JPS6232877A

JPS6232877A - 新規クロレラ

Info

Publication number: JPS6232877A
Application number: JP17272185A
Authority: JP
Inventors: Ryoichi Minoshima; 良一蓑島; Osamu Yamada; 理山田; Tadashi Fujita; 藤田　匡
Original assignee: Nisshin Oil Mills Ltd
Current assignee: Nisshin Oillio Group Ltd
Priority date: 1985-08-06
Filing date: 1985-08-06
Publication date: 1987-02-12
Also published as: CN1033042C; CN86105790A; JPH0126675B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規クロレラ、特に２種のクロレラプロトプ
ラストを細胞融合させて（）られる新規クロレラに関す
るものである。

クロレラは周知のごとく光合成作用を有する単細胞緑藻
類の１種であり、淡水および海水中のいずれかにおいて
も天然に棲息しており、また人工培養されている。クロ
レラの細胞はアミノ酸バランスのよい蛋白質、各種ミネ
ラル類、ビタミン類、糖類、脂質、色素、酵素等を含み
、栄養価値が高いので、これらの栄養素や有用成分の有
効利用の観点から、産業上の利用分野で利用されている
。

例えば、クロレラ細胞そのもののはかＳＣＰ（Ｓｉｎｇ
ｌｅ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　）　、脂質（エイコ
サペンクエン酸などの高度不飽和脂肪酸を含む）、色素
（クロロフィル）などが健康食品、動物、任免、ワムシ
の飼料、植物の肥料などをはじめ化粧品、印刷・塗料用
インク、医薬品などに用いられている。従って本発明は
広範囲に使用できる新規クロレラに関するものである。

〔従来の技術〕

上記のようにクロレラは産業上有用であるので、従来か
ら種々の方法で培養されている。例えば、人工栽培など
で大量に培養したクロレラを集め、濃縮・殺菌を行なっ
た後、クロレラ細胞に物理的処理たとえば高圧ホモジナ
イザー、噴霧乾煙、超音波などの機械的処理をほどこし
てクロレラ細胞を破砕し、細胞内の有用成分を直接ある
いは水や溶剤で抽出する方法が行なわれる。しかしなが
ら、クロレラは藻類の１種であるため、その種により多
少の差異はあるものの微生物に比べるとその増殖速度は
極めて遅いので、クロレラを自然光または人工光下で人
工培養するには、巨大な培養プールやタンクを必要とし
、長時間培養を続けねばならないという問題があった。

従って、このような培養は、クロレラの有用成分を利用
する際のコストアップを招き、経済的に不利であった。

上記培養においては、自然環境下にあるクロレラを採取
し、常法により純粋培養して単一あるいは複合株に選別
し、これを用いるのが一般的であり、その他の方法とし
てはクロレラの変種株を見出し、細胞壁を有しないクロ
レラを人工培養する例（特開昭５７−１４４９７６号）
、培地組成および培養方法を検討した例（特開昭５７−
４７４７６号）を近年わずかに見るにすぎない。

また、クロレラの１種であるクロレラ　ミニュティシマ
（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ　　：
以下、Ｃ，ミニュティシマという）には海水産種および
淡水産種が存在し、このうち海水産Ｃ，ミニュティシマ
はその細胞内にエイコサペンクエン酸く以下、ＥＰＡと
略す。）をはじめとする高度不飽和脂肪酸および／また
はそれらを構成成分とする脂質を産生ずることが知られ
ている。ＥＰＡは魚類の脂質の一戊分でもあり、動脈硬
化予防作用、血栓溶解作用などの作用を有することが近
年間らかになり、健康食品あるいは医薬品原料として注
目を集めている。しかしながら、かかるＣ、ミニュティ
シマさらには他種クロレラについても、有用物質の産生
を目的とした育種は、これまでのところ行なわれていな
い。

一方、バイオテクノロジーの発展とともに高等植物ある
いは微生物を対象とした細胞融合の研究が盛んに行なわ
れており、有用微生物の育種方法として酵母の品種改良
法（特開昭５４−１６３８８３号）、アミノ酸醗酵用微
生物のプロトプラスト融合法（八ｇｒ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｎ＋、、　４３　　（５）、１００７〜１０１３．
１９７９、特開昭５６−１０９５８７号、特開昭５８−
１５８１８４号など）、植物プロトプラスト融合促進法
（特開昭５９−１２００９８号）などが報告あるいは開
示されている。しかしながら、藻類とくにクロレラを対
象とした細胞融合については、クロレラの細胞壁の除去
方法（特開昭５７−１８１６９２号）が見られるにすぎ
ない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明は、クロレラの細胞中に産生される有用
成分を効率良く、かつ経済的に採取することを特徴とす
る特に、ＥＰλを高濃度で産生じ、かつ増殖速度の速い
新規なりロレラを提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、特定のクロレラのプロトプラストと、前記特
定のクロレラとは異なった性質を有する異種クロレラの
プロトプラストとを細胞融合させると、両者の好ましい
性質を有する新規のクロレラ力り尋られるとの知見に基
づいたものである。さらに、上記細胞融合を複数回くり
返すと、より好ましい結果が得られるとの知見に基づい
てなされたのである。

すなわち、本発明は、特定のクロレラのプロトプラスト
と異種クロレラのプロトプラストとを融合させて得られ
る新規クロレラを提供する。

本発明で用いる特定のクロレラは細胞融合において用い
る同一でない性状を有する２種のクロレラ細胞のうちの
一方のクロレラであり、例えば炭素数１６〜２６であり
、分子内に２重結合を３個以上有する高度不飽和脂肪酸
又は該脂肪酸を構成する脂質を産生ずるクロレラがあげ
られる。さらにリブロースジホスフェートカルボキシラ
ーゼ（光合成においてＣＤ２　の固定に関与する酵素）
やカルボニックアンヒドロラーゼ（太陽エネルギーの効
率的利用に関与するＣｏ２）ラップ酵素）などを産生ず
るものをあげることができる。このうち、ＥＰＡ又はＥ
ＰＡを構成成分とする脂質を産生ずるクロレラが好まし
い。又、海水または海水を含む培地で生育する株をあげ
ることができる。この場合、海水を含む培地とは、天然
海水を最低１゜容量％含む培地であれば良く、これを単
に精製水で希釈したものでも、あるいは他の栄養成分を
含む培地にしたものでもよい。上記特定クロレラとして
は、二次カロチノイド代謝産生ずる能力の有無にかかわ
らず、Ｃ，ミニュティシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｍｉｎ
ｕｔｉｓｓｉｍａ　　）があげられる。このクロレラは
天然海水中から容易に採取できるものであるが、各都道
府県にある水産試験場あるいは栽培漁業センター、大学
、その他の公的機関などから分譲を受けることができる
。なお、本発明で用いる特定クロレラは前述の方法で人
手できるＣ、ミニュティシマに限定されるものではなく
、これに属する種々の野生株、変異株、栄養要求性株、
薬剤耐性株を用いることもできる。

一方、本発明で用いる異種クロレラは、前記特定のクロ
レラとは異なった性質を有するクロレラであり、前記特
定のクロレラよりも増殖速度の速い、好ましくは特定の
クロレラよりも２倍以上の増殖力を有するクロレラをあ
げることができる。

又、淡水培地で生育する株をあげることができる。

ここで淡水培地とは、天然海水およびそれから得られる
成分を含まないものをいう。上記した異種クロレラとし
て、クロレラ　エリプソイブイア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
　ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ　　；　ｒ　Ａ　Ｍ　　Ｃ−
２７、ＩＡＭ　　Ｃ−８７など：以下、Ｃ，エリプソイ
ブイアという）、クロレラ　ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅ
ｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ　　；　ＩＡＭ　　Ｃ−３０、
ＩＡＭ　　Ｃ−１６９など：以下、Ｃ，ブルガリスとい
う）などが例示される。尚、ここでＩＡＭ　　Ｃ−２７
は東京大学応用微生物研究所に保存されている番号Ｃ−
２７のクロレラ株を示す。さらに本発明においては、異
種クロレラとして細胞サイズの大きい株、例えばクロレ
ラ　ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｙｒｅｎｏｉ
ｄｏｓａ　　：　Ｉ　Ａ　Ｍ　　Ｃ−２８など：以下、
Ｃ。

ピレノイドサという）や低温又は高温で生育できる株を
用いることができる。尚、本発明で用いる異種クロレラ
としては、上記のクロレラに限定されるものではなく、
これらに属する野生株、変異株、栄養要求性株、薬剤耐
性株を用いてもかまわない。

上記した異種クロレラのうち、特に増殖速度の速いクロ
レラを用いるのが好ましい。又、特定クロレラのプロト
プラストと生育速度の速いクロレラのプロトプラストと
を細胞融合させたものを異種クロレラとして用いること
も好ましい。

本発明においては、上記特定のクロレラと異種クロレラ
とを細胞融合させるにあたり、これらのプロトプラスト
を調整する。クロレラは、他の微生物等に比べて硬い細
胞壁を有しているといわれるが、特開昭５７−１８１６
９２号に記載された「クロレラの細胞壁の除去方法」′
や本発明者らが先に出願した特願昭５９−２６４４２８
号、同６０−４５２２６号記載のクロレラ細胞壁を酵素
処理する方法に基づいてプロトプラストが調整される。

これらのうち、クロレラの細胞壁を、浸透圧調整剤の存
在下でセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、キ
チナーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびアガラーゼの
１種または２種以上の細胞壁分解酵素により処理して細
胞壁を除去する方法やプランクトンの抽出物を用いてク
ロレラの細胞壁を除去する方法によるのが好ましい。

次に上記の方法により得たプロトプラストを細胞融合処
理に付する。本発明では、細胞融合法としてポリエチレ
ングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドンなどの水溶性高分子水溶液に塩化カルシウム、硫
酸カルシウムなどのカルシウムイオンを含み、ソルヒ゛
トール、マンニトール、ショ糖、硫酸マグネシウムなど
で調製した高ｐＨの高張液中で融合させるいわゆる高分
子剤融合法、電気融合法、リポソーム融合法などが利用
できる。かかる方法のうち、例えば高分子剤融合法では
次のような手順により融合処理を行なうことができる。

すなわち、上記の方法で得た特定クロレラのプロトプラ
ストと細胞融合させる対象の異（重クロレラのプロトプ
ラストを約等量の割合で混合し、遠心分離を行なってプ
ロトプラスト混合物を得る。この混合物を１０ｍＭ以上
のカルシウムイオンを含む高張液（ＰＨ８〜１３）に懸
濁させ、これに例えば１０〜５０％ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ１５４０．４０００．６０００など）溶液
を加えて２０〜４０℃に１０分〜２時間保持して融合さ
せる。このようにして融合処理したプロトプラストは、
上記の融合処理剤などを遠心操作により洗浄除去し、次
に述べる方法で細胞壁を再生させる。例えば、ソルビト
ール、マンニトール、ショ糖などの浸透圧調整剤を含む
クロレラの培養液または固体培地で１〜２日培養して細
胞壁が再生した細胞を得る。尚、ここで培養液としては
、海水を用いた天然培地、淡水培地あるいは塩化アンモ
ニウム、硫安、尿素、硝酸塩類などの窒素源、重曹など
の炭酸塩類、乳酸、酢酸、クエン酸、グルコースなどの
炭素源、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、ホ
ウ素、マンガン、亜鉛、銅、モリブデンなどの金属を塩
化物、硝酸塩、硫酸塩、錯体などの形態で、又その他各
種ビタミン類、アミノ酸類などを添加した人工栄養培地
を用いることができる。そして、自然または人工照光下
あるいは暗所で、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４５
℃の温度下、空気、炭酸ガスあるいはそれらの混合気体
を通気もしくは通気せず、攪拌もしくは静置状態で培養
することによって細胞壁の再生を行なわせる。

次に所望の融合細胞を得るには、海水を用いた培地と淡
水培地とを組合せて行なうことができる。

たとえば融合細胞を海水または海水成分を含む培地で細
胞壁を再生させ、数日間培養して出現するコロニーを淡
水培地に移植し、さらに数日間培養して出現するコロニ
ー、つまり所望の融合細胞を採取する。

本発明においては、上記の細胞融合を１回行なうのであ
るが、さらに進んで細胞融合を２回以上行なうことがで
きる。具体的には、特定のクロレラのプロトプラストと
異種クロレラのプロトプラストを前述の方法で１回融合
させ、融合プロトプラストの細胞壁を再生させ、新規ク
ロレラを選択し、これを培養した後、再び新規クロレラ
を異種クロレラとし、これに特定のクロレラとの間で細
胞融合を行なうのである。

より具体的には、海水を含む培地で生育するＣ。

ミニュティシマ（神奈用県水産試験場から分譲された株
）のプロトプラストと淡水培地で生育するＣ、エリプソ
イブイア（ＩＡＭ　　Ｃ−８７）のプロトプラストとの
融合株を選択し、これにさらに海水を含む培地で生育す
るＣ、ミニュティシマ（長崎系水産試験場から分譲され
た株）のプロトプラストまたは淡水培地で生育するＣ、
エリプソイブイア（ＪＡＭ　　Ｃ−８７）のプロトプラ
ストとの融合処理を行ない、２代目融合細胞を得ること
ができる。さらに、この操作をくり返して、３代目以上
の融合細胞を得ることもできる。すなわち複数回の融合
をくり返して得た新規クロレラは、融合１回により得た
新規クロレラに比べて高増殖性及び高ＥＰＡ産生能の両
方を備えているので好ましい。

なお、このようなくり返し融合した株を得るには、海水
産クロレラと淡水産クロレラとの融合株に海水産のクロ
レラを融合させていくと、融合回数に従い、融合株は海
水濃度の高い培地で生育することができるようになると
の知見に基づき、順次海水濃度を高めて融合株を選択す
る。

次に本発明の新規クロレラを表−１に例示する。

尚、表中ＰＣ■は、Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｖｏｌｕ
ｍｅ　（ｍ　４２／β）の略称であり、クロレラの培養
液１１を３００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離した時に
沈澱したクロレラ細胞の沈澱容量を示すものである。そ
　１して、表には、培養開始時にＰ　ＣＶ　１．０のク
ロレラを７日間培養した時のＰＣＭ値を記載し、これ　
脩によってクロレラの増殖速度が表わされるのである。

又、表中のＥＰＡ含量は、クロレラ細胞を常法により破
砕し、油分を溶剤抽出し、その脂肪酸組成をＧＬＣ等の
化学分析により求めたのである。

上記融合株（新規クロレラ）の菌学的性質は次の通りで
ある。

■、形態学的性質２５％海水配合培地を用い、２１℃、５０００ルツクス
照光下で７日間培養した細胞を光学顕微鏡で観察し細胞
の形と大きさを求めた。結果を表−２に示す。

表　　−２〔発明の効果〕本発明によれば、細胞内に有用物質を産生ずるが増殖速
度が遅く、これを産業的に利用する上で大きな欠点とな
っていた従来のクロレラ特性をかえた新規クロレラが提
供される。これにより、細胞内に産業上有用な物質が存
在することは知られていたものの従来の非効率的かつ経
済的でない生産性を大幅に改善することができるのであ
る。従って、本発明によれば特定クロレラが産生ずるＥ
ＰΔ産生能の半分以上の産生能を有し、かつ特定クロレ
ラの増殖速度の２倍以上の増殖速度を有する新規クロレ
ラが提供される。

さらに２回以上くり返して融合を行なって得た新規クロ
レラはＥＰＡ産生能及び増殖性の点で特に好ましいもの
である。又、１回の融合株（Ｎ０Ｍ１００６５株、ＮＯ
ｏ　１２０３８株）は、１回目の培養ではＰＣＶが５〜
６、また総脂肪酸中のＥＰＡ含量が２８．８〜３０．５
％と、ＥＰＡ生産能が良いが、これを継代培養するとＥ
ｌ）Ａ含量の低下が起こる、つまり１回目の融合株が有
するＥＰＡ生産能は非常に不安定であるが、Ｋ株を数回
融合させて得た新規クロレラは、継代培養を行ってもＥ
ＰＡ生産能が低下することがないといった利点がある。

以下、実施例において本発明をさらに詳細に説明する。

〔実施例〕実施例においてクロレラを培養するために用いた培地組
成を表−３に示す。また、実施例においてプロトプラス
トの生成および細胞壁の再生の確Ｓ忍は、カルコフルオ
アＷｈｉｔｅ　）染色法により蛍光顕微鏡で細胞壁の有無
を観察して行ない、さらに中性光試薬により生存プロト
プラストを調べる方法によって行なった。

実施例１海水産クロレラＣ，ミュニティシマ（Ｋ）（神奈用県水
産試験場より分譲を受けた株）および淡水産クロレラＣ
，エリプソイディア（ＩＡＭ　　Ｃ−２７）を各々、人
工海水培地およびＭＣ培地で培養し、特願昭６０．−０
４５２２６号記載の方法すなわちプランクトンより抽出
した細胞壁溶解酵素を用いてプロトプラスト化した。０
．６　Ｍマンニトール／ソルビトール（１：１）を含む
０．０５　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，０）（以下、
等張渡という）で洗浄し、遠心分離により濃縮した後、
両者の等量を混合し、４０％ポリエチレングリコール４
０００，１００ｍ　Ｍ　　Ｃａ　ＣＩＩ　２．０．３　
Ｍ−’ハタ酸２ナトリウムを含む等張渡（ｐＨ８，５＞
に加えて１時間放誼細胞融合を行なわせた。次に上記混
合液を等張渡で２倍に希釈し、１５分静置後、遠心分離
を行なって上澄液を除き、さらに同様の希釈−遠心分離
操作を数回くり返して融合混合物を得た。この混合物を
０．６Ｍマンニトール／ソルビトール（１：　１）を含
む５０％人工海水培地に植菌し、細胞壁の再生を行ない
、１〜２日後に細胞壁の再生が認められた。次いで、こ
の培養液の一部を１．５％寒天を含むＭＣ培地に移植し
、数日間、照光下で培養してコロニーを分取した。さら
に、これらのコロニーを１．５％寒天を含む５０％人工
海水培地にのばし、数日間培養後、生じたコロニーを採
取し、融合株の選択を行なった。選択した融合株を５０
％人工海水培地で培養し、生育速度と脂質を構成する総
脂肪酸中のＥＰＡ含量を求めた。その代表例を次に示す
。なお、融合株ＮＯＭ　１００６５の構成主要脂肪酸は
Ｃ１０，。（１５，２％）　、ｃ、６．。

（１５，３％”）　、Ｃ，、、、（８，６％）、Ｃ，、
、、（４，９％）、Ｃ１ｅ：２（１２，０％）　、Ｃ，
、，３（５，３％）　、Ｃ２０：４（５，０％）、Ｃ２
゜、５（２８，８％）であった。

実験を５回行ない、それぞれについて辱た代表的な融合
株の生育速度（ＰＣＶ）とＥＰＡ含量の分析結果を表−
４に示す。

表　　−４実施例２Ｃ，ミニュティシマ（Ｋ）およびＣ，ブルガリス（ＩＡ
Ｍ　　Ｃ−１６９）を各々、人工海水およびＤＭ培地で
培養し、実施例１と同様にプロトプラスト化した。本実
施例では等張渡として０．５Ｍマンニトールを含む０．
０７　Ｍ　）　Ｕス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用いた
。各々のプロトプラストを等張渡で洗浄し、遠心分離を
行なって濃縮後、それぞれを等量混合し、３０％ポリエ
チレングリコール１４５０．０、ＩＭＣａＣｊ！、を含
む等張渡（ｐＨ９，０）を用いて実施例１と同様に融合
させた。０．５Ｍマンニトールを含む２５％人工海水の
寒天培地で融合混合物の細胞壁の再生を行ない、生育の
速いコロニーを分取し、等張渡で希釈した。次にこれを
５０％人工海水培地（原塩濃度１３．３５　ｇ　／　１
　）に生育させることによりＣ，ブルガリス（ＩＡＭＣ
−１６９）　　株を除き、ついでＤＭ寒天培地でＣ，ミ
ニュテイシマ（Ｋ）株を除いて、融合株を選択した。実
験を５回行ない、それぞれについて得た代表的な融合株
の生育速度とＥＰＡ含量の分析結果を表−５に示す。

表　　−５実施例３実施例１で得た融合株ＮＯＭ　１００６５を５０％人工
海水培地で、またＣ、ミニュティシマ（Ｋ）を人工海水
培地で各々、培養し、実施例１と同様の方法でプロトプ
ラスト化及び融合を行ない、次に１００％海水培地に生
育させることにより、ＮＯＶ　１００６５株を除き、さ
らに淡水培地（ＭＣ）で生育させに株を除いて、生育速
度が速＜　、ＢＰＡ含量の高い２回融合株Ｎ０Ｍ２００
７８を選択した。Ｎ０Ｍ２００７８及びＣ，ミニュティ
シマ（Ｎ）（長崎県水産試験場より分譲を受けた株）を
、それぞれ２５％人工海水培地及び１００％人工海水培
地で培養し、特願昭５９−２６４４２８号の方法に準拠
してプロトプラスト化し、実施例１と同様に融合処理を
行ない、１０１〜１０８％人工海水培地（原塩濃度２７
〜２９ｇ／ｊりおよびＭＣ寒天培地を用いて培養して融
合株の選択を行なった。つまり、１０１〜１０８％人工
海水培地（原塩濃度２７〜２９ｇ／ｌ）に生育させるこ
とにより、Ｎ０Ｍ２００７８株を除き、次に淡水培地（
ＭＣ）によりＮ株を除いてＮ０Ｍ３１０５０株を選択し
た。代表的な融合株の生育速度とＥＰＡ含量の分析結果
を表−６に示す。

表　　−６実施例４融合処理を２回行なった融合株Ｎ　ＯＭ　２００７８と
Ｃ，ミニュティシマ（Ｋ）とを、各々、２５％人工海水
培地および人工海水培地を用いて培養し、実施例１と同
様の方法でプロトプラスト化した後、３５％ポリビニル
ピロリドン１００’　ＯＯ／ポリエチレングリコール３
０００　（＝１　：　１）を用いて融合処理を行なった
。次に実施例１と同様にして細胞壁を再生し、次に１０
１〜１０８％人工海水培地（原塩濃度２７〜２９ｇ／β
）に生育させることにより、Ｎ０Ｖ２００７８株を除き
、さらに淡水培地（ＭＣ）に生育させることによってに
株を除いて、生育速度が速く、ＥＰＡ含量の高い３回融
合株Ｎ０Ｍ３００１３を選択した。Ｎ　ＯＭ３００１３
およびＣ，ミニュティシマ（Ｎ）を、それぞれ２５％人
工海水培地および１００％人工海水培地で培養し、実施
例３と同様に処理して融合させ、細胞壁の再生を行なっ
た後、１０８〜１１６％人工海水培地（原塩濃度２９〜
３１ｇ／β）に生育させることにより、Ｎ０Ｖ３００１
３株を除き、さらに淡水培地（ＭＣ）に生育させてＮ株
を除き、４回融合株であるＮ０Ｖ４１００７株を選択し
た。その代表的な融合株の生育速度とＥＰＡ含量の分析
結果を表−７に示す。

表　　−７実施例５本実施例ではクロレラのプロトプラスト融合を電気融合
法で行なった。先づＣ，ミニュティシマ（Ｋ）とＣ，エ
リプソイブイア（ＩＡＭ　　Ｃ−８７）を実施例１と同
様にしてプロトプラスト化した。

なお、Ｃ，エリプソイブイア（ＩＡＭ　、、Ｃ，−８７
）の培養には　ＭＢＭ培地を用いた。０．０５　ＭＣａ
Ｃβ２を含む等張渡懸濁液（ｐＨ９，０）を用い両プロ
トプラストの細胞数が５Ｘ１０’　個／ｍ１以上になる
ように調製し、電気融合装置の白金平行電極（２順Ｘ２
＋＋ｏｎＸｌＯｍｍ）間に前記等張液の０．０５〜０．
１ｍｆ入れ、８，０■、８０　ＫＨｚの電場下に３０秒
〜１分置き、プロトプラストを接合させた。次に細胞の
膜間電圧を１〜２■になるように１２０■、８０Ｈｚ、
パルス幅５０μｓで数回パルスを細胞に与え、数分〜数
１０分かけて細胞融合させた。次に等張渡で希釈し、遠
心分離を行なって上澄液を除いた。この希釈−遠心分離
操作を数回くり返して融合混合物を得た。実施例１と同
様に５０％人工海水培地およびＭＢＭ培地を用いて融合
物の細胞壁を再させ、さらに融合株を選択した。選択し
た融合株のうち生育速度およびＥＰＡ含量の点で好まし
いものはＰ　ＣＶ　＝　５．７、ＥＰＡ含量＝２８．５
％であった。

手続補正書１．事件の表示　　　昭和６０年特許願第１７２７２１
号２、発明の名称　　　　　新規クロレラ３、補正をす
る者事件との関係　　出願人名称　　日清製油株式会社４、代理人５、ｈｉ正命令の日付　　自　　発１、　明細書第９頁第１行及び第２行の間に以下の文章
を挿入する。

「　なお、海水または海水を含む培地で生育するクロレ
ラの分類については、ナノクロロブシス（Ｎａｎｎｏｃ
ｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属に属する旨の発表もあるが、現
在一般には、上記のようにクロレラ属のミニュティシマ
などと呼ばれているものが、これに入る（Ｂｕｌｌｅｔ
ｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅＪａｐａｎｅｓｅ　５ｏｃｉｅｔｙ
　ｏｆ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ第
４４巻第１０号１１０９〜１１１４頁（１９７８年）、
同第４５巻第７号８８３〜８８９頁（１９７９年）、同
第４５巻第８号９５５〜９５９頁（１９７９年〉、油化
学第３１巻第２号第７７〜９０頁（１９８２年））」２
、　同書ｐ２３表−３下欄の“※１：Ｍ、溶液”を「※
２：Ｍ、溶液」に訂正する。

３、　同書ｐ２４．２行目の“ミュニティシマ”を「ミ
ニュティシマ」に訂正する。

４、　同書ｐ２６表−４中の“ＩＭＭ　　Ｃ−２７”を
ｒＩＡＭ　　Ｃ−２７Ｊに訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）特定のクロレラのプロトプラストと異種クロレラ
のプロトプラストとを融合させて得られる新規クロレラ
。
（２）特定のクロレラが高度不飽和脂肪酸及び／又は該
脂肪酸を構成成分とする脂質を産生する株である特許請
求の範囲第（１）項記載のクロレラ。
（３）高度不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸である
特許請求の範囲第（１）項記載のクロレラ。
（４）特定のクロレラが海水又は海水成分を含む培地で
生育する株である特許請求の範囲第（２）項記載のクロ
レラ。
（５）特定のクロレラが、クロレラミニュティシマであ
る特許請求の範囲第（２）項記載のクロレラ。
（６）異種クロレラが特定のクロレラよりも増殖速度が
速いクロレラである特許請求の範囲第（１）項記載のク
ロレラ。
（７）高度不飽和脂肪酸及び／又は該脂肪酸を構成成分
とする脂質を産生するクロレラのプロトプラストと該ク
ロレラよりも増殖速度の速いクロレラのプロトプラスト
との細胞融合体を異種クロレラとして用いる特許請求の
範囲第（６）項記載のクロレラ。
（８）異種クロレラが淡水培地で生育する株である特許
請求の範囲第（６）項記載のクロレラ。
（９）異種クロレラがクロレラエリプソイディア又はク
ロレラブルガリスの属する株である特許請求の範囲第（
６）項記載のクロレラ。
（１０）特定のクロレラが野性型又は突然変異型のクロ
レラである特許請求の範囲第（１）項記載のクロレラ。
（１１）新規クロレラが産生するエイコサペンタエン酸
量が特定のクロレラが産生する量の１／２以上であり、
かつ増殖速度が特定のクロレラの２倍以上である特許請
求の範囲第（１）項記載のクロレラ。