas、
ATCC19069）；型偏性メタン利用性微生物、
メチロシヌス・トリコスポリウム
（Methylosinus trichasporium）（OB3b、NRRL
Ｂ−11196）およびメチロシヌス
（Methylosinus）sp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）；ならびに通性メタン利用性菌
（bacterium）、メチロバクテリウム
（Methylobacterium）sp.（CRL−26、NRRL Ｂ
−11222）から細胞画分を調製した。 第３表はこれらの各微生物から誘導された種々
の画分中のメタン酸化活性およびプロピレン酸化
活性の分布を示す。全活性の約85−90％がＰ
（40）画分中に検出され、Ｐ（80）画分中には10
％が検出された。可溶性画分Ｓ（80）は活性を全
く含まなかつた。Ｐ（40）およびＰ（80）画分の
メタン酸化およびプロピレン酸化の比活性は試験
した種々の微生物であまり変わりがなかつた（第
４表）。プロピレンのエポキシ化およびメタンの
ヒドロキシル化は共に酸素およびNADHの存在下
に依存した。NADPHまたはアスコルビン酸塩お
よび他の電子キヤリヤーも利用することができ
た。両反応とも、ガスクロマトグラフイによる生
成物の検出によつて測定されるように、初めの15
分間は直線的であつた。
OBBP（NRRL Ｂ−11198）、メチロモナス・メ
タニカ S1（NRRL Ｂ−11199）およびメチロモ
ナス・アルブス BG8（NRRL8−11200）の各菌
株の場合に繰り返し、これらメタン生長微生物の
洗浄済み細胞懸濁液を培養液基準に対する細胞の
軽燥重量0.2ｇ／100mlでメタンのエチレンオキシ
ドへの転化に成功裏に使用し、それぞれ0.9、
0.95および1.2μモル／時／mg蛋白質の転化率を
得た。 上で示したように、メタンの存在下で生長させ
た微生物の細胞または無細胞抽出物（あるいはそ
れから誘導される酵素）の存在下においてプロピ
レンを培養することによつてプロピレンオキシド
が得られる新規方法が発見された。これらの微生
物は短鎖アルカンをヒドロキシル化する（例えば
メタンをメタノールにする）ことができることも
知られており、幾人かの研究者はこれらの微生物
がエチレンをエポキシ化する能力があるかもしれ
ないことを示唆している。今回、本発明者らは、
これらのメタン生長微生物およびその酵素製剤が
エチレン、ブテン−１およびブタジエンの場合よ
りも相対的に高い転化率でプロピレンをエポキシ
化する能力があることを発見した。洗浄済みのメ
タン生長細胞を用いるバツチ式実験において、エ
ポキシ化反応は少なくとも２時間直線的に進行す
る。エポキシド生成物のそれ以上の酸化は検出さ
れなかつた。 メタン生長微生物のエポキシ化酵素系は誘導酵
素（メタンによる）であり、エポキシド生成物は
細胞外に蓄積する（すなわち、反応後、反応混合
物を遠心分離すると、エポキシド生成物は上澄液
画分中にのみ見いだされ、細胞ペレツト中には見
いだされなかつた）。g.l.c.分析の結果、プロピレ
ンの酸化生成物としてのプロパナールの可能性は
なかつた。 比較実験において、メタノールで生長させた微
生物、メチロシヌス・トリコスポリウムOB3b
（NRRL Ｂ−11196）、メチロシスチス・パルブス
OBBP（NRRL、Ｂ−11198）、メチロモナス・メ
タニカS1（NRRL Ｂ−11199）およびメチロバク
テル・カプスラタスＹ（NRRL Ｂ−11201）の各
菌株はメタンのヒドロキシル化能力もC2〜C4ア
ルケンのエポキシ化能力ももつていなかつた。こ
れらの証拠から、メタン生長微生物のみがメタン
ヒドロキシル化能力およびC2〜C4アルケンエポ
キシ化能力を有することがわかる。 前述したように、メタン生長メチロトロフ菌の
全細胞およびオキシゲナーゼ酵素活性を含む無細
胞抽出物は空気の存在下においてヒドロキシル化
およびエポキシ化反応に使用することができる。
無細胞または純酵素製剤を用いる場合には、活性
を高めるためNADHおよび金属（鉄または銅）を
加えてもよい。本発明の無細胞酵素系を利用する
場合、酵素製剤は次のようにして調製する。 細胞画分の調製 総炭素およびエネルギー源としてのメタン（メ
タンおよび空気、１：１容量部）と共に実施例１
記載の無機塩培地700mlを含む2.8フラスコ中
で、30℃で微生物を生長させた。指数増殖中に、
４℃で15分間12000Xgで遠心分離して細胞を採取
した。細胞を５ｍＭ MgCl2を含有するPH7.0の
25ｍＭの燐酸カリウム緩衝液で２回洗浄した。こ
の細胞懸濁液を、４℃で、フレンチ・プレツシヤ
ー・セル（French Pressure cell）〔1054.5Kg／
cm2（15000lb／in2）を１回通レすことによつて破
壊（disintegrate）し、非破壊菌を除去するため
5000Xgで15分間遠心分離を行つた。上澄液（粗
製抽出物）をを次に40000Xgで30分間遠心分離し
て粒状Ｐ（40）画分と可溶性Ｓ（40）画分とを得
た。Ｓ（40）画分は次に8000Xgで60分間遠心分
離して、粒状Ｐ（80）画分と可溶性Ｓ（80）画分
とを得た。粒状画分〔Ｐ（40）およびＰ（80）〕
を５ｍＭのMgCl2を含むPH7.0の25ｍＭ燐酸カリ
リウム緩衝液中に懸濁し、４℃でホモジナイズし
た。 酵素検定 粒状画分〔Ｐ（40）およびＰ（80）〕画分およ
び可溶性画分〔Ｓ（80）〕画分によるメタンおよ
びプロピレンの酸化を、それぞれメタノールおよ
びプロピレンオキシドの生成量を概算することに
より30℃で測定した。1.0ml中に含まれる反応混
合物：５のｍＭのMgCl2を含む、PH7.0の150ｍＭ
燐酸カリウム緩衝液0.6ml；10μモルNADHおよ
び細胞画分。 反応混合物を４℃で10mlびんに入れた。各びん
はゴムキヤツプで密封した。減圧により各びんの
気相を除去した後、メタンまたはプロピレンと酸
素との１：1v／ｖ比混合ガスで置換した。他の
ガス状ｎ−アルカンおよびｎ−アルケンの酸化は
上記のようにして試験した。液状基質では、10μ
の基質を直接用いた。次に各びんを200rpmの
回転振盪機で、30℃で培養した。 ｎ−アルケンのエポキシ化およびｎ−アルカン
のヒドロキシル化の生成物を、80／100クロモソ
ーブ（Chromosorb）Ｗおよびポラパツク
（Porapak）Ｑカラム上に10％カーボワツクス
20Mで充填したステンレス鋼製カラム〔365.76cm
×0.3175cm（12′×1/8″）〕を用いるフオームイオ
ン化ガスクロマトグラフイーによつて分析した。
カラム温度は120℃の恒温に保つた。キヤリヤー
ガスの流速はヘリウム30ml／分であつた。保持時
間の比較および真正標準の同時クロマトグラフイ
ーによつて種々の生成物を確認した。 比活性は１時間当たり１mg蛋白質当たりの生成
物のμモルで示した。種々の画分中の蛋白質の濃
度はローリー（Lowry）ら〔J.Biol.Cham.193、
265−275（1951）〕の方法で測定した。 細胞画分中のｎ−アルカン酸化活性およびｎ−ア
ルケン酸化活性の分布 全く異なる３群のメタン利用性微生物を選んで
無細胞系におけるｎ−アルカン（C1〜C4）および
ｎ−アルケン（C2−C4）の酸化の試験を行つた。
型偏性メタン利用性微生物、メチロモナス
（Methylomonas）sp.（CRL−17、NRRL Ｂ−
11208）およびメチロコツカス・カプスラタス
（Methylocsccus capsulatus）（Texas、
ATCC19069）；型偏性メタン利用性微生物、
メチロシヌス・トリコスポリウム
（Methylosinus trichasporium）（OB3b、NRRL
Ｂ−11196）およびメチロシヌス
（Methylosinus）sp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）；ならびに通性メタン利用性菌
（bacterium）、メチロバクテリウム
（Methylobacterium）sp.（CRL−26、NRRL Ｂ
−11222）から細胞画分を調製した。 第３表はこれらの各微生物から誘導された種々
の画分中のメタン酸化活性およびプロピレン酸化
活性の分布を示す。全活性の約85−90％がＰ
（40）画分中に検出され、Ｐ（80）画分中には10
％が検出された。可溶性画分Ｓ（80）は活性を全
く含まなかつた。Ｐ（40）およびＰ（80）画分の
メタン酸化およびプロピレン酸化の比活性は試験
した種々の微生物であまり変わりがなかつた（第
４表）。プロピレンのエポキシ化およびメタンの
ヒドロキシル化は共に酸素およびNADHの存在下
に依存した。NADPHまたはアスコルビン酸塩お
よび他の電子キヤリヤーも利用することができ
た。両反応とも、ガスクロマトグラフイによる生
成物の検出によつて測定されるように、初めの15
分間は直線的であつた。
【表】
【表】
種々の微生物からの粒状画分〔Ｐ（40）および
Ｐ（80）〕は他のｎ−アルケン、（エチレン、１−
ブテンおよび１・３−ブタジエン）の対応する
１・２−エポキシドへのエポキシ化ならびにメタ
ンおよびエタンの対応するアルコールへのヒドロ
キシル化をも触媒した。第５表はメチロシヌス
sp.（CRL−15、NRRL Ｂ−11202）のＰ（40）
粒状画分による種々のｎ−アルカンおよびｎ−ア
ルケンの酸化速度を示す。酸化生成物の確認は、
Ｐ（40）画分を種々の基質で30℃において10分間
培養した後、ガスクロマトグラフイーによつて行
つた。
Ｐ（80）〕は他のｎ−アルケン、（エチレン、１−
ブテンおよび１・３−ブタジエン）の対応する
１・２−エポキシドへのエポキシ化ならびにメタ
ンおよびエタンの対応するアルコールへのヒドロ
キシル化をも触媒した。第５表はメチロシヌス
sp.（CRL−15、NRRL Ｂ−11202）のＰ（40）
粒状画分による種々のｎ−アルカンおよびｎ−ア
ルケンの酸化速度を示す。酸化生成物の確認は、
Ｐ（40）画分を種々の基質で30℃において10分間
培養した後、ガスクロマトグラフイーによつて行
つた。
【表】
シド
【表】
無細胞系のメタン酸化活性およびプロピレン酸
化活性におよぼす種々の環境因子の影響について
さらに研究するため、メチロシヌスsp.（CRL−
15、NRRL Ｂ−11202）を選んだ。 粒状画分濃度の影響 メタンのヒドロキシル化ならびにプロピレンの
エポキシ化に及ぼすＰ（40）粒状画分濃度の影響
を試験した。１ml当たり蛋白質１〜６mgの範囲で
は、メタノールおよびプロピレンオキシドの生成
はその範囲の粒状画分濃度に直接依存した。粒状
蛋白質濃度を８mg／mlにさらに増加したとき反応
速度は減少した。 反応の時間 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分による、それぞれの
メタンのヒドロキシル化およびプロピレンのエポ
キシ化によるメタノールおよびプロピレンオキシ
ドの生成速度は15分まで時間と共に直線的であつ
た。 PHの影響 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分によるメタンのヒド
ロキシル化およびプロピレンのエポキシ化に及ぼ
すPHの影響を、10分間反応混合物を培養した後生
成したメタノールおよびプロピレンオキシドの量
を概算することによつて試験した。メタンのヒド
ロキシル化ならびにプロピレンのエポキシ化の最
適PHは7.0であることがわかつた。これらの試験
の実施において、反応は実施例１記載のようにし
て行つた。反応生成物の概算は反応混合物を30℃
において回転振盪機で５、10および15分間培養後
ガスクロマトグラフイーによつて行つた。 100％活性は毎時、蛋白質１mg当たりそれぞれ
4.8および4.1μモルのメタノールおよびプロピレ
ンオキシドの生成に等しい。 温度の影響 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分によるメタノールお
よびプロピレンオキシドの生成におよぼす温度の
影響を、種々の温度で10分間反応混合物を培養し
た後試験した。プロピレンのエポキシ化ならびに
メタンのヒドロキシル化の最適温度は35℃である
ことがわかつた。これらの試験の実施において、
反応は実施例１記載のようにして行つた。反応生
成物の概算は、30℃において回転振盪機で反応混
合物を５、10および15分間培養した後ガスクロマ
トグラフイーによつて行つた。100％活性は毎
時、蛋白質１mg当たりそれぞれ5.0および4.2μモ
ルのメタノールおよびプロピレンオキシドの生成
に等しい。 貯蔵の影響 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分によるメタンのヒド
ロキシル化活性およびプロピレンのエポキシ化活
性は両方共冷蔵庫温度（０〜４℃）で貯蔵すると
き同時に減少することが認められた。これらの試
験の実施において、反応は実施例１記載のように
して行つた。反応生成物の概算は、反応混合物を
30℃において回転振盪機で５、10および15分間培
養した後ガスクロマトグラフイーによつて行つ
た。100％活性は毎時、蛋白質１mg当たりそれぞ
れ4.8μモルおよび4.1μモルのメタノールおよび
プロピレンオキシドの生成に等しい。 抑制剤の影響 メタン利用性菌の細胞懸濁液によるメタンの酸
化は種々の金属結合剤または金属キレート化剤に
よつて抑制されると報告されている〔パテル
（Patel）ら、J.Bacteriol.、126、1017−1019
（1976）〕。そこで、メチロシヌスsp.（CRL−
15、NRRL Ｂ−11202）のＰ（40）粒状画分のメ
タン酸化活性およびプロピレン酸化活性に及ぼす
抑制剤の影響を試験した。メタノールおよびプロ
ピレンオキシドの生成は、第６表に示すように
種々の配位子組み合わせ、すなわち窒素−窒素
（α・α−ビピリジル）、酸素−窒素（８−ヒドロ
キシキノリン）および硫黄−窒素（チオ尿素、チ
オセミカルバジド）を有する種々の金属結合性化
合物によつて抑制された。このことはメタンのヒ
ドロキシル化およびプロピレンのエポキシ化の両
方の酸化において金属イオンが関与することを示
唆している。同様に、第6a表に示されるように、
これらの化合物は含細胞酵素製剤を用いる場合に
メタンのヒドロキシル化およびプロピレンのエポ
キシ化をも抑制する。
化活性におよぼす種々の環境因子の影響について
さらに研究するため、メチロシヌスsp.（CRL−
15、NRRL Ｂ−11202）を選んだ。 粒状画分濃度の影響 メタンのヒドロキシル化ならびにプロピレンの
エポキシ化に及ぼすＰ（40）粒状画分濃度の影響
を試験した。１ml当たり蛋白質１〜６mgの範囲で
は、メタノールおよびプロピレンオキシドの生成
はその範囲の粒状画分濃度に直接依存した。粒状
蛋白質濃度を８mg／mlにさらに増加したとき反応
速度は減少した。 反応の時間 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分による、それぞれの
メタンのヒドロキシル化およびプロピレンのエポ
キシ化によるメタノールおよびプロピレンオキシ
ドの生成速度は15分まで時間と共に直線的であつ
た。 PHの影響 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分によるメタンのヒド
ロキシル化およびプロピレンのエポキシ化に及ぼ
すPHの影響を、10分間反応混合物を培養した後生
成したメタノールおよびプロピレンオキシドの量
を概算することによつて試験した。メタンのヒド
ロキシル化ならびにプロピレンのエポキシ化の最
適PHは7.0であることがわかつた。これらの試験
の実施において、反応は実施例１記載のようにし
て行つた。反応生成物の概算は反応混合物を30℃
において回転振盪機で５、10および15分間培養後
ガスクロマトグラフイーによつて行つた。 100％活性は毎時、蛋白質１mg当たりそれぞれ
4.8および4.1μモルのメタノールおよびプロピレ
ンオキシドの生成に等しい。 温度の影響 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分によるメタノールお
よびプロピレンオキシドの生成におよぼす温度の
影響を、種々の温度で10分間反応混合物を培養し
た後試験した。プロピレンのエポキシ化ならびに
メタンのヒドロキシル化の最適温度は35℃である
ことがわかつた。これらの試験の実施において、
反応は実施例１記載のようにして行つた。反応生
成物の概算は、30℃において回転振盪機で反応混
合物を５、10および15分間培養した後ガスクロマ
トグラフイーによつて行つた。100％活性は毎
時、蛋白質１mg当たりそれぞれ5.0および4.2μモ
ルのメタノールおよびプロピレンオキシドの生成
に等しい。 貯蔵の影響 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分によるメタンのヒド
ロキシル化活性およびプロピレンのエポキシ化活
性は両方共冷蔵庫温度（０〜４℃）で貯蔵すると
き同時に減少することが認められた。これらの試
験の実施において、反応は実施例１記載のように
して行つた。反応生成物の概算は、反応混合物を
30℃において回転振盪機で５、10および15分間培
養した後ガスクロマトグラフイーによつて行つ
た。100％活性は毎時、蛋白質１mg当たりそれぞ
れ4.8μモルおよび4.1μモルのメタノールおよび
プロピレンオキシドの生成に等しい。 抑制剤の影響 メタン利用性菌の細胞懸濁液によるメタンの酸
化は種々の金属結合剤または金属キレート化剤に
よつて抑制されると報告されている〔パテル
（Patel）ら、J.Bacteriol.、126、1017−1019
（1976）〕。そこで、メチロシヌスsp.（CRL−
15、NRRL Ｂ−11202）のＰ（40）粒状画分のメ
タン酸化活性およびプロピレン酸化活性に及ぼす
抑制剤の影響を試験した。メタノールおよびプロ
ピレンオキシドの生成は、第６表に示すように
種々の配位子組み合わせ、すなわち窒素−窒素
（α・α−ビピリジル）、酸素−窒素（８−ヒドロ
キシキノリン）および硫黄−窒素（チオ尿素、チ
オセミカルバジド）を有する種々の金属結合性化
合物によつて抑制された。このことはメタンのヒ
ドロキシル化およびプロピレンのエポキシ化の両
方の酸化において金属イオンが関与することを示
唆している。同様に、第6a表に示されるように、
これらの化合物は含細胞酵素製剤を用いる場合に
メタンのヒドロキシル化およびプロピレンのエポ
キシ化をも抑制する。
【表】
【表】
【表】
金属の影響
メタン利用性菌からのメタンモノオキシゲナー
ゼは含銅または含鉄蛋白質である〔トンゲ
（Tonge）ら、J.Biochem.、161、333−344
（1977）〕ので、メチロシヌスsp.（CRL−15、
NRRL Ｂ−11202）のＰ（40）粒状画分によるメ
タンおよびプロピレンの酸化に及びす銅塩および
鉄塩の影響を試験した。メタンのメタノールへの
ヒドロキシル化ならびにプロピレンのプロピレン
オキシドへのエポキシ化の速度は添加銅塩の存在
下で２倍に増加した（第７表）。
ゼは含銅または含鉄蛋白質である〔トンゲ
（Tonge）ら、J.Biochem.、161、333−344
（1977）〕ので、メチロシヌスsp.（CRL−15、
NRRL Ｂ−11202）のＰ（40）粒状画分によるメ
タンおよびプロピレンの酸化に及びす銅塩および
鉄塩の影響を試験した。メタンのメタノールへの
ヒドロキシル化ならびにプロピレンのプロピレン
オキシドへのエポキシ化の速度は添加銅塩の存在
下で２倍に増加した（第７表）。
【表】
基質競争実験
メタン利用性菌の粒状画分によるメタンのヒド
ロキシル化およびプロピレンのエポキシ化は酸素
およびNADHを要求した。同一または類似の酵素
が両方の基質の酸化に関与したかどうかという問
題を基質競争実験によつて試験した。実験はメチ
ロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−11202）の
Ｐ（40）粒状画分によるプロピレンのプロピレン
オキシドへの酸化に及ぼすメタンの影響を測定す
ることから成つていた。第８表中に示すように、
メタンの存在によつてプロピレンオキシドの生成
量は減少した。従つて、メタンは、おそらく有効
酵素部位に対して競争することにより、プロピレ
ンのプロピレンオキシドへの転化を抑制した。
ロキシル化およびプロピレンのエポキシ化は酸素
およびNADHを要求した。同一または類似の酵素
が両方の基質の酸化に関与したかどうかという問
題を基質競争実験によつて試験した。実験はメチ
ロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−11202）の
Ｐ（40）粒状画分によるプロピレンのプロピレン
オキシドへの酸化に及ぼすメタンの影響を測定す
ることから成つていた。第８表中に示すように、
メタンの存在によつてプロピレンオキシドの生成
量は減少した。従つて、メタンは、おそらく有効
酵素部位に対して競争することにより、プロピレ
ンのプロピレンオキシドへの転化を抑制した。
【表】
同様に、第8a表に示すように、メタンはメタン
で生長させたメチロシヌス・トリコスポリウム
OB3b（NRRL Ｂ−11196）の細胞懸濁液からの
プロピレンのエポキシ化に影響を及ぼす。
で生長させたメチロシヌス・トリコスポリウム
OB3b（NRRL Ｂ−11196）の細胞懸濁液からの
プロピレンのエポキシ化に影響を及ぼす。
【表】
プロピレンおよびメタンの酸化の化学量論
メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）の粒状画分Ｐ（40）を用いて、ヒドロキ
シル化およびエポキシ化反応の化学量論を測定し
た。メタン−またはプロピレン−依存NADH酸
化、酸素消費および生成物生成の化学量論は約
１：１：１（第９表）であつた。このことはメタ
ンまたはプロピレン酸素付加がモノオキシゲナー
ゼによつて触媒されていることと一致している。
11202）の粒状画分Ｐ（40）を用いて、ヒドロキ
シル化およびエポキシ化反応の化学量論を測定し
た。メタン−またはプロピレン−依存NADH酸
化、酸素消費および生成物生成の化学量論は約
１：１：１（第９表）であつた。このことはメタ
ンまたはプロピレン酸素付加がモノオキシゲナー
ゼによつて触媒されていることと一致している。
【表】
【表】
比較として、メチロシヌス・トリコスポリウム
OB3b（NRRL Ｂ−11196）の細胞懸濁液による
プロピレンのエポキシ化の化学量論を次のように
して測定した。反応混合物（3.0ml）はPH7.0の
0.05M燐酸ナトリウム緩衝液およびプロピレン
3.6μモルを含んでいた。反応は0.1mlの細胞懸濁
液（3.1mg蛋白質）の注入によつて開始させた。
内因性酸素消費に対する補正を行つた。反応中
（３分間）に消費された酸素の量をクラーク
（Clark）酸素電極でポーラログラフイーによつ
て測定した。プロピレン消費量とプロピレンオキ
シド生成量とはガスクロマトグラフイーで概算し
た。プロピレン消費量は0.29μモル、酸素消費量
は0.30μモル、プロピレンオキシド生成物は0.28
μモルであつた。 酸素活性が粒状画分にある（上澄液にはない）
ことをさらに示すため、次の実験を行つた。メタ
ンで生長させたメチロコツカス・カプスラタス
（CRL M1、NRRL B11219）の細胞を実施例１の
方法で得た。この粗製抽出物を音波破壊
（sonically discupted）〔３×50秒、ウエーブ・エ
ナージー・ウルトラソニツク・オツシレーター、
W201型（Wave Energy Ultrasonic
Oscillator、Model W201）〕したものは10000Xg
遠心分離後、エポキシ化の活性もヒドロキシル化
の活性も示さないことがわかつた。しかし、細胞
をフレンチ・プツシヤー・セル（1000Kg圧）を２
回通過させることによつて破壊した場合には、
10000Xg遠心分離後の粗製抽出物中に両方の活性
が見いだされた。この粗製抽出物を４℃において
40000Xgで90分間さらに遠心分離することによ
り、粗製抽出物中のすべての活性が粒状画分とし
て集められた。第10表に示すように、NADHはエ
ポキシ化およびヒドロキシル化の両反応を刺激し
た。
OB3b（NRRL Ｂ−11196）の細胞懸濁液による
プロピレンのエポキシ化の化学量論を次のように
して測定した。反応混合物（3.0ml）はPH7.0の
0.05M燐酸ナトリウム緩衝液およびプロピレン
3.6μモルを含んでいた。反応は0.1mlの細胞懸濁
液（3.1mg蛋白質）の注入によつて開始させた。
内因性酸素消費に対する補正を行つた。反応中
（３分間）に消費された酸素の量をクラーク
（Clark）酸素電極でポーラログラフイーによつ
て測定した。プロピレン消費量とプロピレンオキ
シド生成量とはガスクロマトグラフイーで概算し
た。プロピレン消費量は0.29μモル、酸素消費量
は0.30μモル、プロピレンオキシド生成物は0.28
μモルであつた。 酸素活性が粒状画分にある（上澄液にはない）
ことをさらに示すため、次の実験を行つた。メタ
ンで生長させたメチロコツカス・カプスラタス
（CRL M1、NRRL B11219）の細胞を実施例１の
方法で得た。この粗製抽出物を音波破壊
（sonically discupted）〔３×50秒、ウエーブ・エ
ナージー・ウルトラソニツク・オツシレーター、
W201型（Wave Energy Ultrasonic
Oscillator、Model W201）〕したものは10000Xg
遠心分離後、エポキシ化の活性もヒドロキシル化
の活性も示さないことがわかつた。しかし、細胞
をフレンチ・プツシヤー・セル（1000Kg圧）を２
回通過させることによつて破壊した場合には、
10000Xg遠心分離後の粗製抽出物中に両方の活性
が見いだされた。この粗製抽出物を４℃において
40000Xgで90分間さらに遠心分離することによ
り、粗製抽出物中のすべての活性が粒状画分とし
て集められた。第10表に示すように、NADHはエ
ポキシ化およびヒドロキシル化の両反応を刺激し
た。
【表】
要 約
フアン デル リンデン（Van der Linden）
〔Biochem.Biophys Acta.、77、157−159
（1963）〕によつて示された緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）の系およびアボツ
トおよびホウ（Abbott and How）〔App.
Microbiol.、26、86−91（1973）〕のプセウドモ
ナス・オレオボランス（Pseudomonas
oleovorans）の系はともにC6−C12の液状１−ア
ルケンをエポキシ化したが、気状アルケンをエポ
キシ化しなかつた。 本発明は３つの異なるメタン利用性菌群のすべ
ての細胞懸濁液によるエチレン、プロピレン、１
−ブテンおよびブタジエンのエポキシ化を提供す
る。アルケンのエポキシ化およびメタンのヒドロ
キシル化は嫌気性条件下あるいはメタノール生長
細胞では見いだされなかつた。このことは酵素系
が誘導性（lnducible）であることを示唆してい
る。生成物の１・２−エポキシドは細胞外に蓄積
した。開示された検定方式におけるプロピレンオ
キシドの非酵素的分解は長時間の培養後でも大し
たものではなかつた。フアン デル リンデン
（上記）は、プセウドモナス（Pseudomonas）
sp.のヘプタン生長細胞による１−オクテンから
の１・２−エポキシオクタンの生成物を示し、こ
のエポキシドは酵素的にそれ以上酸化されないこ
とも述べている。しかし、メイおよびアボツト
（May and Abbott）〔Biochem.Biophys.Res.
Commun.、48、1230−1234（1972）およびJ.
Biol.Chem.、248、1725−1730（1973）〕は、P.オ
レオボランス（P.oleovorans）のω−ヒドロキシ
ル化酵素系に１−オクテンを基質として供給する
とき、８−ヒドロキシ−１−オクテンおよび１・
２エトキシオクタンの両方が生成すると報告し
た。さらに、アボツトおよびホウ（上記）は後者
の化合物のメチル基もヒドロキシル化を受けやす
いことを見いだしている。しかしながら、メタン
利用性菌の生長能力のある（viable）細胞懸濁液
の研究から得た本発明の結果はプロピレンオキシ
ドがさらに酵素的に代謝されないことを示した。 フアン デル リンデン（上記）は、緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）による１−オクテ
ンからのエポキシド蓄積はメチル基エポキシ化に
よる多量の１−オクテンの代謝を伴うことを示し
ている。しかしながら、メタン利用性菌の細胞懸
濁液によるプロピレンのエポキシ化においては、
３−ヒドロキシプロペン−１の生成は全く検出さ
れなかつた。 細胞懸濁液によるC2−C41−アルケンのエポキ
シ化およびメタンのヒドロキシル化は共に種々の
金属結合剤および金属キレート化剤で抑制され、
含金属酵素系が関与することを示している。プロ
ピレン酸化およびメタン酸化の抑制が同程度であ
ること（第6a表）はエポキシ化反応およびヒドロ
キシル化反応が同一または類似の酵素系で触媒さ
れる可能性があることを示している。メタン生長
菌株、メチロコツカス・カプスラタス（NRRL
Ｂ−11219）の細胞懸濁液によるプロピレンのプ
ロピレンオキシドへのエポキシ化は、ヒドロキシ
ル化基質であるメタンの存在下で抑制（50％）さ
れた（第10表）。このことは明らかに単一の酵素
系に対するヒドロキシル化基質とエポキシ化基質
との間の競争を示唆している。メタンモノオキシ
ゲナーゼ酵素系はアルケンのエポキシ化およびメ
タンのヒドロキシル化の両方を触媒するらしい。
メイおよびアボツトの文献（上記）は、プセウド
モナス・オレオボランス（Pseudomonas
Oleovorans）からのω−エポキシ化系が１−オ
クテンのエポキシ化およびｎ−オクテンのヒドロ
キシル化の両方を触媒することを報告している。 ３つの異なるメタン利用性菌群の細胞懸濁液に
よるプロピレンの生体内（in vivo）エポキシ化
の最適条件は帯全く同様である。PH最適値は約６
−７であり且つ温度最適値は約35℃であつた。40
℃より高温でエポキシ化の明らかな減少はモノオ
キシゲナーゼ系の不安定性と生成物プロピレンオ
キシド（b.p.35℃）の揮発性の両方による可能性
がある。 ヒドロキシル化活性およびエポキシ化活性の両
方が、10000Xg遠心分離と80000Xg遠心分離との
間で沈殿する無細胞粒状画分中にあつた。トンゲ
（Tonge）ら〔Biochem.J.、161、333−344
（1977）およびFEBS Lett.、58、293−299
（1975）〕はメチロシヌス・トリコスポリウム
OB3bの粒状画分（10000Xg遠心分離と150000Xg
遠心分離の間で沈降した）からの膜結合
（membrane−bound）メタンモノオキシゲナーゼ
の精製を報告している。最近、しかし本発明者ら
の発見の後で、コルビー（Colby）ら〔Biochem.
J.、165、395−402（1977）〕は、ｎ−アルカン、
ｎ−アルケン、エーテルならびに脂環式、芳香族
および複素環式化合物の酸化を触媒する、メチロ
コツカス・カプスラタス（Bath株）からの特異
な可溶性メタンモノオキシゲナーゼを示した。本
発明者らが試験した３つの異なるメタン利用性菌
群からの菌株はすべて気状アルケン（C2−C4）の
エポキシ化および気状アルカン（C1−C4）のヒド
ロキシル化を触媒する。また、本発明者らは、酵
素活性が粒状画分（すなわち10000Xgで30分破壊
細胞を遠心分離した後の上澄液を10000Xg以上で
１時間遠心分離するときに沈降する物質）中にあ
つて、可溶性画分（すなわち破壊細胞を80000Xg
以上で１時間遠心分離した後の上澄液）中にはな
いという予想外の事実をも発見した。 メチロモナスsp.（CRL−17、NRRL Ｂ−
11208）およびメチロコツカス・カプスラタス
（Texas株ATCC 19069）（型偏性メチロトロフ
菌）；メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）およびメチロシヌス・トリコスポリウム
（OB3b、NRRL Ｂ−11196）（型偏性メチロト
ロフ菌）；ならびにメチロバクテリウムsp.
（CRL−26、NRRL Ｂ−11222）（通性メチロトロ
フ菌）の破壊細胞懸濁液の画分遠心
（differential centrifugation）によつて、ｎ−ア
ルカンのヒドロキシル化およびｎ−アルケンのエ
ポキシ化を触媒する無細胞粒状画分を得た。両活
性はともに主としてＰ（40）画分中にあり、酸素
ならびに電子キヤリヤー（例えばNADH）の存在
に依存していた。 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分によつて触媒され
る、メタンのメタノールへのヒドロキシル化およ
びプロピレンのプロピレンオキシドへのエポキシ
化は同様なPHおよび温度最適値をもつている。両
活性ともＰ（40）粒状画分を冷蔵庫温度で貯蔵中
に同時に失なわれた。 無細胞抽出物によるメタンのヒドロキシル化お
よびプロピレンのエポキシ化は種々の金属結合剤
および金属キレート化剤によつて強力に抑制され
た（第６表）、両方の反応速度は銅塩または鉄塩
の存在下で２倍に増加した（第７表）。このこと
は両方の基質の酸化に含金属酵素系が関与するこ
とを示唆している。これらの結果ならびにヒドロ
キシル化およびエポキシ化反応の化学量論は、両
方の反応が同じ含金属モノオキシゲナーゼ系によ
つて触媒されうることを示している。プロピレン
のプロピレンオキシドへの転化がメタンによつて
抑制されるという事実はこのことを支持してい
る。 メチロコツカス・カプスラスタ（Teyas株）
〔リボンズ（Ribbons）ら、J.Bacteriol.、122、
1351−1363（1975）〕、メチロモナス・メタニカ
〔フエレンチ（Ferenci）ら、J.Gen.Microbiol.、
91、79−91（1975）〕およびメチロシヌス・トリ
コスポリウム（（OB3b）〔トンゲ（Tonge）ら、
Biochem.J.、161、333−344（1977）〕から誘導さ
れた無細胞粒状画分が、メタン、エタン、プロパ
ン、ブタンおよび−酸化炭素の酸素−および
NADH−依存性酸化を触媒することは知られてい
る。これらの微生物粒状画分によるメタンの酸化
は種々の金属結合剤または金属キレート化剤によ
つて抑制された。しかし、これらの微生物による
ｎ−アルケンのエポキシ化は報告されていない。 メチロシヌス・トリコスポリウム（OB3b、
NRRL Ｂ−11196）からのメタンモノオキシゲナ
ーゼは精製され、このメタンモノオキシゲナーゼ
可溶性CO−結合性チトクロームＣ、含銅蛋白質
（メタンモノオキシゲナーゼ）および低分子量蛋
白質の３成分から成ることが示されている〔トン
ゲら、1977（上記）〕。 上記の微生物とは異なり、コルビーら（上記）
はメチロコツカス・カプスラタス（Bath株）か
らの特異な可溶性メタンモノオキシゲナーゼ活性
を報告している。この微生物の可溶性画分による
メタンの酸化は種々の金属結合剤によつて抑制さ
れなかつた。最近、コルビーおよびドルトン
〔Biochem.J.、171、461−468（1978）〕はメチロ
コツカス・カプスラスタ（Bath株）のメタンモ
ノオキシゲナーゼを３成分に分割し、成分の１つ
が含鉄フラビン蛋白質であることを確認した。 上記メチロトロフ菌からのメタン酸化活性は粒
状画分中にあり、コルビーらが発見したメチロコ
ツカス・カプスラスタ（Bath株）の可溶性活性
とは異なる。 フアン デル リンデン（1963、上記）は、ヘ
プタンで生長させたプセウドモナスsp.の休止細
胞による１−オクテンからの１・２−エポキシド
の生成を示した。エポキシドはアルカン代謝の産
物としては検出されず、またプセウドモナスsp.
によつて酸化されなかつた。かくして、アルカン
代謝におけるエポキシドの役割は不明である。フ
アン デル リンデンはエポキシドを生成する酵
素系はアルカンの初期酸化を触媒する系と同じか
もしれないと推定している。カージニおよびジヤ
ートシユク（Cardini and Jurtshuk）〔J.Biol.
Chem.、245、2789−2796（1970）〕はコリネバク
テリウムsp.（Corynebacterium sp.）の無細胞
抽出物がオクタンのオクタノールへのヒドロキシ
ル化に加えて１−オクテンのエポキシオクタンへ
の酸化を行うことを発見した。マツケナおよびク
ーン（Mc Kenna and Coon）〔J.Biol.Chem.、
245、3883−3889（1970）〕はプセウドモナス・オ
レオボランス（Pseudomonas oleovorans）から
ｎ−アルカン（C6−C12）および脂肪酸のヒドロ
キシル化を触媒する酵素系を分離した。その後、
アボツトおよびホウ（上記）ならびにメイおよび
アボツト（上記）はプロセウドモナス・オレオボ
ランスからの酵素系がヒドロキシル化反応に加え
て１−アルケンのエポキシ化をも触媒することを
報告した。プセウドモナスおよびコリネバクテリ
ウムsp.からの酵素系はC6−C12n−アルケンのエ
ポキシ化を触媒した。プセウドモナス酵素系は
C2−C5n−アルケンのエポキシ化を触媒しなかつ
た。 本発明者らは３つの異なるメタン酸化性菌群が
ｎ−アルカン（C1−C4）のヒドロキシル化ならび
にｎ−アルケン（C2−C4）のエポキシ化を触媒す
るという予想外の事実を示した。しかも、ヒドロ
キシル化反応およびエポキシ化反応は同一または
類似のNADH依存性モノオキシゲナーゼによつて
触媒される。 C2−C4アルケンのエポキシ化の実施には、メ
チロトロフ菌に加えて、他の微生物も使用するこ
とができる。これらの微生物には短鎖アルカンで
生長する（細）菌、真菌および酵母が含まれる。
メチロトロフ菌（偏性または通性）または他の微
生物は唯一の炭素源としてのメタンで生長させる
かあるいは他の炭素化合物（メタンまたは別の誘
導物質（inducer）の存在下において）で生長さ
せ、細胞または細胞から誘導される酵素を本発明
の方法に用いることができる。
〔Biochem.Biophys Acta.、77、157−159
（1963）〕によつて示された緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）の系およびアボツ
トおよびホウ（Abbott and How）〔App.
Microbiol.、26、86−91（1973）〕のプセウドモ
ナス・オレオボランス（Pseudomonas
oleovorans）の系はともにC6−C12の液状１−ア
ルケンをエポキシ化したが、気状アルケンをエポ
キシ化しなかつた。 本発明は３つの異なるメタン利用性菌群のすべ
ての細胞懸濁液によるエチレン、プロピレン、１
−ブテンおよびブタジエンのエポキシ化を提供す
る。アルケンのエポキシ化およびメタンのヒドロ
キシル化は嫌気性条件下あるいはメタノール生長
細胞では見いだされなかつた。このことは酵素系
が誘導性（lnducible）であることを示唆してい
る。生成物の１・２−エポキシドは細胞外に蓄積
した。開示された検定方式におけるプロピレンオ
キシドの非酵素的分解は長時間の培養後でも大し
たものではなかつた。フアン デル リンデン
（上記）は、プセウドモナス（Pseudomonas）
sp.のヘプタン生長細胞による１−オクテンから
の１・２−エポキシオクタンの生成物を示し、こ
のエポキシドは酵素的にそれ以上酸化されないこ
とも述べている。しかし、メイおよびアボツト
（May and Abbott）〔Biochem.Biophys.Res.
Commun.、48、1230−1234（1972）およびJ.
Biol.Chem.、248、1725−1730（1973）〕は、P.オ
レオボランス（P.oleovorans）のω−ヒドロキシ
ル化酵素系に１−オクテンを基質として供給する
とき、８−ヒドロキシ−１−オクテンおよび１・
２エトキシオクタンの両方が生成すると報告し
た。さらに、アボツトおよびホウ（上記）は後者
の化合物のメチル基もヒドロキシル化を受けやす
いことを見いだしている。しかしながら、メタン
利用性菌の生長能力のある（viable）細胞懸濁液
の研究から得た本発明の結果はプロピレンオキシ
ドがさらに酵素的に代謝されないことを示した。 フアン デル リンデン（上記）は、緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）による１−オクテ
ンからのエポキシド蓄積はメチル基エポキシ化に
よる多量の１−オクテンの代謝を伴うことを示し
ている。しかしながら、メタン利用性菌の細胞懸
濁液によるプロピレンのエポキシ化においては、
３−ヒドロキシプロペン−１の生成は全く検出さ
れなかつた。 細胞懸濁液によるC2−C41−アルケンのエポキ
シ化およびメタンのヒドロキシル化は共に種々の
金属結合剤および金属キレート化剤で抑制され、
含金属酵素系が関与することを示している。プロ
ピレン酸化およびメタン酸化の抑制が同程度であ
ること（第6a表）はエポキシ化反応およびヒドロ
キシル化反応が同一または類似の酵素系で触媒さ
れる可能性があることを示している。メタン生長
菌株、メチロコツカス・カプスラタス（NRRL
Ｂ−11219）の細胞懸濁液によるプロピレンのプ
ロピレンオキシドへのエポキシ化は、ヒドロキシ
ル化基質であるメタンの存在下で抑制（50％）さ
れた（第10表）。このことは明らかに単一の酵素
系に対するヒドロキシル化基質とエポキシ化基質
との間の競争を示唆している。メタンモノオキシ
ゲナーゼ酵素系はアルケンのエポキシ化およびメ
タンのヒドロキシル化の両方を触媒するらしい。
メイおよびアボツトの文献（上記）は、プセウド
モナス・オレオボランス（Pseudomonas
Oleovorans）からのω−エポキシ化系が１−オ
クテンのエポキシ化およびｎ−オクテンのヒドロ
キシル化の両方を触媒することを報告している。 ３つの異なるメタン利用性菌群の細胞懸濁液に
よるプロピレンの生体内（in vivo）エポキシ化
の最適条件は帯全く同様である。PH最適値は約６
−７であり且つ温度最適値は約35℃であつた。40
℃より高温でエポキシ化の明らかな減少はモノオ
キシゲナーゼ系の不安定性と生成物プロピレンオ
キシド（b.p.35℃）の揮発性の両方による可能性
がある。 ヒドロキシル化活性およびエポキシ化活性の両
方が、10000Xg遠心分離と80000Xg遠心分離との
間で沈殿する無細胞粒状画分中にあつた。トンゲ
（Tonge）ら〔Biochem.J.、161、333−344
（1977）およびFEBS Lett.、58、293−299
（1975）〕はメチロシヌス・トリコスポリウム
OB3bの粒状画分（10000Xg遠心分離と150000Xg
遠心分離の間で沈降した）からの膜結合
（membrane−bound）メタンモノオキシゲナーゼ
の精製を報告している。最近、しかし本発明者ら
の発見の後で、コルビー（Colby）ら〔Biochem.
J.、165、395−402（1977）〕は、ｎ−アルカン、
ｎ−アルケン、エーテルならびに脂環式、芳香族
および複素環式化合物の酸化を触媒する、メチロ
コツカス・カプスラタス（Bath株）からの特異
な可溶性メタンモノオキシゲナーゼを示した。本
発明者らが試験した３つの異なるメタン利用性菌
群からの菌株はすべて気状アルケン（C2−C4）の
エポキシ化および気状アルカン（C1−C4）のヒド
ロキシル化を触媒する。また、本発明者らは、酵
素活性が粒状画分（すなわち10000Xgで30分破壊
細胞を遠心分離した後の上澄液を10000Xg以上で
１時間遠心分離するときに沈降する物質）中にあ
つて、可溶性画分（すなわち破壊細胞を80000Xg
以上で１時間遠心分離した後の上澄液）中にはな
いという予想外の事実をも発見した。 メチロモナスsp.（CRL−17、NRRL Ｂ−
11208）およびメチロコツカス・カプスラタス
（Texas株ATCC 19069）（型偏性メチロトロフ
菌）；メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）およびメチロシヌス・トリコスポリウム
（OB3b、NRRL Ｂ−11196）（型偏性メチロト
ロフ菌）；ならびにメチロバクテリウムsp.
（CRL−26、NRRL Ｂ−11222）（通性メチロトロ
フ菌）の破壊細胞懸濁液の画分遠心
（differential centrifugation）によつて、ｎ−ア
ルカンのヒドロキシル化およびｎ−アルケンのエ
ポキシ化を触媒する無細胞粒状画分を得た。両活
性はともに主としてＰ（40）画分中にあり、酸素
ならびに電子キヤリヤー（例えばNADH）の存在
に依存していた。 メチロシヌスsp.（CRL−15、NRRL Ｂ−
11202）のＰ（40）粒状画分によつて触媒され
る、メタンのメタノールへのヒドロキシル化およ
びプロピレンのプロピレンオキシドへのエポキシ
化は同様なPHおよび温度最適値をもつている。両
活性ともＰ（40）粒状画分を冷蔵庫温度で貯蔵中
に同時に失なわれた。 無細胞抽出物によるメタンのヒドロキシル化お
よびプロピレンのエポキシ化は種々の金属結合剤
および金属キレート化剤によつて強力に抑制され
た（第６表）、両方の反応速度は銅塩または鉄塩
の存在下で２倍に増加した（第７表）。このこと
は両方の基質の酸化に含金属酵素系が関与するこ
とを示唆している。これらの結果ならびにヒドロ
キシル化およびエポキシ化反応の化学量論は、両
方の反応が同じ含金属モノオキシゲナーゼ系によ
つて触媒されうることを示している。プロピレン
のプロピレンオキシドへの転化がメタンによつて
抑制されるという事実はこのことを支持してい
る。 メチロコツカス・カプスラスタ（Teyas株）
〔リボンズ（Ribbons）ら、J.Bacteriol.、122、
1351−1363（1975）〕、メチロモナス・メタニカ
〔フエレンチ（Ferenci）ら、J.Gen.Microbiol.、
91、79−91（1975）〕およびメチロシヌス・トリ
コスポリウム（（OB3b）〔トンゲ（Tonge）ら、
Biochem.J.、161、333−344（1977）〕から誘導さ
れた無細胞粒状画分が、メタン、エタン、プロパ
ン、ブタンおよび−酸化炭素の酸素−および
NADH−依存性酸化を触媒することは知られてい
る。これらの微生物粒状画分によるメタンの酸化
は種々の金属結合剤または金属キレート化剤によ
つて抑制された。しかし、これらの微生物による
ｎ−アルケンのエポキシ化は報告されていない。 メチロシヌス・トリコスポリウム（OB3b、
NRRL Ｂ−11196）からのメタンモノオキシゲナ
ーゼは精製され、このメタンモノオキシゲナーゼ
可溶性CO−結合性チトクロームＣ、含銅蛋白質
（メタンモノオキシゲナーゼ）および低分子量蛋
白質の３成分から成ることが示されている〔トン
ゲら、1977（上記）〕。 上記の微生物とは異なり、コルビーら（上記）
はメチロコツカス・カプスラタス（Bath株）か
らの特異な可溶性メタンモノオキシゲナーゼ活性
を報告している。この微生物の可溶性画分による
メタンの酸化は種々の金属結合剤によつて抑制さ
れなかつた。最近、コルビーおよびドルトン
〔Biochem.J.、171、461−468（1978）〕はメチロ
コツカス・カプスラスタ（Bath株）のメタンモ
ノオキシゲナーゼを３成分に分割し、成分の１つ
が含鉄フラビン蛋白質であることを確認した。 上記メチロトロフ菌からのメタン酸化活性は粒
状画分中にあり、コルビーらが発見したメチロコ
ツカス・カプスラスタ（Bath株）の可溶性活性
とは異なる。 フアン デル リンデン（1963、上記）は、ヘ
プタンで生長させたプセウドモナスsp.の休止細
胞による１−オクテンからの１・２−エポキシド
の生成を示した。エポキシドはアルカン代謝の産
物としては検出されず、またプセウドモナスsp.
によつて酸化されなかつた。かくして、アルカン
代謝におけるエポキシドの役割は不明である。フ
アン デル リンデンはエポキシドを生成する酵
素系はアルカンの初期酸化を触媒する系と同じか
もしれないと推定している。カージニおよびジヤ
ートシユク（Cardini and Jurtshuk）〔J.Biol.
Chem.、245、2789−2796（1970）〕はコリネバク
テリウムsp.（Corynebacterium sp.）の無細胞
抽出物がオクタンのオクタノールへのヒドロキシ
ル化に加えて１−オクテンのエポキシオクタンへ
の酸化を行うことを発見した。マツケナおよびク
ーン（Mc Kenna and Coon）〔J.Biol.Chem.、
245、3883−3889（1970）〕はプセウドモナス・オ
レオボランス（Pseudomonas oleovorans）から
ｎ−アルカン（C6−C12）および脂肪酸のヒドロ
キシル化を触媒する酵素系を分離した。その後、
アボツトおよびホウ（上記）ならびにメイおよび
アボツト（上記）はプロセウドモナス・オレオボ
ランスからの酵素系がヒドロキシル化反応に加え
て１−アルケンのエポキシ化をも触媒することを
報告した。プセウドモナスおよびコリネバクテリ
ウムsp.からの酵素系はC6−C12n−アルケンのエ
ポキシ化を触媒した。プセウドモナス酵素系は
C2−C5n−アルケンのエポキシ化を触媒しなかつ
た。 本発明者らは３つの異なるメタン酸化性菌群が
ｎ−アルカン（C1−C4）のヒドロキシル化ならび
にｎ−アルケン（C2−C4）のエポキシ化を触媒す
るという予想外の事実を示した。しかも、ヒドロ
キシル化反応およびエポキシ化反応は同一または
類似のNADH依存性モノオキシゲナーゼによつて
触媒される。 C2−C4アルケンのエポキシ化の実施には、メ
チロトロフ菌に加えて、他の微生物も使用するこ
とができる。これらの微生物には短鎖アルカンで
生長する（細）菌、真菌および酵母が含まれる。
メチロトロフ菌（偏性または通性）または他の微
生物は唯一の炭素源としてのメタンで生長させる
かあるいは他の炭素化合物（メタンまたは別の誘
導物質（inducer）の存在下において）で生長さ
せ、細胞または細胞から誘導される酵素を本発明
の方法に用いることができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ エチレン、プロピレン、ブテン−１およびブ
タジエンから成る群から選ばれるC2〜C4n−アル
ケンまたはジエンのエポキシ化方法において、メ
チロシヌス属に属するエポキシ生産菌をメタンま
たはジメチルエーテルと酸素とを含む栄養培地中
で培養し、その粒状画分またはこの菌から誘導さ
れる酵素製剤の存在下、上記アルケンまたはジエ
ンを酸素と接触させることを特徴とする低級α−
オレフインのエポキシ化方法。 ２ ｎ−アルケンがプロピレンである特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ３ エポキシ化をバツチ式で行う特許請求の範囲
第１または２項記載の方法。 ４ エポキシ化をバツチ式方法で行い且つ酵素製
剤を固定化する特許請求の範囲第１または２項記
載の方法。 ５ エポキシ化を連続方法で行い且つ酵素製剤を
固定化する特許請求の範囲第１または２項記載の
方法。 ６ 酵素製剤が上記微生物の酵素抽出物から誘導
される特許請求の範囲第１または２項記載の方
法。 ７ プロピレンのエポキシ化方法において、メチ
ロモナス属、メチロコツカス属またはメチロバク
テリウム属に属するプロピレンエポキシ化能を有
する菌をメタンまたはジメチルエーテルと酸素と
を含む栄養培地中で培養し、その粒状画分または
これらの菌から誘導される酵素製剤の存在下、上
記プロピレンを酸素と接触させることを特徴とす
るプロピレンのエポキシ化方法。 ８ エポキシ化をバツチ式で行う特許請求の範囲
第７項記載の方法。 ９ エポキシ化をバツチ式方法で行い且つ酵素製
剤を固定化する特許請求の範囲第７項記載の方
法。 １０ エポキシ化を連続方法で行い且つ酵素製剤
を固定化する特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１ 酵素製剤が上記微生物の酵素抽出物から誘
導される特許請求の範囲第７項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89646778A | 1978-04-14 | 1978-04-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS553792A JPS553792A (en) | 1980-01-11 |
| JPS6231918B2 true JPS6231918B2 (ja) | 1987-07-10 |
Family
ID=25406263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4523379A Granted JPS553792A (en) | 1978-04-14 | 1979-04-12 | Epoxidizing of lower alphaaolefine |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS553792A (ja) |
| BE (1) | BE875511A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61133548A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-06-20 | Tokyo Densoku Kk | 冷陰極放電灯 |
| JPS63169990A (ja) * | 1987-01-09 | 1988-07-13 | Idemitsu Kosan Co Ltd | エポキサイドの製造方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1603864A (en) * | 1978-05-25 | 1981-12-02 | Nat Res Dev | Microbiological oxidation processes |
-
1979
- 1979-04-12 BE BE2/57722A patent/BE875511A/nl not_active IP Right Cessation
- 1979-04-12 JP JP4523379A patent/JPS553792A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS553792A (en) | 1980-01-11 |
| BE875511A (fr) | 1979-10-12 |
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