JPS6238657B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、クレアチニンの反応速度測定方法お
よびクレアチニンの反応速度測定用試薬に係り、
特に臨床生化学検査においてビリルビンの共存に
よる負誤差のない血清中のクレアチニンの反応速
度を測定するのに好適な、正確度の高いクレアチ
ニンの反応速度測定方法に関する。 臨床生化学検査においては、従来殆ど比色分析
が用いられてきたが、近年、より正確度の高い測
定への指向と測定機器の進歩の両面から、反応速
度測定方法（以下「レート法」という。）が重用
されつつある。 このレート法は、いわゆる被検物質の関与する
ある反応の速度を最も適当な時点、即ちできるだ
け、エンドジーナスな誤差が小さくなる時点にお
いて測定するものであるが、大別すると次の３種
類になる。 １ 被検物質が酵素であり、その酵素の関与する
適当な酵素反応の速度より被検物質の濃度（活
性値）を求めるもの。各種トランスアミラー
ゼ、フオスフアターゼ、ペプチダーゼなどの測
定に用いられている。 ２ 被検物質は酵素ではないが、その物質の関与
する適当な酵素反応の速度より被検物質の濃度
を求めるもの。各種脂質類、糖類などの測定に
用いられる。 ３ 被検物質が酵素でなく、それの関与する適当
な化学反応の速度より被検物質の濃度を求める
もの。 レート法は前記のようにエンドジーナスな誤差
を除くことによつて従来の比色法より正確度の高
いデータを得ることが目的であり、その意味から
特異性の高い酵素反応を用いる１と２の場合が最
も一般的に用いられており、レート法すなわち酵
素分析法とも言える現状である。 しかしながら純然たる化学反応による場合にお
いても、エンドジーナスな誤差を除くため、エン
ドポイント比色法よりもレート法を用いる方が有
利な場合がある。これが３の場合であり、その代
表的な例が血清中のクレアチニンのレート法であ
る。 クレアチニンは筋代謝物質で腎臓から排泄され
血清及び尿中のクレアチニン濃度は腎機能障害と
密接な関連があり、生化学検査の中でも最重要測
定項目の一つである。そのクレアチニンの測定法
としては、従来より次式(1)に示すアルカリ下にお
けるクレアチニンピクラートの形成を利用するヤ
ツフエ法がほとんど唯一的に用いられている。 すなわち、ヤツフエ法はアルカリ下でクレアチ
ニンとピクリン酸より生成するクレアチニンピク
ラートの吸収を500nｍ前後の波長で比色測定す
ることによつてクレアチニン濃度を求めるもので
ある。 この方法は操作が簡単で安定であるため実用性
が高いが、感度が余り高くないことと、反応が非
特異的であるという大きな難点をもつている。特
に、非特異性については、正常人の血清を測定し
た場合、測定値の約４分の１がクレアチニン以外
の陽性物質によるとさえ言われている。 即ち、蛋白質やアセトン体がクレアチニンと類
似の呈色反応をし、又各種の糖類やアスコルビン
酸などはピクリン酸を還元して紅色のピクラミン
を生成するため、これらはいずれも正誤差を与え
る。 これらの種々の正誤差を除くため、従来より
種々の工夫がなされている。例えば、用手法の場
合は沈殿ろ過法や透析法などによつて蛋白質を除
去した後にクレアチニンを測定する方法が用いら
れてきた。しかしながらこのような除蛋白操作は
煩雑であり、自動装置においては、界面活性剤を
応用することによつて、除蛋白操作を省略する方
法が採用されている。 しかしながら、界面活性剤によつても蛋白質に
よる誤差を完全に除くことはできない。しかも蛋
白以外の妨害物質に対しては何らの改良もなされ
ていないのが現状であり、臨床検査の最重要測定
項目の１つであるにもかかわらず、従来のクレア
チニンの比色測定は正確度の点で多大の問題を含
んでいる。 このような比色法における正誤差を除くため、
近年登場したのが前述のクレアチニンのレート法
である。このレート法では反応開始後、最適時点
においてクレアチニンピクラートの生成速度を
500nｍ附近の波長における吸光度の変化率より
求めるため、前述の各種妨害物質による誤差を低
減することが可能である。最適時点とは還元剤に
よるピクラミン生成が終了し、蛋白質やアセトン
体などとピクリン酸との反応が進行しない時点を
いう。このような最適時点においては吸光度の変
化は主としてクレアチニンピクラートの生成によ
るものであり、妨害物質による正誤差は従来の比
色法に比較して著しく低減される。 しかしながら、最近クレアチニンのレート法に
おいて、血清中に共存するビリルビンが負誤差を
与えることが判明した。しかも、このビリルビン
による妨害は反応開始後の全領域に表われるた
め、上述のレート測定の開始時点を如何に選んで
も、これによる誤差を除くことはできないことが
わかつた。 最近の実験によれば、クレアチニンのレート測
定におけるビリルビンによる負誤差は極めて大き
く、例えば20mg／dlのビリルビンを含む黄疽血清
を測定した場合、クレアチニンのレート測定値は
真値よりも1.0mg／dlも低いことがわかつた。ク
レアチニンの正常値が0.8〜1.2mg／dlであること
を考慮すれば、この負誤差は著しく大きく生化学
検査の信頼性を著しく損なうものである。 上記問題点を解決するために、本発明の目的は
ビリルビンの共存による負誤差がなく、高い正確
度で測定することのできるクレアチニンの反応速
度測定方法を提供することにある。 上記目的を達成するために本発明は、アルカリ
性下にある生体試料にピクリン酸を添加し、当該
生体試料中のクレアチニンと前記ピクリン酸との
間で形成されるクレアチニンピクラートの反応速
度から前記生体試料中のクレアチニンの濃度を求
めるクレアチニンの反応速度測定方法において、
前記生体試料を、ジクロルイソシアヌル酸、クロ
ラミンＢ、クロラミンＴ、及び、次亜塩素酸ナト
リウムからなる群のいずれか１種を含む試液中
で、当該生体試料中に含まれるビリルビンが酸化
されるまでインキユベーシヨンした後クレアチニ
ンピクラートを形成させ、当該クレアチニンピク
ラートの生成速度から前記生体試料中のクレアチ
ニンの濃度を求めることを特徴とするクレアチニ
ンの反応速度測定方法である。 以下本発明の原理を説明する。本発明者は、前
述のようなビリルビンによる負誤差の原因を究明
するため、クレアチニン測定試薬中に高ビリルビ
ンコントロール血清を添加して、ビリルビンのス
ペクトラムの時間的変化を調べた。その結果、こ
のような負誤差はビリルビンとピクリン酸との反
応によるものでなく、アルカリ下におけるビリル
ビンの酸化変性によるものであることがわかつ
た。その結果を第１図に示す。 即ち、第１図のスペクトラム１は10mg／dlのビ
リルビンを含む高ビリルビンコントロール血清を
クレアチニンのレート測定用試薬によつて希釈し
た直後の吸収曲線であり、スペクトラム２は同液
を37℃で20分間放置した後の吸収曲線である。希
釈率はクレアチニンのレート測定の場合と同様の
13倍である。また、スペクトラム３は１mg／dlの
クレアチニンを含むクレアチニン標準液を同液中
において37℃で20分間反応させた場合のクレアチ
ニンピクラートの吸収曲線である。なお、ここで
スペクトラム１〜３は全て試薬ブランク対照であ
る。 即ち、図から明らかな如く、ビリルビンはアル
カリ下で415nｍに吸収極大を有するが、この吸
収は時間の経過と共に減少し、逆に600nｍ前後
に極大を有するブロードな吸収が増大する。この
原因として、次式(2)に示すように、ビリルビンが
アルカリ下で酸化されてビリベルジンに変化する
ためと考えられる。 一方クレアチニンとピクリン酸の結合によるク
レアチニンピクラートは490nｍに吸収極大を有
するが、その発色感度は低く、１mg／dlのクレア
チニンを37℃で20分間反応させても、その吸収は
スペクトラム３に示す程度である。 即ち、第１図の３つのスペクトラムは、高濃度
のビリルビンを含む黄疽血清を前述のレート法で
測定すると、クレアチニンピクラートの生成によ
る吸収（500nｍ前後）の増加がビリルビンの酸
化による吸収の減少によつて相殺されるため、著
しく負誤差を呈することを示している。 この問題の解決の手段としては、次の３つの方
法が考えられる。 １ ビリルビンの酸化を防ぐ方法 ２ プレインキユーベーシヨンの時間を長くする
方法 ３ ビリルビンの酸化を促進する方法 ビリルビンの酸化を防ぐ方法としては試薬中に
還元剤を共存させる方法、或いはビリルビンと結
合してその安定性を増すような保護剤を共存させ
る方法が考えられる。しかしながら多くの還元剤
は前述のようにそれ自身がピクリン酸と反応し、
ビクラミンを生成するため、逆に正誤差を与える
可能性があり、それらの添加は好ましくないと考
えられる。またビリルビンは元来血清中において
は蛋白質と結合して安定化された状態で存在する
ものであるが、アルカリ水溶液中でさらに強力な
保護剤を見出するのは難しいし、仮にそのような
保護剤があつたとしても、ピクリン酸と反応した
りする可能性が高いと考えられる。 また、アルカリ下におけるプレインキユベーシ
ヨンの時間を十分に長くして、ビリルビンがほと
んど酸化されてからピクリン酸を添加してクレア
チニンを測定する方法は、原則的に正しく、用手
法の場合は有効である。しかしながら、第１図に
示すように、37℃で20分間放置してもビリルビン
の残量は50％程度もあり、全インキユベーシヨン
時間が５〜15分の最近の自動分析装置において、
この方法を用いることは余り効果がない。 そのため本発明においては、自動分析装置の全
インキユベーシヨン時間内で十分な効果が得られ
るように、ビリルビンの酸化を促進する方法を試
みた。この場合、必要な条件はビリルビンをでき
るだけ速やかに酸化するのは当然であるが、クレ
アチニンピクラートの生成を妨害しないことが重
要である。 そのため、種々の酸化剤を添加したクレアチニ
ン測定用試薬中ににおいてビリルビンの酸化速度
とクレアチニンピクラードの生成状況を検討し
た。 その結果、過酸化水素、過マンガン酸塩、重ク
ロム酸塩のように強力な酸化剤中ではビリルビン
は容易に速やかに酸化されることがわかつた。し
かもこの場合、第１図のような長波長領域におけ
る吸収の増大も見られず、ビリルビンはビリベル
ジンよりもさらに酸化された状態になると思われ
る。しかしながら一方、このような強力な酸化剤
の存在下ではクレアチニンピクラートも全く生成
されないことがわかつた。そこで、さらに検討し
た結果、比較的酸化力の弱い酸化剤であるジクロ
ルイソシアヌル酸、クロラミンＢ、クロラミン
Ｔ、次亜塩素酸ナトリウムが上述の目的に対して
最適であることがわかつた。第２図に１％のクロ
ラミンＢを添加したクレアチニンのレート測定用
試薬中における高ビリルビンコントロール血清
（10mg／dlのビリルビン含有）の吸収曲線の時間
的変化を示す。希釈率は13倍であり、スペクトラ
ム４は混合直後の吸収曲線であり、スペクトラム
５は同液を37℃で10分間放置した後の吸収曲線で
ある。即ち、１％のクロラミンＢを添加したクレ
アチニン測定用試薬中においてビリルビンは10分
以内でほとんど全部酸化されることを示してい
る。 また、第３図は１mg／dlのクレアチニン標準液
を、上述のクロラミンＢを添加した試薬と、添加
しない試薬の両方と同一条件（37℃で15分間）で
反応させた場合の吸収曲線である。希釈率は13倍
であり、スペクトラム７はクロラミンＢを添加し
た場合、スペクトラム６は添加しない場合を示し
ている。両方のスペクトラムは実験誤差の範囲内
で、一致しており、これは１％のクロラミンＢの
共存はクレアチニンビクラートの生成を全く妨害
しないことを示している。クロラミンＴとジクロ
ルイソシアヌル酸についても同様な結果が得られ
た。 即ち、第２図、第３図の結果は、クレアチニン
のレート法において、プレインキユベーシヨン時
にアルカリ中に適当な酸化剤を共存させ、ビリル
ビンをほぼ完全に酸化した後にビクリン酸を添加
してクレアチニンを測定すれば、前述の負誤差を
除くことが可能であることを示している。 クレアチニン測定用試薬中の塩素系酸化剤は通
常１〜10％程度の濃度であることが望ましい。１
％より少ないとビリルビンを完全に酸化すること
が難しいからである。又、10％を越えると塩素系
酸化剤が完全に溶けず、したがつてこれ以上の容
量を加えても試薬の浪費となるからである。 以下、自動分析装置に適用した本発明の実施例
を詳細に説明する。本実施例において、最初に試
料血清100μが0.6mlの第１試液と共に反応容器
中に希釈サンプリングされる。この第１試液は従
来のアルカリ緩衝液を使用する。具体的には１
当り5.2ｇのリン酸２ナトリウム、15.0ｇの硼酸
ナトリウム、15.0ｇの水酸ナトリウム、6.0ｇの
塩化ナトリウムを含むものである。 そして、この第１試薬に10.0ｇ／のクロラミ
ンＢを添加する。 前記反応容器は37℃で12分間プレインキユーベ
ーシヨンされる。次いで0.6mlの第２試液が添加
されるが、この第２試液は従来のもの（１当り
3.2ｇのピクリン酸と1.0ｇのラウリル硫酸ナトリ
ウムを含む）と同一のものである。第２試液を添
加してから２分後にこの被検液をレート測定用光
度計の恒温槽（37℃）フローセル中に吸入し、
505nｍの波長の吸光度を１分間測定して、その
吸光度上昇速度とクレアチニン濃度の関係は濃度
既知の高ビリルビンコントロール血清（20mg／
dl）とクレアチニン標準液（10mg／dl）を３種の
割合で混合して作つた疑似試料を上述の方法と従
来のレート法の両方で測定した結果を示す。

【表】 第１表から明らかなように、従来法ではビリル
ビンの濃度が増大するほどクレアチニンの実測値
が理論値より低くなるが、本発明法による実測値
ではそのような誤差はないことがわかる。 なお前記実施例は、本発明を、臨床生化学検査
における血清中のクレアチニンの反応速度測定に
適用したものであるが、本発明の適用範囲はこれ
に限定されず、尿等他の一般の生体試料中のクレ
アチニンの反応速度測定にも同様に適用できるこ
とは明らかである。 以上説明したとおり、本発明は、生体試料中に
アルカリ下でピクリン酸を添加してクレアチニン
ピクラートの生成速度よりクレアチニン濃度を求
めるクレアチニンの反応速度測定方法及びその測
定用試薬であり、生体試料中のビリルビンの酸化
を促進し、且つ、クレアチニンピクラートの生成
を妨害しない酸化剤を含む試液中で、生体試料を
インキユベーシヨンした後、クレアチニンピクラ
ートの生成速度を測定することができる。従つ
て、従来のレート法の試薬に適当な酸化剤を添加
するのみでクレアチニンのレート測定の正確度を
著しく高めることができ、臨床検査の信頼性が著
しく向上するという優れた効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルカリ下におけるビリルビンの酸
化によるスペクトラムの変動を示す線図、第２図
は、酸化剤共存によるビリルビンの酸化の促進状
態を示す線図、第３図は、酸化剤のクレアチニン
ピクラート生成への影響を示す線図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルカリ性下にある生体試料にピクリン酸を
   添加し、当該生体試料中のクレアチニンと前記ピ
   クリン酸との間で形成されるクレアチニンピクラ
   ートの反応速度から前記生体試料中のクレアチニ
   ンの濃度を求めるクレアチニンの反応速度測定方
   法において、前記生体試料を、ジクロルイソシア
   ヌル酸、クロラミンＢ、クロラミンＴ、及び、次
   亜塩素酸ナトリウムからなる群のいずれか１種を
   含む試液中で、当該生体試料中に含まれるビリル
   ビンが酸化されるまでインキユベーシヨンした後
   クレアチニンピクラートを形成させ、当該クレア
   チニンピクラートの生成速度から前記生体試料中
   のクレアチニンの濃度を求めることを特徴とする
   クレアチニンの反応速度測定方法。