JPS6236181B2 - - Google Patents

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JPS6236181B2
JPS6236181B2 JP81500132A JP50013282A JPS6236181B2 JP S6236181 B2 JPS6236181 B2 JP S6236181B2 JP 81500132 A JP81500132 A JP 81500132A JP 50013282 A JP50013282 A JP 50013282A JP S6236181 B2 JPS6236181 B2 JP S6236181B2
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suspension
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fraction
particles
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Kenesu Zee Akatsufu
Maaree Ee Roozentaru
Maaree Ii Boruku
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Isolab Inc
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    • H01M50/30—Arrangements for facilitating escape of gases
    • H01M50/342—Non-re-sealable arrangements
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

請求の範囲 １ 赤血球溶血物溶液を含むテストサンプルの一
定量を、式 CarXH （式中、Carは解離陽イオンH+を供給するイオン
化可能基X-を支持する不活性基質である）で表
される粒径100メツシユより小およびpKa3ないし
７を有する弱酸性陽イオン交換体を予じめ22.5℃
においてPH6.0ないし7.5に平衡化した懸濁液でな
るカラム床、または式 CarYOH （式中、Carは解離陰イオンOH-を供給するイオ
ン化可能基Y+を支持する不活性基質である）で
表される粒径100メツシユより小およびpKa7ない
し10を有する弱塩基性陰イオン交換体を予じめ
22.5℃においてPH7.3ないし9.0に平衡化した懸濁
液でなるカラム床に負荷し、ついで前記カラム床
が式 CarXH で表される陽イオン交換体を包含するものである
場合には一定量の「ビス―トリス」緩衝液を前記
カラム床に導入して、ヘモグロビンHb―Ａla―c
を含有する第１のフラクシヨンを溶出し、または
前記カラム床が式 CarYOH で表される陰オン交換体を包含するものである場
合には一定量の「トリス」緩衝液を前記カラム床
に導入して、ヘモグロビンHb―Ａla―c以外のヘ
モグロビンを含有する第１のフラクシヨンを溶出
し、さらに一定量の洗浄液を前記カラム床に導入
して、該カラム床が式 CarXH で表される陽イオン交換体を包含するものである
場合には、ヘモグロビンHb―Ａ1a―c以外のヘモ
グロビンを含有する第２のフラクシヨンを溶出
し、または前記カラム床が式 CarYOH で表される陰イオン交換体を包含するものである
場合には、ヘモグロビンHb―Ａ1a―cを含有する
第２のフラクシヨンを溶出し、前記第１フラクシ
ヨンおよび第２フラクシヨン中に存在するヘモグ
ロビンを分光分析により別々に定量し、得られた
数値から数式 （第１フラクシヨン又は第２フラクシヨン中のヘモグロビンＨｂ―Ａ１ａ―ｃ量）／（第１フラクシヨン中のヘモ
グロビン量）＋（第２フラクシヨン中のヘモグロビン量） に従つて特定人の血糖状態の診断指標としての全
ヘモグロビン量に対するヘモグロビンHb―Ａ1a
―ｃ量の比を算出するものであつて、前記イオン
交換体、懸濁液、緩衝液および洗浄液などを含む
前記分析工程全体にわたりシアン化物を含有しな
いものを使用することを特徴とする、ヘモグロビ
ンHb―Ａ1a―cの測定法。
２ CarXHで表される弱酸性陽イオン交換体の
平衡化懸濁液が、Carがメタクリル酸とジビニル
ベンゼンとの共重合体であり、X-がカルボキシ
ル基である弱酸性陽イオン交換体の22.5℃におけ
る平衡化PH実質的に6.98をもつ懸濁液である、特
許請求の範囲第１項記載のヘモグロビンHb―Ａ1
ａ―ｃの測定法。
３ CarXHで表される弱酸性陽イオン交換体の
平衡化懸濁液が、Carがセルロースであり、X-が
カルボキシメチル基である弱酸性陽イオン交換体
の22.5℃における平衡化PH実質的に6.8をもつ懸
濁液である、特許請求の範囲第１項記載のヘモグ
ロビンHb―Ａ1a―cの測定法。
４ CarXHで表される弱酸性陽イオン交換体の
平衡化懸濁液が、Carがセルロースであり、X-が
カルボキシメチル基である弱酸性陽イオン交換体
の22.5℃における平衡化PH実質的に6.1をもつ懸
濁液である、特許請求の範囲第１項記載のヘモグ
ロビンHb―Ａ1a―cの測定法。
５ CarXHで表される弱酸性陽イオン交換体の
平衡化懸濁液が、Carがメタクリル酸とジビニル
ベンゼンとの共重合体であり、X-がカルボキシ
ル基である弱酸性陽イオン交換体の22.5℃におけ
る平衡化PH実質的に6.8をもつ懸濁液である、特
許請求の範囲第１項記載のヘモグロビンHb―Ａ1
ａ―ｃの測定法。
６ CarYOHで表される弱塩基性陰イオン交換体
の平衡化懸濁液が、Carがセルロースであり、Y+
がジエチルアミノエチル基である弱塩基性陰イオ
ン交換体の22.5℃における平衡化PH実質的に8.5
をもつ懸濁液である、特許請求の範囲第１項記載
のヘモグロビンHb―Ａ1a―cの測定法。
７ CarYOHで表される弱塩基性陰イオン交換体
の平衡化懸濁液が、Carがポリスチレンとジビニ
ルベンゼンとの共重合体であり、Y+が―NH2、
―NHR、―Ｎ（Ｒ）２（ここで、Ｒは―CH3ま
たは―C2H5の如き脂肪族炭化水素基である）で
表される第１、第２および第３アミン基の混合で
ある弱塩基性陰イオン交換体の22.5℃における平
衡化PH実質的に7.5をもつ懸濁液である、特許請
求の範囲第１項記載のヘモグロビンHb―Ａ1a―c
の測定法。
８ 赤血球溶血物溶液を含むテストサンプルの一
定量を、式 CarXH （式中、Carは解離陽イオンH+を供給するイオン
化可能基X-を支持する不活性基質である）で表
される粒径100メツシユより小およびpKa3ないし
７を有する弱酸性陽イオン交換体を予じめ22.5℃
においてPH6.0ないし7.5に平衡化した懸濁液でな
るカラム床、または式 CarYOH （式中、Carは解離陰イオンOH-を供給するイオ
ン化可能基Y+を支持する不活性基質である）で
表される粒径100メツシユより小およびpKa7ない
し10を有する弱塩基性陰イオン交換体を予じめ
22.5℃においてPH7.3ないし9.0に平衡化した懸濁
液でなるカラム床に負荷し、ついで前記カラム床
が式 CarXH で表される陽イオン交換体を包含するものである
場合には一定量の「ビス―トリス」緩衝液を前記
カラム床に導入して、ヘモグロビンHb―Ａ1a―c
を含有する第１のフラクシヨンを溶出し、または
前記カラム床が式 CarYOH で表される陰イオン交換体を包含するものである
場合には一定量の「トリス」緩衝液を前記カラム
床に導入して、ヘモグロビンHb―Ａ1a―c以外の
ヘモグロビンを含有する第１のフラクシヨンを溶
出すると共に、前記赤血球溶血溶液を含むテスト
サンプルの一定量を希釈して希釈溶血物溶液を調
製し、これら第１フラクシヨンおよび希釈溶血物
溶液を分光分析して各々に含まれるヘモグロビン
を定量し、得られた数値から数式 （第１フラクシヨン中のヘモグロビンＨｂ―Ａ１ａ―ｃ量）／（希釈溶血物溶液中のヘモグロビン量） または １−（第１フラクシヨン中のヘモグロビンＨｂ−Ａ１ａ−ｃ以外のヘモグロビン量）／（希釈溶血物溶液中のヘ
モグロビン量） に従つて特定人の血糖状態の診断指標としての全
ヘモグロビン量に対するヘモグロビンHb―Ａ1a-c
量の比を算定するものであつて、前記イオン交換
体、懸濁液、緩衝液および洗浄液などを含む前記
分析工程全体にわたりシアン化物を含有しないも
のを使用することを特徴とする、ヘモグロビン
Hb―Ａ1a-cの測定法。
９ CarXHで表される弱酸性陽イオン交換体の
平衡化懸濁液が、Carがメタクリル酸とジビニル
ベンゼンとの共重合体であり、X-がカルボキシ
ル基である弱酸性陽イオン交換体の22.5℃におけ
る平衡化PH実質的に6.98をもつ懸濁液である、特
許請求の範囲第８項記載のヘモグロビンHb―Ａ1
ａ−ｃの測定法。
１０ CarXHで表される弱酸性陽イオン交換体
の平衡化懸濁液が、Carがセルロースであり、X-
がカルボキシメチル基である弱酸性陽イオン交換
体の22.5℃における平衡化PH実質的に6.8をもつ
懸濁液である、特許請求の範囲第８項記載のヘモ
グロビンHb―Ａ1a-cの測定法。
１１ CarXHで表される弱酸性陽イオン交換体
の平衡化懸濁液が、Carがセルロースであり、X-
がカルボキシメチル基である弱酸性陽イオン交換
体の22.5℃における平衡化PH実質的に6.1をもつ
懸濁液である、特許請求の範囲第８項記載のヘモ
グロビンHb―Ａ1a―cの測定法。
１２ CarXHで表される弱酸性陽イオン交換体
の平衡化懸濁液が、Carがメタクリル酸とジビニ
ルベンゼンとの共重合体であり、X-がカルボキ
シル基である弱酸性陽イオン交換体の22.5℃にお
ける平衡化PH実質的に6.8をもつ懸濁液である、
特許請求の範囲第８項記載のヘモグロビンHb―
Ａ1a-cの測定法。
１３ CarYOHで表される弱塩基性陰イオン交換
体の平衡化懸濁液が、Carがセルロースであり、
Y+がジエチルアミノエチル基である弱塩基性陰
イオン交換体の22.5℃における平衡化PH実質的に
8.5をもつ懸濁液である、特許請求の範囲第８項
記載のヘモグロビンHb―Ａ1a-cの測定法。
１４ CarYOHで表される弱塩基性陰イオン交換
体の平衡化懸濁液が、Carがポリスチレンとジビ
ニルベンゼンとの共重合体であり、Y+が―
NH2、―NHR、―Ｎ（Ｒ）２（ここで、Ｒは―
CH3または―C2H5の如き脂肪族炭化水素基であ
る）で表される第１、第２および第３アミン基の
混合である弱塩基性陰イオン交換体の22.5℃にお
ける平衡化PH実質的に7.5をもつ懸濁液である、
特許請求の範囲第８項記載のヘモグロビンHb―
Ａ1a-cの測定法。
技術分野 本発明は、血中のヘモグロビンHb―Ａ1a―cの
測定法に係る。さらに詳述すれば、本発明は、特
定人の血糖状態の診断指標としての百分率による
数値を求める方法に係る。さらに本発明は、この
方法を実施するための改良した液クロマトグラフ
イー用カラム（非シアン化物法）にも係る。
背景技術 本発明によれば、全血サンプルを患者から採取
し、適当な臨床化学上の常法により赤血球溶血物
でなるテストサンプルを調製する。その後、本発
明によれば、改良したイオン交換液カラムミクロ
クロマトグラフイー装置、分光分析法および数学
的計算法を使用して、テストサンプル中に存在す
るヘモグロビン類の分離、検知および定量の一連
の操作を行なう。
生化学的には、ヘモグロビンは酸素を組織に運
搬する赤血球中の両性たんぱくの色素物質であ
る。正常人の赤血球中には、各種のクロマトグラ
フ法により分離されうる小ヘモグロビンが存在し
ている。これらの小ヘモグロビンはHb―Ａ1a、
Hb―Ａ1b、Hb―Ａ1c、Hb―Ａ1dおよびHb―Ａ1e
と指称されている。このうち、ヘモグロビンHb
―Ａ1cが最も多く、小ヘモグロビンの大部分を占
める。ヘモグロビンHb―Ａ1cのレベルは患者の
平均血糖レベルと関連があることは知られてい
る。正常人では、全ヘモグロビンに対するHb―
Ａ1cの割合は３〜６％であると見られている。幼
年者または成人に係わらず、糖尿病患者につい
て、治療前における全ヘモグロビンに対するHb
―Ａ1cの割合は６〜12％である。さらに、Hb―
Ａ1c（分離されかつ同定されうるサブクラスとし
て）のレベルは、長時間にわたつての過血糖症の
度合の指標として役立ちうることが理解されてい
る。
本出願人は、ここで開示する方法およびカラム
に関する５件の米国特許を受けている。これらの
米国特許は、第4142855号、第4142856号、第
4142857号および第4142858号（いずれも1979年３
月発効）および第4168147号（1979年９月発効）
である。
これらのうち初めの３件（′855、′856および′
857）の発明は、セルロース粒子の平衡化懸濁液
でなるイオン交換体カラムを使用するものであ
る。セルロースは、′855では弱塩基性陰イオンタ
イプであり、′856および′857では弱酸性陽イオン
である。あとの２件（′858および′147）の発明は
樹脂粒子の平衡化懸濁液でなるイオン交換体カラ
ムを使用するものである。この場合の樹脂は弱酸
性陽イオンタイプである。
各特許発明では、イオン交換粒子２７から平衡
化懸濁液２７（Ｓ）を調製するために「処理溶液
２８」を使用している。さらに、この処理溶液２
８（好適にはPHおよび／またはイオン強度が調整
されている）は「溶出液」２８または１２８とし
ても使用され、テストサンプルの導入後、カラム
２０に添加されている。これら従来の処理溶液２
８および溶出液２８および１２８は、シアン化物
またはCN-イオンの存在により特徴づけられる。
緩衝液中における成分または有効化合物とし
て、あるいはヘモグロビンのクロマトグラフイー
における展開剤としてシアン化物（KCN）を使
用することは、以前から必須のこととして許容さ
れていた。従来の文献の中でも、Allenら著「正
常成人および胎児ヘモグロビンのクロマトグラフ
イー上の異質性に関する観察」（ジヤーナル・オ
ブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー
（Journal of the American Chemical Society）
Vol80、1628〜1634頁、1958年４月）には、「シ
アン化カリウムは、クロマトグラフイーの間、フ
エリヘモグロビンシアニドの解離を低減させるた
めに展開液中には始めから含まれる。オキシヘモ
グロビンをクロマトグラフイーにかける際には、
フエリヘモグロビンシアニドとオキシヘモグロビ
ンとはクロマトグラフ的には同じ挙動を示すた
め、シアン化物を展開液から排除する。このよう
に、オキシヘモグロビン溶液中の極微量のフエリ
ヘモグロビン（メトヘモグロビン）はフエリヘモ
グロビンシアニドに変えられるが、カラム上に遅
移動性の異質域を形成するものではない。」との
開示がある（前記文献、1630頁参照）。
これら特許明細書中に記載された発明に続い
て、ヘモグロビンHb―Ａ1a〜cの指標またはレベ
ルを測定するためのミクロクロマトグラフイーに
よる臨床検査技術では、粒子処理溶液あるいは緩
衝液または溶出液中におけるシアン化物またはシ
アノ基の存在を必ずしも必要としないことが発見
された。実際、シアン化物の存在は有害なものと
見なすことができる。
説明によれば、前記特許発明は、溶出液フラク
シヨン中におけるヘモグロビン、特にHb―Ａ1a
〜ｃの量が分光分析によつて検知、測定されるこ
とを開示している。また、この分光分析が、テス
トサンプル１０中に存在する特定のヘモグロビン
によつて起こる光の吸収を測定する装置４０によ
つて行なわれることも開示している。従来の発明
は、ヘモグロビンの存在を検知するためのスペク
トルの可視部分は紫域、さらに詳述すれば、実質
的に415nm（すなわち4150Å）にあるとの公知の
事実に対応している。
前記発明の出願後、各溶出液中に存在する特定
のヘモグロビンの量を表わす数値（415nmにおけ
る分光．分析により測定）は時間の因子によつて
左右されることが明らかになつた。分光分析をか
なり迅速に実施する場合には（たとえば溶出後30
分以内）、得られる数値は規準または標準に一致
する。しかしながら、さらに長い時間後では（た
とえば60分）、得られる数値はヘモグロビンHb―
Ａ1a〜cに関する実際の値よりも低い値を示す。
前記発明の各々の方法およびカラムについて注意
深く研究したところ、シアン化物またはシアノ基
の存在が、テストサンプル中に存在するヘモグロ
ビンHb―Ａ1a〜cを表わす正確な数値に対して、
得られた数値を不正確なものとしていることがわ
かつた。
また、イオン交換体粒子の処理溶液あるいは緩
衝液中にシアン化物が存在することは、フエロヘ
モグロビン誘導体のフエリヘモグロビンシアニド
への時間を関数とする変化反応の度合を増加さ
せ、これに伴なつて、分光分析により得られる数
値の変化が大きくなる。もちろん、熟練した者が
測定を行なう場合には、このような誤差は補正さ
れるはずである。しかしながら、比較的熟練して
いない者にとつては、シアン化物を使用しない方
法を利用することが望まれる。
シアン化物を使用しないことによる他の利点
は、本発明によるミクロカラムおよび試薬の輸出
入が簡単である点にある。多くの国では、製品に
シアン化物を含有する旨記載しているため（極微
量であつたとしても）、規制を受けることもあ
る。製造の際には、試薬の調製およびイオン交換
物質の平衡化に関して廃液または残渣の排出は環
境の汚染にもつながるが、シアン化物を使用しな
いため問題がない。さらに、使用したカラムおよ
び試薬溶液の廃棄も簡単である。
発明の開示 本発明の目的は、シアン化物またはCN-イオン
を全く含まない試薬または溶液を使用して、特定
人の血糖状態の診断用指標としての百分率値を求
める方法を提供することにある。
さらに本発明の目的は、シアン化物またはCN-
イオンの存在しない状態で、特定人の血液中に存
在する全ヘモグロビン（Hb）に対するヘモグロ
ビンHb―Ａ1a〜cの割合を、迅速に、安価にかつ
正確に分離、検知および算定する方法を提供する
ことにある。
本発明の他の目的は、多数の連続工程を必要と
するものではあるが、スタンダードな手法として
採用されうるような方法を提供することにあり、
臨床化学の分野に熟知する者が繰返しかつ正確に
多人数の者の血液をテストし、特定人の血糖状態
を糖尿病と診断する際に、医者らが利用できる基
礎データを確立できる。
本発明のさらに他の目的は、ヘモグロビンHb
―Ａ1a〜cのレベルを測定するためのミクロクロ
マトグラフによる臨床検査法に使用するミクロカ
ラムであつて、シアン化物を含有せずかつ本発明
による方法の実施のための予じめ決められたミク
ロクロマトグラフイー特性を有するミクロカラム
を提供することにある。
本発明のこれらの目的および他の目的は、本発
明の利点と同様に、以下に詳述する各種の具体例
についての詳細な記載により明らかになるであろ
う。
一般に、特定人の血糖状態の診断用指標として
の百分率値を求めるための本発明方法は、前記人
間から採取しかつその後赤血球溶血物を含有する
テストサンプルとして調製した全血サンプルを使
用する。その後、一定量のテストサンプルを、シ
アン化物を含まないカラム床の端部に導入する。
カラム床はテストサンプル中に存在する特定のヘ
モグロビンを吸収する。このカラム床は、100メ
ツシユより小のサイズをもつイオン交換物質粒子
の平衡化懸濁液でなる。カラム床中の粒子は
CarXHおよびCarYOHでなる群から選ばれる物
質である。ここで「Car」は、解離陽イオンH+を
供給するイオン化可能基X-、および解離陰イオ
ンOH-を供給するイオン化可能基Y+を支える不
活性基質を表わす。
本発明の実施にあたつては、CarXH粒子は弱
酸性陽イオン交換体であつて、pKaが３〜７であ
り、しかも温度22.5℃においてPH6.0ないし7.5の
平衡化懸濁液として使用されることが必須の要件
である。
また、同様に、CarYOHは弱塩基性陰イオン交
換体であつて、pKaが７〜10であり、しかも温度
22.5℃においてPH7.3〜9.0の平衡化懸濁液として
使用されることが、本発明の実施の必須要件であ
る。
その後、シアン化物を含まない一定量の緩衝液
をカラム床の端部から導入し、テストサンプル中
に存在する特定のヘモグロビンを含有する第１フ
ラクシヨンを優先的に溶出する。カラム床が
CarXH粒子の平衡化懸濁液の場合には、第１フ
ラクシヨンは、テストサンプル中に存在するヘモ
グロビンHb―Ａ1a〜cの実質的に全部を含有す
る。また、カラム床がCarYOH粒子の平衡化懸濁
液の場合には、テストサンプル中に存在するHb
―Ａ1a〜c以外のヘモグロビンの実質的にすべて
を含む。いずれの場合にも、一定量の第１溶出液
フラクシヨンをカラム床の他端部から採取する。
本発明の第１の具体例では、一定量の洗浄液を
カラム床の端部に導入して、脱着しかつテストサ
ンプル中に存在する残りのヘモグロビンの実質的
にすべてを含有する第２フラクシヨンを溶出す
る。カラム床がCarXH粒子の平衡化懸濁液の場
合には、第２フラクシヨンは、テストサンプル中
に存在するHb―Ａ1a〜c以外のヘモグロビンのす
べてを含有する。また、カラム床がCarYOH粒子
の平衡化懸濁液の場合には、第２フラクシヨン
は、テストサンプル中に存在するヘモグロビン
Hb―Ａ1a〜cの実質的にすべてを含有する。いず
れの場合にも、一定量の第２溶出液フラクシヨン
をカラム床の他端部から採取する。
ついで、第１および第２溶出液フラクシヨン中
に存在するヘモグロビンを分光分析により別々に
検知、定量し、各々の量を数値として表わす。つ
いで、これらの数値を数式に従つて比較する。
CarXHまたはCarYOX粒子の平衡化懸濁液でな
るカラム床および緩衝液を使用する本発明方法の
第２の具体例では、一定量の第１溶出液フラクシ
ヨンをカラム床の端部から採取する。一方、一定
量のテストサンプルを希釈して、分光分析により
簡便に検知、定量されうる赤血球溶血物溶液とす
る。ついで、第１溶出液フラクシヨンおよび希釈
溶血物溶液中に存在するヘモグロビンを分光分析
により別々に検知、定量し、各々の量を数値とし
て求め、数式に従つて比較する。
いずれの具体例においても、数式により、テス
トサンプル中に存在するヘモグロビンHb―Ａ1a
〜ｃに関する百分率値を求めることができ、テス
トサンプルを提供する者の血糖状態の診断指標と
して利用される。
本発明のいずれの具体例においても、得られた
百分率値は、医者らが、テストサンプルを提供し
た患者の血糖特性の診断指標として使用できる。
本発明の実施に当り使用されるミクロカラム
は、貯留部、これに接続しかつ排出端をもつ胴部
を有している。貯留部と胴部との接合部および胴
部と排出端の接合部は横断デイスクにより閉止さ
れる。デイスク間の胴部に位置するイオン交換体
粒子はカラム床を形成する。また、デイスクは赤
血球溶血物溶液に対して透過性である。カラム床
はシアン化物を含まない粒子の平衡化懸濁液でな
る。粒子は100メツシユより小のサイズを有し、
特に、CarXHおよびCarYOHでなる群から選ば
れる物質でなる。
【図面の簡単な説明】
図面は、実質的に実物大のスケールで図示した
改良クロマトグラフイーミクロカラムからヘモグ
ロビンの第１および第２フラクシヨンが溶出され
る本発明方法の第１の具体例を示す概略図であ
る。
発明を実施するための最良の形態 本発明方法の実施にあたつては、患者らから全
血サンプルを採取することが必要である。従来の
臨床化学法に従つて全血サンプルを採取できる。
全血サンプルから赤血球溶血物溶液を含有する
好適なテストサンプル（符号１０）を調製する方
法については、２種類の方法を開示する同一出願
人に係る前述の米国特許明細書における記載を参
照するものとし、ここではその詳細については省
略する。全血サンプルの主なヘモグロビン物質で
あるテストサンプルの調製のために方法10―ａが
使用できる。全血サンプルのヘモグロビン物質に
加えて、プラズマたんぱく質、脂質、および白血
球および赤血球を含むテストサンプルの調製のた
めには方法10―ｂが使用できる。
図面（実物大で示す）を参照すれば、符号２０
はクロマトグラフ用ミクロカラムを示す。カラム
２０は、貯留部２１、これに接続する胴部２２お
よび胴部に接続する排出端２３でなり、排出端は
キヤツプ２４により選択的に閉止される。貯留部
２１と胴部２２との接続部はデイスク２５により
閉止されている。さらに、胴部２２と排出端との
接続部もデイスク２６により閉止されている。符
号２７は、デイスク２５および２６の間のカラム
床を形成するイオン交換物質粒子を示す。
各デイスク２５および２６は透過性であつて、
貯留部２１から胴部２２への赤血球溶血物溶液の
導入および胴部２２から排出端２３を介しての溶
出液フラクシヨンの排出を可能とするとともに、
粒子２７のカラム床を胴部２２内に保持しうるよ
うにミクロ孔のネツトワークを有している。デイ
スク２５および２６はチグラータイプの一般的な
可撓性および弾性を有する線状高密度ポリエチレ
ンでなる。一般的には、この種のフイルタ用ポリ
エチレンは「Vyon」の名称で販売されている。
本発明によれば、イオン交換物質粒子２７は
100メツシユより小のサイズであり、CarXHおよ
びCarYOHで表わされる物質の中から選ばれる。
Carは基質を示し、セルロース、またはポリスチ
レンまたはメタクリル酸とジビニルベンゼンとの
共重合体である。X-はCarにより支持されかつ解
離陽イオンH+を供給するイオン化可能基であ
り、カルボキシル基またはカルボキシメチル基で
ある。Y+はCarにより支持されかつ解離陰イオン
OH-を供給するイオン化可能基を示し、ジエチ
ルアミノエチル基または式―NH2、―NHRおよ
び―Ｎ（Ｒ）２で表わされるアミン基の混合物で
ある。
CarXH粒子２７はpKa3〜７の弱酸性陽イオン
交換体として特徴づけることもできる。また
CarYOH粒子27はpKa7〜10の弱塩基性陰イオン
交換体として特徴づけることもできる。
市販されているイオン交換物質粒子２７の場合
には、ミクロカラム２０のデイスク（２５および
２６）間の胴部での使用のために、通常、処理を
ほどこす必要がある。このような処理は粒子２７
についてカラム胴部の「その場」で実施できる。
しかしながら、一連の同心カラム２０のための粒
子をバツチ方式で処理することが好ましく、これ
により所望のミクロクロマトグラフイー特性をも
つカラム２０の使用が可能になる。
カラム２０のカラム床を構成するイオン交換物
質粒子２７は所望のまたは「初期の」PHを有する
平衡化懸濁液２７（Ｓ）の形で使用される。
CarXHについては、温度22.5℃においてPH6.0〜
7.5の懸濁液２７（Ｓ）の形で使用できる。また
CarYOH粒子については、温度22.5℃においてPH
7.3〜9.0の懸濁液２７（Ｓ）の形で使用できる。
懸濁液２７（Ｓ）は、シアン化物を含まない処理
溶液２８を使用して調製される。
本発明によれば、処理溶液２８を、カラム床
（CarXHまたはCarYOH粒子の懸濁液２７（Ｓ）
でなる）からテストサンプル１０中に存在する特
定のヘモグロビン（ただし、かならずしも全部で
はない）を含有する溶出液フラクシヨンを得るた
めの溶出用の緩衝液１２８としても使用できる。
手法１０―ａまたは１０―ｂにより調製した一
定量のテストサンプル１０を、平衡化懸濁液２７
（Ｓ）でなるカラム床の１方の端部に導入する。
手法１０―ａに従つて調製したテストサンプルに
ついては蒸留水を使用して１：４で希釈する必要
がある。
好ましくは、カラム２０を垂直方向に配置し、
排出端キヤツプ２４を取はずし、一定量のテスト
サンプル１０を貯留部２１に充填する。テストサ
ンプル１０の大部分はデイスク２５を容易に通過
し、懸濁液２７（Ｓ）のカラム床上に通過する。
デイスク２５の上または中に残留するテストサン
プル１０の少量部分を、次の工程で少量（0.2
ml）の緩衝液１２８を使用して、カラム床上に排
出する。
一定量の緩衝液１２８（シアン化物を含有しな
い）をカラム貯留部に導入して、テストサンプル
１０の第１フラクシヨンを選択的に排出端２３か
ら取出す。第１フラクシヨン３０を容器３１で集
める。カラム床がCarXH粒子の懸濁液２７
（Ｓ）の場合には、第１フラクシヨン３０はテス
トサンプル１０中に存在するヘモグロビンHb―
Ａ1a〜cの実質的にすべてを含有する。一方、カ
ラム床がCarYOH粒子の懸濁液２７（Ｓ）の場合
には、第１フラクシヨン３０はテストサンプル１
０中に存在するHb―Ａ1a〜c以外のヘモグロビン
の実質的にすべてを含有する。いずれの場合に
も、一定時間後に緩衝液２８を添加して、一定量
の第１フラクシヨン３０を容器３１で集める。
本発明方法の第１の具体例では、図面に示すよ
うに、一定量の洗浄液３４をカラム貯留部２１に
導入したのち、テストサンプル１０の第２フラク
シヨン３２を容器３３で集める。第２フラクシヨ
ンはテストサンプル１０中に存在する残りのヘモ
グロビンの実質的にすべてを含有する。カラム床
がCarXH粒子の懸濁液の場合には、第２フラク
シヨン３２はHb―Ａ1a〜c以外のテストサンプル
１０中に存在するヘモグロビンの実質的にすべて
を含有する。また、カラム床がCarYOHの場合に
は、第２フラクシヨン３２はテストサンプル１０
中に存在するヘモグロビンHb―Ａ1a〜cの実質的
にすべてを含有する。いずれの場合にも、一定量
の第２フラクシヨン３２が容器３３で集められ
る。
洗浄液３４はシアン化物を含有していない。洗
浄液３４の組成は、その使用により溶出液フラク
シヨン３２の分光分析特性（色）が影響されない
限り、あまり重要ではない。使用できる洗浄液
は、イオン交換物質粒子２７のカラム床からテス
トサンプル１０の残留する血液成分の実質的に全
部を完全に脱着するに充分なイオン強度あるいは
PHを有しているものである。たとえば、4M
NaCl ４mlを貯留部２１に導入する。一定時間後
（20〜30分後）、実質的に４mlの溶出液フラクシヨ
ンを容器３３で集める。CarXH粒子の懸濁液２
７（Ｓ）から溶出したフラクシヨン３２は、本発
明方法に従つて次の処理を行なう前に、蒸留水を
使用して適当に希釈する必要がある。
本発明の両具体例によれば、テストサンプル１
０について液カラムミクロクマトグラフイーを行
なつたのち、患者らから採取した全血サンプル中
に存在する全ヘモグロビン（Hb）に対するHb―
Ａ1a〜cの比の算定のために分光装４０（図示せ
ず）を使用する。
分光分析は、テストサンプル１０中に存在する
特定のヘモグロビンによつて起こる光の吸収を測
定する装置により実施する。ヘモグロビンの存在
を検知するためのスペクトルの可視域は紫域、さ
らに詳述すれば実質的に415nm（4150Å）にあ
る。
分光装置４０は測定波長を415nmにプリセツト
した光学分光計である。また、分光装置４０は、
調整可能に選択されるスペクトル波長の関数とし
て２つのビームの輻射能の比または比の関数を与
える機器と組合された分光計の如き形式の分光計
でもよい。本発明による分光分析が光吸収特性に
よりテストサンプル１０から特定のヘモグロビン
を検知しかつ定量することを目的とするものであ
るため、他の形式の装置を使用することもでき
る。たとえば、１組のネスラー管の如き肉眼比較
測定器なども使用できる。
本発明方法の第１具体例では、容器３１および
３３の内容物を、分光装置用の適当なセルに別々
に移す。第１および第２溶出液フラクシヨン３０
および３２の分光分析により、テストサンプル１
０中に存在する特定のヘモグロビンの量を表わす
数値が得られる。分光装置４０として従来の分光
計または分光光度計を使用する場合には、表示さ
れた数値は吸光度の関数であり、光がセルを通過
し感知光電セルに向つて移動する間に特定のヘモ
グロビンによつて吸収された波長４１５nmの光
の量の測定値である。
つぎに、得られた各溶出液フラクシヨン３０お
よび３２中の特定のヘモグロビンに関する数値を
数式に従つて比較する。
溶出液フラクシヨン３０および３２がCarXH
粒子の懸濁液２７（Ｓ）でなるカラム床から溶出
されたものである場合には、次式を使用する。
（第１フラクシヨン３０についての数値）×１００／（第１フラクシヨン３０についての数値）＋（第２フラクシ
ヨンについての数値）＝百分率値 溶出液フラクシヨン３０および３２がCarYOH
粒子の懸濁２７（Ｓ）でなるカラム床から溶出さ
れたものである場合には、次式を使用する。
（第２フラクシヨンについての数値）×１００／（第１フラクシヨン３０についての数値）＋第２フラクシヨン３
２についての数値）＝百分率値 CarXHまたはCarYOH粒子の懸濁液２７
（Ｓ）および緩衝液１２８を使用する本発明方法
の第２具体例では、一定量の第１溶出液フラクシ
ヨン３０を容器３１で集める。予め、同時にある
いは連続して、分光分析により簡便に検知されか
つ定量される赤血球溶血物溶液として一定量のテ
ストサンプル１０を調製する。充分に希釈しない
場合には、テストサンプル１０の光吸収特性は、
従来の分光装置の感知光電セルの操作効率を損な
うような度合であることが明らかである。したが
つて、たとえば、第１フラクシヨン３０の溶出前
に、カラム２０の端部に導入されるテストサンプ
ル１０の容量に等しい量のテストサンプル１０
を、蒸留水により、実質的に１：480の割合で希
釈して、分光計による分析用の溶血物溶液を調製
する必要がある。
ついで、特殊なテストサンプル１０の溶出物フ
ラクシヨン３０および希釈溶血物溶液中における
特定のヘモグロビンについての数値を数式に従つ
て比較する。
溶出液フラクシヨン３０がCarXH粒子の懸濁
液２７（Ｓ）でなるカラム床から溶出されたもの
である場合には、次式を使用する。
（溶出液フラクシヨン３０についての数値）×１００／溶血物溶液についての数値＝百分率値 溶出液フラクシヨン３０がCarYOH粒子の懸濁
液２７（Ｓ）でなるカラム床から溶出されたもの
である場合には、次式を使用する。
100−（溶出液フラクシヨン３０についての数値）×１００／溶血物溶液についての数値＝百分率値 これら数式のうちのいずれかを使用することに
より、テストサンプルを提供した人間の血糖状態
の診断指標として、テストサンプル中に存在する
ヘモグロビンHb―Ａ1a〜cについての数値が得ら
れる。
以下の実施例は、臨床化学の分野に熟知する者
による本発明の実施について、さらに説明するも
のである。
実施例 １ CarYOH形イオン交換物質粒子として、Carが
セルロースであり、Y+がジエチルアミノエチル
基（―Ｏ―CH2―CH2―Ｎ（C2H5）2）であつて、
pKaが実質的に9.5であるタイプのものを使用し
た。一般には、このタイプのイオン交換物質は
Whatman DEAE―52として市販されている。
このセルロース粒子２７から、H2N・Ｃ
（CH2OH）36.06ｇ（0.05M）、防腐剤としての
NaN30.10ｇ（0.01％）をH2Oで１とした組成を
もつ「トリス」処理溶液２８と混合することによ
り、22.5℃においてPH8.5の懸濁液２７（Ｓ）を
調製した。処理溶液と混合したのち、ついでセル
ロース粒子をさらに酸溶液２９（たとえば、4M
HCl）で処理してPHを実質的に8.5に再調整し
た。
本発明方法の両具体例において、これらセルロ
ース粒子の懸濁液２７（Ｓ）のカラム床の端部に
一定量の緩衝液１２８を導入し、Hb―Ａ1a〜c以
外のテストサンプル１０中に存在するヘモグロビ
ンを含有する溶出液を溶出した。この緩衝液１２
８は処理溶液２８と同じ組成ではあるが、濃HCl
によりPHを22.5℃において実質的に7.7に調整し
たトリス溶液である。
実施例 ２ 他のCarYOH形イオン交換物質粒子２７とし
て、Carがポリスチレンとジビニルベンゼンの共
重合体であり、Y+が式―NH2、―NHRおよび―
Ｎ（Ｒ）２（ここでＲは―CH3あるいは―C2H5
の如き脂肪族炭化水素基である）で表わされる第
１級、第２級および第３級アミン基の混合である
タイプのものを使用した。これら粒子のpKaは７
〜９である。この種のイオン交換物質はDowdex
MWA―１およびAmberlite IRA―93の名称で市
販されている。
これらの脂肪粒子から、実施例１と同じ組成の
トリス処理溶液２８と混合することにより、22.5
℃においてPH7.5の懸濁液２７（Ｓ）を調製し
た。
Hb―Ａ1a〜c以外のヘモグロビンの実質的にす
べてを含有するテストサンプル１０の第１フラク
シヨンを、実施例１と同じ組成をもちかつPHを
22.5℃において実質的に7.5に調整したトリス緩
衝液１２８を使用して、これらの樹脂粒子の懸濁
液２７（Ｓ）でなるカラム床から溶出した。
実施例 ３ CarXH形イオン交換物質粒子として、Carがメ
タクリル酸とジビニルベンゼンの共重合体であ
り、X+がカルボキシル基（―COOH）であり、
かつpkaが４〜６であるタイプのものを使用し
た。この種のイオン交換物質はAmberlite CG―
50の名称で市販されている。
この樹脂重合体２７から、KH2PO43.74ｇ
（0.027M）、KOH0.955ｇ（0.017M）および防腐
剤としてのNaN30.10ｇ（0.01％）をH2Oで１と
した組成をもつ「リン酸塩」処理溶液２８と混合
することにより、22.5℃においてPH6.98の懸濁液
２７（Ｓ）を調製した。処理溶液２８との混合
後、ついで樹脂粒子２７を酸溶液２９（たとえ
ば、4M H3PO4）で処理して、PHを実質的に6.98
に再調整した。
本発明方法の両具体例に従つて、一定量の緩衝
液１２８を、これら樹脂粒子の懸濁液２７（Ｓ）
でなるカラム床の端部に導入し、テストサンプル
１０中に存在するHb―Ａ1a〜cの実質的にすべて
を含有する溶出液フラクシヨン３０を溶出した。
この緩衝液１２８は、処理溶液２８と同じ組成を
有しかつPHが6.98であるリン酸塩溶液であある。
実施例 ４ 他のCarXH形イオン交換物質粒子２７とし
て、Carがセルロースであり、X-がカルボキシメ
チル基（―Ｏ―CH2―COOH）でありかつpKaが
3.5であるタイプのものを使用した。この種のイ
オン交換物質はWhatman CM―52の名称で市販
されている。
これらのセルロース粒子２７から、
KH2PO43.74ｇ（0.027M）およびKOH0.748ｇ
（0.013M）および防腐剤としてのNaN30.10ｇ
（0.01％）をH2Oで１とした組成のリン酸塩処
溶液２８と混合することにより、22.5℃において
PHが実質的に6.8である懸濁液２７（Ｓ）を調製
した。
ヘモグロビンHb―Ａ1a〜cの実質的にすべてを
含有するテストサンプル１０の第１フラクシヨン
３０を、処理溶液２８と同じ組成をもちかつ実質
的に6.8のPHをもつリン酸塩緩衝液１２８を使用
することにより、これらセルロース粒子の懸濁液
２７（Ｓ）でなるカラム床から溶出した。
実施例 ５ 実施例４のセルロース粒子２７から、
（HOCH2CH2）2NC（CH2OH）36.28ｇ（0.03M）お
よび防腐剤としてのNaN30.10ｇ（0.01％）をH2O
で１とした組成の「ビスートリス」処理溶液２
８と混合することにより、22.5℃においてPHが実
質的に6.1である懸濁液２７（Ｓ）を調製した。
処理溶液２８と混合したのち、ついでセルロース
粒子をさらに酸溶液２９（たとえば、4M HCl）
で処理して、PHを実質的に6.1に再調整した。
ヘモグロビンHb―Ａ1a〜cの実質的にすべてを
含有するテストサンプル１０の第１フラクシヨン
３０を、処理溶液２８の組成にNaCl2.34ｇ
（0.04M）を添加した組成もちかつPHが実質的に
6.1であるビスートリス緩衝液１２８を使用し
て、これらをセルロース粒子の懸濁液２７（Ｓ）
でなるカラム床から溶出した。
実施例 ６ 実施例３の樹脂粒子から、実施例５と同じ組成
のビス−トリス処理溶液２８と混合することによ
り、22.5℃においてPHが実質的に6.8である懸濁
液２７（Ｓ）を調製した。ヘモグロビンHb―Ａ1
ａ〜ｃの実質的にすべてを含有するテストサンプル
１０の第１フラクシヨン３０を、処理溶液２８の
組成にNaCl7.02ｇ（0.12M）を添加した組成をも
ちかつPHが実質的に6.8であるビスートリス緩衝
液１２８を使用することにより、これら樹脂粒子
の懸濁液２７（Ｓ）でなるカラム床から溶出し
た。
まとめ 以上説明した本発明の具体例には、蒸留水を使
用しての希釈が必要とされる各種の工程、技術ま
たは手法が開示されている。しかしながら、改良
されたミクロカラム２０を使用する本発明の実施
の最良の態様では、本発明が糖尿病の存在を検査
しかつ糖尿病制御の度合を監視するための信頼す
べき方法たるためには、常法の注意深い採用とま
ちがいのない遂行を必要とすることは、臨床化学
の分野に熟知する者には容易に理解されるであろ
う。さらに、本発明の実施にあたつては、多数の
人間（糖尿病患者および正常人を含めて）につい
て繰返しテストするための試験法としては、本来
的に、テストサンプル１０、溶液２８および１２
８，２９および３４、フラクシヨン３０および３
２および溶液４２の標準量および容量、適切な希
釈割合、および分光装置の慎重な選択および調整
が大きく関連することが理解されるであろう。そ
れ故、本発明の精神および内容については、ここ
に添付する請求の範囲によつて決定されるべきで
ある。
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