JPS6236325A - リユ−マチ性関節炎のような自已免疫疾患の抑制因子による治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 公貝旦１λ 哺乳動物免疫系は器官、細胞及び細胞の可溶性生産物の
複雑な配列を包含する。免＃ｉ系に関わる器官は骨髄、
膵臓及びリンパ節を包含する。広く異なる細胞が免疫系
中に存在し、それは大食細胞、顆粒球及びＴ並びに８９
７８球を包含する。免疫系細胞の生産する可溶性産物の
例は抗体（８９７８球が生産する）及びりン７オカイン
（′Ｉ゛−リンパ球が生産）を包含する。後者は免＃ｉ
系の制御において重要な役割を果す。

免疫系の基本的な機能は以下のことを包含する： ａ）体内の物質又は細胞が、“自己のものである”か又
は“自己のものではない”かを決定するための識別。

ｂ）′自のものではない存在物への応答を容易にするた
めの細胞間の連絡。

Ｃ）　“自のものではない物質又は細胞に対する特異的
作用。

免疫系は、感染有機体の撲滅及び組織の機能不全である
と考えられる自己免疫反応を包含する顕示に対して感応
する。ここに、種々の理由により及び年令、個人の遺伝
的構成、ウィルス、胸腺欠陥及びホルモンを包含する種
々の因子を考慮すると、哺乳動物体は、重症筋無力症、
自己免疫性溶血性貧血症及びリューマチ性関節炎を包含
する自己免疫性疾患をもたらす、それ自体の部分に対す
る抗体を生産することがある。

リューマチ性関節炎の内科的治療は、ステロイド、非ス
テロイド抗炎症剤、含塩及び免疫抑制剤として分類する
ことかでさる薬剤の投与から成っている。しかしながら
、変性関節炎、高副腎皮質症、及ブ下垂体−副腎軸の分
裂を包含する、長期ｆ史用に伴なう重大な副作用をかん
がみて、フルチフステロイドは使用に注意を要する。た
とえば、アスピリン、７エ７プロ７エン、イブプロフェ
ン及ブトルメチンのような非ステロイド系抗炎症剤は、
高い投与量による副作用、たとえば耳鳴り、胃の不調及
び血小板粘着性の低下に酎えることを条件として、長期
間の治療において有用である。

含塩は皮膚炎及び形成不全性バ血を包含する毒性ｂｓ１
作用の高い発生率を伴なう。リューマチ性関節炎の劇的
な改善は、たとえばタロラムブシル、シクロホス７アミ
ド、メルカプトプリン及びアザチオプリンのような免疫
抑制剤において認められている。しかしながら、このよ
うな薬剤は着るしい毒性を伴ない、催許性であるおそれ
があり且つリンパ腫及び感染の増大を生じさせるおそれ
がある。

これＣ）の理由によって、免疫抑制剤の日常的な使用は
断念されている（たとえば、カリホルニア州ロスアルト
ス、メディカル出版刊のり、Ｐ、スタイテスらの編者“
基礎及び臨床免疫学”中のに、Ｈ。

７アイ及ＶＫ、Ｅ、サックによる゛°リューマチ性疾患
”と題する第２６章参照）。

本発明の目的は、たとえばリューマチ性関節炎のような
自己免疫性疾患にががった、たとえばヒトのような、哺
乳動物に対する免疫抑制治療方法を提供することにある
。本発明の別の目的は、低い副作用を有するのみで、非
自己性抗原、たとえば感染と闘う患者の能力に者るしい
影響を一ダ、えることがないン（３療である。

＾凱卯Ｉ−塊 本発明は、ヒトの急性リンパ芽球白血病細胞系統ＣＥＭ
から誘導することができる因子の投与による、たとえば
リューマチ性関節炎のような自己免疫性疾患の治療のた
めの方法に関するものである。特定の細胞系統はＣＥ　
Ｍ系統を６−チオグアニンと共に培養し且つ生き残る僅
がな割合の細胞、すなわち、６−Ｔ耐性細胞を回収する
ことによって取得する。このようにして生産した培！　
６　ＴＣＥＭ細胞からの本発明に１３いて使用する上澄
因子を“抑制物質活性化因子”すなわち“Ｓ　Ａ　Ｆ″
と名付ける。Ｓ　Ａ　Ｆは抗原物質によって免疫を与え
且つ比較基剤のみによって処理した対照動物と比較して
、ズ差反応抗原物質によって免疫を与えた試験動物にお
ける自己抗体の生産を抑制することが見出された。

本明細書中では下記の略号を使用する：Ａ　Ｉ　）（／
＼＝自己免疫溶血性バ血症Ａ　ＴＣＣ＝アメリカ類型培
ｆｉ物収集ＣＥ　Ｍ　＝　ｌｊンパ芽球白血病細胞系統
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣＣＣＬ　１１９） １）ＡＩ”ｌ’＝直接抗免疫グロブリン試験ＦＣ３＝ウ
シ胎児血清 ａ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ　＝最低必須媒本 Ｎ＝規定度 ＰＢＳ＝燐酸塩緩衝食塩水 ＲＢＣ＝赤血球 ５ＡＦ＝抑制物質活性化囚了− ６−Ｔ＝６−チオグアニン 発明の詳細な説明 本発明の方法は抑制物質活性化因子の投す弓こよる自己
免疫疾患を有する哺乳動物の治療に関するものである。

特に、この方法はヒトの治療に対して適用することがで
きる。自己免疫性は免疫機構が、“非自己”に対してで
はなく“自己”に対して向けられる状態として定義する
ことができる。自己免疫疾患は、ある種の“自己”に向
けた免疫機構の病原的な帰結と定義することができる。

自己免疫性は、いくつかの異なる器官組織に関わる多く
の適用に関連する。さらに、自己免疫疾患は全身的又は
器官特異的に分類することができる。全身的自己免疫患
の例は、グツドパスチャー氏症候群、リューマチ性関ｆ
ｌｒ＋炎、ショーグレン氏症候群及ブ全身的紅斑性狼瘡
を包含゛する。、器官特異的自己免疫病の例は重症筋無
力症、グレージス病（拡散毒性甲状腺Ｉ！ＩＴり、多発
性硬化症、ハシモトの甲状腺炎、スカンＦシス　ニグリ
ヵンス（ｓｃＦＩｎｔｌ＋ｏ！冒・＋ｎｉｇｒｉｃａｎ
ｓ）に伴なうインシュリン耐性糖尿病、運動失調−毛細
血管拡張症に伴なうインシュリン耐性糖尿病、アレルギ
ー性鼻炎喘息、機能性自律異常、若年性インシュリン依
存性喘息、悪性貧血、アジラン病、特発性副甲状腺機能
低下症、自発性不妊病、早期卵巣機能停止症、天庖揄、
水庖性瘍揄、胆硬変症、自己免疫溶血性白血病、特発性
血小板減少性紫斑病及１特発性好中球減少症を包含する
。

本発明の方法は下記に説明するように特にリューマチ性
関節炎及び自己免疫性溶血性白血病に適用することがで
きる。

−［七−１九１乱改炎ニジヨー）　Ｃ＞は、“リューマ
チ性関節炎”、バーバード大学出版、ケンブリッジ、マ
サチューセッツ（１９５７）中で、リューマチ性関節炎
は、全身性のものであって関節に影響を及ぼす仕方によ
って特徴的である病因的に未知の慢性炎症性疾患である
と定義している。細胞及び体液的免疫学的事項の両方が
、その病因を媒介する。

たとえば、リンパ球及び大多数のＴ−細胞がしばしば滑
液組織及び滑液中に認められ、且つ多くの徴候がリュー
マチ性関節炎における疾病活性をもつ変化した１゛−細
胞＋９１能と連結する（ノヤーナルオプ　リューマトロ
ノ−（Ｊ　、　ＲＩ＋ｕｍａｔｏｌ）（１９８４）１−
１，７５４〜９中のＪ、■、パータッチによる“リュー
マチ性関節炎を有する患者の滑、液と血液中のりンバ球
集合と炎症表示”；ランセラ）（Ｌａｎｃｅｔ）（１９
８１）２，８３９−４２中のＧ、ジャノーシーによる“
リューマチ性関節炎二′１゛−リンパ球−大食細胞免疫
調整の疾患”及びジャーナルオプ　リューマトロノー（
１９８２）、５−．３５９〜６５中のＣ，Ｊ、Ｌ、Ｍ、
メーヤーによる“リューマチ性関節炎を有する患者の滑
液膜中のリンパ球集合物のモノクローナル単体によるそ
の場の局在化”などの文献参照）。リューマチ性関節炎
の患者からのＴ　−１ｊンパ球の試験管内特性の変化は
、“関節炎及びリューマチス″（１９８４）、２４−．
１２３４〜４４中でＲ，Ｍ、ホープによって記されてい
るように、変化した細胞の相互作用及び病気の活動度と
関連することが報告されている。

かくして、リューマチ性関節炎におけるＴリンパ球機能
の正常化を目的とする治療は、その処置において十分に
有用である。そのために、多くの広範囲の活性の免疫抑
制剤、たとえばシクロホス７アミド及びペタメタシン、
が、実験的な自己免疫疾患モデルにおいて試験された。

これらの有望な動物実験結果に基づいて、リューマチ性
関節炎を含む多くの自己免疫疾患の治療のための臨床薬
として免疫抑制剤が導入された。しかしながら、それら
の臨床的な効能にかかわらず、これらの薬剤は、それら
の広い非特異的免疫抑制作用の結果として、長期にわた
る投与の間に毒性を生じる傾向があるために、治療薬と
しての有用性が限られている。

１政免反隻胤ｉ叉ム（−：溶血性貧血症は赤血球の溶解
又は破壊を診断上の特徴とする状態である。

原因が認められず且つ付随する病気が認められない後天
性の溶血性貧血のほとんどすべての場合に、自己免疫機
構が問題の根源であると思われる（Ｍ。

Ｍ、ウィントロープ、“クリニカル　ヘマトロジ−（Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ　　ＨｃｍａｔｏｌｏｇｙＬｍＧ版、６
２６　Ｋ。

シー及び７エビが−、フイラデルフイア（１９６７）参
照）。

本発明の方法において用いられる抑制物質活性化因子（
ＳＡＦ）は： ｉ）　リンパ芽球細胞系統ＣＥＭの安定な６−チオグツ
二ン耐性突然変異体が分泌したものであり、 ｉｉ）非ミ）ケン性であり、且つ ｉｉｉ　）　　非細胞毒性である。

さらに詳細には、本発明の方法において用いるＳＡＦは
： ｉｖ）１０″″６の希釈度において少なくとも９０％の
ミ）ケン誘発１′細胞増殖を抑制するが該希釈度におい
てミトゲン誘発Ｂ細胞増殖を抑制せず、Ｖ）たとえば、
約ｔｔｏ、ｏｏｏドルトンの高分子量たんぱく質中に包
含され、 νｉ）生理学的、Ｈにおいて最大の抑制因子活性を表わ
し、 ｖｉｉ）５６℃において不活性化し、 ｖｉｉｉ　）　　それがミトゲン性刺激に対するヒトの
末梢血液リンパ球増殖を抑制する場合と同様な効力をも
ってミトゲン刺激に対するマウスの肺臓細胞増殖を抑制
し、 １λ）　ラット赤血球によって免疫を−５えたマウスに
おける外米抗原（該ラット赤血球）において行なえ）れ
る抗体生産よりも大きな抑制効果を自己抗体生産に対し
て表わす。

Ｓ　Ａ　Ｆは、下記の？Ａ製Ａ　、　Ｂ　、　Ｃ及びＩ
）中において且つ１９８３年５月１８日出願の本発明者
による米国特許願第４９５．９０８号及ゾ１９８３年９
月２１日出願の５３４，５２６号の部分的継続である、
１９８４年３ノ１５日出願の、本発明者の共願中の米国
特許願ｔｐＪ５８６，５１５号中に記されているように
６−チオグアニンによる破壊に対して耐性であるＣ　Ｅ
　Ｍ　’）ンパ芽球白血病細胞系統の細胞によって生産
される上澄液から取得することができる。米国特許願４
９５．９０８及び５３４．５２６号はここに放棄される
。１９８４年１２月５日公告のヨーロッパ特許明細１！
：（Ｅ　Ｐ　Ｏ）第１２７．３９４号は本出願名による
米国特許願第５８６．５１５号の同効物であり、その中
でＳＩ［７又は抑制物質誘発因子と名付けた、ＳＡＦの
調製に対して本明細書中に参考として一入せしめる。

支え。６−チオグアニン（２−７ミノー６−メルカプト
プリン＝６Ｔ）はシグマ（カタログ番号Ａ−４８８２）
から取得した。１００ｍｇの６Ｔを１００１の蒸留水中
に溶解した。１又は２滴の１ＯＮ　　Ｎａ０）Ｉを添加
して６Ｔの完全な溶解を助けた。最終溶液の、）ＩＩは
約−９である。

リンハ芽球白血ＭＪＲａｃＥＭ（ＣＣＲＦ−ＣＴ：）Ｍ
、ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）はメリーランド州、ロックビ
ル、アメリカ類型培養物収集から取得して、９０％のα
−ＭＥＭと１０％のＦＣ３中に保った。ｅ　ｏｌ相（１
０６細胞／ウエル）におけるＣＥＭ細胞を種々の濃度の
６Ｔによって処理し、７日後に第１表に示すように生存
率を分析した。

亀Ｕ ０．５　　　　　　　　　　　　　　　５　１ＣＥＭｍ
胞を種々の濃度の６Ｔに対して７日間暴露したのち、染
料排除によって生存率を分析した。

３０μｓ／ｍｅの６Ｔで処理した細胞を、その後の研究
に対して選択した。残りの生活能力のある細胞を、７ア
イコルーハイペーク　グラジェント２５Ｉ１１２の培１
！７ラスフ中で著るしい数の細胞が認められるまで生長
させたのち、死んだ細胞を７フイコルーハイペーク　グ
ラジェントによって除去した。生存する細胞を２ｇ分に
分けた。１部分を３日毎に加える新しい媒体と共にＱ−
ＭＥＭ＋ＦＣ３中に保ち且つ細胞を１週間毎に継代接種
した。他の部分は、サブクローニングのために９６のウ
ェルをもつミクロタイター板中に入れた。サブクローン
を約２〜３週間生長させ、その後に２４ツエルのりンブ
ロートレイに移した。細胞が１０６／ウエルの密度に達
したときに、それを第２表に示すように７ミノプテリン
感応性とＳＡＦの生産について試験した。

ＣＥＭ　　　　　　　１００　　　　５Ｘ１０−’６１
’−ＣＥＭ　　　　　１０　　　　　　１０−’６Ｔ−
ＣＥＭ２　　　　０　　　　　　１０”４　　　０　　
　　　１０″″６ １３　　　　２　　　　　　＞１０−’１４　　　　４
　　　　　　１０−　’１７　　　　２　　　　　　＞
１０−’１８　　　　０　　　　　　１０−　’１９　
　　　０　　　　　　１０−　’２０　　　　１　　　
　　　１０−’ ＣＥＭ、６Ｔ−ＣＥＭ及びそのサブクローンをアミノプ
テリン処理（０，００５μｇ〜０．５μｇ／１ａｌｌに
対する感応性について試験した。０゜０５μｇのアミノ
プテリンへの７日の暴露後に各細胞系統の生存率を示し
た。

２　Ｔ−細胞増殖物の抑制物質効果を１９８４年１２月
５日公告のＥＰＯ第１２７．３９４号の実施例４に記し
た方法に従って測定した。５０％の抑制を示す種々のＬ
澄液の希釈度を示した。“〉１（１−”″の記載は１０
−６よりも高い希釈度において５０％の抑制が達成され
ることを意味する。

最高の水べ一のＳ　Ａ　Ｆ生産を示したサブクローンの
−・つを、その後の研究のために選択した。系統６　Ｔ
　−ＣＥ　Ｍ　−２（）は３年以上にわたり一定したＳ
　Ａ　Ｆ分泌の水準を示し、因子の分泌において染色体
の損失が伴わないことを指示した。増殖特性、核型、ア
ミノプテリンに対する感応性、抑制物質活性の水準及び
池の免疫学的分析に対する上澄液の効果をＣＥＭ、６Ｔ
−ＣＥＭ、６”ｒ−ＣＥＭ−２０及びＡｚ−ＣＥＭ（７
ザブアニン耐性ＯＥＭ突然変異体）をｆＩｔＪ３表に示
す： ｇ５ぷ（Ｌ 感受性’　　　　　９８１０　　　　２３２倍化時間２
２０　　２４　　　２０　　　２６核型　　　　４５±
１６７２±１２７４±１４７０±１８物質活性　　　＜
　ＩＰ’　　＜　１０−’　　１０−１＜　１０−’性
　　　　　　　　　　　　　　５×　１０−コ　５Ｘ　
　１０−５　　１０−’　　　　　＜　　１０−’ｉ、
　　ｏ、ｏｓμＢ７ｖ／ｌのアミノプテンへの７日間の
暴露後の細胞の生存率％ ２、　５Ｘ１０５細胞／ｖａｌの出発濃度から細胞の数
が２倍になるまでの時間。

３、　　１００個の細胞から染色体を数え、平均と標準
偏差を示した。

４、　］゛−細−細胞−細胞増殖に対する抑制物質活性
をＥＰＯ第１２７，３９４号の実施例４に記した方法に
従って測定した。

“〈１０−″の記載はＢ細胞増殖の５０％抑制を達成す
るために１０−１未満の希釈度が必要であることを意味
する。“＞　１０−　＠”の記載は１０−６よりも高い
希釈度において５０％の抑制が達成されることを意味す
る。

５、　他発的ＭＬＣに対する抑制物質活性をＥＰＯ第１
２７．３９４号の実施例５に記した方法に従って測定し
た。５０％抑制を示す上澄液の希釈度を示した。“＜　
１０−　”の記載はＭＬＣ反応の５０％抑制を達成する
ためには１０−１未満の希釈度が必要であることを意味
する。

６、　細胞毒性ＴＩＪＡ胞の発生に対する効果をＥＰ０
１２７．３９４号の実施例７に記載の方法に従って測定
した。を澄液（１０−’希釈度で使用）処理細胞と媒体
処理細胞の開の細胞毒性差を％として示した。

１３、ｉｔ３ｍ制！Ｌ上−乱衣へ乳讐−６Ｔ−ＣＥＭ細
胞を、通常のように、１（）％ＦＣ３を含有するａＭＥ
Ｍ中に保った。ｆ３Ｔ−Ｃ［ＥＭからの抑制性上澄液の
生産のために、細胞を洗浄し且つ２％ＦＣ３を伴なうａ
　−Ｍ　Ｅ：　Ｍ中Ｃ２Ｘ１０’細胞７′Ｉｎ　Ｑ又は
１０′′細胞／１ＩＩＱで懸濁させた。４８時間後に上
澄液を収穫して、機能的活性を評価した。

Ｃ０礁虜ｌヱＪニウＡ耽−殿一　細胞を含有しな一上−
ａ液を１０．０００回転／分で２０分間遠心分離して、
すべての残渣を除いた。次いで硫酸アンモニウムを徐々
に加えて最終的に５０％硫酸アンモニウム飽和溶液を与
えた。４５分間の攪拌後に、溶液を１０，０００回転／
分で一３０分間遠心分離した。抑制物質活性を有する沈
殿をＰ　Ｂ　Ｓ　ｌ：対して完全に透析した。全工程を
低温で行ない且つｐＨを７．０〜７．４に保った。以下
の実施例におぃては、このＳ　Ａ　Ｆ’の両分を用いた
。

Ｄ、＋−２−７ＬニルＳ−Ｚ裏とｐ−全一λメソヒ＠ノ
ヨηｙ−ト若−２に（ニー。　活性物質活性を有する５
０％硫酸アンモニウム画分をセファクリルＳ−２００ス
ーパーフアインカラム（２，５Ｘ５０ｃｍ）−トで、さ
らに精製した。カラムをＰＢＳで１Ｙ衡化し、流速は３
０ｍ１／時間とした。２１の透析した、５０％硫酸アン
モニウム沈殿画分をカラム−［−に加えた。

Ｐ　Ｉ：３　Ｓを用いて洛出を行なって、５＋ｎｇず−
）の量を集めた。２８０ｎｎ＋において光学密度を測定
することによってたんばく質プロフィールを得た。

自己免疫疾患の治療において、２日間の分析でＣｏｎＡ
、Ｊ全１′リンパ球増殖の８０％抑制を与えるＳ　ＡＦ
の最大濃度の測定によって、ＳＡＦの個々のバッチを標
準化することができる。このような希釈度の逆数を、試
験したＳＡＦの“活性の単位”と定義する（たとえば、
４Ｘ１０−’の希釈度で抑制するバッチは２ＸｌＯ’単
位／１を含有する）。

特定の治療に対して必要なＳＡＦの絶対量は症状の継続
時間及び激烈度に依存する。一般に、Ｓ　Ａ１・゛は″
苑快まで体中１ｋｌ？当り２〜１０ｘ　１０　’単位、
すなわち１〜２０ｍＨの投−り頃範囲でｆＱ’日与える
ことができる。Ｓ　Ａ　Ｆ’はデルン濾過及びイオン交
換クロマトグラフィーにより、又はＳＯＳポリアクリル
アミド電気泳動によって、単一の帯域が得られるまで精
製することができる。Ｓ　Ａ　Ｉ：″の比活性は、約０
．５〜２Ｘ１０１１位／＋ｎＨでなければならない。Ｓ
ＡＦは静脈注射溶液として投すすることができ、且つ注
射液Ｊ１．Ｊの容器としての使用のための規格に合致す
るガラスびん中で−２（ビＣにおいて貯蔵することがで
きる。推奨される防腐剤はメチル及びプロピルパラベン
である。

実施例１ ａ、同元又は高度に２差反応性の同種又は異種組織又は
器官の高濃度の注射による自己免疫応答の誘発を、たと
えば自己溶血性１τ血症、自己免疫甲状腺炎及び自己免
疫脳を髄炎のような自己免疫疾患の誘発のために使用し
た。その後に実験動物中に認められる症状は、これらの
誘発された病気がヒトの臨床疾患自己免疫溶血性１τ血
症、甲状腺炎及び多発性硬化症に近似することを示唆す
る（Ｈ，３，７ランド、プロシーメンタ　オブ　ソサイ
エテイー　オブ　エクスベリメンタル　ビオＯシカル／
ディジ７　（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｓ　ｏｃ、　Ｅ　ＸＬ）。

Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、Ｈ３−！、１２１（１９６９）：Ａ
。

Ｄ、プラグ−タイン、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）
＋１７土、１１３７（１９７１）；及びり、Ｌ、〃ツサ
ーら、サイエンス、１−針１−，８７３（１！Ｊ７３）
参照）。

ヒトの自己免疫溶血性貧血症は古くからの自己免疫病で
あって、その場合には患者の赤血球に対する自己抗体は
、溶血とその結果としての貧血を生じさせる（Ｒ，Ｓ、
エバンスら、アンＮ、Ｙ。

アカデミ−サイエンス（Ａｎｎ、Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ
。

Ｓｃｉ、　）ｊ　２４−．４２２（１９６５）参照）。

動物中に実質的に赤血球自己抗体を誘発する一方法は、
マウスを交差反応性のラットの赤血球によって免疫する
ことである（Ｃ，Ｙ、ローら、ノヤーナルオブ　インミ
ュノロノー（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉａ＋ｍｕｎ
。

ｆｏｇｙ）第１２５巻、：ＰＪ４号、１６３４−１６３
８頁（１９８０）参照）。自己抗体の持続時間は大部分
の通常のマウスの系統において自己制限的であって、恐
らくは抑制因子Ｔ細胞の特定の集団固体数によって制御
される（Ｊ、Ｈ，Ｌ、プレー７エアら、ネーチャー（Ｎ
　ｎｔｕｒｅ）ｆｉ−；　−３−、２１３（１９７３）
及びＡ、タックら、クリニカル　エクスペリメンタル　
インミュノロノー（ＣＩｉｎ、　Ｅｘｐ、　　Ｉ＋ｏｎ
＋ｕｎｏｌ、　）２７．−．５３８　（１９７７）参照
）。抑制の程度は系統によって異なる。Ｃ５７ＢＬ、／
６マウスは見掛上強い抑制物質系を有し且つきわめて一
時的な自己抗体が免疫後に発現するのみである。しかし
ながら、ＣＢ　Ａ及びＣ３Ｈマウスにおいては、赤血球
自己抗体は、免疫後１０週問程度の長期にわたってＤＡ
ＩＴによって検出することができる（Ａ、　　タック、
ネーチャー、？１ノー、１５４（１９７８））。それ１
こ対して、Ｎ２Ｂマウス、ヒトの自己免疫溶血性ｉｔ血
症のための古典的７９スモデル、は誘発に対して高感応
性を示すばかりでなく、一度誘発されさえすれば、赤血
球自己抗体は、動物の死に至るまで、持続する。同様に
、実験的な：ｌｉｌ種箱を髄炎の誘発に対して高度に敏
感であることが示されているＳＪＬ系統の場合において
は、誘発を受けたときに、抗原特異的抑制細胞の損失に
よつて自己抗体生産の制御ができなかった。かくして自
己耐性の発現の欠如は、恐らくは病気の顕示の原因とな
るものと思われ、実験的自己免疫溶血性貧血症は、実験
化合物の生体内研究に対する良好なモデルであることを
示唆する。

自己ＲＢ　Ｃに対する自己抗体力価の減退の抑制又は促
進におけるＳ　Ａ　Ｅ’の効果を、この実験モデルにお
いて応答する正常なマウスの系統であるＣ３）！／Ｊマ
ウスにおいて研究した。ＳＡＦは、用Ｆｉｔに関係する
仕方で、このマウスモデルにおける自己抗体力価の減退
を促進することが認められた。

（１０毛Ａ イＬｑｌ　＠ｔ　ａ＠　：マウス：雌のＣ３Ｈ／Ｊマウ
スは、メイン州、バーハーバ−、シャクソン研究所から
取得した。１グループ当り１０匹のマウスを用いた。

ラット：雌のロング　エバンス　ラットは、マサチュー
セッツ州チャールスリパー研究所から取得した。

４ｇ　ｑ−ｒｐ、：ラットの赤血球をロング　エバンス
ラットから集め、３回洗浄したのち、２Ｘ１０’細胞／
マウスの細胞濃度で腹腔内注射した。１週間に１度の２
回の注射後に、マウスがら採血して自己抗体力価を試験
した。次いでマウスを、各グループの平均自己抗体力価
が同等となるようにＩＯグループに分けた。１週間後に
更に１回の免疫をマウスに与えた。

ＳＡＦ処ＬＩ：２０％のグリセリンを含有するハンクス
緩衝液に対して徹底的に透析しであるＳＡＦの５０％硫
酸アンモニウム沈殿画分を用いた。対照基剤は２０％の
グリセリンを含有するハンクス緩衝液又はＳＡＦと正確
に同じようにして調製した培養基の５０％硫酸アンモニ
ウム沈殿画分の何れかでありな、ＳＡＦ処理は最後のＢ
ＢＣ免疫と同日にｔ！ｌｉ始した。腹腔内ＳＡＦ処理は
１週問当９５回の０．２ｍ１２の用徹で投与した。

抗血清：子持異性ウサギ抗マウス免疫グロブリンは、オ
ンタリオ州、ホーンビー、セグーレーン研究所から得た
。抗血清を２ｍｌの蒸留水によって戻し、いくつかに分
けて冷凍した。この抗血清のに６４希釈物をＤ　Ａ　Ｉ
　Ｔに対して使用した。ＤＡＩＴにおいて用いた希釈剤
は１％フルプミンを伴なうＰＢＳであった。

Ｃ１成駿＝− スチューデント式試験を用いて、試験グループと対照グ
ループの間の抗体力価を比較した。

ＤＡＩＴ：赤血球自己抗体の存在を、ミクロタイター板
中の修飾クーム式試験によって検出した。

尾からの採血によって１週間に１回５０μｉの血液を採
取した。マウスの赤血球をＰＢＳによって４回洗浄した
のち、０．６％の最終濃度に再懸濁した。ウサギの抗−
マウス免疫グロブリン（シーグーレーン）の連続的な２
倍ずつの希釈を、希釈剤として１％フルプミンＰＢＳを
用いて、Ｖ形成のミクロタイターウェル中で行なった。

５０μｌの洗浄したマウスの細胞を各ウェルに加え、ポ
ルテックスパイプレーク−によって混合したのち、蒸発
を避けるために封じた。ミクロタイター板を室温で終夜
放置して、翌日に測定した。ウサギ抗マウス免疫グロブ
リンの力価を、赤血球に結合した自己抗体の尺度として
記録した。鋭敏で再現性のある終点が、このミクロタイ
ク一方法を用いることによって得Ｃ）れな。各動物から
の５０μｔの血液が試験に対して十分であった。この方
法によって得た結果は、従来の試験管中のクーム式の試
験によって得られる結果と直接に比較することができる
。

ｄ０帖ｌ Ｄ　Ａ　Ｉ　Ｔ試験において、第４表に示すような結果
を得た： 第一（ｋ Ａ　１１−ＩＡ（Ｌｏｇ２）＋（処理、週零）週−Ｊｔ
Ｊ−＝−−−じμｍ１０１３−魚訳］−−−５ＡＦ（１
，慣希累、）−１２，３±２．７　　２．４±２．６　
　　２．７±２．９２　６．５±１．０　　７，０±１
．４−　　７．５±１．２３　８．１±１．１　　７．
３±１．２　　　８．４±０．８４　７．４±１．３　
　６．０＋０．９　　　８．０±７．１５　７．７±１
．３　　６．５±０．９　　　７．１±１．１６　　　
７．４±９．２　　　　６．３±０．９　　　　　６．
６±０．４７　　　７．８±１．０　　　　５，８±１
．２　　　　６．１±１．０８　　　８．５±１．２　
　　　７．１±０．９　　　　７．８±１．８９　　　
１１．７±３．８　　　８．４±１．３本　　　９．２
±１．９１０　　　９．７±０．８　　　　８．３±１
．４＊　　　　８．２±１．７１１　　１０．３±１．
９　　　７．５±１．１本　　　８．８±１．４１２　
　５．９±０．７　　　４．３±０．８本　　　５．０
±１．１本１３　　１３．０±３．３　　　８．６±４
．２寧　　１１．１±３．２１４　　８、＝１±５．８
　　　４．７±３．８車　　　７．７±４．９＋マウス
赤血球の凝集反応を与える抗血清の最高力価（Ｒ低濃度
）として報告した。

零Ｐ　＜　０．５ 最初の８週に対しては、Ｓ　Ａ　１”処理したＣ　３　
＋１／、１マウスは、対照グループと匹敵する自己抗体
生産を発現した。しかしながら、９週口以降からは対照
と試験グループの間に差が出始めた。１／４及び１／８
の希釈においてＳ　Ａ　Ｆで処理したグループは対照グ
ループよりも低い自己抗体力価を示した。後続する週の
開にＳ　Ａ　Ｆ処理したグループにおいては自己抗体力
価が逼かに迅速に減退したが、その減退は用喰（こ関連
した。９ｉ！ｉ以降からは対照グループと比較して１／
４希釈のＳＡＦで処理したグループは統計的に有、童の
自己抗体力価の減退を示した。さらに１氏い用１ｉｔの
ＳＡ［’（１／８及び１／１６希釈）ちまた対照よりも
低い自己抗体生産の力価を示したが、その差は常ｉこ統
計的に有意ではなかった。

実施例２ ツサギの凝集素力価の測定をも行なう以外は実施例１の
手順及び試験を繰返した。

ｉ、ＤＡＩＴにおいて、得られた結果を第５表に示す。

＋マウス赤血球の凝集を与える抗血清の最高の力価とし
て報告した。

ｉｉ、ラットの凝集力価測定二この測定の目的は、ＳＡ
Ｆによって生じる外米抗原に対する抗体の生産における
変化を検出することにある。試験血清の連続的な２倍希
釈を、■型の底のミクロタイター板中で行なった。５０
μｅの０．６％ラット赤血球を各ウェルに加えた。ａ集
力価は凝集を与える最後のウェルとして表わした。

免疫原（ラット赤血球）に対する抗体の生産を０゜３．
６．９及び１２週にモニターした。その結果をｉ６表に
示す。

■）　　　　Ｎ　　　　Ｑり　　　　αコ１ト：　　　
　　　　　　　　鍼　　、ＡＣ／）　　　　い３週から
以降では、対照と高用量グループ（１／４希釈、週５回
注射）の闇に僅かであるが明確な差が認められた。代用
にのＳＡＦで処理したグループは、対照グループとの顕
著な差を示さなかった。

実施例１及び２は、Ｓ　Ａ　Ｆ５回／週の腹腔的注射が
自己抗体の生産を顕著に抑制することを示している。か
くして、ＳＡＦ％理は、正常なマウス系統が示す現象と
しての、自己免疫応答の抑制の過程を促進した。抗原、
すなわちラット赤血球、に対する抗体の生産もよたＳＡ
Ｆの適当な用量によって低下した（ラットの凝集試験に
よって示される）。この場合は、統計的に有意ではある
けれども差は小さく、自己抗原に対するＳ　Ａ　Ｆ抑制
抗体生産が外米抗原に対するものよりも遥か一二大であ
ることを示し、自己免疫疾患における治療上の役割は、
その選択性によるものと思われる。

細胞転移実験−二よって、正常なマウス系統における自
己抗体生産の抑制が、抗原特異性抑制細胞によって媒介
されることが示唆された。外米抗原に対する抗体よりも
遥かに急速に自己抗体生産を抑制しｒこＳＡＦが、抗原
特異性抑制細胞の個体群を刺戟するかどうかは明確でな
い。しかしながら、ＳＡＦが自己抗体生産を低下させる
こと、従って自己免疫疾患の治療において有用であるこ
とは明らかである。

細胞系統６Ｔ−ＣＥＭ及びそのサブクローン６”ｌ’−
ＣｌＥＭ−２０は、１９８３年４月２６日にメリーラン
ド州ロックビル、パークローンドライブの７メリカ類型
培養物収集、１２３０１において保’Ｉ？され、それぞ
れ、Ａ　１”　ＣＣ受入れ番号ＣＲｌ−８２９６及ゾＣ
ＲＬ８２９５がり、えられた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳動物に対して： ｉ）リンパ芽球細胞系統（セルライン）ＣＥＭの安定な
   ６−チオグアニン耐性突然変異体によって分泌され、 ｉｉ）非ミトゲン性であり、且つ ｉｉｉ）非細胞毒性である因子を投与することを特徴と
   する哺乳動物の自己免疫性疾患の治療方法。 ２、該自己免疫性疾患は全身的自己免疫性疾患である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該自己免疫性疾患はグッドパスチャー氏症候群であ
   る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、該自己免疫性疾患はリューマチ性関節炎である特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ５、該自己免疫性疾患はショーグレン氏症候群である特
   許請求の範囲第２項記載の方法。 ６、該自己免疫性疾患は全身的紅斑性狼瘡である特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ７、該自己免疫性疾患は器官特異的自己免疫性疾患であ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、該自己免疫性疾患は重疾筋無力症、自己免疫性甲状
   腺炎、自己免疫性溶血性貧血症、自己免疫性脳脊髄炎又
   は多発性硬化症である特許請求の範囲第７項記載の方法
   。 ９、該自己免疫性疾患は自己免疫性溶血性貧血症である
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、該自己免疫性疾患は多発性硬化症である特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 １１、該因子を非経口的に哺乳動物に投与する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 １２、該非経口的投与は静脈内に行なう特許請求の範囲
   第１１項記載の方法。 １３、該哺乳動物はヒトである特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 １４、該細胞系統（セルライン）は７２±１２の核型を
   有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １５、該細胞系統はＡＴＣＣ　ＣＲＬ８２９５又はＡＴ
   ＣＣ　ＣＲＬ８２９６の性質を有する特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 １６、該因子は、さらに： ｉｖ）１０＾−＾６の希釈度において少なくとも９０％
   のミトゲン誘発Ｔ細胞増殖を抑制するが該希釈度におい
   てミトゲン誘発Ｂ細胞増殖を抑制しない、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 １７、該因子は、さらに： ｖ）高分子量たんぱく質中に包含されている特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １８、該因子は、さらに： ｖｉ）生理学的ｐＨにおいて最大の抑制因子活性を表わ
   す、 特許請求の範囲第１項記載の方法。 １９、該因子は、さらに： ｖｉｉ）５６℃において不活性化される特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ２０、該因子は、さらに： ｖｉｉｉ）それがミトゲン性刺激に対するヒトの末梢血
   液リンパ球リンパ球増殖を抑制する場合と同様な効力を
   もってミトゲン性刺激に対するマウスの脾臓細胞増殖を
   抑制する、 特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２１、該因子は、さらに ｉｘ）ラット赤血球で免疫性を与えたマウスにおける外
   米抗原（該ラット赤血球）に対しての抗体生産に対する
   よりも大きな抑制効果を自己抗体生産に対して表わす、 特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２２、該因子は、さらに ｉｖ）１０＾−＾６の希釈度において少なくとも９０％
   のミトゲン誘発Ｔ細胞増殖を抑制するが該希釈度におい
   てミトゲン誘発Ｂ細胞の増殖を抑制せず； ｖ）高分子量たんぱく質中に包含させてあり； ｖｉ）生理学的ｐＨにおいて最大の抑制活性を表わし； ｖｉｉ）５６℃において不活性化され； ｖｉｉｉ）それがミトゲン刺激に対するヒトの末梢血液
   リンパ球増殖を抑制する場合と同様な効力をもってマウ
   スの膵臓細胞増殖を抑制し；且つ ｉｘ）ラットの赤血球で免疫を与えたマウスにおける外
   来抗原（該ラット赤血球）に対しての抗体生産に対する
   よりも大きな抑制効果を自己抗体生産に対して表わす、 特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２３、該方法は哺乳動物における自己抗体生産の低下を
   包含する特許請求の範囲第１項記載の方法。