JPS6236186A - ポリヨ−ドチロニンアツセイに有用なグルコ−ス−６−リン酸デヒドロゲナ−ゼコンジユゲ−ト - Google Patents
ポリヨ−ドチロニンアツセイに有用なグルコ−ス−６−リン酸デヒドロゲナ−ゼコンジユゲ−トInfo
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- JPS6236186A JPS6236186A JP61127110A JP12711086A JPS6236186A JP S6236186 A JPS6236186 A JP S6236186A JP 61127110 A JP61127110 A JP 61127110A JP 12711086 A JP12711086 A JP 12711086A JP S6236186 A JPS6236186 A JP S6236186A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
（発明の分野）
チロキシンは、甲状腺により分泌される、補乳類の生理
機能上重要なホルモンである。チロキシンの測定は病気
の決定における重要な診断手段である。放射線免疫検定
法、拮抗蛋白質結合法、クロマトグラフィー等を含む様
々な技術がチロキシンの測定に用いられてきた。これら
の技術は実行困難な点および放射線免疫検定法の場合に
不安定な試薬を用いる点で多くの不都合さを欠点として
伴う。
機能上重要なホルモンである。チロキシンの測定は病気
の決定における重要な診断手段である。放射線免疫検定
法、拮抗蛋白質結合法、クロマトグラフィー等を含む様
々な技術がチロキシンの測定に用いられてきた。これら
の技術は実行困難な点および放射線免疫検定法の場合に
不安定な試薬を用いる点で多くの不都合さを欠点として
伴う。
（先行技術の記載）
米国特許第３８１７８３７号は酵素イムノアッセイにつ
いて記載している。米国特許第４０４０９０７号はヨー
ドチロニン酵素コンジュゲートについて記載している。
いて記載している。米国特許第４０４０９０７号はヨー
ドチロニン酵素コンジュゲートについて記載している。
米国特許第４１７１２４４号は酵素結合ポリヨードチロ
ニンについて開示している。ポリヨー下チロニンイムノ
アッセイは米国特許第４０４３８７２号に記載されてい
る。米国特許第４１２１９７５号はポリヨードチロニン
アッセイに用いる試料の前処理について記述している。
ニンについて開示している。ポリヨー下チロニンイムノ
アッセイは米国特許第４０４３８７２号に記載されてい
る。米国特許第４１２１９７５号はポリヨードチロニン
アッセイに用いる試料の前処理について記述している。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いる酵素
イムノアッセイは米国特許第３８７５０１１号に記載さ
れている。液体試料中の遊離チロキシンまたは３，５．
３’ −）リョードチロニンの測定方法は米国特許第４
４１０６３３号に記載されている。ヨードチロニン免疫
源および抗体は米国特許第４３９９１２１号に記載され
ている。
イムノアッセイは米国特許第３８７５０１１号に記載さ
れている。液体試料中の遊離チロキシンまたは３，５．
３’ −）リョードチロニンの測定方法は米国特許第４
４１０６３３号に記載されている。ヨードチロニン免疫
源および抗体は米国特許第４３９９１２１号に記載され
ている。
チロキシン放射線免疫検定法は米国特許第４０１８８８
３号に記述されている。血清中のチロキシンおよびトリ
ョードチロニンを測定する放射線免疫検定法は米国特許
第３９１１０９６号に開示されている。トリョードチロ
ニンおよびチロキシンの放射線免疫検定法は米国特許第
３９２８５５３号に記載されている。
３号に記述されている。血清中のチロキシンおよびトリ
ョードチロニンを測定する放射線免疫検定法は米国特許
第３９１１０９６号に開示されている。トリョードチロ
ニンおよびチロキシンの放射線免疫検定法は米国特許第
３９２８５５３号に記載されている。
［発明の要約］
この発明はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（
Ｇ６ＰＤＨ）にコンジュゲートしたポリヨードチロニン
類似体（Ｐ Ｉ Ａ）をイムノアッセイに用いることを
目的として提供する。Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート（複合
体）は抗体結合部位で試料中のポリヨードチロニンと拮
抗し得る。Ｐ Ｉ Ａ−Ｇ ６ＰＤＨコンジユゲートと
の抗体の結合は実質的に酵素コンジュゲートの酵素活性
を低減させる。既知標準値に関連づけて試料含有アッセ
イ溶液の酵素活性を決定することにより、試料中のポリ
ヨードチロニンの量を測定することができる。
Ｇ６ＰＤＨ）にコンジュゲートしたポリヨードチロニン
類似体（Ｐ Ｉ Ａ）をイムノアッセイに用いることを
目的として提供する。Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート（複合
体）は抗体結合部位で試料中のポリヨードチロニンと拮
抗し得る。Ｐ Ｉ Ａ−Ｇ ６ＰＤＨコンジユゲートと
の抗体の結合は実質的に酵素コンジュゲートの酵素活性
を低減させる。既知標準値に関連づけて試料含有アッセ
イ溶液の酵素活性を決定することにより、試料中のポリ
ヨードチロニンの量を測定することができる。
ボリョードチロニン類似体は鎖長ｌ原子の結合基（ｌｉ
ｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）によりＧ６ＰＤＨにコンジュ
ゲートする（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、結合）する。
ｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）によりＧ６ＰＤＨにコンジュ
ゲートする（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、結合）する。
［実施態様の記載］
この発明の組成物は０６ＰＤＨにコンツユゲートしたポ
リョードチロコン類似体であり、ポリョードチロコンに
対して特異的な抗体と結合すると酵素コンジュゲートの
酵素活性は実質的に低下する。鎖長ｌ原子の結合基によ
りポリョードチロコン類似体がＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈとコ
ンジュゲートされる。
リョードチロコン類似体であり、ポリョードチロコンに
対して特異的な抗体と結合すると酵素コンジュゲートの
酵素活性は実質的に低下する。鎖長ｌ原子の結合基によ
りポリョードチロコン類似体がＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈとコ
ンジュゲートされる。
この結合（ｌｉｎｋａｇｅ）には窒素および硫黄類似体
を含む非オキソカルボニル基またはスルホニル基を伴う
ことが多い。非オキソカルボニル基またはスルホニル基
が結合基である場合、これはＧ６ＰＤＨのアミノ基に結
合する。（非オキソカルボニルは少なくとも１個のへテ
ロ原子で置換されたカルボニル基を意味する。これを具
体的に示すと、非オキソカルボニルはカルボン酸のカル
ボニル基−Ｃ−ＯＨを含み、窒素類似体はアミド酸のイ
ミＨ ノカルボニル基−Ｃ−ＯＨを含み、硫黄類似体はチオ酸
のチオカルボニル基−Ｃ−ＯＨを含む。スルホニル基は
スルホン酸由来の基 である。
を含む非オキソカルボニル基またはスルホニル基を伴う
ことが多い。非オキソカルボニル基またはスルホニル基
が結合基である場合、これはＧ６ＰＤＨのアミノ基に結
合する。（非オキソカルボニルは少なくとも１個のへテ
ロ原子で置換されたカルボニル基を意味する。これを具
体的に示すと、非オキソカルボニルはカルボン酸のカル
ボニル基−Ｃ−ＯＨを含み、窒素類似体はアミド酸のイ
ミＨ ノカルボニル基−Ｃ−ＯＨを含み、硫黄類似体はチオ酸
のチオカルボニル基−Ｃ−ＯＨを含む。スルホニル基は
スルホン酸由来の基 である。
上記非オキソカルボニル基またはスルホニル基はいずれ
もアミンに結合してヒドロキシの置換によりアミドを形
成し得る。） 酵素にコンジュゲートしたＰＩＡの数は少なくともｌ、
通常少なくとも２、一般的には１２以下、通常１０以下
および好ましくは平均して約３〜８の範囲内である。Ｐ
ＴＡはアラニン基を欠く点でチロキシンとは異なり、１
〜４個のヨウ素が臭素およびｔ−ブチルのようなアイソ
スター性基と置換され、またヨウ素の１個が水素と置換
され得る。
もアミンに結合してヒドロキシの置換によりアミドを形
成し得る。） 酵素にコンジュゲートしたＰＩＡの数は少なくともｌ、
通常少なくとも２、一般的には１２以下、通常１０以下
および好ましくは平均して約３〜８の範囲内である。Ｐ
ＴＡはアラニン基を欠く点でチロキシンとは異なり、１
〜４個のヨウ素が臭素およびｔ−ブチルのようなアイソ
スター性基と置換され、またヨウ素の１個が水素と置換
され得る。
イムノアッセイにおいて酵素コンジュゲートを受容体、
好ましくは抗体およびチロコン誘導体を含む疑のある未
知の試料と組み合わせて用いることが可能なため、アッ
セイ試料の酵素活性を既知標準値と比較することにより
未知の試料中のチロコン誘導体の量を測定することがで
きる。
好ましくは抗体およびチロコン誘導体を含む疑のある未
知の試料と組み合わせて用いることが可能なため、アッ
セイ試料の酵素活性を既知標準値と比較することにより
未知の試料中のチロコン誘導体の量を測定することがで
きる。
大抵の場合、ＰｒＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートは下式
［式中、
Ｚは、活性部位以外で結合したＧ６ＰＤＨであり、（「
活性部位」の語は酵素作用に必要なアミノ酸単位または
基を意味する）、 ｍ は、ｌないし１６の数、通常２〜１２の範囲および
好ましくは３〜８の範囲の数であり、α１−４は通常ヨ
ウ素、臭素またはｔ−ブチル、好ましくはヨウ素である
が、ただし１＠芒抄が水素であり得、 Ｗは、炭素または硫黄であり、 Ｘは、Ｗが硫黄のときには酸素、またはＷが炭素のとき
にはＸはＹと一緒になって酸素、窒素、硫黄または炭素
（ただし、炭素は２個の置換基を有し得、各々の置換基
はカルボキシ、低級アルキル、またはヒドロキシ、アミ
ノ、アルコキシ、カルボキシ、チオ等で置換された低級
アルキル等のように炭素、≠た酸素、窒素および硫黄か
らなる群から選ばれた原子１〜５個を有する）と二重結
合を形成し得、またはその他の場合水素であり、Ｙは、
Ｗが硫黄のときには酸素であるか、またはＹは、低級ア
ルキルまたはカルボキシ、またはヒドロキシ、カルボキ
シ、アミノ、アルコキシ。
活性部位」の語は酵素作用に必要なアミノ酸単位または
基を意味する）、 ｍ は、ｌないし１６の数、通常２〜１２の範囲および
好ましくは３〜８の範囲の数であり、α１−４は通常ヨ
ウ素、臭素またはｔ−ブチル、好ましくはヨウ素である
が、ただし１＠芒抄が水素であり得、 Ｗは、炭素または硫黄であり、 Ｘは、Ｗが硫黄のときには酸素、またはＷが炭素のとき
にはＸはＹと一緒になって酸素、窒素、硫黄または炭素
（ただし、炭素は２個の置換基を有し得、各々の置換基
はカルボキシ、低級アルキル、またはヒドロキシ、アミ
ノ、アルコキシ、カルボキシ、チオ等で置換された低級
アルキル等のように炭素、≠た酸素、窒素および硫黄か
らなる群から選ばれた原子１〜５個を有する）と二重結
合を形成し得、またはその他の場合水素であり、Ｙは、
Ｗが硫黄のときには酸素であるか、またはＹは、低級ア
ルキルまたはカルボキシ、またはヒドロキシ、カルボキ
シ、アミノ、アルコキシ。
チオ等で置換された低級アルキル等のように炭素、＝＝
酸素、窒素および硫黄からなる群から選ばれた１〜５個
の原子を有する置換基である］を育する。このような化
合物の例を挙げると、アミド結合によりＧ６ＰＤＨにコ
ンジュゲートされた４−（４−ヒドロキシ−３，５−シ
ョートフェノキノ）−３，５−ショート安息香酸または
４−（４−ヒトロキン〜３−ヨードフェノキシｌ−３，
５−ショート安は香酸がある。・ 大抵の場合、この発明のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈコンジュゲ
ートは下式 ３式中、 ｍおよびＺは前記の意味、 α４は水素またはヨウ素、および Ａは酸素またはイミンである ］ を有する。
酸素、窒素および硫黄からなる群から選ばれた１〜５個
の原子を有する置換基である］を育する。このような化
合物の例を挙げると、アミド結合によりＧ６ＰＤＨにコ
ンジュゲートされた４−（４−ヒドロキシ−３，５−シ
ョートフェノキノ）−３，５−ショート安息香酸または
４−（４−ヒトロキン〜３−ヨードフェノキシｌ−３，
５−ショート安は香酸がある。・ 大抵の場合、この発明のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈコンジュゲ
ートは下式 ３式中、 ｍおよびＺは前記の意味、 α４は水素またはヨウ素、および Ａは酸素またはイミンである ］ を有する。
大抵の場合、Ｇ６ＰＤＨとの結合基はアミド（その窒素
類似体すなわちアミジンを含む）またはスルホンアミド
、通常アミドであり、リジンから得られるアミノ基また
は末端アミノ基由来のものである。
類似体すなわちアミジンを含む）またはスルホンアミド
、通常アミドであり、リジンから得られるアミノ基また
は末端アミノ基由来のものである。
この発明のＰＩＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートは、酵素
イムノアッセイで用いられる場合これと非常に近い関係
の（鎖長の）長い結合基を有するポリヨードチロニン０
６ＰＤＨコンツユゲートに勝る利点を有することがわか
った。例えば、この発明のコンジュゲートは本来の酵素
活性の実質的な部分、約５０〜６０％を保有する。保有
された酵素活性はポリヨードチロニンに対する抗体のコ
ンジュゲートとの結合特約４０〜６０％阻害され得る。
イムノアッセイで用いられる場合これと非常に近い関係
の（鎖長の）長い結合基を有するポリヨードチロニン０
６ＰＤＨコンツユゲートに勝る利点を有することがわか
った。例えば、この発明のコンジュゲートは本来の酵素
活性の実質的な部分、約５０〜６０％を保有する。保有
された酵素活性はポリヨードチロニンに対する抗体のコ
ンジュゲートとの結合特約４０〜６０％阻害され得る。
大抵の場合この発明のコンジュゲートを用いるアッセイ
で検出され得るポリヨードチロニンアナライト（ａｎａ
ｌｙｔｅｓ分析質）は下式（式中、α２およびα４は共
にヨウ素であるかまたは一方がヨウ素で他方が水素であ
り得る）を有する。
で検出され得るポリヨードチロニンアナライト（ａｎａ
ｌｙｔｅｓ分析質）は下式（式中、α２およびα４は共
にヨウ素であるかまたは一方がヨウ素で他方が水素であ
り得る）を有する。
このようなアナライトの例としては〇−（４〜ヒドロキ
シ−３，５−ショートフェニル）−３，５〜シヨートチ
ロシンおよび０−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフェニ
ル）−３，５−ショートチロシンがある。
シ−３，５−ショートフェニル）−３，５〜シヨートチ
ロシンおよび０−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフェニ
ル）−３，５−ショートチロシンがある。
ＰＴＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートは、広範な種類のイ
ムノアッセイ、すなわち分離段階を用いる（ヘテロジニ
アスアッセイ）かまたは分離段階を用いない（ポモジニ
アスアッセイ）に使用され得ろ。
ムノアッセイ、すなわち分離段階を用いる（ヘテロジニ
アスアッセイ）かまたは分離段階を用いない（ポモジニ
アスアッセイ）に使用され得ろ。
これらのタイプのアッセイは文献に広範に記載されてい
る。例えばマジオ著「エンザイムーイムノアッセイＪ（
Ｅｎｚｙｍｅ −１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、シー６ア
ール・シー・プレス、インコーホレイテッド、ポカ・レ
イトン、フロリダ、１９８０年、米国特許第３８１７８
３７および３９３５０７４号（これらの内容を引用して
説明の一部とする）参照（ここで列挙したもので完全に
網羅した訳ではない）。
る。例えばマジオ著「エンザイムーイムノアッセイＪ（
Ｅｎｚｙｍｅ −１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、シー６ア
ール・シー・プレス、インコーホレイテッド、ポカ・レ
イトン、フロリダ、１９８０年、米国特許第３８１７８
３７および３９３５０７４号（これらの内容を引用して
説明の一部とする）参照（ここで列挙したもので完全に
網羅した訳ではない）。
アッセイは少なくとも２種の異なる方法で行なわれ得る
。具体的な説明をするためにチロキシンを例にあげる。
。具体的な説明をするためにチロキシンを例にあげる。
ヘテロジニアス法の場合、ＰＩＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュ
ゲート、試料および抗チロキシン抗体を適当な緩衝媒質
中で合わせ、混合物を充分な時間インキュベートし、好
便な手段で抗体に結合した酵素コンジュゲートを結合し
ていない酵素コンジュゲートと分離する。例えば、抗チ
ロキシンに対する抗体を用いると、アッセイ媒質から酵
素コンジュゲートと・抗チロキシン複合体の完全な分離
が容易となる。次いでアッセイ媒質中の残存するＰＩＡ
−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートの酵素活性を測定すること
ができる。。
ゲート、試料および抗チロキシン抗体を適当な緩衝媒質
中で合わせ、混合物を充分な時間インキュベートし、好
便な手段で抗体に結合した酵素コンジュゲートを結合し
ていない酵素コンジュゲートと分離する。例えば、抗チ
ロキシンに対する抗体を用いると、アッセイ媒質から酵
素コンジュゲートと・抗チロキシン複合体の完全な分離
が容易となる。次いでアッセイ媒質中の残存するＰＩＡ
−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートの酵素活性を測定すること
ができる。。
ホモジニアス法の場合、ＰＩＡ−０６ＰＤ）（コンツユ
ゲート、抗チロキシン抗体および試料を合わせたものを
充分な時間インキュベートする。溶液の酵素活性を分離
せずに測定する。
ゲート、抗チロキシン抗体および試料を合わせたものを
充分な時間インキュベートする。溶液の酵素活性を分離
せずに測定する。
試料中のチロキシンの量は、アッセイの結果と既知の標
準値を比較することにより測定する。例えば、既知量の
チロキシンを有する試料を製造し、アッセイを行い、酵
素活性を測定する。次いて酵素活性をチロキシン濃度に
対するグラフに表わし、このグラフを用いて未知のチロ
キシンの量を測定する。
準値を比較することにより測定する。例えば、既知量の
チロキシンを有する試料を製造し、アッセイを行い、酵
素活性を測定する。次いて酵素活性をチロキシン濃度に
対するグラフに表わし、このグラフを用いて未知のチロ
キシンの量を測定する。
アッセイの条件は用いられた特定の方法により異なる。
ホモジニアス技術を用いろ場合、受容体による結合時の
酵素コンジュゲートの活性における変化を最適化するよ
うに条件を選択する。通常、ＰＨ値は約５．５〜１０の
範囲、普通的７〜９゜５の範囲であり、この範囲で受容
体およびチロキシン間の強い結合が起こる。温度は緩和
な温度、通常的０°〜４５°の範囲であり、さらに一般
的には約２０°〜４０°の範囲である。
酵素コンジュゲートの活性における変化を最適化するよ
うに条件を選択する。通常、ＰＨ値は約５．５〜１０の
範囲、普通的７〜９゜５の範囲であり、この範囲で受容
体およびチロキシン間の強い結合が起こる。温度は緩和
な温度、通常的０°〜４５°の範囲であり、さらに一般
的には約２０°〜４０°の範囲である。
使用する緩衝液は普通アッセイ媒質に、約０゜００１〜
．０５Ｍの濃度、通常的０．０１〜０２Ｍの濃度をもた
らす濃度である。酵素を安定化するために蛋白質を含有
させることが多い。蛋白質はアルブミン、例えばウサギ
血清アルブミン、および／またはゼラチンであり得、一
般に最終的なアッセイ混合物巾約０．００５〜０．５重
量パーセント、さらに一般的には約０．Ｏ１〜０．２重
量パーセントで存在する。望ましいと判明した他の添加
物、例えばグリセロール、チメロサール（Ｔ ｈｉｍｅ
ｒｏｓａｌ） 、アジ化ナトリウム等ら存在し得る。
．０５Ｍの濃度、通常的０．０１〜０２Ｍの濃度をもた
らす濃度である。酵素を安定化するために蛋白質を含有
させることが多い。蛋白質はアルブミン、例えばウサギ
血清アルブミン、および／またはゼラチンであり得、一
般に最終的なアッセイ混合物巾約０．００５〜０．５重
量パーセント、さらに一般的には約０．Ｏ１〜０．２重
量パーセントで存在する。望ましいと判明した他の添加
物、例えばグリセロール、チメロサール（Ｔ ｈｉｍｅ
ｒｏｓａｌ） 、アジ化ナトリウム等ら存在し得る。
Ｐ Ｉ Ａ−Ｇ ６ ＰＤＨコンジュゲートの濃度は、
興味の対象であるポリヨードチロニンの濃度により大き
く異なる。普通、ＰＩＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート濃
度は約１Ｏ−５〜１０−”Ｍ、さらに一般的には約ｌ０
−７〜ＩＯ−ＩＩＭである。コンジュゲートしたポリヨ
ードチロニンの濃度に対する結合部位の比率は一般に少
なくとも約０．５ないし１０００未満、通常的１−１０
０である。
興味の対象であるポリヨードチロニンの濃度により大き
く異なる。普通、ＰＩＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート濃
度は約１Ｏ−５〜１０−”Ｍ、さらに一般的には約ｌ０
−７〜ＩＯ−ＩＩＭである。コンジュゲートしたポリヨ
ードチロニンの濃度に対する結合部位の比率は一般に少
なくとも約０．５ないし１０００未満、通常的１−１０
０である。
試薬を加える順序は厳密なものではない。しかしながら
、試料を加える前にＰＩ Ａ−０６ＰＤ）（コンジュゲ
ートおよび受容体を合わせない方が好ましい。加える順
序は好ましくは試料および抗体、次に酵素コンツユゲー
トである。都合により特定の酵素基質を加えることもで
きる。各々の段階後、アッセイ混合物をインキュベート
し得る。通常、インキュベーション期間は約ｌＯ秒〜１
時間である。
、試料を加える前にＰＩ Ａ−０６ＰＤ）（コンジュゲ
ートおよび受容体を合わせない方が好ましい。加える順
序は好ましくは試料および抗体、次に酵素コンツユゲー
トである。都合により特定の酵素基質を加えることもで
きる。各々の段階後、アッセイ混合物をインキュベート
し得る。通常、インキュベーション期間は約ｌＯ秒〜１
時間である。
酵素活性測定は、約５秒〜６０分間、一般的には約０．
２５〜３０分間行なわれ得る。２分未満、好ましくは１
分未満の急速な測定がこの発明の有用な具体例である。
２５〜３０分間行なわれ得る。２分未満、好ましくは１
分未満の急速な測定がこの発明の有用な具体例である。
大部分の場合、分光測光技術が用いられる。しかしなが
ら、他の技術としては蛍光測定法、滴定法等も挙げられ
る。
ら、他の技術としては蛍光測定法、滴定法等も挙げられ
る。
ＰＩＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートは文献に記載された
ものと同様の技術により製造され得ろ。
ものと同様の技術により製造され得ろ。
例えば、酵素と低分子量化合物のコンジュゲーションは
米国特許第４０４０９０７号に記載されており、この内
容を引用して説明の一部とする。例えば、ＰＩＡの非オ
キソカルボニル基、例えばカルボキシ基を、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドによるエステル形成によりＧ６ＦＤ
Ｈのアミン基との反応に対し活性化することができる。
米国特許第４０４０９０７号に記載されており、この内
容を引用して説明の一部とする。例えば、ＰＩＡの非オ
キソカルボニル基、例えばカルボキシ基を、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドによるエステル形成によりＧ６ＦＤ
Ｈのアミン基との反応に対し活性化することができる。
ＰＩＡは公知化合物である。
以下、実施例をあげて説明するが、これらに限定する訳
ではない。
ではない。
［実施例］
（特記しない限り、温度はすべて摂氏である。特記しな
い限り、パーセントとあろはすべて重量パーセントであ
る。） 実施例１ Ｇ６ＰＤＨと４−（４−ヒドロキシ−３，５−ショート
フェノキシ）−３，５−ショート安息香酸（ＨＤＤＡ）
のコンジュゲーション。
い限り、パーセントとあろはすべて重量パーセントであ
る。） 実施例１ Ｇ６ＰＤＨと４−（４−ヒドロキシ−３，５−ショート
フェノキシ）−３，５−ショート安息香酸（ＨＤＤＡ）
のコンジュゲーション。
ＨＤＤＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ９）エ
ステルを常法により製造した（米国特許第４０４０９０
７号参照）。ジシクロへキシルカルボジイミド（３２！
９）（Ｄ ＣＣ）、ＨＤＤＡ（１００ｍ９）およびＮＨ
Ｓ（１７，４ｍ９）を溶媒として１ｍ１２のテトラヒド
ロフラン（ＴＨＦ）中で合わせた。
ステルを常法により製造した（米国特許第４０４０９０
７号参照）。ジシクロへキシルカルボジイミド（３２！
９）（Ｄ ＣＣ）、ＨＤＤＡ（１００ｍ９）およびＮＨ
Ｓ（１７，４ｍ９）を溶媒として１ｍ１２のテトラヒド
ロフラン（ＴＨＦ）中で合わせた。
ノンクロヘキンル尿素（Ｄ ＣＵ）の白色不溶性沈澱の
形成で示されるように室温で容易にエステルが生成した
。反応を室温で一夜そのまま持続させた。
形成で示されるように室温で容易にエステルが生成した
。反応を室温で一夜そのまま持続させた。
ＤＣＵ沈澱を濾過により除去すると、澄明なエステル濾
液は微黄色をしていた。Ｔ Ｉ−Ｉ Ｆを回転濃縮によ
り除去した。乾燥エステルを乾燥ＤＭＦに溶かし、再濾
過して次のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈとのコンジュゲーシヨン
に備えた。
液は微黄色をしていた。Ｔ Ｉ−Ｉ Ｆを回転濃縮によ
り除去した。乾燥エステルを乾燥ＤＭＦに溶かし、再濾
過して次のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈとのコンジュゲーシヨン
に備えた。
天然Ｇ６ＰＤ）ｌを４℃で一夜ｐＨ８，５の０゜０５Ｍ
燐酸緩衝液を３回かえて透析した（保存剤なし）。用い
た酵素の濃度は４〜θπ９／ｍ１２であった。次いでＤ
ＭＦを酵素溶液に２０％（ｖ／ｖ）の割合となるまでゆ
っくりと加えた。コンジュゲーシヨン中ｐＨを９に維持
した。
燐酸緩衝液を３回かえて透析した（保存剤なし）。用い
た酵素の濃度は４〜θπ９／ｍ１２であった。次いでＤ
ＭＦを酵素溶液に２０％（ｖ／ｖ）の割合となるまでゆ
っくりと加えた。コンジュゲーシヨン中ｐＨを９に維持
した。
ＨＤ Ｄ ＡのＮ ＨＳエステルを少量のアリコートで
スポイトにより、ゆっくりと加えた。少量のアリコート
の酵素を各々ハプテン添加後採取して非活性度％および
阻害％を求めた。非活性度は６０％より大きくあるべき
てない。
スポイトにより、ゆっくりと加えた。少量のアリコート
の酵素を各々ハプテン添加後採取して非活性度％および
阻害％を求めた。非活性度は６０％より大きくあるべき
てない。
１％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ） −２０を含む塩基性緩
衝液（５５ｍＭ）リス、ＭａＮ３およびチメロサールを
含む）で平衡状態にしたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ ）Ｇ−１００カラム上ＨＤＤＡ−Ｇ６ＰＤＨコン
ジュゲートをクロマトグラフィーにかけた。活性を有す
るフラクションをプールし、０゜４５μミリボア（ＭＮ
Ｉｉｐｏｒｅ）フィルターを用いて沈澱をすべて濾去し
た。）ＩＤＤＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートはコンジュ
ゲートしていない酵素の場合の５０％の酵素活性を示し
た。平均して６６ＰＤＨの各分子は６〜１０のＨＤＤＡ
単位を含んでいた。
衝液（５５ｍＭ）リス、ＭａＮ３およびチメロサールを
含む）で平衡状態にしたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ ）Ｇ−１００カラム上ＨＤＤＡ−Ｇ６ＰＤＨコン
ジュゲートをクロマトグラフィーにかけた。活性を有す
るフラクションをプールし、０゜４５μミリボア（ＭＮ
Ｉｉｐｏｒｅ）フィルターを用いて沈澱をすべて濾去し
た。）ＩＤＤＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートはコンジュ
ゲートしていない酵素の場合の５０％の酵素活性を示し
た。平均して６６ＰＤＨの各分子は６〜１０のＨＤＤＡ
単位を含んでいた。
Ｔ４−ＢＡＳ免疫源を用いてヒツジにおいて抗Ｔ４抗体
を製造した。
を製造した。
実施例２
アッセイ
アッセイプロトコル
使用した試薬の処方を次に列挙する。
前処理した試料・・・米国特許第４１２１９７５号記載
の手順にしたがい、 ０．２５Ｍ ＮａＯＨ ０２５％ α−シクロデキストリン ００２５％サリチル酸 により前処理した血清試料 アッセイ緩衝液 ２００ｍＭ トリス塩基 ０．０１％ Ｎ ａ Ｎ ３ ｏ、ｏｏｉ％ チメロサール ｐＨ８，５ 抗体試薬（試薬Ａ） ２００ ｔｔｇ／ｍＱプールしたヒツジ抗Ｔ、（ＮＨ。
の手順にしたがい、 ０．２５Ｍ ＮａＯＨ ０２５％ α−シクロデキストリン ００２５％サリチル酸 により前処理した血清試料 アッセイ緩衝液 ２００ｍＭ トリス塩基 ０．０１％ Ｎ ａ Ｎ ３ ｏ、ｏｏｉ％ チメロサール ｐＨ８，５ 抗体試薬（試薬Ａ） ２００ ｔｔｇ／ｍＱプールしたヒツジ抗Ｔ、（ＮＨ。
）、ＳＯ，精製血清
３００ｍＭ グルコース−６−リン酸・１１ナトリ
ウム ３００ｍＭ ＮＡＤ” １．０％ ＢＳＡ ２００ｍＭ トリス塩基 ００５％ Ｎ ａ Ｎ ＋１ ０．００５％ チメロサール ｐＨ５，５ 酵素試薬（試薬Ｂ） ２〜８μ／ｍＱ ＨＤＤＡ−Ｇ６ＰＤＩ（ｌンジュゲー
ト １％ ＢＳＡ ０．９％ ＮａＣＱ ５５ＩＩＩＭトリス塩基 ０．０５％ Ｎ ａ Ｎ ｚ ０．００５％ チメロサール ｐＨ８，０ 既知量のチロキシンを２０．４０．８０．１２０および
２０ Ｏｒ＋ｇ／ｌｎＱの濃度でチロキシン不含有ひと
血清に溶かすことにより測定液を製造した。
ウム ３００ｍＭ ＮＡＤ” １．０％ ＢＳＡ ２００ｍＭ トリス塩基 ００５％ Ｎ ａ Ｎ ＋１ ０．００５％ チメロサール ｐＨ５，５ 酵素試薬（試薬Ｂ） ２〜８μ／ｍＱ ＨＤＤＡ−Ｇ６ＰＤＩ（ｌンジュゲー
ト １％ ＢＳＡ ０．９％ ＮａＣＱ ５５ＩＩＩＭトリス塩基 ０．０５％ Ｎ ａ Ｎ ｚ ０．００５％ チメロサール ｐＨ８，０ 既知量のチロキシンを２０．４０．８０．１２０および
２０ Ｏｒ＋ｇ／ｌｎＱの濃度でチロキシン不含有ひと
血清に溶かすことにより測定液を製造した。
アッセイの段階的試験プロトコルは下記のとおりであっ
た。
た。
１、ビーカーＮｏ、１中１．４０μｉ２測定液 ＋１０
０μσ前処理した試料。
０μσ前処理した試料。
２、ビーカーＮｏ、１中、５０μ１２試薬Ａ ＋３００
μＱアツセイ緩衝液。
μＱアツセイ緩衝液。
３、ビーカーＮｏ、１中、５０μρ試薬Ｂ＋３００μａ
アヅセイ緩衝液 ４、フローセルに吸引、ステイサー（Ｓ ｔａｓａｒ）
■分光光度計で測定 ３７℃ ４０ｎｍ １０秒遅延 ３０秒読み取り時間 結果は次のようになった。
アヅセイ緩衝液 ４、フローセルに吸引、ステイサー（Ｓ ｔａｓａｒ）
■分光光度計で測定 ３７℃ ４０ｎｍ １０秒遅延 ３０秒読み取り時間 結果は次のようになった。
平均＝６．７５μｇ／ｄｃ
標準偏差−０，２７μｇ／ｄσ
ＣＶ％＝４．０７％
Ｎ ＝ １６
実施例３
Ｇ６ＰＤＨと４（４−ヒドロキシ−３−ヨードフェノキ
ン）−３、５−ショート安息香酸（ＨＩ ＤＡ）のコン
ジュゲーンヨン。
ン）−３、５−ショート安息香酸（ＨＩ ＤＡ）のコン
ジュゲーンヨン。
ＨＤＤＡのＮＨＳエステルの製造に関し実施例１で既述
したものと同様の手順にしたがいＨＩＤＡのＮ ＨＳエ
ステルの製造を行なった。生成したエステル誘導体を２
０％ヘキサン−〇 ８２ Ｃ（ｂ溶離セルロースカラム
に通過させることにより精製した。
したものと同様の手順にしたがいＨＩＤＡのＮ ＨＳエ
ステルの製造を行なった。生成したエステル誘導体を２
０％ヘキサン−〇 ８２ Ｃ（ｂ溶離セルロースカラム
に通過させることにより精製した。
コンノユゲーション中２５％カルピトール（Ｃａｒｂｉ
ｔｏｌ）を使用したこと以外は前記と同様の手順により
°Ｇ６ＰＤＨ酵素とのコンジュゲーシヨンを行なった。
ｔｏｌ）を使用したこと以外は前記と同様の手順により
°Ｇ６ＰＤＨ酵素とのコンジュゲーシヨンを行なった。
ＨＩＤＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートの精製は、０．０
５５Ｍトリス緩衝液溶離セファデックスＧ−５０カラム
に通して行なった。活性を有するフラクションをプール
した。ＨＩ ＤＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートはコンジ
ュゲートしていない酵素の場合の約４０％の酵素活性を
示した。
５５Ｍトリス緩衝液溶離セファデックスＧ−５０カラム
に通して行なった。活性を有するフラクションをプール
した。ＨＩ ＤＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートはコンジ
ュゲートしていない酵素の場合の約４０％の酵素活性を
示した。
Ｔ、−ＢＳＡ免疫源を用いて抗Ｔ、３抗体をヒツジにお
いて製造した。
いて製造した。
実施例４
アッセイ
アッセイプロトコル
用いた試薬の処方を以下に列挙する。
アッセイ緩衝液
０．０５５Ｍ）リス塩基
０、０５％ Ｎ ａ Ｎ ３
ｐＨ８，０
試薬Ａ
ヒツジ抗Ｔ３ （ＮＨｊ２ＳＯ４精製血清〜２００μｇ
／ｍＱ。
／ｍＱ。
０．０５５Ｍ トリス
０．０５％ Ｎ ａ Ｎ ３
０．１３２Ｍ Ｇ６Ｐ
０．０８Ｍ ＮＡＤ“
ｐ）１５
試薬Ｂ
ＨＩＤＡ ０６ＰＤＨコンジユゲ一ト〜２〜８μｇ／
ｍ（！ ０．０５５Ｍ トリス塩基 ０．０５％ Ｎ ａ Ｎ ３ ０．０３２Ｍ Ｇ６Ｐ ０．２％ ゼラチン、タイプＡ ｐＨ６，２ Ｔｊ測定液 ０．２５．５０．７５、＋００．２００ ｎｇ／ｍｆ２
Ｔ３．０．０５Ｎ ＮａＯＨ中または４００ ｎｇ／
ｍｆｆ Ｔ、 、血清中。
ｍ（！ ０．０５５Ｍ トリス塩基 ０．０５％ Ｎ ａ Ｎ ３ ０．０３２Ｍ Ｇ６Ｐ ０．２％ ゼラチン、タイプＡ ｐＨ６，２ Ｔｊ測定液 ０．２５．５０．７５、＋００．２００ ｎｇ／ｍｆ２
Ｔ３．０．０５Ｎ ＮａＯＨ中または４００ ｎｇ／
ｍｆｆ Ｔ、 、血清中。
アッセイの試験プロトコルは次のとおりであった。
１、キュベツトＮｏ、ｌ中に１０μＱのＴ３測定液およ
び１００μＱのアッセイ緩衝液をピペットで採取。
び１００μＱのアッセイ緩衝液をピペットで採取。
２．２５℃で５分インキュベーション。
３、キュベツトＮｏ、１中に５０μＱの酵素作業試薬（
２５μＱ試薬Ｂ＋２５μＱアツセイ緩衝液）をピペット
で採取。
２５μＱ試薬Ｂ＋２５μＱアツセイ緩衝液）をピペット
で採取。
４．３７℃で９秒インキュベーション。
５、キュベツトＮｏ、ｌ中に２５μρの試薬Ａおよび２
５０μＱのアッセイ緩衝液をピペットで採取。
５０μＱのアッセイ緩衝液をピペットで採取。
６．３４０／３８０ｎｍフィルターを用いて５分の反応
時間にＡＢＡ−１００分光側光分析器（アボット社製
）をセット。
時間にＡＢＡ−１００分光側光分析器（アボット社製
）をセット。
このアッセイは検定範囲を通じて（０〜２００ｎｇ／ｍ
１２ Ｔ３）Ｏ、ｌ ６６光学密度のアッセイ応答を
もたらす。
１２ Ｔ３）Ｏ、ｌ ６６光学密度のアッセイ応答を
もたらす。
前記実施例の結果が示すところによると、この発明のＰ
ＩＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートを用いる方法によって
非常に低濃度および非常に少量のポリヨードチロニン、
例えばチロキシンを検出できることがわかる。この方法
は手をわずられす工程がほとんどない全く簡単なもので
ある。試薬を緩衝媒質中で合わせ、場合により混合物を
インキュベートし、次いで酵素基質を加えることにより
、短時間分光光度計の読み取りをすればポリヨードチロ
ニンアナライトを測定することができろ。このノステム
はオートメーションが可能であるから試料および試薬を
自動的に混合し、読み取りをすることができろ。ＰＩＡ
−０６ＰＤＨコンジユゲートは、これと非常に近い関係
があり鎖長が１原子よりも長い、酵素およびポリョード
チロエン間の結合基を有する化合物よりも優れた利点を
示す。
ＩＡ−Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートを用いる方法によって
非常に低濃度および非常に少量のポリヨードチロニン、
例えばチロキシンを検出できることがわかる。この方法
は手をわずられす工程がほとんどない全く簡単なもので
ある。試薬を緩衝媒質中で合わせ、場合により混合物を
インキュベートし、次いで酵素基質を加えることにより
、短時間分光光度計の読み取りをすればポリヨードチロ
ニンアナライトを測定することができろ。このノステム
はオートメーションが可能であるから試料および試薬を
自動的に混合し、読み取りをすることができろ。ＰＩＡ
−０６ＰＤＨコンジユゲートは、これと非常に近い関係
があり鎖長が１原子よりも長い、酵素およびポリョード
チロエン間の結合基を有する化合物よりも優れた利点を
示す。
前記アッセイでこのような鎖長の長い結合基を有する化
合物を用いても意義のある結果は得られなかっｆこ。
合物を用いても意義のある結果は得られなかっｆこ。
前記発明について明確に理解できるように例示および実
施例を用いである程度詳しく記載したが、ある程度の変
化および修正を特許請求の範囲内で行ない得ることは明
らかである。
施例を用いである程度詳しく記載したが、ある程度の変
化および修正を特許請求の範囲内で行ない得ることは明
らかである。
特許出願人 シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド
ーホレイテッド
Claims (11)
- （１）鎖長が１原子の結合基によりグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼにコンジュゲートしたポリヨード
チロニン類似体である化合物。 - （２）結合基が非オキソカルボニル基である、特許請求
の範囲第１項記載の化合物。 - （３）式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、 Ｚは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであり
、 α＾１〜α＾４は、ヨウ素、臭素、ｔ−ブチルおよび水
素からなる群から選ばれ（ただし、水素でありうるαは
１個だけである）、 Ｗは、炭素または硫黄であり、そして Ｘは、Ｗが硫黄のときには酸素であり、Ｗが炭素のとき
にはＹと一緒になって炭素、酸素、窒素または硫黄との
二重結合を形成するか、または水素であり、 Ｙは、Ｗが硫黄のときには酸素であり、またはＹは炭素
、酸素、窒素および硫黄からなる 群から選ばれた原子１〜５個を有する置換基であり、そ
して ｍは、１〜１６の数である］ で示される化合物。 - （４）Ｗが炭素である、特許請求の範囲第３項記載の化
合物。 - （５）ＸがＹと一緒になってオキソを形成する、特許請
求の範囲第３項記載の化合物。 - （６）α＾１〜α＾４がヨウ素および水素からなる群か
ら選ばれたものである、特許請求の範囲第３項記載の化
合物。 - （７）α＾１〜α＾４がヨウ素である、特許請求の範囲
第３項記載の化合物。 - （８）式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ［式中、 α＾４はヨウ素または水素、 Ｚはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ｍは２
〜１２の数、および Ａ酸素またはイミン（ＮＨ）である］ される化合物。 - （９）α＾４がヨウ素およびＡが酸素である、特許請求
の範囲第８項記載の化合物。 - （１０）ポリヨードチロニンを含む疑のある試料中にお
けるポリヨードチロニンの存在または量の検出方法であ
って、 水性媒質中で試料、特許請求の範囲第１〜９項のいずれ
か１項記載の化合物、ポリヨードチロニンに対して特異
的な抗体および上記検出を行なう上で必要な他の試薬が
あればこれを合わせ、上記媒質の酸素活性を測定するこ
とからなる方法。 - （１１）ポリヨードチロニン類似体およびグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼをコンジュゲートすること
からなる、特許請求の範囲第１項記載の化合物の製造方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73973285A | 1985-05-31 | 1985-05-31 | |
| US739732 | 1985-05-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6236186A true JPS6236186A (ja) | 1987-02-17 |
| JP2534989B2 JP2534989B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61127110A Expired - Fee Related JP2534989B2 (ja) | 1985-05-31 | 1986-05-30 | ポリヨ−ドチロニンアツセイに有用なグルコ−ス−６−リン酸デヒドロゲナ−ゼコンジユゲ−ト |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0204523B1 (ja) |
| JP (1) | JP2534989B2 (ja) |
| AT (1) | ATE72831T1 (ja) |
| CA (1) | CA1282024C (ja) |
| DE (1) | DE3683953D1 (ja) |
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| CA2283597C (en) | 1998-10-02 | 2008-02-05 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Reduced cortisol conjugates |
| WO2001036351A2 (en) | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists related applications |
| US6638977B1 (en) * | 1999-11-19 | 2003-10-28 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists |
| GR1004119B (en) * | 2000-07-26 | 2003-01-23 | Αυτοματοι Αναλυτες Και Διαγνωστικα Αντιδραστηρια Medicon Hellas Α.Ε. | DEVELOPMENT OF A NEW HOMOGENEOUS IMMUNOENZYMIC METHOD FOR THE PRODUCTION OF A CLINICAL LABORATORY TEST SYSTEM (kit) FOR THE QUANTIFICATION OF THYROXINE AND TRIIODOTHYRONINE IN HUMAN SERUM, UTILIZINGPOLYIODOTHYRONINE CONJUGATED WITH GLYCOGEN PHOSPHO.... |
| US7153666B2 (en) * | 2003-07-17 | 2006-12-26 | General Atomics | Methods and compositions for determination of glycated proteins |
| US7022492B2 (en) * | 2003-12-15 | 2006-04-04 | Dade Behring Inc. | Ecstasy haptens and immunogens |
| US20050130243A1 (en) * | 2003-12-15 | 2005-06-16 | Zheng Yi F. | Assay for entactogens |
| US6991911B2 (en) * | 2003-12-15 | 2006-01-31 | Dade Behring Inc. | Assay for entactogens |
| US7115383B2 (en) * | 2004-03-22 | 2006-10-03 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine |
| US7037669B2 (en) * | 2004-03-22 | 2006-05-02 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine using stereospecific reagents |
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| EP2283149A1 (en) * | 2008-05-13 | 2011-02-16 | General Atomics | Electrochemical biosensor for direct determination of percentage of glycated hemoglobin |
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|---|---|---|---|---|
| US4040907A (en) * | 1974-06-20 | 1977-08-09 | Syva Company | Iodothyronine enzyme conjugates |
| US4171244A (en) * | 1975-02-20 | 1979-10-16 | Syva Company | Enzyme-bound-polyidothyronine |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4039385A (en) * | 1972-05-08 | 1977-08-02 | Syva Company | Cardiac glycoside enzyme conjugates |
| US3875011A (en) * | 1972-11-06 | 1975-04-01 | Syva Co | Enzyme immunoassays with glucose-6-phosphate dehydrogenase |
| US4043872A (en) * | 1975-02-20 | 1977-08-23 | Syva Company | Polyiodothyronine immunoassay |
| US4376825A (en) * | 1979-05-07 | 1983-03-15 | Syva Company | Enzyme amplification compounds for assays for androgens |
| US4410633A (en) * | 1980-09-25 | 1983-10-18 | Corning Glass Works | Method for the measurement of free thyroxine or 3,5,3'-triiodothyronine in a liquid sample |
-
1986
- 1986-05-30 AT AT86304125T patent/ATE72831T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1986-05-30 EP EP86304125A patent/EP0204523B1/en not_active Expired
- 1986-05-30 JP JP61127110A patent/JP2534989B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-30 CA CA000510483A patent/CA1282024C/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-11-24 US US07/125,805 patent/US4847195A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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|---|---|
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| ATE72831T1 (de) | 1992-03-15 |
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| DE3683953D1 (de) | 1992-04-02 |
| US4847195A (en) | 1989-07-11 |
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