JPS6234058A - フロ−サイトメ−タによる網状赤血球の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はフローサイトメ）　ＩＪ−を応用した血液の光
学的測定技術特に近時その計数の重要性を増した未成熟
（網状）赤血球の測定方法に関する。

従来の技術 血液試料中の未成熟の赤血球は網状赤血球（レチクロサ
イトＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｏ、　ＲＥＴとも略記）と
称せられ、通常全赤血球中０．７〜２．２％がこれにあ
たシ、網状赤血球数の測定によって急性内出血、溶血性
貧血、産生不良性貧血その他の各種診断を裏付けるため
近時の臨床検査に重要視されてきた。

上記網状赤血球の計数には轟初ニューメチレンブルー、
ブリリアントクレゾールブルー等の塩基性染料により染
色された塗床血液が用いられ、全赤血球を顕微鏡で捩察
しながら発色した網状赤血球の割合を計数することが行
われた。

止揚の各種染料による染色には血液試料の前処理、染色
後の目視算定に時間と労力を要し、検査数の大きい場合
に不適当であった。

そこで開発されたフローサイトメトリーによる血液検査
は高速化、精度の向上を達成しつつあるがなお未だ網状
赤血球計数について問題が残されている。

従来技術のうち、米国特許第４，３３６，０２９号、同
第４，３２５，７０６号、同第４，２８４，４１２号は
網状赤血球の染色にアクリジンオレンジを用いることを
提案している。このアクリジンオレンジは網状赤血球中
のＲＮＡ成分に吸着されて赤色螢光を発し、緑色螢光が
主体の成熟赤血球と区別して計数可能にする。しかし、
アクリジンオレンジの場合、囚　染色溶液それ自体のバ
ックグラ／ド螢光が強く、血球由来の螢光強度測定に背
景雑音となり誤差を生じ易い、（Ｂｌ　　螢光が赤色領
域の６３０ｎｍ以上であるため、高感度の螢光測光装置
が必要、（ｑ　非特異染色の度合が強く、成熟赤血球の
中に赤色螢光を発生させるため、検体量誤差の小さい染
色液組成の調製が難しい、（ｒ）Ｉ　　血小板を強く染
色するため、測定中に血小板と赤血球が同時通過すると
成熟赤血球の散乱光強度と血小板の赤色螢光強度とが同
時測定され、これが網状赤血球相当の信号しにルを構成
するので誤差の原因となる、（均　アクリジンオレンジ
＠液は環境依存性が大きく螢光強度が変化し易い、々ど
の問題があった。

また、特開昭５９−１４２４６５号公報においては染料
としてチオフラビンＴの使用を開示している。これは、
血液試料のＲＮＡ染色を行った後希釈や洗浄によって背
景螢光及び成熟赤血球の非特異螢光を減少させたうえで
網状赤血球のＲＮＡ螢光をフローサイトメータで検出ｌ
ｌ′Ｉｌ］定するものであるが、（目　上記希釈を通じ
て非特異螢光の低減に伴ない同時にＲＮＡ結合の染料に
よる特異螢光も低減するため、螢光感度の高い測光装置
が要求される。まだ、［Ｇｌ　　希釈後は螢光強度の経
時的低下が激しくなるので再現性の高いデータが得られ
ない又（Ｇ′）染色に比較的時間がかかるという問題が
あった。

さらに、ピロニンＹを染料として用いることも行われだ
が、これは固定した赤血球をＲＮＡ染色してから洗浄し
て非特異螢光及び背景螢光を完全に除いた後、ＲＮＡ結
合の染料による特異螢光を測定するものである。この染
料によれば、（ＨＪ　　血球の事前固定処理、染色、洗
浄の各工程に要する時間が大きく他の方式の数十倍の所
要時間がかかるため多検体処理には適当でない、山　ピ
ロニンＹそのものの螢光量子収率がきわめて低く、この
だめ高出力レーザ光源による励起によってはじめて測定
可能になる、（Ｊ）　　ピロニンＹは低重合度のＲＮＡ
、ＤＮＡ　としか結合しないので特異螢光を得るべきＲ
ＮＡ染色の効率が低い、などの問題があった。

従来使用されている７０−サイドメドＩｊ−による染色
網状赤血球計数に避は難い前述のごとき、アクリジンオ
レンジの場合の（八〜（ト）、チオフラビンＴの場合の
（乃〜（α）、ピロニンＹの場合の（Ｈ）〜町のすべて
の問題点を及ぶ限シ除去し得る染料物質を選択使用して
、染色試料中の網状赤血球の螢光強度を著しく増強させ
、その反面試料溶液についてはその背景螢光を低下させ
て螢光測定におけるＳ／Ｎ比を高め、網状赤血球の特に
低濃度又は低ＲＥＴ比率域での測定精度を格段に向上せ
しめることが本発明の解決しよう）する課題である。

問題点を解決するための手段 本発明は、上記の問題点を解決し、全血液試料中の赤血
球について、成熟赤血球群と未成熟赤血球であってＲＮ
Ａの多い網状赤血球群とをＲＥＴ比率の多少、赤血球濃
度の大小等に影響されることなく鮮烈かつ強固な螢光染
色を網状赤血球群に施こしその染色螢光強度を著しく増
強して網状赤血球の高精度の識別を可能にするものであ
シ、そのために本発明は網状赤血球を螢光染色するため
オ−ラミンＯを含有する試薬を用いること、この試薬の
使用景を試料血液中のＲＮＡ　を析出せしめるよシも過
剰量とすることを特徴とするフローサイトメトリーによ
る血球測定方法を実現したものである。光学的測定に際
し血球形状を安定化させるために、塩化ナトリウム等の
アルカリ金属塩を添加して染色液試薬を等張にし、また
血液細胞の染色効率を高めるために緩衝剤を添加するこ
ともできる。

螢光染料としてのオーラミンＯは ＮＨ、ＨＮＯ３ または ＮＨ−ＨＩＪ ｊ が用いられる。これらのオーラミン０は染色血球に対し
て鮮明な色相を与えるとともにそれ自体の着色力も犬で
ある。

染料の分量が少なく、螢光強度が低く、かつ散乱光強度
分布にまとまシがない場合、螢光増大作用を有する固定
剤例えばグルタルアルデヒドを少の増大作用はトリトン
Ｘ−１００の添加により調整し適切な検出レベルに保つ
ことが可能である。

このようにして溶液の背景螢光を相対的に抑制し、さら
に網状赤血球の散乱光強度分布におけるまとまりをよく
し、これと同時に膜粘性を下げ血球相互の付着を防止し
てその弁別計数をより一層たやすくし、網状赤血球の測
定精度を格段に向上する。

オーラミン０は試薬１　ｍｇ当り３０〜２５００μ９ｒ
の含有量が、又塩化ナトリウムなどのアルカリ金属塩は
１　ｒｔｔｌ当り５〜２０ｍｇｒでよく、ｐＨは６−１
０に調整することが好適である。上述した組成分を有す
る等張緩衝染料溶液はＥＤＴＡなどで抗凝固化した全血
液試料と混合するための血球測定特に網状赤血球測定用
試薬となシ、本発明ではこの試薬を、検体中の血球細胞
に含まれるＲＮＡ　　と化合して費消されるオーラミン
００分量を基準にしてこの基準を十分に越える過剰量の
試薬を使用することを特色とする。なお、上記試薬その
ものに関しては本出願人により特願昭６０−１２３１２
８号として出願されている。

上記オーラミン０含有の血球測定用試薬を抗凝固性全血
液試料に混合すると、オーラミン染料が網状赤血球を含
宅血球をすべて鮮烈に染色して細胞中のＲＮＡ　と結合
してこれを析出させ螢光染色する。このオーラミンＯに
よる染色状態は、界面活性剤によシ螢光及び散乱光が共
に増強されて１時間以上持続するが、さらにアルデヒド
類による背景螢光の抑制作用が重なって、これらが綜合
され従来の試薬に比して網状赤血球の弁別計数精度は大
幅に向上する。本発明では又析出したＲＮＡの連鎖状分
子に特異吸着された螢光染色に加え、ＲＮＡを含む他の
網状物質にオーラミンが非特異吸着される過剰量のオー
ラミンを用いており、このため網状赤血球を含む血球濃
度が低い場合や低ＲＥＴ比率の血液試料についても網状
赤血球の螢光強度が著しく増強されて目視計数と比べ測
定データのばらつきが殆んどなくなり診断データの高い
信頼性を与えるものとなる。染色された網状赤血球は、
アルゴンイオンレーザ、キセノ／又は水銀アークランプ
、ヘリウム−カドミウムレーザ等を好適とする励起光源
で紫色光ないし青色光を照射し発生する約４５０〜７０
０　ｎｍ程度の螢光をフローサイトメータで検出するこ
とにより弁別計数される。この試薬によりフローサイト
メータで網状赤血球を測定する場合、その組成はオーラ
ミｙＯ：　３０〜２０００１’？、’／ｍｅ、　Ｎａ（
Ｊ：　８〜１３”＋９’／ｒｎｅ　、グルタルアルデヒ
ド：　Ｏ〜５００　ＰＩ’／　ｍｌ。

トリドアＸ　−１００：０〜１００１”９’／ｒｒｔｌ
、緩衝剤としてのリン酸、ホウ酸、バルビタール：０．
０１〜０．２Ｍ／ｌ、残υ水で全体を１１にしｐＨ７，
０〜９．０に調製すると好適である。

作用 従来のアクリジンオレンジによる染色法では、第３図の
斜線部分の示す網状赤血球が発する螢光を全部測光する
ことが望ましいにも拘らず、網状赤血球の特異染色と成
熟赤血球や溶液自体の非特異染色が競合し成熟赤血球自
体が染色されることになり被測定波長域で重なり、この
ため網状赤血球のみを検出することができない。第３図
（１）に見る如く、成熟赤血球による背後螢光の影響を
受けることなく螢光測光ができる波長域が極めて小さい
ことが分かる。一方、網状赤血球を多く含む検体では、
試薬中の染料が一定であったため特異染色に必要な染料
が不足し、第３図（ｎ）に示す様に網状赤血球による螢
光強度が弱小になる。また、赤血球数が少なく染料が過
剰となると共に染料が吸着しやすい血球試料の場合、第
３図（ｆｉｌ）に示す如く成熟赤血球、網状赤血球とも
に信号強度が増大し特異吸着の弁別が益々困難になる。

このような信号強度の泪対的変化は第４図に比較されて
いる。

従って、アクリジンオレンジ法では、試料中の探索する
血球数をある程度予め調整しておき、そのうえでさらて
特異吸着を最大に非特異吸着を最小（Ｃする染料濃度を
決定し、受光フィルター及び網、を 赤血球検知レベルの決定で再現性と精度の確認をするこ
とが必要であった。

ピロニンＹ１チオフラビンＴ法ではＲＮＡを最大染色し
た場合、第５図（１）に示す様に成熟赤血球同士の螢光
強度比が小さくしかも溶液螢光から血球信号を弁別する
ことが難しい状態になる。このため、実際の測定時は希
釈で溶液及び成熟赤血球による背後螢光を低減させてい
るが、第５図（ｎ）に示す如（ＲＮＡ　自体に基づく特
異螢光を含めて血球信号が著しく小さくなり測光に支障
を来たすに至る。

染料にオーラミンＯを用いた場合、第１図（ａ）に示す
様に、溶液による背後螢光及び粘性の比較的低い成熟赤
血球などに吸着された染料による螢光強度は小さく網状
赤血球による螢光強度は相対的に太きい。従って、網状
赤血球の多い検体においてもＲＮＡが完全に染色される
だけの染料を含有する試薬量で網状赤血球を成熟赤血球
から十分に弁別することができる。染色によって、網状
赤血球内にはＲＮＡ　、　　リポソーム、ミドコンドリ
ヤ、ゴルジ体などの集積物からなる網状物質が析出沈殿
し、染料が過剰であると第１図（ｂ）に示す如く、これ
らの物質の酸性部位に吸着され、このため、吸着された
全ての染料がＲＮＡに吸着された（Ｂ）と同程度の高い
量子収率の光（ｑを発するので網状物質全体が網状赤血
球の弁別に寄与する。すなわち網状物質は第１図（ｂ）
のＢ％Ｃの螢光強度を発生し第２図に明らかな様に溶液
及び成熟赤血球によるＡをはるかにしのぐ。かくして、
オーラミン○を過剰に用いる染色で、この染料は従来法
の如く網状赤血球の測定に悪影響を及ぼすことはなく、
反対に、成熟赤血球に極めて近く網状物質それ自体の少
ない網状赤血球さえも検出可能にし、この場合測光装置
に様々な螢光感度改善策を施す必要がない。

実施例 オーラミンＯ：１．９ｒ、塩化ナトリウム：９，９ｒに
ｏ、ｏＩＭ／ｌリン酸緩衝液と水を加えて１ｇとしｐＨ
７，２０の黄色の試薬を調製した。この試薬１０ｒｒｔ
ｌにＥＤＴＡ抗凝固新鮮血１ｏｐｚ　　を加え、室温で
３０秒間インキュベートした後螢光フローサイトメータ
に送入した。光源は約５００　ｎｍの励起光を発生する
アルゴンイオンレーザを用い、５２０　ｎｍ以上の螢光
を受光検出した。前方散乱光−後方螢光で検出した網状
赤血球の含有比率の高い０．１〜２６％ＲＥＴの３０．
ｔ＊体についてｉ測定した。この場合の測定データと目
視計数データとの相関は低ＲＥＴ試料でも極めて高かっ
た。

効果 以上に述べた様に、オーラミン０を含有する螢光染色試
薬を血液試料に対して十分過剰量混合して染色すると次
のような螢光フローメータにとって極めて特有の効果が
もたらされる： （１）　　成熟赤血球と網状赤血球との螢光強度信号差
が大きく、両者の及び溶液螢光との間の信号弁別精度が
より一層向上する。これに関連して、生成直後の未成熟
状態から次第に成熟赤血球に近づいた網状赤血球や、も
ともと血球細胞内にＲＮＡなど網状物質が少ないもので
もこれを成熟赤血球、血小板等から高い精度で弁別し得
る。従って、低ＲＥＴ　比率の試料溶液で網状赤血球の
見逃しが殆んどない。

（２）染色時間が極めて短い。アクリジンオレンジ法は
５分間染色だが、ＲＥＴ　＝　２〜３％を超えると染色
終了に１０分以上を要する。過剰オーラミン○による染
色ではＲＥＴ＝１３％の検体でも３０秒で完了する。

（３）螢光強度が安定で染色後１時間程度は褪光し々い
から測定値の再現性・信頼性が高い。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）は試料中の網状赤血球のＲＮＡ量と釣合う
分量のオーラミン○を含有する試薬量を用いたときの血
球細胞の螢光染色状態を示すグラフ、第１図（ｂ＋は本
発明方法により過剰量のオーラミンＯを使用した染色の
示す［ａ）と同様のグラフ、第２図は第１図ｔ＆）、ｔ
ｂ）にそれぞれ対応する螢光強度の信号１．ＩＩを比較
するグラフ、第３図（Ｄ、（ＩＩ）、（Ｉｌ［）はアク
リジンオレンジ法による第１図と同様のグラフ、第４図
は第３図に対応する第２図と同様のグラフ、第５図（１
１、（ＩＤはピロニンＹ、チオフラビンＴ法による第３
図と同様のグラフである。 特許出願人　東亜医用電子株式会社 （外５名） ）鼾η−−皮一長　とｎ〜 ４５０　　５００　５５０　　６０゜ −萱光六長（ｎｙｎ） １　　　　　　Ｎ 第３図 ５００　　　　　５８０　　　　　６００　　　（７７
７、？ン−Ｖ方蓑 フ１１ｖ′−倖ぜ　　　　　　　　ツヤ器燈−準ヤ雰キ
一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）オーラミンＯを含有する血球用螢光染色試薬を用い
   、試料血球中のＲＮＡを析出せしめるよりも過剰量の前
   記試薬によつて染色した試料に対し、紫ないし青色の波
   長領域の光を光源より照射し、前記試料からの螢光を測
   光することによつて網状赤血球を測定することを特徴と
   する、フローサイトメータによる網状赤血球の測定方法
   。 ２）特許請求の範囲１記載の方法において、前記光源が
   アルゴン−イオンレーザであることを特徴とするフロー
   サイトメータによる網状赤血球の測定方法。 ３）特許請求の範囲１記載の方法において、前記光源が
   ヘリウム−カドミウムレーザであることを特徴とするフ
   ローサイトメータによる網状赤血球の測定方法。 ４）特許請求の範囲１記載の方法において、前記光源が
   水銀アークランプであることを特徴とするフローサイト
   メータによる網状赤血球の測定方法。 ５）特許請求の範囲１記載の方法において、前記光源が
   キセノンアークランプであることを特徴とするフローサ
   イトメータによる網状赤血球の測定方法。