JPS6232896A - 有用たん白質の産生方法 - Google Patents
有用たん白質の産生方法Info
- Publication number
- JPS6232896A JPS6232896A JP60171251A JP17125185A JPS6232896A JP S6232896 A JPS6232896 A JP S6232896A JP 60171251 A JP60171251 A JP 60171251A JP 17125185 A JP17125185 A JP 17125185A JP S6232896 A JPS6232896 A JP S6232896A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- medium
- microcarrier
- useful protein
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだ動
物細胞をミクロキャリヤ上で培養、維持することにより
、該有用たん白質を産生ずる方法に関する。
物細胞をミクロキャリヤ上で培養、維持することにより
、該有用たん白質を産生ずる方法に関する。
（従来の技術）
近年いわゆる遺伝子操作技術の応用により、各種有用た
ん白質に対応するＤＮＡを大腸菌をはじめとする原核細
胞あるいは動物細胞などの真核細胞に導入し、その情報
を発現させることにより、該有用たん白質を産生せしめ
ることが可能となってきた。
ん白質に対応するＤＮＡを大腸菌をはじめとする原核細
胞あるいは動物細胞などの真核細胞に導入し、その情報
を発現させることにより、該有用たん白質を産生せしめ
ることが可能となってきた。
原核細胞を用いる系と真核細胞を用いる系のたん白質の
生産性の比較については現時点では一般的には大腸菌な
どを用いる原核細胞系の方が有利と考えられている。し
かしながら糖たん白質などｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎを要するものに
ついては、原核細胞系ではその機構が欠除しているため
に、産生させることができないものがある。これらのこ
とから動物細胞を宿主として用いる遺伝子操作によるた
ん白質産生糸が注目を集めている。すなわち目的とする
たん白質をコードするＤＮＡを適当な動物細胞に何らか
の方法で導入し、該細胞中に安定に保持せしめ、必要に
応じて該ＤＮＡを増幅せしめ、且つ該ＤＮＡを発現せし
めることにより目的とするたん白質を産生せしめる方法
が考えられている。本発明は、まさにこのように外来遺
伝子を導入、増幅された動物細胞を培養、増殖させ、該
外来遺伝子にコードされるたん白質を産生せしめること
を特徴とする有用たん白質の産生方法に関するものであ
る。
生産性の比較については現時点では一般的には大腸菌な
どを用いる原核細胞系の方が有利と考えられている。し
かしながら糖たん白質などｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎを要するものに
ついては、原核細胞系ではその機構が欠除しているため
に、産生させることができないものがある。これらのこ
とから動物細胞を宿主として用いる遺伝子操作によるた
ん白質産生糸が注目を集めている。すなわち目的とする
たん白質をコードするＤＮＡを適当な動物細胞に何らか
の方法で導入し、該細胞中に安定に保持せしめ、必要に
応じて該ＤＮＡを増幅せしめ、且つ該ＤＮＡを発現せし
めることにより目的とするたん白質を産生せしめる方法
が考えられている。本発明は、まさにこのように外来遺
伝子を導入、増幅された動物細胞を培養、増殖させ、該
外来遺伝子にコードされるたん白質を産生せしめること
を特徴とする有用たん白質の産生方法に関するものであ
る。
動物細胞に外来遺伝子をぶ入し、発現させる試みは数多
くある。（例えば蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊 １９
８３．１２ ｖｏｌ ２８ Ｎｏ１４ 、”組換え遺伝
子の細胞への五人と発現”）。その例としては、マウス
由来Ｃ１２７１細胞を宿主、ウシパピローマウィルス（
ＢＰＶ）を・ｈフタ−としてヒトインターフェロンαお
よびγを持続的に産生させる方法、（Ｒ，Ｆｕｋｕｎａ
ｇａ ＝ｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、 ＮＡＳ８１．５０８６
（１９８４） ）、 あるいは２．チャイニーズハム
スター由来ＣＨＯ細胞を宿主、アデノウィルスをベクタ
ーとしてヒトインターフェロンＴを持続的に産生させる
方法（Ｊ、１Ｉａｙｎｅｓ、Ｃ，Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ、
Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄ、ｌ１ｅｓ、ＩＬ ６８７（１９８
３））などが挙げられる。
くある。（例えば蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊 １９
８３．１２ ｖｏｌ ２８ Ｎｏ１４ 、”組換え遺伝
子の細胞への五人と発現”）。その例としては、マウス
由来Ｃ１２７１細胞を宿主、ウシパピローマウィルス（
ＢＰＶ）を・ｈフタ−としてヒトインターフェロンαお
よびγを持続的に産生させる方法、（Ｒ，Ｆｕｋｕｎａ
ｇａ ＝ｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、 ＮＡＳ８１．５０８６
（１９８４） ）、 あるいは２．チャイニーズハム
スター由来ＣＨＯ細胞を宿主、アデノウィルスをベクタ
ーとしてヒトインターフェロンＴを持続的に産生させる
方法（Ｊ、１Ｉａｙｎｅｓ、Ｃ，Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ、
Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄ、ｌ１ｅｓ、ＩＬ ６８７（１９８
３））などが挙げられる。
しかしながら上記に例として挙げた動物細胞はいずれも
接着依存性細胞であるため、遺伝子操作を施した動物細
胞を培養する際には浮遊培養による培養はできない。従
って、このような接着依存性細胞を増殖させるためには
一般に単層培養を行う。単層培養法は、いまだにローラ
ー培養などが主流を占め、手間のかかること、およびバ
クテリヤやかびなどにｌη染されやずいなどの欠点があ
り、試験研究用規模の域を出ない場合が多い。上述した
ように、現存までのところ遺伝子操作を施した動物細胞
を大量に培養する技術は確立されていない。
接着依存性細胞であるため、遺伝子操作を施した動物細
胞を培養する際には浮遊培養による培養はできない。従
って、このような接着依存性細胞を増殖させるためには
一般に単層培養を行う。単層培養法は、いまだにローラ
ー培養などが主流を占め、手間のかかること、およびバ
クテリヤやかびなどにｌη染されやずいなどの欠点があ
り、試験研究用規模の域を出ない場合が多い。上述した
ように、現存までのところ遺伝子操作を施した動物細胞
を大量に培養する技術は確立されていない。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明は、遺伝子操作を施した動物培養細胞を大量に培
養し、かつ長期間にわたって維持させ、目的とする有用
たん白質を大量に生産することを目的とする。
養し、かつ長期間にわたって維持させ、目的とする有用
たん白質を大量に生産することを目的とする。
（問題点を解決するための手段）
上記目的は以下の本発明により達成される。
すなわち本発明は、有用たん白質をコードするＤＮＡを
組込んだベクターを含む動物細胞をミクロキャリヤ上で
増殖、維持せしめることを特徴とする該有用たん白質の
産生方法である。
組込んだベクターを含む動物細胞をミクロキャリヤ上で
増殖、維持せしめることを特徴とする該有用たん白質の
産生方法である。
本発明の有用たん白質は、遺伝子操作により産生できる
ものであれば特に限定されないが、たとえば、ヒト・イ
ンターフェロンβ、ヒト・インターフェロンＴあるいは
ヒト・インターロイキン２等が挙げられる。
ものであれば特に限定されないが、たとえば、ヒト・イ
ンターフェロンβ、ヒト・インターフェロンＴあるいは
ヒト・インターロイキン２等が挙げられる。
有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだベクターは
、動物細胞中で増幅しうる性質を有するものであり、好
ましくは、１ ） ｐＢＲ３２２の複製開始点等の大腸
菌中での複製に必要な複製開始点、ウシパピローマウィ
ルス タイプＩ（ＢＰＶ−１） ＤＮＡのＰｖｕ ＩＩ
切断長鎖フラグメント、Ｓｖ４゜プロモーター（初期ま
たは後期）、有用たん白質をコードするＤＮＡ、および
ｐｏｌｙｒＡ付加シグナルを含むベクター、あるいは、
２）大腸菌中での複製に必要な複製開始点、ＳＶ４゜初
期プロモーター、その下流に連結したジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡ、有用たん白質を
コードするＤＮＡ、およびｐｏｌｙｒΔ付加シグナルを
含むベクター等が用いられる。動物細胞は、有用たん白
質をコードするＤＮＡを組込んだベクターの増殖を許容
する性質を有するものであり、好ましくは、マウスＣｌ
２７−１細胞、あるいはＣｌｌ０ ｄｈｆｒ−（ジヒド
ロ葉酸還元酵素欠…チャイニーズハムスター オバリー
細胞）等が用いられる。
、動物細胞中で増幅しうる性質を有するものであり、好
ましくは、１ ） ｐＢＲ３２２の複製開始点等の大腸
菌中での複製に必要な複製開始点、ウシパピローマウィ
ルス タイプＩ（ＢＰＶ−１） ＤＮＡのＰｖｕ ＩＩ
切断長鎖フラグメント、Ｓｖ４゜プロモーター（初期ま
たは後期）、有用たん白質をコードするＤＮＡ、および
ｐｏｌｙｒＡ付加シグナルを含むベクター、あるいは、
２）大腸菌中での複製に必要な複製開始点、ＳＶ４゜初
期プロモーター、その下流に連結したジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡ、有用たん白質を
コードするＤＮＡ、およびｐｏｌｙｒΔ付加シグナルを
含むベクター等が用いられる。動物細胞は、有用たん白
質をコードするＤＮＡを組込んだベクターの増殖を許容
する性質を有するものであり、好ましくは、マウスＣｌ
２７−１細胞、あるいはＣｌｌ０ ｄｈｆｒ−（ジヒド
ロ葉酸還元酵素欠…チャイニーズハムスター オバリー
細胞）等が用いられる。
通常、前記１）のベクターにはマウスＣ１２７−１細胞
が、前記２）のベクターにはＣ）１０ ｄｈｆｒ−細胞
が用いられる。
が、前記２）のベクターにはＣ）１０ ｄｈｆｒ−細胞
が用いられる。
ミクロキャリヤとしては、正に荷電した化学残基を有す
る多糖類微小粒体（例えばジエチルアミノエチル化した
架橋デキストラン微粒子、ジメチルアミノプロピル化し
たポリアクリルアミド微粒子等）、またはコラーゲン被
覆架橋デキストラン微粒子が最も一般的に用いられるが
、合成高分子微小粒体（例えばポリスチレン微小粒体）
、無機質微小粒体（例えばガラス微小粒体）その他細胞
と親和性を有する素材よりなる微小粒体もしくは微小体
等であってもよい。
る多糖類微小粒体（例えばジエチルアミノエチル化した
架橋デキストラン微粒子、ジメチルアミノプロピル化し
たポリアクリルアミド微粒子等）、またはコラーゲン被
覆架橋デキストラン微粒子が最も一般的に用いられるが
、合成高分子微小粒体（例えばポリスチレン微小粒体）
、無機質微小粒体（例えばガラス微小粒体）その他細胞
と親和性を有する素材よりなる微小粒体もしくは微小体
等であってもよい。
有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだベクターを
含む動物細胞をミクロキャリア上で増殖、維持させる際
の培地は、通常の培地を用いることができるが、Ｃｌ２
７−１細胞の場合は増殖培地としてウシ胎児血清（Ｆｅ
２）’２〜１０％添加ダルヘノコー変法イーグルＭＥＭ
培地を、維持培地としてウシ胎児血？＃０．０５〜２％
添加ダルベツコ−変法イーグルＭＥＭ培地を用いること
が、ＣｔｌＯｄｈｆｒ−細胞の場合は増殖培地としてウ
シ胎児血清２〜１０％添加ＭＥＭアルファ培地（ヌクレ
オシド非添加）を、維持培地としてウシ胎児血清０．１
〜２％添加ＭＥＭアルファ培地（ヌクレオシド非添加）
を用いることが好ましい。
含む動物細胞をミクロキャリア上で増殖、維持させる際
の培地は、通常の培地を用いることができるが、Ｃｌ２
７−１細胞の場合は増殖培地としてウシ胎児血清（Ｆｅ
２）’２〜１０％添加ダルヘノコー変法イーグルＭＥＭ
培地を、維持培地としてウシ胎児血？＃０．０５〜２％
添加ダルベツコ−変法イーグルＭＥＭ培地を用いること
が、ＣｔｌＯｄｈｆｒ−細胞の場合は増殖培地としてウ
シ胎児血清２〜１０％添加ＭＥＭアルファ培地（ヌクレ
オシド非添加）を、維持培地としてウシ胎児血清０．１
〜２％添加ＭＥＭアルファ培地（ヌクレオシド非添加）
を用いることが好ましい。
ここで維持培地とは、増殖した細胞を維持させるための
培地であり通常は増殖培地に比べ、ウシ胎児血清の添加
が微量で良い。
培地であり通常は増殖培地に比べ、ウシ胎児血清の添加
が微量で良い。
インターフェロン、インターロイキン２等の有用たんば
く質を産生させる場合は、この維持培地を有用たんばく
質産生用の培地として使用できる。
く質を産生させる場合は、この維持培地を有用たんばく
質産生用の培地として使用できる。
本発明は有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだベ
クターを含み、ミクロキャリヤに接着する性質を有する
動物細胞をミクロキャリヤ上で培養、維持し、該ＤＮＡ
を発現せしめることにより、該有用たん白質を産生せし
める方法に関するものである。本発明方法により、従来
は困難でありた有用たん白質筒産葎の動物細胞の大量培
養化が果たせ、その結果大量の有用たん白質を分泌生産
することが可能となり、商業生産を考える上でも効果的
である。さらに本発明の一部の例では従来の動物細胞培
養による生産系としては異例な程の長期間培養が可能で
、しかも殆んどその培養全期間に亘って有用たん白質を
高濃度で産生じつづけ、したがって細胞の継代などの手
間が省ける効果と、動物細胞培養液組成の中で一般的に
高いコストを占める血清の添加量を極めて低く抑える効
果も見い出されている。
クターを含み、ミクロキャリヤに接着する性質を有する
動物細胞をミクロキャリヤ上で培養、維持し、該ＤＮＡ
を発現せしめることにより、該有用たん白質を産生せし
める方法に関するものである。本発明方法により、従来
は困難でありた有用たん白質筒産葎の動物細胞の大量培
養化が果たせ、その結果大量の有用たん白質を分泌生産
することが可能となり、商業生産を考える上でも効果的
である。さらに本発明の一部の例では従来の動物細胞培
養による生産系としては異例な程の長期間培養が可能で
、しかも殆んどその培養全期間に亘って有用たん白質を
高濃度で産生じつづけ、したがって細胞の継代などの手
間が省ける効果と、動物細胞培養液組成の中で一般的に
高いコストを占める血清の添加量を極めて低く抑える効
果も見い出されている。
以下にマウス由来Ｃ１２７１細胞を宿主、ＢＰＶをベク
ターとしてヒトインターフェロンγを発現する細胞、お
よびチャイニーズハムスター由来ＣＨＯ細胞を宿主、ア
デノウィルスをベクターとしてヒトインターロイキン２
を発現する細胞を用いた実施例で具体的に本発明を説明
する。
ターとしてヒトインターフェロンγを発現する細胞、お
よびチャイニーズハムスター由来ＣＨＯ細胞を宿主、ア
デノウィルスをベクターとしてヒトインターロイキン２
を発現する細胞を用いた実施例で具体的に本発明を説明
する。
いうまでもないが、本発明は以下に述べる実施例に限定
されるものではない。
されるものではない。
実施例１
（１）ＢＰＶＴ Ｃ１２７の ：ｐ Ｓ Ｖ
Ｉ Ｆ Ｎ ｒ／ Ｂ Ｐ Ｖｑｔｔｐ＋ （特願
昭５９−１７０３５１号）を組込んだＣ１２７−■細胞
（Ｄ、 Ｒ，Ｌｏｗｙ ｅｔａｌ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、２
６，１９１．１９７８）のクローンＮｏ、６４−１（特
願昭５９−１７０３５１号）を得た。以後このクローン
細胞をＢＰＶγ／Ｃ１２７細胞と呼ぶ。
Ｉ Ｆ Ｎ ｒ／ Ｂ Ｐ Ｖｑｔｔｐ＋ （特願
昭５９−１７０３５１号）を組込んだＣ１２７−■細胞
（Ｄ、 Ｒ，Ｌｏｗｙ ｅｔａｌ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、２
６，１９１．１９７８）のクローンＮｏ、６４−１（特
願昭５９−１７０３５１号）を得た。以後このクローン
細胞をＢＰＶγ／Ｃ１２７細胞と呼ぶ。
（２）種細胞の培養：
ＢＰＶｒ／Ｃ１２７細胞７Ｘ１０’ケをウシ胎児血清（
Ｆｅ２）１０％およびグルコース１ｇ／ｌを添加したダ
ルベツコ−変法イーグルＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ）（日
永製薬製）１０ｍＡにＱＱしプラスチックフラスコ（コ
ーニング社製、２５１００．細胞接着面積２５ｃ艷）中
、３７°Ｃにて培養する。通常３〜４日でｃｏｎｆｌｕ
ｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ（細胞数６〜８×１０６ケ
／フラスコ）を形成する。０．２５％トリプシン（Ｄｉ
ｆｃｏ社製、１：２５０）を用いて常法に従い細胞懸濁
液を調整する。
Ｆｅ２）１０％およびグルコース１ｇ／ｌを添加したダ
ルベツコ−変法イーグルＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ）（日
永製薬製）１０ｍＡにＱＱしプラスチックフラスコ（コ
ーニング社製、２５１００．細胞接着面積２５ｃ艷）中
、３７°Ｃにて培養する。通常３〜４日でｃｏｎｆｌｕ
ｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ（細胞数６〜８×１０６ケ
／フラスコ）を形成する。０．２５％トリプシン（Ｄｉ
ｆｃｏ社製、１：２５０）を用いて常法に従い細胞懸濁
液を調整する。
ＢＰＶｒ／Ｃｌ２７細胞を種細胞の培養と同様にプラス
チックフラスコ中で培養しｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎ
ｏｌａｙｅｒを形成させる。このｍｏｎｏｌａｙｅｒの
培養上清を２〜３日毎に維持培地で交換する。このよう
にして得たインターフェロンの積算力価を第１表Ａに示
す。
チックフラスコ中で培養しｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎ
ｏｌａｙｅｒを形成させる。このｍｏｎｏｌａｙｅｒの
培養上清を２〜３日毎に維持培地で交換する。このよう
にして得たインターフェロンの積算力価を第１表Ａに示
す。
ミクロキャリヤ培養によるインターフェ吐 −産
生： プラスチックフラスコ中で培養した種細胞をルー瓶（ｆ
−［［１胞接着面積約１５０ｃａｌ）に継代する。ｃｏ
ｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ（３−４Ｘ Ｉ
Ｏ’／ルー瓶）を形成させた後トリプシナイズし細胞懸
濁液を調整する。ミクロキャリヤ“ｃｙｔｏｄｅｘ−１
”（ファルマシア社製）０．６ｇをＦＣ５５％およびＩ
ｇ／／！グルコース添加Ｄ−ＭＥＭｌ ９０ｍＡに′、
Ｌ４．濁し、上記細胞懸濁液（２゜４Ｘ１０’細胞／
１０ ｍ ｎ Ｆ Ｃ３５％添加Ｄ−ＭＥＭ）とともに
５００ｒｎｆｆ’ｇｌのスピナーびん中で攪拌培養する
。２〜３日毎に培養液の９０％を新しい培養液（ＦＣ３
５％およびグルコースＩｇ／７！添加Ｄ−ＭＥＭ）に交
換する。通常培養開始後６日目にミクロキャリヤ上にｃ
ｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒを形成する。
生： プラスチックフラスコ中で培養した種細胞をルー瓶（ｆ
−［［１胞接着面積約１５０ｃａｌ）に継代する。ｃｏ
ｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ（３−４Ｘ Ｉ
Ｏ’／ルー瓶）を形成させた後トリプシナイズし細胞懸
濁液を調整する。ミクロキャリヤ“ｃｙｔｏｄｅｘ−１
”（ファルマシア社製）０．６ｇをＦＣ５５％およびＩ
ｇ／／！グルコース添加Ｄ−ＭＥＭｌ ９０ｍＡに′、
Ｌ４．濁し、上記細胞懸濁液（２゜４Ｘ１０’細胞／
１０ ｍ ｎ Ｆ Ｃ３５％添加Ｄ−ＭＥＭ）とともに
５００ｒｎｆｆ’ｇｌのスピナーびん中で攪拌培養する
。２〜３日毎に培養液の９０％を新しい培養液（ＦＣ３
５％およびグルコースＩｇ／７！添加Ｄ−ＭＥＭ）に交
換する。通常培養開始後６日目にミクロキャリヤ上にｃ
ｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒを形成する。
この時点以降２〜３日毎に９０％の培地を維持培地で交
換し培養を継続する。このようにして得たインターフェ
ロンの積算力価を第１表Ｂに示した。
換し培養を継続する。このようにして得たインターフェ
ロンの積算力価を第１表Ｂに示した。
またミクロキャリヤ培養経過とインターフェロン積算力
価を第１図に示した。
価を第１図に示した。
Ａは増殖培地（ＦＣ３５％およびグルコース１ｇ／！添
加ダルヘノコー変法イーグルＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ）
で培養したときの細胞数を示す（植え込んでから６日目
まで）。
加ダルヘノコー変法イーグルＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ）
で培養したときの細胞数を示す（植え込んでから６日目
まで）。
△は維持培地としてＦｅ１２．２％およびグルコースＩ
ｇ／β添加Ｄ−ＭＥＭを用いたときの細胞数（６日日以
降）を示す。
ｇ／β添加Ｄ−ＭＥＭを用いたときの細胞数（６日日以
降）を示す。
ムは維持培地としてＦｅ２１０％およびグルコースＩｇ
／Ｉｌ添加Ｄ−ＭＥＭを用いたときの細胞数（６日日以
降）を示す。
／Ｉｌ添加Ｄ−ＭＥＭを用いたときの細胞数（６日日以
降）を示す。
○は維持培地としてＦｅ１２．２％およびグルコースＩ
ｇ／Ａ添加Ｄ−ＭＥＭを用いたときのインターフェロン
積算力価を示す。
ｇ／Ａ添加Ｄ−ＭＥＭを用いたときのインターフェロン
積算力価を示す。
・は維持培地としてＦＣ３ＩＯ％およびグルコースＩｇ
／ｆｆ添加Ｄ−ＭＥＭを用いたときのインターフェロン
積算力価を示す。
／ｆｆ添加Ｄ−ＭＥＭを用いたときのインターフェロン
積算力価を示す。
インターフェロン力価測定は、Ｓ、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉ
ｎらの方法（Ｊ、Ｖｉｒｏｌエフ５５．１９８１）に従
いＦＬ細胞、５ｉｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓを用いたＣＰ
Ｅ５０法により行った。標準インターフェロンとしては
、ＮＩＨ標準ヒトインターフェロンＴとすり合わせを行
った組換え大腸菌由来のヒトインターフェロンｒ８，３
００単位／ｍ／！を用いた。（特願昭５９−１７Ｑ３５
１号参照）実施例２ （１）ＣＨＯ−インターロイキン２ ｃｌｏｎｅ １
１９の構築： ＣＨＯ−インターロイキン２ ｃｌｏｎｅ １−１は次
ゝ に示す順序に従い作製した。基本的な遺伝子
操作の手法は” Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ
” （Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２） Ｃｏ１ｄ
ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ）
に依った。
ｎらの方法（Ｊ、Ｖｉｒｏｌエフ５５．１９８１）に従
いＦＬ細胞、５ｉｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓを用いたＣＰ
Ｅ５０法により行った。標準インターフェロンとしては
、ＮＩＨ標準ヒトインターフェロンＴとすり合わせを行
った組換え大腸菌由来のヒトインターフェロンｒ８，３
００単位／ｍ／！を用いた。（特願昭５９−１７Ｑ３５
１号参照）実施例２ （１）ＣＨＯ−インターロイキン２ ｃｌｏｎｅ １
１９の構築： ＣＨＯ−インターロイキン２ ｃｌｏｎｅ １−１は次
ゝ に示す順序に従い作製した。基本的な遺伝子
操作の手法は” Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ
” （Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２） Ｃｏ１ｄ
ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ）
に依った。
ｉ）ベクター Ｉ Ｌ ２−２８．３の＝製ヒトインタ
ーロイキン２遺伝子をクローン化するベクターｐｌＬ２
−２８．３の作製は以下のように行った。
ーロイキン２遺伝子をクローン化するベクターｐｌＬ２
−２８．３の作製は以下のように行った。
ヒト扁桃よりリンパ球を分離し、２％ウシ胎児血清、１
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （Ｎ−２ｈｙｄｒｏｘｙｅｔ
ｈｙ Ｉ ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ ’ −２−ｅｔ
ｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ） （ｐ１１７．２
）、５Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール、１００
車位／ｍβペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマ
イシンを含むＲＰＭｌ １６４．０培地に５Ｘ１０６個
／ ｍ Ｉ！となるように懸濁した。次にＰ ＨＡ （
ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１％、ＴＰＡ（１２
−０−ｔｅｔｒａ ｄｅｃａａｏｙｌ ｐｈｏｒｂｏｒ
−１３−ａｃｅｔａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ社）を５ ｎ
ｇ ／ ｍ Ｉｔとなるように加えた（Ｙ、に、Ｙｉｐ
らＩｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３
４．１３１（１９８１）、ＨｉｒａｎｏらＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ２７．８７
（１９８３） ） 、この方法によりＩＬ２やＩＦＮ−
ｒなどの生理活性物質の産生が誘導される。ＰＨＡおよ
びＴＰＡ添加１６〜２４時間後に細胞を集めｍＲＮＡを
調整した。
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （Ｎ−２ｈｙｄｒｏｘｙｅｔ
ｈｙ Ｉ ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ ’ −２−ｅｔ
ｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ） （ｐ１１７．２
）、５Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール、１００
車位／ｍβペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマ
イシンを含むＲＰＭｌ １６４．０培地に５Ｘ１０６個
／ ｍ Ｉ！となるように懸濁した。次にＰ ＨＡ （
ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１％、ＴＰＡ（１２
−０−ｔｅｔｒａ ｄｅｃａａｏｙｌ ｐｈｏｒｂｏｒ
−１３−ａｃｅｔａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ社）を５ ｎ
ｇ ／ ｍ Ｉｔとなるように加えた（Ｙ、に、Ｙｉｐ
らＩｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３
４．１３１（１９８１）、ＨｉｒａｎｏらＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ２７．８７
（１９８３） ） 、この方法によりＩＬ２やＩＦＮ−
ｒなどの生理活性物質の産生が誘導される。ＰＨＡおよ
びＴＰＡ添加１６〜２４時間後に細胞を集めｍＲＮＡを
調整した。
ｍＲＮＡの調製とｃＤＮＡの一作製およびプラスミドへ
のクローニングは公知の方法（岡山らＭｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３＋
２８０ （１９８３））に従った。得られたｃＤＮＡ
ライブラリーの中から公知のインターロイキン２ｃＤＮ
Ａ （呑口らＮａ Ｌｕｒｅ、、 ３０２．３０５ （
１９８３） ）に相補的な塩基配列ＧＡＴ ＧＣＴ
ＴＴＧ ＡＣＡ ＡＡＡ ＧＧＴをプローブと
してコロニーハイブリダイゼーションにより ＣＧｒｕ
ｎｓｔｅｒｎ ＆：）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。
のクローニングは公知の方法（岡山らＭｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３＋
２８０ （１９８３））に従った。得られたｃＤＮＡ
ライブラリーの中から公知のインターロイキン２ｃＤＮ
Ａ （呑口らＮａ Ｌｕｒｅ、、 ３０２．３０５ （
１９８３） ）に相補的な塩基配列ＧＡＴ ＧＣＴ
ＴＴＧ ＡＣＡ ＡＡＡ ＧＧＴをプローブと
してコロニーハイブリダイゼーションにより ＣＧｒｕ
ｎｓｔｅｒｎ ＆：）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ７２．３９６Ｈ１９７５））陽性の株を選択
し、プラスミドｐｌＬ２−２８．３を得た。（第２図）
３００μｇのｐｌＬ２−２８．３をＢａｍ ＩＩＩで消
化し、アガロースゲル電気泳動を行った。ヒ１−インタ
ーロイキン２遺伝子を含む短鎖断片のバントを切り出し
、電気溶出法によりＤＮＡ断片をゲルから回収精製した
。これをさらにＢｇｌ Ｉで消化し、アガロースゲル電
気泳動によりヒトインターロイキン２揚造遺伝子を含む
長鎖断片を分離精製した。次にＴ、ＤＮＡポリメラーゼ
によりこのＤＮＡの末端を平滑末端とし、この末端にＴ
４ＤＮＡリガーゼにてＢｇｌＩＩリンカ−を付けた。
し、プラスミドｐｌＬ２−２８．３を得た。（第２図）
３００μｇのｐｌＬ２−２８．３をＢａｍ ＩＩＩで消
化し、アガロースゲル電気泳動を行った。ヒ１−インタ
ーロイキン２遺伝子を含む短鎖断片のバントを切り出し
、電気溶出法によりＤＮＡ断片をゲルから回収精製した
。これをさらにＢｇｌ Ｉで消化し、アガロースゲル電
気泳動によりヒトインターロイキン２揚造遺伝子を含む
長鎖断片を分離精製した。次にＴ、ＤＮＡポリメラーゼ
によりこのＤＮＡの末端を平滑末端とし、この末端にＴ
４ＤＮＡリガーゼにてＢｇｌＩＩリンカ−を付けた。
さらにＢ、ｌ ＩＩおよびＲｓａ Ｉで消化し、インタ
ーロイキン２構造遺伝子を含む断片をアガロースゲル電
気泳動により分離精製した。これを断片ａとする。
ーロイキン２構造遺伝子を含む断片をアガロースゲル電
気泳動により分離精製した。これを断片ａとする。
一方、ｐＳＶ２ ｒａｂｂｉｔβｇｌｏｂｉｎ（Ｒ，Ｃ
，Ｍｕｌｌｉｇａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９．１４
２２（１９８０））を旧ｎｄＩＨ１Ｂｇｌ■で消化して
得られる２つのＤＮＡ断片のうち長い方のＤＮＡ断片を
上述のようにアガロースゲル電気泳動、電気溶出により
分＾「精製した。
，Ｍｕｌｌｉｇａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９．１４
２２（１９８０））を旧ｎｄＩＨ１Ｂｇｌ■で消化して
得られる２つのＤＮＡ断片のうち長い方のＤＮＡ断片を
上述のようにアガロースゲル電気泳動、電気溶出により
分＾「精製した。
これを断片すとする。
さらに既知の方法で化学的に下記のオリゴマーを合成し
た。
た。
５’ ＡＧＣＴＴＴＧＣＡ八八ＧＡＴＧＴ３へへ −
−−・−−−−ｄ３１八ＡＣＧＴＴＴＣＴＡＣＡ５’
−−−−−−−−８次に０．１μｇの断片ａ、０．１
．ｌｊｇの断片ｂ、０゜１８μｇのオリゴマーｄ、０．
０９μｇのオリゴマー〇とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼにて１５℃１８時間反応させることによりこれらを連
絡し、Ｅ、ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１（Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａ
ｄａｂａｎ らＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋１３８、１
７．９ （１９８０）を形質転換した。
−−・−−−−ｄ３１八ＡＣＧＴＴＴＣＴＡＣＡ５’
−−−−−−−−８次に０．１μｇの断片ａ、０．１
．ｌｊｇの断片ｂ、０゜１８μｇのオリゴマーｄ、０．
０９μｇのオリゴマー〇とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼにて１５℃１８時間反応させることによりこれらを連
絡し、Ｅ、ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１（Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａ
ｄａｂａｎ らＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋１３８、１
７．９ （１９８０）を形質転換した。
アンピシリン １００μｇ／ｍｌに耐性を示す株よりプ
ラスミドＤＮＡを抽出し、ｌｌ１ｎｄＩ［Ｉ切断部位周
辺の塩基配列をＭａｘａｍ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（Ｍｅｔ
ｈＥｎｚｙｍ、、６５，４９９（１９８０））により決
定し目的のベク９−ｐｓＶｈｌＬ２を得た。（第３図）
の作製 ＳＶ４０の複製開始点、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２
の複製開始点とテトラサイクリン耐性遺伝子、およびア
デノウィルス主要後期プロモーターにつながれたＤＨＦ
Ｒ遺伝子からなる公知のプラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶＡ
＃ ３ （Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎ らＭｏ１ｅ
ｃｕｆａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ２，１３０４（１９８２））をＥｃｏＲＩで消化し
、ＤＮＡポリメラーチーで処理し、ＥｃｏＲＩ切断部位
を平滑末端にした。この連鎖ＤＮＡ０．６ μｇをｐｓ
ｖｈ ＩＬ２のＡｃｃ Ｈ消化最長鎖断片０．６μｇと
を混合し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼにて１５℃１８時間反応
させることによりこれらを連結した。この反応混合物２
０μ２を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＭＣｌ０６１を形質転換
し、得られたテトラサイクリン耐性を示すコロニーから
プラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素切断地図を作り目
的のプラスミドｐＡｄＤｈ ＩＬ２を得た。このプラス
ミドに含まれるインターロイキン２の方向性が２通り存
在するのでインターロイキン２の遺伝子が読まれる方向
とＤＨＦＲ遺伝子が読まれる方向が同じものをｐＡｄＤ
ｈ ＩＬ２Ｔ、違うものをｐＡｄＤｈｌＬ２Ｃとした。
ラスミドＤＮＡを抽出し、ｌｌ１ｎｄＩ［Ｉ切断部位周
辺の塩基配列をＭａｘａｍ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（Ｍｅｔ
ｈＥｎｚｙｍ、、６５，４９９（１９８０））により決
定し目的のベク９−ｐｓＶｈｌＬ２を得た。（第３図）
の作製 ＳＶ４０の複製開始点、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２
の複製開始点とテトラサイクリン耐性遺伝子、およびア
デノウィルス主要後期プロモーターにつながれたＤＨＦ
Ｒ遺伝子からなる公知のプラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶＡ
＃ ３ （Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎ らＭｏ１ｅ
ｃｕｆａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ２，１３０４（１９８２））をＥｃｏＲＩで消化し
、ＤＮＡポリメラーチーで処理し、ＥｃｏＲＩ切断部位
を平滑末端にした。この連鎖ＤＮＡ０．６ μｇをｐｓ
ｖｈ ＩＬ２のＡｃｃ Ｈ消化最長鎖断片０．６μｇと
を混合し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼにて１５℃１８時間反応
させることによりこれらを連結した。この反応混合物２
０μ２を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＭＣｌ０６１を形質転換
し、得られたテトラサイクリン耐性を示すコロニーから
プラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素切断地図を作り目
的のプラスミドｐＡｄＤｈ ＩＬ２を得た。このプラス
ミドに含まれるインターロイキン２の方向性が２通り存
在するのでインターロイキン２の遺伝子が読まれる方向
とＤＨＦＲ遺伝子が読まれる方向が同じものをｐＡｄＤ
ｈ ＩＬ２Ｔ、違うものをｐＡｄＤｈｌＬ２Ｃとした。
（第４図）
ｉｖ ） ０迎ｈＩＬ２によるｄｈｆｒ−細胞の形″転
換ヒトインターロイキン２発現用ベクターｐＡｄＯｈＩ
Ｌ２Ｃ４μｇをリン酸カルシウム法により約１×１０６
個のｄｈｆｒ−Ｃｌｌ０細胞ＤＸＢＩＩ株（Ｇ、ＬＩｒ
ｌａｕｂらＰｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ 、八ｃａｄ、Ｓｃｉ
ＵＳ＾−Ｊヱ、 ４２１６（１９８０））に４人
し、２日後に１０％透析牛脂児血清（ＧＩＢＣＯ社）を
含む核酸成分不含アルファＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）から
成る選択培地で直径１０ｃｍのディツシュ５枚にまきな
おし、１０日間培養したところ約１０００個のｄｈｆｒ
” となった形質転換体が得られた。このうち１２個の
クローンを２４穴のプレートに分離し、Ｃｏｎｆｌｕｅ
ｎｔになるまで培養し、その培養液のインターロイキン
（ＩＬ）２活性を測定した（第２表）。
換ヒトインターロイキン２発現用ベクターｐＡｄＯｈＩ
Ｌ２Ｃ４μｇをリン酸カルシウム法により約１×１０６
個のｄｈｆｒ−Ｃｌｌ０細胞ＤＸＢＩＩ株（Ｇ、ＬＩｒ
ｌａｕｂらＰｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ 、八ｃａｄ、Ｓｃｉ
ＵＳ＾−Ｊヱ、 ４２１６（１９８０））に４人
し、２日後に１０％透析牛脂児血清（ＧＩＢＣＯ社）を
含む核酸成分不含アルファＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）から
成る選択培地で直径１０ｃｍのディツシュ５枚にまきな
おし、１０日間培養したところ約１０００個のｄｈｆｒ
” となった形質転換体が得られた。このうち１２個の
クローンを２４穴のプレートに分離し、Ｃｏｎｆｌｕｅ
ｎｔになるまで培養し、その培養液のインターロイキン
（ＩＬ）２活性を測定した（第２表）。
第２表
ＣＨＯｒＬ２−１ １６
＝４８
＝１０８
顧
ｄｈｆｒ” となった前記 ｉｖ）のクローン化細胞Ｃ
１１０１１２−１を選択培地で増殖させ、直径１０ｃｍ
のディツシュ当り約２Ｘ１０’個の細胞を０．０２μＭ
のメトトレキセートを含む選択培地で培養した。
１１０１１２−１を選択培地で増殖させ、直径１０ｃｍ
のディツシュ当り約２Ｘ１０’個の細胞を０．０２μＭ
のメトトレキセートを含む選択培地で培養した。
１４日間培養後、１７個のクローンを２４穴プレートに
分離し０．０２μＭのメトトレキセートを含む選択培地
で培養した。増殖速度の早い５株について培養上清のイ
ンターロイキン２活性を測定した。（第３表） 第３表 ｃＨＯＩＬ２１＊ ５０ 第３表に示すように、メトトレキセートを含まない培地
で培養したＣＨＯＩＬ２−１に比ベメトトレキセートを
含む培地で選別したクローンは３〜１０倍高いインター
ロイキン２活性を示した。
分離し０．０２μＭのメトトレキセートを含む選択培地
で培養した。増殖速度の早い５株について培養上清のイ
ンターロイキン２活性を測定した。（第３表） 第３表 ｃＨＯＩＬ２１＊ ５０ 第３表に示すように、メトトレキセートを含まない培地
で培養したＣＨＯＩＬ２−１に比ベメトトレキセートを
含む培地で選別したクローンは３〜１０倍高いインター
ロイキン２活性を示した。
上記方法で作製した約２Ｘ１０’個のＣＨＯ−ＩＬ２
１−１細胞を、直径１０ｃｍのベトリディシュ（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ 、 ２５０２０）に０．０５μＭメトトレキ
セート（ＭＴＸ）と１０％透析ＦＣ３（ＧＩＢＣＯ）を
含む核酸成分不含むアルファーＭＥＭ （アルファーＭ
ＥＭ、Ｇ Ｉ ＢＣＯ）で培養した。
１−１細胞を、直径１０ｃｍのベトリディシュ（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ 、 ２５０２０）に０．０５μＭメトトレキ
セート（ＭＴＸ）と１０％透析ＦＣ３（ＧＩＢＣＯ）を
含む核酸成分不含むアルファーＭＥＭ （アルファーＭ
ＥＭ、Ｇ Ｉ ＢＣＯ）で培養した。
１４日間培養し、１０個のクローンを２４穴プレート（
Ｃｏｒｎｉｎｇ 、２５８２０）に分離した。これを上
記の培地で培養し増殖速度の早いクローンを選択した。
Ｃｏｒｎｉｎｇ 、２５８２０）に分離した。これを上
記の培地で培養し増殖速度の早いクローンを選択した。
これらのクローンのうちＣＨＯＩＬ２．１−１−９ （
以後ＣＨＯＩＬ２ １１９と呼ぶ）を用いて以下の実験
を行った。
以後ＣＨＯＩＬ２ １１９と呼ぶ）を用いて以下の実験
を行った。
（２）種細胞の培養
クローン１１９細胞１．５ＸＩＯ６ケを０．０５μＭＭ
ＴＸと透析ＦＣ３１０％を含むアルファーＭＥＭ培地１
０ｍ１に懸濁し２５ＣＩＩ！プラスチツクフラスコ（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ ２５１００）中で３７℃にて培養する。
ＴＸと透析ＦＣ３１０％を含むアルファーＭＥＭ培地１
０ｍ１に懸濁し２５ＣＩＩ！プラスチツクフラスコ（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ ２５１００）中で３７℃にて培養する。
通常３〜４日でＣｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅ
ｒ（細胞数６〜７Ｘ１０６／フラスコ）を形成する。０
．２５％トリプシンを用い常法に従い細胞懸濁液を調製
する。
ｒ（細胞数６〜７Ｘ１０６／フラスコ）を形成する。０
．２５％トリプシンを用い常法に従い細胞懸濁液を調製
する。
（３）ミクロキャリヤ培養によるインターロイキン２産
生ニ プラスチックフラスコ中で培養した種細胞をルーびんに
継代する。Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ（
３ＸＩＯ’／ルーびん）を形成させた後トリプシナイズ
し細胞懸濁液を調整する。ミクロキャリヤＣｙｔｏｄｅ
ｘ−３（ファルマシア社製） ０．８ｇを０．０５μＭ
ＭＴＸと透析ＦＣ３５％を含むアルファーＭＥＭ培地１
９０ｍｊｌ！に懸濁し、上記細胞懸濁液（２，４Ｘ １
０’細胞／ ｌ Ｏｍ ｊ２０．０５ＭＭＴＸ、透析Ｆ
Ｃ３５％添加アルファーＭＥＭ培地）とともに５００ｍ
ｌ容量のスピナーびん中で攪拌培養する。２〜３日毎に
培養液の９０％を新しい培養液（０，０５μＭＭＴＸ、
透析ＦＣ３５％添加アルファーＭＥＭ培地）に交換する
。
生ニ プラスチックフラスコ中で培養した種細胞をルーびんに
継代する。Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ（
３ＸＩＯ’／ルーびん）を形成させた後トリプシナイズ
し細胞懸濁液を調整する。ミクロキャリヤＣｙｔｏｄｅ
ｘ−３（ファルマシア社製） ０．８ｇを０．０５μＭ
ＭＴＸと透析ＦＣ３５％を含むアルファーＭＥＭ培地１
９０ｍｊｌ！に懸濁し、上記細胞懸濁液（２，４Ｘ １
０’細胞／ ｌ Ｏｍ ｊ２０．０５ＭＭＴＸ、透析Ｆ
Ｃ３５％添加アルファーＭＥＭ培地）とともに５００ｍ
ｌ容量のスピナーびん中で攪拌培養する。２〜３日毎に
培養液の９０％を新しい培養液（０，０５μＭＭＴＸ、
透析ＦＣ３５％添加アルファーＭＥＭ培地）に交換する
。
通常培養開始後６〜７日ミクロキャリヤ上にＣ０ｎｆｌ
ｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌｏｙｅｒを形成する。この時点以
後２〜３日毎に９０％の培地をインターロイキン２産生
用培地（０，０５μＭＭＴＸ、透析ＦＣ３０゜２％添加
アルファーＭＥＭ培地）に交換し培養を′ｍ続する。こ
のようにして得たインターロイキン２の積算力価を第５
図に示した。
ｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌｏｙｅｒを形成する。この時点以
後２〜３日毎に９０％の培地をインターロイキン２産生
用培地（０，０５μＭＭＴＸ、透析ＦＣ３０゜２％添加
アルファーＭＥＭ培地）に交換し培養を′ｍ続する。こ
のようにして得たインターロイキン２の積算力価を第５
図に示した。
インターロイキン２力価測定は、ＣＴＬＬ−２細胞（Ｓ
、Ｇ１１１１ｇ らＪ、Ｉｍｍｎｍｏｌ、、 １２０
．２０２７（１９７８） ）を用い、Ｔ、Ｍｏｓｍａｎ
ｎの方法Ｕ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、 ６５．５５ （１９８３））に従った。標
準インターロイキン２としてはヒト末梢血リンパ球より
調製したインターロイキン２ （５０００国際単位／
ｍ ｌ、国際標準インターロイギン２と力価すり合せ
済み）を用いた。
、Ｇ１１１１ｇ らＪ、Ｉｍｍｎｍｏｌ、、 １２０
．２０２７（１９７８） ）を用い、Ｔ、Ｍｏｓｍａｎ
ｎの方法Ｕ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、 ６５．５５ （１９８３））に従った。標
準インターロイキン２としてはヒト末梢血リンパ球より
調製したインターロイキン２ （５０００国際単位／
ｍ ｌ、国際標準インターロイギン２と力価すり合せ
済み）を用いた。
第１図はＢＰＶｒ／Ｃ１２７細胞のミクロキャリヤ培養
経過とインターフェロンγ産生の状況を示したものであ
る。 第２図はヘクターｐ Ｉ Ｌ ２−２８．３の構成を、
第３図はヘクターｐｓｖｈ ｌ Ｌ２の構成を示す。 第４図はヘクターｐＡｄＤｈｌＬ２ｃおよびｐＡｄＤｈ
ｌ Ｌ２Ｔの作製方法を示す。 第５図はＣＨＯ−ＩＬ２ｃｌｏｎｅｌ１９細胞のミクロ
キャリヤ培養経過とインターロイキン２産生の状況を示
したものである。
経過とインターフェロンγ産生の状況を示したものであ
る。 第２図はヘクターｐ Ｉ Ｌ ２−２８．３の構成を、
第３図はヘクターｐｓｖｈ ｌ Ｌ２の構成を示す。 第４図はヘクターｐＡｄＤｈｌＬ２ｃおよびｐＡｄＤｈ
ｌ Ｌ２Ｔの作製方法を示す。 第５図はＣＨＯ−ＩＬ２ｃｌｏｎｅｌ１９細胞のミクロ
キャリヤ培養経過とインターロイキン２産生の状況を示
したものである。
Claims (1)
- （１）有用たん白質をコードするＤＮＡを組込んだベク
ターを含む動物細胞をミクロキャリヤ上で増殖、維持せ
しめることを特徴とする有用たん白質の産生方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60171251A JP2690297B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 有用たん白質の産生方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60171251A JP2690297B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 有用たん白質の産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232896A true JPS6232896A (ja) | 1987-02-12 |
| JP2690297B2 JP2690297B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=15919854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60171251A Expired - Lifetime JP2690297B2 (ja) | 1985-08-05 | 1985-08-05 | 有用たん白質の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2690297B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020043448A (ko) * | 2000-12-04 | 2002-06-10 | 리송알렉스인근 | 인터루킨-2 재조합 단백질 및 그의 제조방법 |
| US8735172B2 (en) | 2000-10-19 | 2014-05-27 | Biocartis S.A. | Method and device for the manipulation of microcarriers for an identification purpose |
| US8939376B1 (en) * | 1999-04-16 | 2015-01-27 | Mycartis Nv | Encoding of microcarriers |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60102187A (ja) * | 1983-11-07 | 1985-06-06 | Nippon Zenyaku Kogyo Kk | 細胞生産物の連続大量培養法 |
| EP0178220A2 (en) * | 1984-10-01 | 1986-04-16 | Institut Pasteur | Retroviral vector |
-
1985
- 1985-08-05 JP JP60171251A patent/JP2690297B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60102187A (ja) * | 1983-11-07 | 1985-06-06 | Nippon Zenyaku Kogyo Kk | 細胞生産物の連続大量培養法 |
| EP0178220A2 (en) * | 1984-10-01 | 1986-04-16 | Institut Pasteur | Retroviral vector |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8939376B1 (en) * | 1999-04-16 | 2015-01-27 | Mycartis Nv | Encoding of microcarriers |
| US8967483B2 (en) | 1999-04-16 | 2015-03-03 | Mycartis Nv | Encoding of microcarriers |
| US8735172B2 (en) | 2000-10-19 | 2014-05-27 | Biocartis S.A. | Method and device for the manipulation of microcarriers for an identification purpose |
| KR20020043448A (ko) * | 2000-12-04 | 2002-06-10 | 리송알렉스인근 | 인터루킨-2 재조합 단백질 및 그의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2690297B2 (ja) | 1997-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3343357B2 (ja) | レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法 | |
| EP0856059B1 (en) | Methods for production of recombinant plasmids | |
| JP4240818B2 (ja) | 第ｖｉｉｉ因子のための発現系 | |
| JP2721139B2 (ja) | 動物のインターフェロン | |
| KR100675473B1 (ko) | 미세담체에 배양한 중국 햄스터 난소 세포로부터 이질성분비단백질을 생산하는 방법 | |
| JP7728755B2 (ja) | 細胞を再プログラム化して形質細胞様樹状細胞またはｉ型インターフェロン産生細胞に変換する組成物、その方法および用途 | |
| CN103898074B (zh) | 一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体及其制备方法 | |
| Geserick et al. | Enhanced productivity during controlled proliferation of BHK cells in continuously perfused bioreactors | |
| WO2020072480A1 (en) | Ssi cells with predictable and stable transgene expression and methods of formation | |
| WO2005019450A1 (ja) | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 | |
| CN1265144A (zh) | 鉴定可用于通过内源基因激活生产人蛋白质的人细胞系 | |
| CN113493806B (zh) | 利用人肝癌细胞HepG2/C3A作为生物反应器生产重组人血清白蛋白 | |
| JPS6232896A (ja) | 有用たん白質の産生方法 | |
| CN105200073A (zh) | 新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白 | |
| Mizrahi | Biologicals from animal cells in culture | |
| JP2706260B2 (ja) | ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現 | |
| JPH05509229A (ja) | 減少されたクリアランスを有する組織プラスミノーゲンアクチベーター変異体 | |
| JP2990708B2 (ja) | 有用たん白質の産生方法 | |
| CN101348789B (zh) | 通过同源重组在人细胞中生产人突变蛋白 | |
| Dröge | Mammalian Expression Systems | |
| JP3128882B2 (ja) | インターロイキン−６の産生方法 | |
| JPS6344898A (ja) | ヒトアンチトロンビン３（ａｔ３）の製造 | |
| JP3147414B2 (ja) | インターロイキン−６の産生法 | |
| JP2832358B2 (ja) | モノクローナル抗体の増収法 | |
| JP2023505119A (ja) | ｍＴＯＲ活性化剤を含む体細胞から誘導万能幹細胞への逆分化効率増進用組成物及びこれを用いた逆分化効率の増進方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |