JPS6236671B2 - - Google Patents
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- JPS6236671B2 JPS6236671B2 JP55007557A JP755780A JPS6236671B2 JP S6236671 B2 JPS6236671 B2 JP S6236671B2 JP 55007557 A JP55007557 A JP 55007557A JP 755780 A JP755780 A JP 755780A JP S6236671 B2 JPS6236671 B2 JP S6236671B2
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- activity
- protease
- approximately
- protease activity
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/66—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は虫歯の予防ないしは治療に有用な新規
アルカリプロテアーゼM3に関する。 虫歯の成因は次のように考えられている。すな
わち、食物等から由来するシユクロース（シヨ
糖）を栄養源としてStreptococcus mutansや
Streptococcussanguisの如き虫歯菌が口腔内で生
育増殖しながらグルコシルトランスフエラーゼ
（glucosyltransferase）（以下、GTFと略す）を
生産し、このＧＴＦはシユクロース（シヨ糖）を
水溶性あるいは非水溶性のデキストランの如き多
糖類に変換する。かくして生産された多糖類、特
に非水溶性の多糖類は虫歯金その他の細菌の表面
を被覆しながら、やがては歯牙表面に付着して歯
苔（デンタル プラク）を形成し、その中の細菌
は更に歯苔中の糖を利用して乳酸の如き酸を産生
し、この酸の歯のエナメル質を溶解し、初期の虫
歯が発生するとされている。 そこで本発明者らはこのＧＴＦの活性を阻害す
れば歯苔の発生、ひいては虫歯の予防ないしは治
療ができるとの観点から、種々検討した結果、本
発明の新規アルカリプロテアーゼM3が極めて強
いＧＴＦ阻害活性および虫歯抑制作用を有するこ
とを見い出し、本発明を完成した。 次に本発明のアルカリプロテアーゼM3の理化
学的性質を述べ、ついで本発明のアルカリプロテ
アーゼM3が新規な酵素である根拠を明らかにす
る。 (1) 作用 本酵素はカゼインを加水分解し、かつＧＴＦ
の活性を阻害する強アルカリ性プロテアーゼで
ある。しかし本酵素は虫歯菌細胞溶解活性を実
質的に有ささない。 (2) 至適pHおよびpH安定性 第１図に示すようにカゼインを基質とした場
合の至適pHは９〜12.5であり、また第２図に示
すように本酵素はpH４〜９において37℃、６日
間放置した場合約50％以上のプロテアーゼ活性
が残存する。 (3) 至適温度および熱安定性 第３図に示すようにカゼインを基質とした場
合の本酵素の至適温度は約65℃であり、また第
４図に示すように本酵素水溶液を55℃、10分間
加熱してもそのプロテアーゼ活性は失なわれな
い。 (4) 失活条件 第４図に示すように、本酵素水溶液を60℃、
10分間加熱した場合その約50％のプロテアーゼ
活性が失なわれ、65℃、10分間の加熱ではその
90％以上のプロテアーゼ活性が失活する。 (5) 各種添加剤の影響 本酵素のプロテアーゼ活性に対する種々物質
の影響を次表に示す。
アルカリプロテアーゼM3に関する。 虫歯の成因は次のように考えられている。すな
わち、食物等から由来するシユクロース（シヨ
糖）を栄養源としてStreptococcus mutansや
Streptococcussanguisの如き虫歯菌が口腔内で生
育増殖しながらグルコシルトランスフエラーゼ
（glucosyltransferase）（以下、GTFと略す）を
生産し、このＧＴＦはシユクロース（シヨ糖）を
水溶性あるいは非水溶性のデキストランの如き多
糖類に変換する。かくして生産された多糖類、特
に非水溶性の多糖類は虫歯金その他の細菌の表面
を被覆しながら、やがては歯牙表面に付着して歯
苔（デンタル プラク）を形成し、その中の細菌
は更に歯苔中の糖を利用して乳酸の如き酸を産生
し、この酸の歯のエナメル質を溶解し、初期の虫
歯が発生するとされている。 そこで本発明者らはこのＧＴＦの活性を阻害す
れば歯苔の発生、ひいては虫歯の予防ないしは治
療ができるとの観点から、種々検討した結果、本
発明の新規アルカリプロテアーゼM3が極めて強
いＧＴＦ阻害活性および虫歯抑制作用を有するこ
とを見い出し、本発明を完成した。 次に本発明のアルカリプロテアーゼM3の理化
学的性質を述べ、ついで本発明のアルカリプロテ
アーゼM3が新規な酵素である根拠を明らかにす
る。 (1) 作用 本酵素はカゼインを加水分解し、かつＧＴＦ
の活性を阻害する強アルカリ性プロテアーゼで
ある。しかし本酵素は虫歯菌細胞溶解活性を実
質的に有ささない。 (2) 至適pHおよびpH安定性 第１図に示すようにカゼインを基質とした場
合の至適pHは９〜12.5であり、また第２図に示
すように本酵素はpH４〜９において37℃、６日
間放置した場合約50％以上のプロテアーゼ活性
が残存する。 (3) 至適温度および熱安定性 第３図に示すようにカゼインを基質とした場
合の本酵素の至適温度は約65℃であり、また第
４図に示すように本酵素水溶液を55℃、10分間
加熱してもそのプロテアーゼ活性は失なわれな
い。 (4) 失活条件 第４図に示すように、本酵素水溶液を60℃、
10分間加熱した場合その約50％のプロテアーゼ
活性が失なわれ、65℃、10分間の加熱ではその
90％以上のプロテアーゼ活性が失活する。 (5) 各種添加剤の影響 本酵素のプロテアーゼ活性に対する種々物質
の影響を次表に示す。
【表】
前表から明らかなように、本酵素のプロテア
ーゼ活性は10-3Mのヨード酢酸、ＤＥＲ、FeSO4
およびＥＤＴＡによつて実質的に阻害されず、
10-4MのＮＢＳによつて完全に阻害される。 なお、第１表に挙げた物質以外に、８−ヒド
ロキシキノリン、シユウ酸カリウム、ジエチル
ジチオカルバミン酸ナトリウム、ピロリン酸ナ
トリウム、Na2HAsO4、FCH2COONa、
NH2OH・ＨＣｌ・チオセミカルバジド、
(NH2)2・ＨＣｌ・1 /2H2SO4、NaHSO3、
HSCH2CH2OH、グルタチオン、Ｌ−システイ
ン塩酸塩、２・３−ジメルカプト−１−プロパ
ノール、ＮａＦ、大豆から抽出したトリプシン阻
害剤、MgCl2、Li2SO4およびAg2SO4をそれぞ
れ10-3M添加した場合、本酵素のプロテアーゼ
相対活性は85〜110であり、本酵素のプロテア
ゼ活性はこれらの物質によつてほとんど影響さ
れない。 (6) 等電点 pH9.5付近 〔pH２〜11.5のキヤリアー・アンホライト法
（LKBプロダクター社製）、（300V、40時間）〕 (7) 分子量 約1.7×104 〔セフアデツクスＧ−75（フアルマシア社
製）によるゲル過法〕 (8) UV吸収スペクトラム 第５図に示すとおり。 (9) IR吸収スペクトル 第６図にに示すとおり。 (10) 精製法 後記実施例記載のとおり。 (11) 力価の測定法 (イ) プロテアーゼ活性 0.6％カゼイン−0.05Mトリス・塩酸緩衝
溶液（pH8.0）２mlに適当に希釈したアルカ
リプロテアーゼM3溶液１mlを加えて37℃、
10分間温置し、反応停止溶液〔0.01Mトリク
ロル酢酸−0.02Ｍ酢酸ソーダ−0.03Ｍ酢酸〕
３mlを加え、生ずる沈殿を去し液の
275nｍにおける吸光度を測定する。この
UV275値を、チロシン標準溶液のUV275値と
の比較から、チロシン量に換算する。 プロテアーゼ活性の１単位とは、１μｇの
チロシンを１分間に増加させるに必要な酵素
量である。 (ロ) ＧＴＦ阻害活性 試薬 (ａ) ＧＴＦ溶液 Streptococcus mutansのK1−Ｒ株また
はＡＨＴ株をＴＴＹ※培地中で37℃、24時間
静置培養し、培養物を遠心分離し、その上
清に50％硫安を加えて生ずる沈殿を0.05Ｍ
リン酸緩衝溶液（pH6.8）に溶解し、水に
対して透析して調製する。 ※ Trypticase−Tryptose−Yeast
extract培地（pH7.0） (ｂ) ５％シユクロース−1/15Ｍリン酸緩衝溶
液（pH6.8） (ｃ) アルカリプロテアーゼM3−1/15Ｍリン
酸緩衝溶液（pH6.8） (ｄ) 1/15Ｍリン酸緩衝溶液（pH6.8） (ｅ) アンスロン溶液 再結晶アンスロン200mgを95％硫酸100ml
に冷却下溶解し、更に水20mlを加えて調製
する。 方法 0.1mlの(a)、2.0mlの(b)および0.05mlの(c)か
らなる混液を37℃、18時間温置し、次に最終
濃度が70％となるようにエタノールを加えて
４℃、２時間放置する。生ずる沈殿（多糖
類）を遠心分離し、沈殿を5.0mlの（ｄ）に溶解
し、再たび同様なエタノール処理して沈殿を
得る。沈殿を5.0mlの（ｄ）に溶解し、冷却下そ
の0.1mlに6.0mlの（ｅ）を加えてよく振盪し100
℃で10分間加熱する。冷後620nmの吸光度
を測定し多糖類の量を求める。 なお、ＧＴＦの活性は多糖類の生成量（μ
ｇ／ml）で表示し、ＧＴＦの阻害率は次式に
従つて算出するものとする。 阻害率（％）＝Ａ−Ｂ／Ａ×100 Ａ；M3非添加時のＧＴＦ活性値 Ｂ；M3添加時のＧＴＦ活性値 このような理化学的性質を有する本発明のアル
カリプロテアーゼM3と至適pH値が10以上で分子
量が27000以下と認められる既知のアルカリプロ
テアーゼとの比較を次に挙げる。
ーゼ活性は10-3Mのヨード酢酸、ＤＥＲ、FeSO4
およびＥＤＴＡによつて実質的に阻害されず、
10-4MのＮＢＳによつて完全に阻害される。 なお、第１表に挙げた物質以外に、８−ヒド
ロキシキノリン、シユウ酸カリウム、ジエチル
ジチオカルバミン酸ナトリウム、ピロリン酸ナ
トリウム、Na2HAsO4、FCH2COONa、
NH2OH・ＨＣｌ・チオセミカルバジド、
(NH2)2・ＨＣｌ・1 /2H2SO4、NaHSO3、
HSCH2CH2OH、グルタチオン、Ｌ−システイ
ン塩酸塩、２・３−ジメルカプト−１−プロパ
ノール、ＮａＦ、大豆から抽出したトリプシン阻
害剤、MgCl2、Li2SO4およびAg2SO4をそれぞ
れ10-3M添加した場合、本酵素のプロテアーゼ
相対活性は85〜110であり、本酵素のプロテア
ゼ活性はこれらの物質によつてほとんど影響さ
れない。 (6) 等電点 pH9.5付近 〔pH２〜11.5のキヤリアー・アンホライト法
（LKBプロダクター社製）、（300V、40時間）〕 (7) 分子量 約1.7×104 〔セフアデツクスＧ−75（フアルマシア社
製）によるゲル過法〕 (8) UV吸収スペクトラム 第５図に示すとおり。 (9) IR吸収スペクトル 第６図にに示すとおり。 (10) 精製法 後記実施例記載のとおり。 (11) 力価の測定法 (イ) プロテアーゼ活性 0.6％カゼイン−0.05Mトリス・塩酸緩衝
溶液（pH8.0）２mlに適当に希釈したアルカ
リプロテアーゼM3溶液１mlを加えて37℃、
10分間温置し、反応停止溶液〔0.01Mトリク
ロル酢酸−0.02Ｍ酢酸ソーダ−0.03Ｍ酢酸〕
３mlを加え、生ずる沈殿を去し液の
275nｍにおける吸光度を測定する。この
UV275値を、チロシン標準溶液のUV275値と
の比較から、チロシン量に換算する。 プロテアーゼ活性の１単位とは、１μｇの
チロシンを１分間に増加させるに必要な酵素
量である。 (ロ) ＧＴＦ阻害活性 試薬 (ａ) ＧＴＦ溶液 Streptococcus mutansのK1−Ｒ株また
はＡＨＴ株をＴＴＹ※培地中で37℃、24時間
静置培養し、培養物を遠心分離し、その上
清に50％硫安を加えて生ずる沈殿を0.05Ｍ
リン酸緩衝溶液（pH6.8）に溶解し、水に
対して透析して調製する。 ※ Trypticase−Tryptose−Yeast
extract培地（pH7.0） (ｂ) ５％シユクロース−1/15Ｍリン酸緩衝溶
液（pH6.8） (ｃ) アルカリプロテアーゼM3−1/15Ｍリン
酸緩衝溶液（pH6.8） (ｄ) 1/15Ｍリン酸緩衝溶液（pH6.8） (ｅ) アンスロン溶液 再結晶アンスロン200mgを95％硫酸100ml
に冷却下溶解し、更に水20mlを加えて調製
する。 方法 0.1mlの(a)、2.0mlの(b)および0.05mlの(c)か
らなる混液を37℃、18時間温置し、次に最終
濃度が70％となるようにエタノールを加えて
４℃、２時間放置する。生ずる沈殿（多糖
類）を遠心分離し、沈殿を5.0mlの（ｄ）に溶解
し、再たび同様なエタノール処理して沈殿を
得る。沈殿を5.0mlの（ｄ）に溶解し、冷却下そ
の0.1mlに6.0mlの（ｅ）を加えてよく振盪し100
℃で10分間加熱する。冷後620nmの吸光度
を測定し多糖類の量を求める。 なお、ＧＴＦの活性は多糖類の生成量（μ
ｇ／ml）で表示し、ＧＴＦの阻害率は次式に
従つて算出するものとする。 阻害率（％）＝Ａ−Ｂ／Ａ×100 Ａ；M3非添加時のＧＴＦ活性値 Ｂ；M3添加時のＧＴＦ活性値 このような理化学的性質を有する本発明のアル
カリプロテアーゼM3と至適pH値が10以上で分子
量が27000以下と認められる既知のアルカリプロ
テアーゼとの比較を次に挙げる。
【表】
本発明のアルカリプロテアーゼM3は、前記第
２表に挙げた理化学的性質のいずれかにおいて既
知のアルカリプロテアーゼとは異なり、新規な酵
素と認められる。特に本発明のアルカリプロテア
ーゼM3は次の諸性質を有する点において既知ア
ルカリプロテアーゼとは区別される。 (1) 至適pH値が９〜12.5の強アルカリプロテアー
ゼであり (2) FeSO4、ＤＦＰ、ＥＤＴＡまたはヨード酢酸のい
ずれによつても実質的に阻害されず (3) ＧＴＦ阻害作用を有し、かつ (4) アルカリプロテアーゼのうちでも最も低分子
であること なお、前記第２表に挙げた既知アルカリプロテ
アーゼのうちでも文献番号13（特開昭48−
92582）に記載されている酵素は本発明の酵素M3
と最も類似すると考えられるが、ＤＦＰの作用な
らびに等電点において明確に区別される。 本発明の新規アルカリプロテアーゼM3はスト
レプトマイセス属に属するアルカリプロテアーゼ
M3生産菌を培養し、培養物からアルカリプロテ
アーゼM3を採取することにより製造できる。 ストレプトマイセス属に属するアルカリプロテ
アーゼM3生産菌としては、例えばStreptomyces
globisporus Ｂ−1829株が好適である。このＢ−
1829株は微工研およびATCCに、微工研菌寄第
596号およびATCC−21553号として寄託されてお
り、その菌学的性質ならびに培養方法は特公昭49
−16956号や米国特許3929579号明細書に詳細に説
明されている。 Ｂ−1829菌株の培養物からアルカリプロテアー
ゼM3の採取は、アンバーライトＣＧ50（ダウケミ
カル社製）処理、硫安分画、ＣＭ−セフアデツク
スＣ−25（フアルマシア社製）処理等を適当に組
み合せることにより実施できる。 かくして得られる本発明の新規アルカリプロテ
アーゼM3は歯みがき粉、練歯みがき、口腔洗浄
剤等の形態で虫歯の予防ないしは治療に供され
る。 次に製造実施例ならびに試験例を挙げて本発明
を更に詳細に説明する。 実施例 アルカリプロテアーゼM3の製造 ２％デキストリン、0.5％大豆粉、0.25％ペプ
トン、0.5％Na2HPO4、0.1％KH2PO4、0.1％
MgSO4および0.5％NaClからなる培地（pH7.5）
７０中で培養したStreptomyces globisporus Ｂ
−1829の培養物をフイルタープレスで過し液
７０を得、これにアンバーライトＣＧ50（ダウケ
ミカル社製のH+タイプのイオン交換樹脂）2.8kg
を加え、１時間攪伴して酵素を吸着させたのち遠
心分離機により樹脂部分を分離する。酵素が吸着
された樹脂に0.2Ｍ Na2HPO4 10を加え、アンモ
ニア水でpH7.5に調節して１時間攪拌溶出する。
その溶出液12に60％飽和となるように固形硫酸
アンモニウムを加えて４℃で１夜放置する。生じ
た沈殿を取し、水道水1.8に溶解して酵素含
有液を得る。これを1N HClでpH2.0に調節し、室
温にて30分間攪拌後、1N NaOHでpH6.0となし流
水中で透析する。別に準備したＣＭ−セフアデツ
クスＣ−25（Na+タイプ）のカラム（４×40cm）
に上記透析液を通し、脱イオン水で280nｍの吸
収がなくなるまで洗浄する。ついで水３と
0.2Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）からなる溶媒を用
いる直線勾配法で溶出を行なう。緩衝溶液濃度
0.03〜0.05Ｍ附近に溶出される活性区分約400ml
を集め、ダイヤフイルターＡＳ201（バイオエンジ
ニアリング社製）によつて脱塩・濃縮を行ない、
約50mlになつた濃縮液を凍結乾燥し0.7ｇのアル
カリプロテアーゼM3を得る。本酵素のプロテア
ーゼ活性は730Ｕ／mgであつた。 次に本酵素のアミノ酸分析の結果を、特開昭48
−92582に記載された酵素との比較において示
す。
２表に挙げた理化学的性質のいずれかにおいて既
知のアルカリプロテアーゼとは異なり、新規な酵
素と認められる。特に本発明のアルカリプロテア
ーゼM3は次の諸性質を有する点において既知ア
ルカリプロテアーゼとは区別される。 (1) 至適pH値が９〜12.5の強アルカリプロテアー
ゼであり (2) FeSO4、ＤＦＰ、ＥＤＴＡまたはヨード酢酸のい
ずれによつても実質的に阻害されず (3) ＧＴＦ阻害作用を有し、かつ (4) アルカリプロテアーゼのうちでも最も低分子
であること なお、前記第２表に挙げた既知アルカリプロテ
アーゼのうちでも文献番号13（特開昭48−
92582）に記載されている酵素は本発明の酵素M3
と最も類似すると考えられるが、ＤＦＰの作用な
らびに等電点において明確に区別される。 本発明の新規アルカリプロテアーゼM3はスト
レプトマイセス属に属するアルカリプロテアーゼ
M3生産菌を培養し、培養物からアルカリプロテ
アーゼM3を採取することにより製造できる。 ストレプトマイセス属に属するアルカリプロテ
アーゼM3生産菌としては、例えばStreptomyces
globisporus Ｂ−1829株が好適である。このＢ−
1829株は微工研およびATCCに、微工研菌寄第
596号およびATCC−21553号として寄託されてお
り、その菌学的性質ならびに培養方法は特公昭49
−16956号や米国特許3929579号明細書に詳細に説
明されている。 Ｂ−1829菌株の培養物からアルカリプロテアー
ゼM3の採取は、アンバーライトＣＧ50（ダウケミ
カル社製）処理、硫安分画、ＣＭ−セフアデツク
スＣ−25（フアルマシア社製）処理等を適当に組
み合せることにより実施できる。 かくして得られる本発明の新規アルカリプロテ
アーゼM3は歯みがき粉、練歯みがき、口腔洗浄
剤等の形態で虫歯の予防ないしは治療に供され
る。 次に製造実施例ならびに試験例を挙げて本発明
を更に詳細に説明する。 実施例 アルカリプロテアーゼM3の製造 ２％デキストリン、0.5％大豆粉、0.25％ペプ
トン、0.5％Na2HPO4、0.1％KH2PO4、0.1％
MgSO4および0.5％NaClからなる培地（pH7.5）
７０中で培養したStreptomyces globisporus Ｂ
−1829の培養物をフイルタープレスで過し液
７０を得、これにアンバーライトＣＧ50（ダウケ
ミカル社製のH+タイプのイオン交換樹脂）2.8kg
を加え、１時間攪伴して酵素を吸着させたのち遠
心分離機により樹脂部分を分離する。酵素が吸着
された樹脂に0.2Ｍ Na2HPO4 10を加え、アンモ
ニア水でpH7.5に調節して１時間攪拌溶出する。
その溶出液12に60％飽和となるように固形硫酸
アンモニウムを加えて４℃で１夜放置する。生じ
た沈殿を取し、水道水1.8に溶解して酵素含
有液を得る。これを1N HClでpH2.0に調節し、室
温にて30分間攪拌後、1N NaOHでpH6.0となし流
水中で透析する。別に準備したＣＭ−セフアデツ
クスＣ−25（Na+タイプ）のカラム（４×40cm）
に上記透析液を通し、脱イオン水で280nｍの吸
収がなくなるまで洗浄する。ついで水３と
0.2Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）からなる溶媒を用
いる直線勾配法で溶出を行なう。緩衝溶液濃度
0.03〜0.05Ｍ附近に溶出される活性区分約400ml
を集め、ダイヤフイルターＡＳ201（バイオエンジ
ニアリング社製）によつて脱塩・濃縮を行ない、
約50mlになつた濃縮液を凍結乾燥し0.7ｇのアル
カリプロテアーゼM3を得る。本酵素のプロテア
ーゼ活性は730Ｕ／mgであつた。 次に本酵素のアミノ酸分析の結果を、特開昭48
−92582に記載された酵素との比較において示
す。
【表】
【表】
試験例 １
ＧＴＦ阻害作用
Streptococcus mutansのK1−Ｒ株ならびに
AHT株由来のGTFに対するアルカリプロテアー
ゼM3および既知のプロテアーゼの阻害活性を測
定し次表の結果を得た。なお、各プロテアーゼの
添加量は160Ｕ／mlである。 第４表の結果から明らかなように本発明のアル
カリプロテアーゼM3は強いＧＴＦ阻害活性を有す
ることが判る。すでに述べた様にＧＴＦ阻害活性
の測定は、中性プロテアーゼの活性が最も強いpH
6.8において行なわれるにもかかわらず、中性プ
ロテアーゼにはＧＴＦ阻害活性がほとんど認めら
れない。
AHT株由来のGTFに対するアルカリプロテアー
ゼM3および既知のプロテアーゼの阻害活性を測
定し次表の結果を得た。なお、各プロテアーゼの
添加量は160Ｕ／mlである。 第４表の結果から明らかなように本発明のアル
カリプロテアーゼM3は強いＧＴＦ阻害活性を有す
ることが判る。すでに述べた様にＧＴＦ阻害活性
の測定は、中性プロテアーゼの活性が最も強いpH
6.8において行なわれるにもかかわらず、中性プ
ロテアーゼにはＧＴＦ阻害活性がほとんど認めら
れない。
【表】
【表】
実験例 ２
虫歯の抑制
一群10匹のゴールデンハムスター（３週令）を
虫歯誘発飼料No.200（Archives of Oral Biology
９ 377〜400、1964）で１週間予備飼育した
後、あらかじめ培養したStreptococcus mutant
ＡＨＴの培養物をハムスターの両頬嚢内へ0.1mlず
つ接種し、ついで各種プロテアーゼを含有する前
記No.200飼料で更に４週間飼育する。その後ハ
ムスターを屠殺して上下の顎骨を採取し、肉片お
よび歯苔を除去してからP.H.Keyesらの方法（J.
Dental Research 23 439−444、1944）に従つ
て臼歯の虫歯のスコアリングを行ない次表の結果
を得た。なお、臼歯試料の動物番号は観察者に対
しブラインドにして観察を行なわせしめた。
虫歯誘発飼料No.200（Archives of Oral Biology
９ 377〜400、1964）で１週間予備飼育した
後、あらかじめ培養したStreptococcus mutant
ＡＨＴの培養物をハムスターの両頬嚢内へ0.1mlず
つ接種し、ついで各種プロテアーゼを含有する前
記No.200飼料で更に４週間飼育する。その後ハ
ムスターを屠殺して上下の顎骨を採取し、肉片お
よび歯苔を除去してからP.H.Keyesらの方法（J.
Dental Research 23 439−444、1944）に従つ
て臼歯の虫歯のスコアリングを行ない次表の結果
を得た。なお、臼歯試料の動物番号は観察者に対
しブラインドにして観察を行なわせしめた。
【表】
【表】
【表】
前表から明らかなように本発明のアルカリプロ
テアーゼM3は極めて強い虫歯抑制作用を有す
る。
テアーゼM3は極めて強い虫歯抑制作用を有す
る。
第１図はM3の活性pH範囲を、第２図はM3のpH
安定性を、第３図はM3の活性温度範囲を、第４
図はM3の熱安定性を、第５図はM3のＵＶ吸収スペ
クトラムを、第６図はM3のＩＲ吸収スペクトラム
をそれぞれ表わす。 なお、第１図および／または第２図における１
はリン酸緩衝溶液を、２はトリス・塩酸緩衝溶液
を、３はSorensen氏緩衝溶液を、４はクエン酸
緩衝溶液をそれぞれ意味し、緩衝溶液濃度は第１
図では0.05Ｍであり、第２図では0.02Ｍである。
安定性を、第３図はM3の活性温度範囲を、第４
図はM3の熱安定性を、第５図はM3のＵＶ吸収スペ
クトラムを、第６図はM3のＩＲ吸収スペクトラム
をそれぞれ表わす。 なお、第１図および／または第２図における１
はリン酸緩衝溶液を、２はトリス・塩酸緩衝溶液
を、３はSorensen氏緩衝溶液を、４はクエン酸
緩衝溶液をそれぞれ意味し、緩衝溶液濃度は第１
図では0.05Ｍであり、第２図では0.02Ｍである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するアルカリプロテ
アーゼM3； (1) 作用 本酵素はカゼインを加水分解し、かつグルコ
シルトランスフエラーゼの活性を阻害する (2) 至適pHおよびpH安定性 カゼインを基質とした場合の本酵素の至適pH
値は９〜12.5であり、本酵素はpH４〜９におい
て37℃、６日間放置した場合約50％以上のプロ
テアーゼ活性が残存する (3) 至適温度および熱安定性 カゼインを基質とした場合の本酵素の至適温
度は約65℃であり、本酵素水溶液を55℃、10分
間加熱しても安定である (4) 失活条件 本酵素水溶液を60℃、10分間加熱した場合に
はその約50％のプロテアーゼ活性が失なわれ、
65℃、10分間の加熱でそのプロテアーゼ活性の
90％以上が失活する (5) 各種添加剤の影響 本酵素のプロテアーゼ活性は10-4MのＮ−ブ
ロモスクシンイミドによつて完全に阻害される
が、10-3Mのヨード酢酸、ジイソプロピルフル
オロホスフエート、エチレンジアミンテトラア
セテート（ＥＤＴＡ）およびFeSO4によつてほと
んど阻害されない (6) 等電点 pH9.5付近 (7) 分子量 約1.7×104
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP755780A JPS56106593A (en) | 1980-01-24 | 1980-01-24 | Alkali protease m3 |
| US06/225,266 US4364926A (en) | 1980-01-24 | 1981-01-15 | Novel alkaline protease M3 method for the preparation thereof and dental caries-prophylactic composition containing the same |
| GB8101793A GB2069501B (en) | 1980-01-24 | 1981-01-21 | Alkaline protease m3 |
| DE19813102216 DE3102216A1 (de) | 1980-01-24 | 1981-01-23 | Alkalische protease m(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts), verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung und mittel zur verhinderung von zahnkaries |
| FR8101315A FR2482131A1 (fr) | 1980-01-24 | 1981-01-23 | Nouvelle protease alcaline m3, son procede de preparation et composition prophylactique contre la carie dentaire la contenant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP755780A JPS56106593A (en) | 1980-01-24 | 1980-01-24 | Alkali protease m3 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56106593A JPS56106593A (en) | 1981-08-24 |
| JPS6236671B2 true JPS6236671B2 (ja) | 1987-08-07 |
Family
ID=11669096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP755780A Granted JPS56106593A (en) | 1980-01-24 | 1980-01-24 | Alkali protease m3 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4364926A (ja) |
| JP (1) | JPS56106593A (ja) |
| DE (1) | DE3102216A1 (ja) |
| FR (1) | FR2482131A1 (ja) |
| GB (1) | GB2069501B (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5192677A (en) * | 1986-05-08 | 1993-03-09 | Cornell Research Foundation Inc. | Alkali and heat stable protease from thermomonospora fusca |
| JPH02250816A (ja) * | 1989-03-23 | 1990-10-08 | Kao Corp | 口腔用組成物 |
| US5071977A (en) * | 1989-05-10 | 1991-12-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Plaque inhibiting oligosaccharide |
| US5190746A (en) * | 1989-05-10 | 1993-03-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Plaque inhibiting oligosaccharide |
| EP0458644A1 (en) * | 1990-05-25 | 1991-11-27 | Scholl Plc | A micro-organism and proteases therefrom |
| DK246290D0 (da) * | 1990-10-12 | 1990-10-12 | Novo Nordisk As | Nyt enzym |
| US5339771A (en) * | 1993-09-15 | 1994-08-23 | Axelrod Herbert R | Animal chew toy containing animal meal |
| US5553570A (en) * | 1994-11-14 | 1996-09-10 | Vannatter, Iii; Charlie H. | Disc-shaped animal retrieval toy having treat container |
| CA2216928A1 (en) * | 1995-03-28 | 1996-10-03 | Novo Nordisk A/S | Oral care compositions |
| DE10237317B4 (de) * | 2002-08-15 | 2010-04-08 | 3M Espe Ag | Enzymhaltige Zusammensetzung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
| EP1600141B1 (en) * | 2004-05-24 | 2013-04-17 | 3M Deutschland GmbH | Collagenolytic active enzyme containing compositions for the treatment of dental caries |
| EP1754464A1 (en) * | 2005-08-17 | 2007-02-21 | 3M Innovative Properties Company | Enzyme comprising dental composition |
| CN102170792A (zh) * | 2008-07-18 | 2011-08-31 | 希尔氏宠物营养品公司 | 提高老龄动物生活质量的方法 |
| US9622956B2 (en) * | 2011-12-21 | 2017-04-18 | Colgate-Palmolive Company | Oral care compositions |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3838009A (en) * | 1968-10-25 | 1974-09-24 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for producing detergent resisting alkaline protease |
| DE2000820A1 (de) | 1969-01-10 | 1970-07-23 | Monsanto Co | Mundpflege-Produkte mit einem Gehalt an neutraler Prothease |
| GB1293563A (en) * | 1969-04-10 | 1972-10-18 | Astra Laekemedel Ab | Enzymes and methods for their preparation, isolation and purification |
| JPS4916956B1 (ja) * | 1970-05-28 | 1974-04-25 | ||
| US3929579A (en) * | 1969-06-07 | 1975-12-30 | Dainippon Pharmaceutical Co | Dental caries-inducing microorganism cells lytic enzyme |
| JPS4916629B1 (ja) * | 1969-06-07 | 1974-04-23 | ||
| US3713983A (en) * | 1970-07-06 | 1973-01-30 | Kikkoman Shoyu Co Ltd | Method for preparing a thermostable and alkali-stable protease |
| US3751561A (en) * | 1970-11-23 | 1973-08-07 | Monsanto Co | Stable polymer-enzyme oral hygiene compositions |
-
1980
- 1980-01-24 JP JP755780A patent/JPS56106593A/ja active Granted
-
1981
- 1981-01-15 US US06/225,266 patent/US4364926A/en not_active Expired - Fee Related
- 1981-01-21 GB GB8101793A patent/GB2069501B/en not_active Expired
- 1981-01-23 DE DE19813102216 patent/DE3102216A1/de not_active Ceased
- 1981-01-23 FR FR8101315A patent/FR2482131A1/fr active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2069501A (en) | 1981-08-26 |
| GB2069501B (en) | 1983-11-23 |
| FR2482131A1 (fr) | 1981-11-13 |
| DE3102216A1 (de) | 1982-03-04 |
| US4364926A (en) | 1982-12-21 |
| JPS56106593A (en) | 1981-08-24 |
| FR2482131B1 (ja) | 1983-06-10 |
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