JPS6235067B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なヒトアンチトロンビンの免疫
学的測定方法に関する。 血液凝固、線維素溶解（線溶）、補体、炎症、
その他種々の生体反応において、多数のプロテア
ーゼが関与することが知られており、これらのプ
ロテアーゼの働きは生体内に存在する阻害物質に
より正確に制御されている。 この生体反応を血液凝固の面からみると、血液
の凝固に関与する因子は数多く存在しているけれ
ども、その制御機構において最も重要な働きをし
ているので本発明で問題としているアンチトロン
ビンであると一般に考えられている。 血液中に存在するトロンビン阻害因子はアンチ
トロンビンと総称され、過去の研究においては
からまで分類されたが、現在最も生理的に重要
でその存在、作用が確認されているのはアンチト
ロンビンのみであり、このアンチトロンビン
は分子量が約62000の糖タンパクである。以下ヒ
トのアンチトロンビンを“AT”と略称す
る。 ATによるトロンビンの阻害作用は、トロン
ビンの活性中心であるセリンと１：１のモル比で
結合して複合体を形成することによつておこると
考えられており、この阻害反応はヘパリンによつ
て著しく促進されることからATはまたアンチ
トロンビン−ヘパリンコフアクターとも呼ばれて
いる。 ATはまたトロンビン以外の凝固又は線溶系
のプロテアーゼ、即ちプラスミン並びにａ、
ａ、XIａ及びXIIａの各因子とも反応して、それら
の活性を阻害し、同様にヘパリンでその作用は促
進されるが、特に内因系の血液凝固であれ、また
外因系の血液凝固系であれ、両血液凝固系におい
て重要な役割を果すXa因子の活性をより効果的
に阻害する。従つて、ATの主要な機能は、ト
ロンビンの阻害よりむしろａ因子の阻害にある
とされている。かくして、ATの凝固阻害因子
としての働きは、トロンビンのフイブリノーゲン
に働く凝固活性を抑えることにより、むしろａ
因子がプロトロビンを活性化せしめるのを阻止す
ることの方がより大きいと考えられている。 ATの生物学的意義は主としてその活性化凝
固因子阻害作用による血管内凝固の制御にあり、
血栓ないし血管内凝固の出現に対し防御的に働く
ことにあると考えられている。 このようなATの持つ凝固系における制御作
用の重要性から、その値の変動を測定すること
は、臨床診断、治療法の選定において極めて有意
義なものである。 例えば播種性血管内凝固症候群では血中のAT
は減少し、プロゲステロン−エストロゲン合剤
服用中の婦人または妊婦では血中のATは低下
しやすく、従つて血中のATの定量は血栓症発
現の危険性を予知するのに役立つ。また、先天性
AT欠乏症多発の家系では血栓症の出現率が高
く、AT増加を伴う家系では出血傾向を来たす
症例も報告されており、血中のATの検出・定
量はこれら血栓症、出血傾向の予防、治療上極め
て重要である。 いずれにせよ血漿または血清中のATの測定
は、血栓形成もしくはこれに関連した動脈硬化病
変の存在、または凝固亢進状態の存在を知る上で
臨床上重要な情報を与えてくれることになる。 従つて、従来からATの測定法が研究されて
いくつか提案されている。例えば、フイブリノー
ゲン又はその他の合成基質を用い、該基質に対す
るトロンビンの酵素活性に及ぼすATの抑制効
果を測定することによつてATを測定すること
から成る酵素学的方法〔P.S.Damus and R.D.
Rosenberg、Methods in Enzymol.X LV、653
（1976）参照〕；抗AT抗体を含有した寒天ゲ
ル上に検体を滴下して沈降輪を形成せしめ、その
沈降輪の直径を標準曲線と対比することにより該
検体中のハウジングを決定することから成る一元
免疫拡散法〔山村雄一監修、医化学実験法講座第
４巻「免疫化学」第159〜164頁（1972年）及び山
中学著「臨床検査学雑誌」第５巻第431〜436頁
（1977年）参照〕が知られている。しかしながら
前者の酵素学的方法は操作が繁雑で、基質の種類
や純度によつて測定値に重大な影響が生じ、また
高度の専門的能力を必要とするなど種々の難点が
ある。また、後者の一元免疫拡散法は測定結果が
得られるまでに数日（通常１〜３日）もかかり、
臨床診断上緊急を要する場合には全く役に立たな
いなどの欠点がある。殊に、血液の凝固線溶に関
連する病態の変化は一般に急激に起ることが多
く、ATの測定に手数がかかり結果が出るまで
に数日を要すると、時には患者にとつて致命的な
結果を生ずることになりかねないのである。 しかして、従来よりATの簡便で且つ迅速な
測定方法の出現が強く望まれていたのである。 本発明者らはこの要望に応えるべく鋭意研究し
た結果、AT又は抗AT抗体を感作した免疫
学的に不活性な担体粒子よりなら試薬を用い、し
かも該試薬と検体を反応させる際、検体の希釈の
ためにPH9.6の希釈液を用いることにより凝集像
の再現性が著るしく向上し、偽反応が生ずること
がなくなり、その結果、免疫学的凝集又は凝集阻
止反応により、極めて簡便に且つ迅速に、しかも
かなりの精度をもつて検体中のATを検出測定
しうることを見い出し、本発明を完成するに至つ
た。 かくして、本発明によれば、PH9.6の希釈液に
より一定の希釈倍数に希釈した検体に、抗AT
抗体を感作した免疫学的に不活性な担体粒子より
なる免疫学的測定試薬を添加し、或いはPH9.6の
希釈液により一定の希釈倍数に希釈した検体に予
め抗AT抗体を加えておき、次いでATを感
作した免疫学的に不活性な担体粒子よりなる免疫
学的測定試薬を添加し、凝集の生成の有無を判定
することによつて該検体中のATを測定するこ
とを特徴とする。ATの免疫学的測定方法が提
供される。 本発明の測定試薬において使用されるATは
ヒトの血漿からそれ自体公知の方法により、例え
ばゲル過、イオン交換クロマトグラフイー、ア
フイニテイークロマトグラフイー等の方法を単独
で又は組み合せ用いて分離精製することにより取
得することができる〔分離精製法の詳細について
は必要あれば、前記Methods in Enzymol.
XLV、653（1976）参照〕。 一方、抗AT抗体もまたそれ自体公知の方法
により調製することができ、例えば上記の如くし
て得たATにフロインドのアジユバントその他
の補助剤を加えたもので、ウサギ、モルモツト、
ヤギ、ヒツジ、などの人間以外の哺乳動物を免疫
し、その抗血清を回収し、該抗血清から通常の方
法に従い、例えば硫安沈殿法による分画によつて
抗AT抗体を分離することにより取得すること
ができる。 本発明に従い感作すべきAT及び抗AT抗
体の純度は厳密に制約されるものではないが、一
般にATはデイスク電気泳動法により実質的に
単一の像を示す程度の純度のものが好ましく、ま
た抗AT抗体は血漿中のATとの抗原−抗体
反応において免疫電気泳動法により実質的に単一
の像を示す程度の純度のものが適している。 また、かかるAT又は抗AT抗体の感作の
ために用いられる免疫学的に不活性な担体粒子と
しては、例えば、ホルマリンなどで固定化した赤
血球、高分子ラテツクス、ベントナイト、コロジ
オン、シリカ、カオリン等、従来免疫化学的測定
試薬の担体として通常使用されているものはいず
れも使用できる。かかる担体粒子は一般に約0.01
〜約20ミクロン、好ましくは約0.05〜約10ミクロ
ンの平均粒径を有することができる。 本発明において「感作」なる語は、AT又は
抗AT抗体を上記した如き担体粒子上に物理的
に吸着せしめる場合及び化学的に結合させる場合
の両方を包含する意味で用いるものである。 かくして、感作は通常の方法によつて行なうこ
とができ、例えば、上記した如き担体粒子にAT
又は抗AT抗体を物理的に吸着させる場合に
は、感作すべきAT又は抗AT抗体を最終濃
度0.001〜0.5％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは0.01〜0.2
％（Ｗ／Ｖ）になるように緩衝液（例えばグリシ
ンNaOH緩衝液）中に溶解し、撹拌しながら担体
（例えばポリスチレンラテツクス）を加え、通常
約４〜約60℃、好ましくは約15〜約40℃の温度で
約30〜180分間さらに撹拌をつづけることによ
り、感作を行なうことができる。この場合、AT
及び抗AT抗体に対して免疫学的に不活性な
タンパク質〔例えばヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジな
どの動物の血清のアルブミンやグロブリンなど〕
の緩衝溶液〔通常0.01〜0.5％（Ｗ／Ｖ）濃度の
ものが使用される〕で感作前又は感作後の担体粒
子を処理することができ、これによつて非特異的
反応を除くことができる。 また、前記担体粒子にAT又は抗AT抗体
を化学的に結合せしめる場合としては、例えばカ
ルボキシル基やアミノ基などAT又は抗AT
抗体と化学的に結合しうる官能基を表面にもつ担
体粒子と感作すべきAT又は抗AT抗体とを
適当な結合剤例えばカルボジイミド、ビスジアゾ
ベンジジン、グルタールアルデヒドなどの存在下
に反応させる方法が挙げられる。この場合におい
ても、上記と同様に不活性なタンパク質を感作前
又は感作後の担体粒子で処理する（化学的に結合
せしめる）ことにより非特異的反応を除き高感度
の試薬を得るようにすることができる。 上記の感作操作において、担体粒子へのAT
又は抗AT抗体の感作量及び／又は該不活性タ
ンパク質による処理の程度を適宜調節することに
より、常に一定の高感度の免疫学的診断試薬を調
製することができる。 上記の如く調製された測定試薬は、検体例えば
血漿、尿、胸水、髄液、血清などの体液中のAT
の免疫学的測定のために使用することができ、
その測定はそれ自体公知の免疫学的凝集反応又は
免疫学的凝集阻止反応を利用して行なうことがで
きる。 上記検体の希釈例を作製するために要する希釈
液としては、PH9.6の緩衝液を用いることがで
き、例えばグリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、アン
モニウム緩衝液などが用いられるが、中でもグリ
シン緩衝液を用いるのが好ましい。 例えば、免疫学的凝集反応においては、スライ
ドガラス板上又は小試験管中で、PH9.6の希釈液
により一定の希釈倍率に希釈した検体と上記の抗
AT抗体を感作した担体粒子よりなる測定試薬
とを相互に接触せしめる。もし検体中にATが
存在すれば凝集反応が起り、肉眼的に観察するこ
とができる。検体の希釈倍率を増やし、凝集反応
が確認できる最大希釈倍率を求めることにより、
検体中のAT濃度を決定することができる。 また、免疫学的凝集阻止反応においては、上記
と同様、スライドガラス板上又は小試験管中に、
PH9.6の希釈液により一定の希釈倍率に希釈した
検体と抗AT抗体とを滴加し、混和した後、本
発明によるATを感作した担体粒子より成る測
定試薬を加えて接触せしめ、その際に凝集像が現
われるか否かを判定する（該希釈検体中にある一
定濃度以上でATが存在すれば凝集阻止像が観
察される）ことにより上記と同様にして検体中の
AT濃度を決定することができる。 上記のように本発明の方法によれば、PH9.6の
希釈液を用いて希釈し検体と試薬とを加え、スラ
イドガラス板上又は小試験管中の凝集像を肉眼的
に観察するという極めて簡便な操作だけで、迅速
に検体中のATを測定することができ、臨床学
的には患者のベツドサイドで極めて手軽に数分間
でATの定量を行なうことが可能となる。本発
明におけるかかる効果は前述した従来の測定法か
らは全く予想外のことであり、AT測定分野に
画期的な発展をもたらすものである。 次に実施例により本発明をさらに説明する。 実施例 １ (a) ATの製造 ヒト新鮮血１に二重シユウ酸溶液（シユウ
酸アンモニウム12.5ｇとシユウ酸カリウム7.5
ｇを水に溶解して１にしたもの）100mlを加
え、４℃、6000rpmで20分間遠心分離し、得ら
れた血漿を53℃で２分間加熱した。生じた沈殿
を４℃、6000rpmで20分間遠心分離により取り
除いた。その上清１ml当り100mgの硫酸バリウ
ムを加え、室温で30分間ゆるやかに撹拌し、生
じた沈殿物を４℃、6000rpmで20分間遠心分離
して除去した。この操作を再度繰り返す。次い
で限外過により100mlに濃縮した。この濃縮
液10mlに1/200Ｍのリン酸緩衝液（PH7.2）100
mlを加え、同じ緩衝液で膨潤させたヘパリン−
セフアロース4B100ml中に加える。室温で30分
間ゆるやかに撹拌したのち、ガラスフイルター
上で吸引過し、次いで1/200Ｍリン酸緩衝液
（PH7.2）１を用い洗浄したのち、2M NaCl含
有リン酸緩衝液（PH7.2）300mlを用いATを
溶出した。この溶出液を再度限外過にて10ml
以下に濃縮し、0.1M Tris−HCl緩衝液（PH
8.3）で平衡化したDEAE−セルロースＡ−50
を充填したイオン交換クロマトグラフイーカラ
ムに添加し、0.25M NaCl含有0.1M、Tris−
HCl緩衝液（PH8.3）で溶出し、次いで0.01M
Tris−HCl緩衝液（PH8.3）で平衡化した
Sephadex Ｇ−200を用いゲル過し、得られ
たAT分画を凍結乾燥した。 (b) 抗AT抗体の製造 上記(a)で得たAT１mgを生理食塩液１mlに
溶解し、同量のコンプリート・フロインド・ア
ジユバントで乳化し、家兎の足蹠および皮下に
注射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗
体価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた
血液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rmpで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含有1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗AT
抗体を製造した。 (c) 抗AT抗体感作ポリスチレンラテツクスの
製造 上記(b)で製造した抗AT抗体10mgを５mlの
0.24Mグリシン緩衝液（PH9.6）に溶解し、こ
れに２％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸
濁液（平均粒径：0.109μ）５mlを加えて混合
し、室温で２時間撹拌した。この後、遠心分離
して得た沈殿を0.3％にウシ血清アルブミン
（BSA）を含むグリシン緩衝液10mlに懸濁さ
せ、抗AT抗体感作ポリスチレンラテツクス
を得た。 (d) 血漿中のATの測定（凝集反応法） 被検者の血漿３検体を0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）で25倍、50倍、75倍、100倍、150倍及
び200倍に希釈し、各希釈血漿をキヤピラリー
ピペツトで２滴ずつ（約100μ）を反応ラス
イド板上に滴下し、これに上記(c)で製造した抗
AT抗体感作ポリスチレンラテツクスを１滴
ずつ滴下する。両者を混合し、スライド板をゆ
るやかに揺動し、３分後に肉眼で凝集像の有無
を観察した。なお、本実施例においては試薬の
感度を４μｇ／mlに調整したものを用いた。各
被検液のAT濃度は下記第１表に示すとおり
であつた。なお、従来法として一元免疫拡散法
〔山村雄一監修、医化学実験法講座第４巻「免
疫化学」第161〜164頁（1972年）参照〕による
測定値も第１表に併せて示す。第２〜４表にお
いても同様。

【表】 実施例 ２ (a) AT感作ポリスチレンラテツクスの製造 実施例１(a)で製造したAT４mgを0.24Mグ
リシン緩衝液（PH9.6）５mlに溶解し、２％ポ
リスチレンラテツクス（粒径0.500μ）５mlを
加えて室温で１時間撹拌した。撹拌後４℃、
10000rpmで20分間遠心分離を行い得られた沈
殿物を上記緩衝液10mlで洗浄した。再度遠心分
離後、沈殿物を0.2％BSA含有グリシン緩衝液
10mlに懸濁させ、AT感作ポリスチレンラテ
ツクスを製造した。 (b) 血漿中のATの測定（凝集阻止反応法） 被検者の血漿３検体を0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）で25倍、50倍、75倍、100倍、150倍及
び200倍に希釈し、各希釈液の１滴（約50μ
）を反応スライド板上に滴下し、これに実施
例１(b)で製造した抗AT抗体を400倍に希釈
した液を１滴ずつ滴下し、混合後上記(a)で製造
したAT感作ポリスチレンラテツクスを１滴
ずつ滴下する。この三者を均一に混合し、スラ
イド板をゆるやかに揺動し、３分後肉眼で凝集
像、凝集阻止像を観察した。なお、この実施例
においては試薬の感度を４μｇ／mlに調整した
ものを用いた。各被検者のAT濃度は下記第
２表に示すとおりであつた。

【表】 実施例 ３ (a) 抗AT抗体感作血球の製造 常法によりホルマリン固定したヒツジ赤血球
４％懸濁液（リン酸緩衝液、PH7.4）に等量の
0.01％タンニン酸溶液を加えて56℃で30分反応
させ、次いでリン酸緩衝液で赤血球を洗浄後、
８％懸濁液とした。ついで前記実施例１(b)で製
造したAT抗体の0.1％溶液を加え56℃で２時
間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液にて
血球を遠心洗浄し、0.2％BSAを含むリン酸緩
衝液にて３％血球濃度の懸濁液とした。 (b) 血漿中のATの測定（凝集反応法） 被検者の血漿４検体を0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）で50倍、100倍、200倍、300倍、400倍
及び500倍に希釈し、各希釈液300μずつを小
試験管に入れ上記(a)で製造した抗AT抗体感
作血球の３％懸濁液50μを加え混和したのち
強く振盪し、ミラー付スタンドに２時間静置
し、管底像により判定した。本実施例において
は測定感度を0.1μｇ／mlに調整してあるの
で、各被検液中のAT濃度は下記第３表に示
すごとくである。

【表】 実施例 ４ (a) 抗AT抗体を結合したアミノ基含有ポリス
チレンラテツクスの製造 実施例１(b)で製造した抗AT抗体10mgを
0.06Mリン酸緩衝液（PH7.4）５mlに溶解しこ
れにアミノ基含有ポリスチレンラテツクスの２
％（Ｗ／Ｖ）懸濁液５mlを加えて混合し、次い
で１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド・ハイドロクロライドの
0.5％水溶液１mlを加えて一昼夜室温で反応を
行つた。反応終了後、４℃、10000rpmで20分
間遠心分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩
液（PH8.6）10mlにて３回洗浄した。沈殿を0.2
％BSA含有グリシン緩衝化食塩液（PH8.6）10
mlに懸濁させ、抗AT抗体を結合したアミノ
基含有ポリスチレンラテツクスを製造した。 (b) 血漿中のATの測定（凝集反応法） 被検者の血漿５検体を0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）で33倍、66倍、100倍、133倍及び166
倍に希釈し、各希釈液の２滴ずつ（約100μ
）を反応スライド板上に滴下し、これに上記
(a)で製造した抗AT抗体感作アミノモデイフ
アイドポリスチレンラテツクスを１滴ずつ滴下
した。両者を混合し、スライド板をゆるやかに
揺動して３分後肉眼で凝集像を観察した。な
お、本実施例においては試薬の感度を３μｇ／
mlに調整したものを用いた。各被検液のAT
濃度は下記第４表に示すごとくである。 なお、上記(a)で用いたアミノ基含有ポリスチ
レンラテツクスは次の如くして製造したもので
ある。 市販のカルボキシルモデイフアイドポリスチ
レンラテツクス（ダウ・ケミカル社製）の10％
懸濁液５mlにε−第三ブトキシカルボニルリジ
ンメチルエステル260mgをジメチルホルムアミ
ド（DMF）３mlに溶かした液を加え、０℃に
冷却したのち撹拌しつつ水溶性カルボジイミ
ド、〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩〕343mgを加え
る。０℃にて１時間、室温にて３時間撹拌をつ
づけたのち室温に一夜放置し、遠心分離する。
上清を捨て、沈降物を50％DMF水溶液、つい
で水で洗浄する。 これに氷冷した濃塩酸５mlを加え、ときどき
ふりまぜつつ０℃に15分間放置したのち氷水で
約倍量にうすめ遠心する。沈降物を洗液が中性
になるまで洗浄し、ついでトリエチルアミンの
10％水溶液10mlを加えて室温で15分撹拌後遠心
し、洗液が中性になるまで水洗をくり返す。最
後に10％懸濁液になるように濃度を調整し所望
のリジン−ラテツクスを得る。本品はニンヒド
リン反応陽性である。 かくして得られたアミノ基含有ポリスチレン
ラテツクスの構造は にて表わされる。

【表】 実施例 ５ (a) ATを結合したカルボキシル基含有ポリス
チレンラテツクスの製造 実施例１(a)で製造したAT４mgを0.06Mリ
ン酸緩衝液（PH7.4）４mlに溶解し、これに市
販のカルボキシルモデイフアイドポリスチレン
ラテツクス（ダウ・ケミカル社製）の10％
（ｗ／ｖ）懸濁液１mlを加えて混合し、次いで
１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド・ハイドロクロライドの0.5％
水溶液１mlを加えて一昼夜室温で反応を行つ
た。反応終了後、４℃、10000rpmで20分間遠
心分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩液
（PH8.6）10mlにて３回遠心洗浄し、沈殿を0.1
％BSA含有グリシン緩衝化食塩液15mlに懸濁
させ、AT結合カルボキシル基含有ポリスチ
レンラテツクスを製造した。 (b) 血漿中のATの測定（凝集阻止反応法） 被検者の血漿５検体を0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）で20倍、40倍、60倍、80倍、100倍、
120倍及び140倍に希釈し、各希釈液の１滴（約
50μ）を反応スライド板上に滴下し、これに
実施例１(b)で製造した抗AT抗体を、200倍
に希釈した液を１滴ずつ摘下し、混合後上記(a)
で製造したAT結合カルボキシル基含有ポリ
スチレンラテツクスを１滴ずつ滴下する。この
三者を均一に混合し、スライド板をゆるやかに
揺動し、３分後肉眼で凝集阻止像を観察した。
なお、この実施例においては試薬の感度を2.5
μｇ／mlに調整したものを用いた。各被検者の
AT濃度は下記第５表に示すとおりであつ
た。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ PH9.6の希釈液により一定の希釈倍数に希釈
   した検体に、抗ヒトアンチトロンビン抗体を感
   作した免疫学的に不活性な担体粒子よりなる免疫
   学的測定試薬を添加し、或いはPH9.6の希釈液に
   より一定の希釈倍数に希釈した検体に予め抗ヒト
   アンチトロンビン抗体を加えておき、次いでヒ
   トアンチトロンビンを感作した免疫学的に不活
   性な担体粒子よりなる免疫学的測定試薬を添加
   し、凝集の生成の有無を判定することによつて該
   検体中のヒトアンチトロンビンを測定すること
   を特徴とするヒトアンチトロンビンの免疫学的
   測定方法。