JPS6239600A - 双し類幼虫に有毒な新規ポリペプチド類 - Google Patents
双し類幼虫に有毒な新規ポリペプチド類Info
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- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は双し煩幼虫に毒性のあろ新規ポリペプチド類に
関する。
関する。
［先行技術及び問題点］
蚊のような人を刺す双し類のハエ類は、世界中で医学上
、経済上重要な大問題を生している。現在の防除法に殺
幼虫があるが、これは防除薬剤を主に水生幼虫に施用す
るものである。これらの薬剤はしばしば、環境に著しい
悪影響を生し、このため慎重に使用されなければならな
い。現在使用の殺虫剤には、微生物学的につくられる生
物学的殺虫剤バシラス・スリンギエンシス・バラエティ
・イスラエレンシスがある。この細菌は胞子形成により
、双し頚幼虫に非常に特異的な毒素を含有する蛋白質性
の結晶をつくる。補乳類、魚類、鳥類、また他の昆虫類
に対しても毒性は認められない。しかし、市販の製剤中
に存在する生育可能な胞子が環境災害を起こす可能性が
ある。蛋白質と考えられる毒素は相当な研究の主題であ
った。
、経済上重要な大問題を生している。現在の防除法に殺
幼虫があるが、これは防除薬剤を主に水生幼虫に施用す
るものである。これらの薬剤はしばしば、環境に著しい
悪影響を生し、このため慎重に使用されなければならな
い。現在使用の殺虫剤には、微生物学的につくられる生
物学的殺虫剤バシラス・スリンギエンシス・バラエティ
・イスラエレンシスがある。この細菌は胞子形成により
、双し頚幼虫に非常に特異的な毒素を含有する蛋白質性
の結晶をつくる。補乳類、魚類、鳥類、また他の昆虫類
に対しても毒性は認められない。しかし、市販の製剤中
に存在する生育可能な胞子が環境災害を起こす可能性が
ある。蛋白質と考えられる毒素は相当な研究の主題であ
った。
バシラス・スリンギエンシス・バラＩティ・イスラエレ
ンシス（Ｂｔｉ）は、蚊の幼虫に対する特異的な病原体
として、１９７７年にイスラエルのネゲブ地域で初めて
確認された胞子形成菌である［ゴールトバーグーエルー
ジエイ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、 Ｌ、Ｊ、）及びマルガリ
ット・ジエイ（Ｍａｒｇａｌｉｔｔ、 Ｊ、）（１９７
７年）モスキード・ニュース３７巻３５５−３５８頁コ
。その独特の性状のため、蚊とブヨ（ｂｌａｃｋ ｆｌ
ｙ）に対する非常に特異的な防除剤として、いち早く商
業化された。有毒因子を確認し単離する幾つかの試みが
、現在報告されている。胞子化されたバシラスからのパ
ラ胞子結晶が毒性活性を含み、しかも胞子自体が必要で
はないことが知られている［ティレル・ディー・ジェイ
（Ｔｙｒｅｌ ｌ 、 Ｄ、、１．）、デビットマン・
エル−アイ（Ｄａｖｉｄｓｏｎ、 Ｌ、１．）、ブラ争
エル・エイ（Ｂｕｔ Ｉａ、Ｌ、Ａ、）及びラモスカ啼
ダブリューーｘイ （Ｒａｍｏｓｋａ、Ｗ、Ａ、）（１
９７９年） ＡｐｐＨｉｅｄ ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃ−ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８巻６
５６−６５８頁］。
ンシス（Ｂｔｉ）は、蚊の幼虫に対する特異的な病原体
として、１９７７年にイスラエルのネゲブ地域で初めて
確認された胞子形成菌である［ゴールトバーグーエルー
ジエイ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、 Ｌ、Ｊ、）及びマルガリ
ット・ジエイ（Ｍａｒｇａｌｉｔｔ、 Ｊ、）（１９７
７年）モスキード・ニュース３７巻３５５−３５８頁コ
。その独特の性状のため、蚊とブヨ（ｂｌａｃｋ ｆｌ
ｙ）に対する非常に特異的な防除剤として、いち早く商
業化された。有毒因子を確認し単離する幾つかの試みが
、現在報告されている。胞子化されたバシラスからのパ
ラ胞子結晶が毒性活性を含み、しかも胞子自体が必要で
はないことが知られている［ティレル・ディー・ジェイ
（Ｔｙｒｅｌ ｌ 、 Ｄ、、１．）、デビットマン・
エル−アイ（Ｄａｖｉｄｓｏｎ、 Ｌ、１．）、ブラ争
エル・エイ（Ｂｕｔ Ｉａ、Ｌ、Ａ、）及びラモスカ啼
ダブリューーｘイ （Ｒａｍｏｓｋａ、Ｗ、Ａ、）（１
９７９年） ＡｐｐＨｉｅｄ ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃ−ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８巻６
５６−６５８頁］。
蚊幼虫のＬＣ５０は０．２ｎｇ／ｉｔ程度の低さである
と報告されたく結晶の乾燥重量に基づく）。ごれらの結
晶をアルカリ緩衝液、例えは５０ ｍＭ炭酸ナトリウム
（ｐｔｌ １０．５）で抽出すると、結晶マトリックス
゛から毒性因子が可溶型になって放出される［チルコツ
ト・シー・エヌ（Ｃｈｉ Ｉｃｏｔｔ、 Ｃ，Ｎ、）、
カルマコフ・シエイ（Ｋａｌ−ｍａｋｏｆｆ、 Ｊ、）
及びピレイ・ジエイ・ニス（Ｐｉｌｌａｉ、 Ｊ、Ｓ、
）（１９８１年） Ｐｒｏｃ、 Ｉノ旧■。
と報告されたく結晶の乾燥重量に基づく）。ごれらの結
晶をアルカリ緩衝液、例えは５０ ｍＭ炭酸ナトリウム
（ｐｔｌ １０．５）で抽出すると、結晶マトリックス
゛から毒性因子が可溶型になって放出される［チルコツ
ト・シー・エヌ（Ｃｈｉ Ｉｃｏｔｔ、 Ｃ，Ｎ、）、
カルマコフ・シエイ（Ｋａｌ−ｍａｋｏｆｆ、 Ｊ、）
及びピレイ・ジエイ・ニス（Ｐｉｌｌａｉ、 Ｊ、Ｓ、
）（１９８１年） Ｐｒｏｃ、 Ｉノ旧■。
Ｏｔａｇｏ Ｍｅｄ、 Ｓｃｈ、５９巻４０−４１頁；
ティレル・ディー・ジエイ、ブラ・エル・エイ、アント
リユース・アール・イー（ＡｎＪｒｅｗｓ、 Ｒ，Ｅ、
）、クレーマー・ケイ・ジエイ（Ｋｒａ−ｍｅｒ、に、
Ｊ、）、デビットマン・エル・アイ、及びノーディン・
ビー（Ｎｏｒｄｉｎ、 Ｐ、）（１９８１年） Ｊ、
Ｂａｃｔ、１４５巻＋０５２−１０６２頁］。放出は特
異的活性（１０倍以上）の減少を伴う。おそらくこれは
、不溶性粒状毒素がフィルターフィーディング幼虫（ｆ
ｉｌｔ、ｅｒ ｆｅｅｄｉｎｇ １ａｒｖａｅ）によ
って、よりたやすく同化されるためである［グツド・ア
ール・エッチ（Ｄａｄｄ、Ｒ，Ｈ，）（１９７５年）
Ｊ、 ＥＸＴ）、ＺＯＯＩ。
ティレル・ディー・ジエイ、ブラ・エル・エイ、アント
リユース・アール・イー（ＡｎＪｒｅｗｓ、 Ｒ，Ｅ、
）、クレーマー・ケイ・ジエイ（Ｋｒａ−ｍｅｒ、に、
Ｊ、）、デビットマン・エル・アイ、及びノーディン・
ビー（Ｎｏｒｄｉｎ、 Ｐ、）（１９８１年） Ｊ、
Ｂａｃｔ、１４５巻＋０５２−１０６２頁］。放出は特
異的活性（１０倍以上）の減少を伴う。おそらくこれは
、不溶性粒状毒素がフィルターフィーディング幼虫（ｆ
ｉｌｔ、ｅｒ ｆｅｅｄｉｎｇ １ａｒｖａｅ）によ
って、よりたやすく同化されるためである［グツド・ア
ール・エッチ（Ｄａｄｄ、Ｒ，Ｈ，）（１９７５年）
Ｊ、 ＥＸＴ）、ＺＯＯＩ。
１９１巻３９５−３９７頁］。はとんどの毒性は除去さ
れるが、幾分は抽出された結晶に結合されたまま残る［
シュネル・ディー （Ｓｃｈｎｅｌｌ、 Ｄ、）、フ７
ネンスティール・エム・エイ（Ｐｆａｎｎｅ’ｎ５ｔｉ
ｅｌ、 Ｍ、Ａ、）及びニッカーソン・ケイ・ダブリュ
ー（Ｎ１ｃｋｅｒｓｏｎ。
れるが、幾分は抽出された結晶に結合されたまま残る［
シュネル・ディー （Ｓｃｈｎｅｌｌ、 Ｄ、）、フ７
ネンスティール・エム・エイ（Ｐｆａｎｎｅ’ｎ５ｔｉ
ｅｌ、 Ｍ、Ａ、）及びニッカーソン・ケイ・ダブリュ
ー（Ｎ１ｃｋｅｒｓｏｎ。
ＬＷ、）（１９８４年） ５ｃｉ−ｅｎｃｅ ２２３巻
１１９＋−１１９３頁コ。
１１９＋−１１９３頁コ。
未抽出結晶と可溶性抽出液双方の活性が、加熱又は多大
のプロテアーゼ処理によって破壊されることは、毒性因
子が蛋白質であることを示唆している。可溶性抽出液中
に存在する蛋白質の分析はＭＷ２６０００−２８０００
（２６Ｋ）の主要蛋白種を、他の蛋白質と共に明らか
にしている［ティレルφディー・ジエイ、ブラ・エル・
エイ、アントリユース・アール・イー、クレーマー・ケ
イ・ジェイ、デビットマン・エル・アイ、及びノーディ
ン・ビー（１９８１年）Ｊ、 Ｂａｃｔ、Ｉ４５巻１０
５２−１０６２頁；トーマス令ダブ瞥ツユー争イー（Ｔ
ｈｏ−ｍａｓ、Ｗ、Ｅ、）及びイーシー・ディー・ジェ
イ（Ｅｌｌａｒ、 Ｄ、Ｊ、）（１９８３年） Ｊ、Ｃ
ｅ！１Ｓｃｉ、 ｆ３０巻１８１−１９７頁］。この２
６に蛋白質は、一般的な細胞溶解活性をもっことが立証
され［トーマス・ダブリュー・イー及びイーシー・ディ
ー・ジエイ・ （１９８３年） ＦＥＢＳレター１５４
巻３６２−３６８頁］、特異的な双し類δ−エンドトキ
シンであると報告された［ヤマモト・ティー（ｙａｍａ
ｎ＋ｏｔｏ、 Ｔ、）、イイズカ・ティー（ｌｉｚｕｋ
ａ、 Ｔ、）及びアーロンソン・ジエイ・エヌ（Ａａｒ
ｏｎｓｏｎ、Ｊ、Ｎ−）（１９８３年）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９巻２９７−２８４頁；ア
ームストロング・ジエイーエル（Ａｒｍｓ−ｔｒｏｎｇ
、 Ｊ、Ｌ、）、ローアマン・ジーーｘフ（Ｒｏｈｒ−
ｎ＋ａｎｎ、Ｇ、Ｆ、）及びボードロー・ジー・ニス（
Ｂｅａｕｄ’−ｒｅａｕ、 Ｇ、Ｓ、）（１９８５年〉
Ｊ。
のプロテアーゼ処理によって破壊されることは、毒性因
子が蛋白質であることを示唆している。可溶性抽出液中
に存在する蛋白質の分析はＭＷ２６０００−２８０００
（２６Ｋ）の主要蛋白種を、他の蛋白質と共に明らか
にしている［ティレルφディー・ジエイ、ブラ・エル・
エイ、アントリユース・アール・イー、クレーマー・ケ
イ・ジェイ、デビットマン・エル・アイ、及びノーディ
ン・ビー（１９８１年）Ｊ、 Ｂａｃｔ、Ｉ４５巻１０
５２−１０６２頁；トーマス令ダブ瞥ツユー争イー（Ｔ
ｈｏ−ｍａｓ、Ｗ、Ｅ、）及びイーシー・ディー・ジェ
イ（Ｅｌｌａｒ、 Ｄ、Ｊ、）（１９８３年） Ｊ、Ｃ
ｅ！１Ｓｃｉ、 ｆ３０巻１８１−１９７頁］。この２
６に蛋白質は、一般的な細胞溶解活性をもっことが立証
され［トーマス・ダブリュー・イー及びイーシー・ディ
ー・ジエイ・ （１９８３年） ＦＥＢＳレター１５４
巻３６２−３６８頁］、特異的な双し類δ−エンドトキ
シンであると報告された［ヤマモト・ティー（ｙａｍａ
ｎ＋ｏｔｏ、 Ｔ、）、イイズカ・ティー（ｌｉｚｕｋ
ａ、 Ｔ、）及びアーロンソン・ジエイ・エヌ（Ａａｒ
ｏｎｓｏｎ、Ｊ、Ｎ−）（１９８３年）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９巻２９７−２８４頁；ア
ームストロング・ジエイーエル（Ａｒｍｓ−ｔｒｏｎｇ
、 Ｊ、Ｌ、）、ローアマン・ジーーｘフ（Ｒｏｈｒ−
ｎ＋ａｎｎ、Ｇ、Ｆ、）及びボードロー・ジー・ニス（
Ｂｅａｕｄ’−ｒｅａｕ、 Ｇ、Ｓ、）（１９８５年〉
Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １６１巻３９−４６巻コ。２６
に蛋白質を暗号化した遺伝子は、最近クローン化され、
組替え遺伝子生成物は、細胞培養基検定で細胞溶解性が
あり、蚊の幼虫に対して毒性があると報告された［ウォ
ート・イー・ニス（Ｗａｒｄ、 Ｅ、Ｓ、）、イーシー
・ディー・ジェイ、及びドツト・ジェイ・エイ（Ｔｏｄ
ｄ、Ｊ、Ａ、）（１９８４年） ＦＥＢＳレター１７
５巻３７７−３８２頁］。
に蛋白質を暗号化した遺伝子は、最近クローン化され、
組替え遺伝子生成物は、細胞培養基検定で細胞溶解性が
あり、蚊の幼虫に対して毒性があると報告された［ウォ
ート・イー・ニス（Ｗａｒｄ、 Ｅ、Ｓ、）、イーシー
・ディー・ジェイ、及びドツト・ジェイ・エイ（Ｔｏｄ
ｄ、Ｊ、Ａ、）（１９８４年） ＦＥＢＳレター１７
５巻３７７−３８２頁］。
［問題点を解決する手段］
本発明では双し類の幼虫に対する特異的な毒性という生
物学的性状をもつ新規なポリペプチド類を明らかにし、
特許請求している。これらの新規ポリペプチド類はバシ
ラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラエレンシ
ス（Ｂｔｉ）のパラ胞子結晶のアルカリ抽出液中に以下
の性状によって明瞭に確認されろ。
物学的性状をもつ新規なポリペプチド類を明らかにし、
特許請求している。これらの新規ポリペプチド類はバシ
ラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラエレンシ
ス（Ｂｔｉ）のパラ胞子結晶のアルカリ抽出液中に以下
の性状によって明瞭に確認されろ。
３５にポリペプチド：
１、変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウｂの存在下にゲル電
気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３００
０ｄ。
気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３００
０ｄ。
２、連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せにより測定され
る等電点が約６，５±０．３゜ ３、全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性を
失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び ４、双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣｓ ｏは０．
０５７４ｇ／ｍｌ未満。
る等電点が約６，５±０．３゜ ３、全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性を
失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び ４、双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣｓ ｏは０．
０５７４ｇ／ｍｌ未満。
６６にポリペプチド：
１ 、５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定されろ分子量が、約６６
０００ｄ±４０００ｄ。
０００ｄ±４０００ｄ。
２、これを蛋白分解的消化にかけると、次の特徴をもつ
ポリペプチドを生ずる。
ポリペプチドを生ずる。
（ａ）変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にゲル
電気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３０
００ｄ。
電気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３０
００ｄ。
（ｂ）連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せにより測定さ
れる等電点が約６．５±０．３。
れる等電点が約６．５±０．３。
（ｃ）全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （ｄ）双し頚幼虫に対する毒性があり、ＬＣ５Ｇは０．
０５μ８７ｍ１未満。
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （ｄ）双し頚幼虫に対する毒性があり、ＬＣ５Ｇは０．
０５μ８７ｍ１未満。
３、双し類幼虫に対し特異的な毒性をもつ。
本発明の新規ポリペプチド類は、Ｂｔｉの結晶抽出液か
ら単離される０本発明に使用されろ単離及び特性化手順
は、下の実施例に提示されている。
ら単離される０本発明に使用されろ単離及び特性化手順
は、下の実施例に提示されている。
Ｂｔｉ結晶は、任意の８ｔｉ菌から得ることができる。
例えば、適した給源は合衆国メリーラント州ロックビル
に所在するアメリカ標準培養基保存機関から人手できる
バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラエレ
ンシス、ＡＴＣＣ３５６４６、である。
に所在するアメリカ標準培養基保存機関から人手できる
バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラエレ
ンシス、ＡＴＣＣ３５６４６、である。
本発明の新規ポリペプチド類は、双し頌幼虫の場所を処
理するために種々の方法で処方できる。
理するために種々の方法で処方できる。
本明細書に記載の膜結合性状のため・これらのポリペプ
チドや双し類幼虫に対して活性のある他のＢｔｉポリペ
プチド類を、燐脂質小胞へ吸収させて粒状型にすること
カニできる。これは殺幼虫ポリペプチドをフィルターフ
ィーディイング性の双し類幼虫にあてがう効果的な手段
となる。水性懸濁液中における天然又は合成脂質小胞へ
の殺幼虫ポリペプチド類の受動的結合により、特異的吸
収が起こりうる。脂質小胞は、赤血球や他の細胞膜のよ
うな天然給源から、又は水中でコロイド懸濁液を形成で
きるレシチンや他の脂質化合物類のような合成化合物類
から得られる。粒状吸収剤はラテックスビーズ［シュネ
ル・ディー、ファネンスティール・エム・エイ、及びニ
ッカースン・ケイ番ダブリュー（１９８４年） ５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２２３巻＋１９１−１１９３頁コや低密度ポ
リエチレン小胞（警ＰＩ Ａｃｃ、 Ｎｏ、８５−１０
１４５５／Ｉ７）でもよい。
チドや双し類幼虫に対して活性のある他のＢｔｉポリペ
プチド類を、燐脂質小胞へ吸収させて粒状型にすること
カニできる。これは殺幼虫ポリペプチドをフィルターフ
ィーディイング性の双し類幼虫にあてがう効果的な手段
となる。水性懸濁液中における天然又は合成脂質小胞へ
の殺幼虫ポリペプチド類の受動的結合により、特異的吸
収が起こりうる。脂質小胞は、赤血球や他の細胞膜のよ
うな天然給源から、又は水中でコロイド懸濁液を形成で
きるレシチンや他の脂質化合物類のような合成化合物類
から得られる。粒状吸収剤はラテックスビーズ［シュネ
ル・ディー、ファネンスティール・エム・エイ、及びニ
ッカースン・ケイ番ダブリュー（１９８４年） ５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２２３巻＋１９１−１１９３頁コや低密度ポ
リエチレン小胞（警ＰＩ Ａｃｃ、 Ｎｏ、８５−１０
１４５５／Ｉ７）でもよい。
ポリペプチド類は、無機ミネラル類（フィロ珪酸塩、炭
酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）や、植物材料（粉末トウモロ
コシ穂軸、もみ殻、くるみ殻等）のような種々の不活性
材料と混合することによって、水和剤、粒剤又は粉剤と
して処方できる。処方剤は展開／粘着助剤、安定化剤、
他の殺虫添加剤、又は表面活性剤を包含する。液体処方
剤は、水性基盤又は非水性基上のものであって、フオー
ム、ゲル、ｔ１濁液、乳剤等として使用できる。成分は
流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は１合体を包含
できる。
酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）や、植物材料（粉末トウモロ
コシ穂軸、もみ殻、くるみ殻等）のような種々の不活性
材料と混合することによって、水和剤、粒剤又は粉剤と
して処方できる。処方剤は展開／粘着助剤、安定化剤、
他の殺虫添加剤、又は表面活性剤を包含する。液体処方
剤は、水性基盤又は非水性基上のものであって、フオー
ム、ゲル、ｔ１濁液、乳剤等として使用できる。成分は
流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は１合体を包含
できる。
殺虫濃度は特定処方剤の性格、特に濃厚液であるか、直
接に使用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は
、１重量％未満ても、１００重量％ても存在しうる。乾
燥処方剤は、約１−９５重量％の殺虫剤をもちつるが、
液体処方剤は概して液相中ｔこ約１−６０重量％の固形
分をもつ。
接に使用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は
、１重量％未満ても、１００重量％ても存在しうる。乾
燥処方剤は、約１−９５重量％の殺虫剤をもちつるが、
液体処方剤は概して液相中ｔこ約１−６０重量％の固形
分をもつ。
処方剤は、双し類幼虫の環境、例えば植物、±ｊｇ、又
は水への噴霧、散布、散水等によって施用できる。 以
下は、本発明実施にとって最良の態様を含めた手順を例
示する実施例である。これらの実施例は限定的に考えら
れてはならない。他に注意がなければ、百分率はすべて
重量であり、溶媒混合物の割合はずへて容量による。
は水への噴霧、散布、散水等によって施用できる。 以
下は、本発明実施にとって最良の態様を含めた手順を例
示する実施例である。これらの実施例は限定的に考えら
れてはならない。他に注意がなければ、百分率はすべて
重量であり、溶媒混合物の割合はずへて容量による。
実施例１ 溶血活性からの蚊幼虫活性の分離レノクラフ
ィンＲて形成される密度勾配玉の遠心により、Ｂｔｉか
らのバラ胞子結晶を精製する［ティレルやティー伊シエ
イ、テビットソン・エル・アイ、ブラ・エル・エイ、及
びラモスカ・ダブリュー・エイ（１９７９年） Ａｐｐ
Ｈｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ−ｍｅｎｔａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８巻０５６−６５８頁］。
ィンＲて形成される密度勾配玉の遠心により、Ｂｔｉか
らのバラ胞子結晶を精製する［ティレルやティー伊シエ
イ、テビットソン・エル・アイ、ブラ・エル・エイ、及
びラモスカ・ダブリュー・エイ（１９７９年） Ａｐｐ
Ｈｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ−ｍｅｎｔａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８巻０５６−６５８頁］。
この手法は、結晶を胞子から、また細胞砕片から分離す
る。精製された結晶を、５０ ｍＭ Ｎａ２Ｃ０３（ｐ
ｔｌ １０．５）を含む緩衝液で３７℃、１時間抽出す
る。この抽出手順で、分子量〜６５０００ｄ及び２ｓｏ
ｏｏｊの種を含む種々の可溶性蛋白質、並びに３２００
０ｄ−３６０００ｄの分子量範囲の幾つかの蛋白質の複
合体が放出される。。
る。精製された結晶を、５０ ｍＭ Ｎａ２Ｃ０３（ｐ
ｔｌ １０．５）を含む緩衝液で３７℃、１時間抽出す
る。この抽出手順で、分子量〜６５０００ｄ及び２ｓｏ
ｏｏｊの種を含む種々の可溶性蛋白質、並びに３２００
０ｄ−３６０００ｄの分子量範囲の幾つかの蛋白質の複
合体が放出される。。
この技術で周知のように、これらの蛋白質を視覚化し、
トデンル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリル
アミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量
測定をおこない、続いてクマシーブルＲ２５０で染色す
る［レムリ・ニー・ケイ（Ｌａｅｎ＋−ｍｌｉ、 Ｕ、
に、）（１９７０年） Ｎａｔｕｒｅ ２２７巻６８０
−６８５頁］。
トデンル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリル
アミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量
測定をおこない、続いてクマシーブルＲ２５０で染色す
る［レムリ・ニー・ケイ（Ｌａｅｎ＋−ｍｌｉ、 Ｕ、
に、）（１９７０年） Ｎａｔｕｒｅ ２２７巻６８０
−６８５頁］。
これらの可溶性抽出液は、少なくとも二つの生物学的活
性をもつことが立証された。一つは一般細胞溶解活性で
、時間と温度に依存し、培養基中の広範囲の細胞を溶解
できる。もう一つは蚊の幼虫に対する非電に特異的な毒
性である。一般的細胞溶解活性は、哺乳類赤血球（ＲＢ
Ｃ）の溶血によって検定するのが最も好都合である。検
定は以下のように行われろ。
性をもつことが立証された。一つは一般細胞溶解活性で
、時間と温度に依存し、培養基中の広範囲の細胞を溶解
できる。もう一つは蚊の幼虫に対する非電に特異的な毒
性である。一般的細胞溶解活性は、哺乳類赤血球（ＲＢ
Ｃ）の溶血によって検定するのが最も好都合である。検
定は以下のように行われろ。
１ 、１１ＩｔＩ乳類（ヒト、うさぎ、又はねずみのい
ずれも同しように使用可能）の新鮮又は保存赤血球細胞
を血しよう除去のため、等張食塩水（２５ｍＭ燐酸塩、
ｐＨ６，８： １２５ ｎＭ ＮａＣ１） （ＰＢＳ）
で洗う。細胞を遠心分離（１００ｃ）ｇ、１０分）によ
って集め、ベレット化された赤血球細胞１ ｍｌを等張
食塩水１０ｍ１に懸濁し、１０％と定義されろ懸濁１＾
をつくる。
ずれも同しように使用可能）の新鮮又は保存赤血球細胞
を血しよう除去のため、等張食塩水（２５ｍＭ燐酸塩、
ｐＨ６，８： １２５ ｎＭ ＮａＣ１） （ＰＢＳ）
で洗う。細胞を遠心分離（１００ｃ）ｇ、１０分）によ
って集め、ベレット化された赤血球細胞１ ｍｌを等張
食塩水１０ｍ１に懸濁し、１０％と定義されろ懸濁１＾
をつくる。
２、試験試料を等張緩重液に入れろ。緩衝液自体の選択
は決定的ではないが、浸透圧衝撃による細胞溶解をさけ
るために溶１夜を等張させるのが必須である。
は決定的ではないが、浸透圧衝撃による細胞溶解をさけ
るために溶１夜を等張させるのが必須である。
３．１０％赤血球懸濁液！００μｍと試験試料１００μ
ｍを一緒にする。多数検定を行う場合（例えばカラムフ
ラクションを検定する時）、９６ウエルのミクロタイタ
ープレートでこれを行うのが好都合である。検定試料を
振とうしながら３７℃で３０分培養する。このあと細胞
を静置し、検定上澄み液２５μｍを水で１１に希釈し、
４１０ ｎ＋ｗでの光学密度を測定することにより、定
性的（＋＋＝全体的溶解、＋＝部分的溶解、又は０＝溶
解なし）又は定量的に検定を採点する。
ｍを一緒にする。多数検定を行う場合（例えばカラムフ
ラクションを検定する時）、９６ウエルのミクロタイタ
ープレートでこれを行うのが好都合である。検定試料を
振とうしながら３７℃で３０分培養する。このあと細胞
を静置し、検定上澄み液２５μｍを水で１１に希釈し、
４１０ ｎ＋ｗでの光学密度を測定することにより、定
性的（＋＋＝全体的溶解、＋＝部分的溶解、又は０＝溶
解なし）又は定量的に検定を採点する。
脱イオン水５ＩＩ１１中に蚊幼虫５匹を入れたバイアル
に試験試料の少量を直接添加することにより、殺幼虫活
性を検定できる。この生物検定を２４時間後に読み取り
、ＬＣ５［１を個々の゛試料の希釈系統から決定する。
に試験試料の少量を直接添加することにより、殺幼虫活
性を検定できる。この生物検定を２４時間後に読み取り
、ＬＣ５［１を個々の゛試料の希釈系統から決定する。
双し類毒性からの一般細胞溶解活性の分離は、ウルトロ
ゲル” ＡｃＡ３４ （ＬＫＢ、ブローマ社、スエーデ
ン）又は同等物のカラム上で、５０ｎ＋Ｍ）リス−〇Ｃ
Ｉ （ｐＨ８，０）及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む
緩衝液中で達成される。カラム寸法は２ｘ７５ｃｍであ
り、〜７１１時の率で溶離を行う。３．７ ｍｌフラク
ションを集め、溶離を２８０ ｎｉで監視する。
ゲル” ＡｃＡ３４ （ＬＫＢ、ブローマ社、スエーデ
ン）又は同等物のカラム上で、５０ｎ＋Ｍ）リス−〇Ｃ
Ｉ （ｐＨ８，０）及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む
緩衝液中で達成される。カラム寸法は２ｘ７５ｃｍであ
り、〜７１１時の率で溶離を行う。３．７ ｍｌフラク
ションを集め、溶離を２８０ ｎｉで監視する。
２８０ ｎｍ吸収ピークが幾つか認められるが、双し類
毒性はフラクション２１（ピーク■）と３０（ピーク■
）を中心とする２ビークに分割される一方、溶血活性は
フラクション３６を中心とする１ビークに限定される。
毒性はフラクション２１（ピーク■）と３０（ピーク■
）を中心とする２ビークに分割される一方、溶血活性は
フラクション３６を中心とする１ビークに限定される。
フラクション３６では１０−１５μｇ／ｍｌの高蛋白濃
度でも、蚊幼虫に対する毒性は検出てきない。逆に、毒
性ピークには、溶血活性がほとんど、又はまったく付随
していない。
度でも、蚊幼虫に対する毒性は検出てきない。逆に、毒
性ピークには、溶血活性がほとんど、又はまったく付随
していない。
これらの毒性ピークフラクションの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分
析は、ピーク■に２主要蛋白質の存在を明らかにしてい
る。これらのバンドの分子量は、標準との比較により６
６０００ｄ±４０００ｄと３５０００ｄ±３０００１と
測定される。放置すると、６６０００ｄのバンドは消滅
するのが観察され、３５０００ｄのバンドは強度が高ま
る。
析は、ピーク■に２主要蛋白質の存在を明らかにしてい
る。これらのバンドの分子量は、標準との比較により６
６０００ｄ±４０００ｄと３５０００ｄ±３０００１と
測定される。放置すると、６６０００ｄのバンドは消滅
するのが観察され、３５０００ｄのバンドは強度が高ま
る。
毒性の著しい損失は検出されない。これは６６０００ｄ
の蛋白質が分子ｆｌｔ３５０００ｄのより小さい蛋白質
の前駆物質であり、小さいほうの断片が大きいほうのプ
ロトキシンの毒性全部を保持していることを示唆してい
る。
の蛋白質が分子ｆｌｔ３５０００ｄのより小さい蛋白質
の前駆物質であり、小さいほうの断片が大きいほうのプ
ロトキシンの毒性全部を保持していることを示唆してい
る。
ピークＨのＳＤＳゲル分析は、６６０００ｄ蛋白質の検
出可能な痕跡を明らかにしていない。代りに、三つ以上
の蛋白質の複合体が３２０００ｄから約３６０００ｄま
での範囲の分子量で見られる。それより低い分子量の蛋
白質は検出てきない。
出可能な痕跡を明らかにしていない。代りに、三つ以上
の蛋白質の複合体が３２０００ｄから約３６０００ｄま
での範囲の分子量で見られる。それより低い分子量の蛋
白質は検出てきない。
フラクション３６を中心とする溶血活性のピークは、主
要構成分として２６０００ｄ蛋白質を含有することがわ
かっている。このバンドは、Ｂｔｉ結晶中に存在する主
要種の清１２６に蛋白質に対してつくられる抗血清と強
力に反応する。ある重要な観察は、２６Ｋの特異的抗血
清とピークｒ及びＨに存在する任意の蛋白質との間には
有意の相互反応性が認められないことである。これは、
溶血ピークの主成分である２［３０００ｄ （２６Ｋ）
蛋白質が双し類毒性に関与している蛋白質と無関係であ
ることを示している。
要構成分として２６０００ｄ蛋白質を含有することがわ
かっている。このバンドは、Ｂｔｉ結晶中に存在する主
要種の清１２６に蛋白質に対してつくられる抗血清と強
力に反応する。ある重要な観察は、２６Ｋの特異的抗血
清とピークｒ及びＨに存在する任意の蛋白質との間には
有意の相互反応性が認められないことである。これは、
溶血ピークの主成分である２［３０００ｄ （２６Ｋ）
蛋白質が双し類毒性に関与している蛋白質と無関係であ
ることを示している。
実施例２ 双し類毒性活性の脂質膜への結合Ｂｔｉ可溶
性蛋白質の細胞膜結合能力を評価するため、細胞質蛋白
質をすべて除いた赤血球（ＲＢＣゴースト）を使用した
。トッジらの方法［トツジ・ジエイ・ティー（Ｄｏｄｇ
ｅ、 Ｊ、Ｔ、）、ミツチェル。
性蛋白質の細胞膜結合能力を評価するため、細胞質蛋白
質をすべて除いた赤血球（ＲＢＣゴースト）を使用した
。トッジらの方法［トツジ・ジエイ・ティー（Ｄｏｄｇ
ｅ、 Ｊ、Ｔ、）、ミツチェル。
シー（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、 Ｃ，）及びハナハン・ディ
ー・シエイ （ｌ１ａｎａｈａｎ、 Ｄ、Ｊ、）（１９
６３年） Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
ー・シエイ （ｌ１ａｎａｈａｎ、 Ｄ、Ｊ、）（１９
６３年） Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ｔｏｏ巻＋ １９−１２７頁］に従
って、低張性緩衝液（１０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７，２）の
あとに高張性緩衝ｔ＆ （１１０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７，
２）にさらすという繰り返し周期からなる浸透圧衝撃に
よって、これらのＲＢＣゴーストはつくられる。ＲＢＣ
ゴーストが無色で、ヘモグロビンその他の細胞質成分の
完全な除去を示す時、溶血は完全と判定された。ゴース
ト膜を遠心分離（ｔｏ、０００ｇ、３０分）て集め、未
分別の結晶抽出液と部分精製されたカラムフラクション
での蛋白質吸収（結合）実験に使用した。
って、低張性緩衝液（１０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７，２）の
あとに高張性緩衝ｔ＆ （１１０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７，
２）にさらすという繰り返し周期からなる浸透圧衝撃に
よって、これらのＲＢＣゴーストはつくられる。ＲＢＣ
ゴーストが無色で、ヘモグロビンその他の細胞質成分の
完全な除去を示す時、溶血は完全と判定された。ゴース
ト膜を遠心分離（ｔｏ、０００ｇ、３０分）て集め、未
分別の結晶抽出液と部分精製されたカラムフラクション
での蛋白質吸収（結合）実験に使用した。
実施例１に記載のとおりに調製された未分別結晶抽出液
（１００μｍ）をゴースト膜２４ｇ１１と一緒に、３７
℃、３０分培養した。次に吸収ずみ及び吸収前の上澄み
液の溶血活性と殺幼虫活性を試験した。ＲｅＣゴースト
膜での吸収は溶血活性と毒性のいずれも抽出液から失わ
れることがわかり、有毒因子と溶血因子が膜に結合され
たことを示唆している。
（１００μｍ）をゴースト膜２４ｇ１１と一緒に、３７
℃、３０分培養した。次に吸収ずみ及び吸収前の上澄み
液の溶血活性と殺幼虫活性を試験した。ＲｅＣゴースト
膜での吸収は溶血活性と毒性のいずれも抽出液から失わ
れることがわかり、有毒因子と溶血因子が膜に結合され
たことを示唆している。
これは毒性の場合、吸収後、ゴースト膜カ蚊幼虫に対し
て非常に有毒になること、すなわち抽出液から激減した
毒性がゴースト膜に濃縮されたことの立証によって確認
された。細胞膜への結合が毒素の特異的活性を高める効
果をもつのは、おそらくフィルターフィーディング性の
双し類幼虫が粒状型の毒素をより効率的に摂取できるた
めであろう。吸収後の可溶性抽出液のＳＯＳポリアクリ
ルアミドゲルをクマシーで染色して肉眼検査すると、２
６に蛋白質の明白な選択的除去が明らかになった。
て非常に有毒になること、すなわち抽出液から激減した
毒性がゴースト膜に濃縮されたことの立証によって確認
された。細胞膜への結合が毒素の特異的活性を高める効
果をもつのは、おそらくフィルターフィーディング性の
双し類幼虫が粒状型の毒素をより効率的に摂取できるた
めであろう。吸収後の可溶性抽出液のＳＯＳポリアクリ
ルアミドゲルをクマシーで染色して肉眼検査すると、２
６に蛋白質の明白な選択的除去が明らかになった。
２６に蛋白質バンドはＲＢＣゴースト膜フラクションと
関係していることがわかった。
関係していることがわかった。
Ｒ８Ｃゴーストと選択的に関係しているかもしれない他
の種を確認するため、未分別抽出液中に存在する蛋白質
に１２５■て標識をつけ、放射性トレーサーとして働か
せた。これらの放射性抽出液をＲＢＣゴーストと一緒に
培養し、続いて５ＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフ
法にかけると、２蛋白質が特異的かつ緊密にゴースト膜
に結合されることを示した・これらの結合蛋白質の分子
量は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより２６０００ｄ及び３５００
０ｄと推定された。２６０００ｄ蛋白質が、抽出液から
除去され膜フラクションに結合されるのが５Ｏ５−ＰＡ
ＧＥで観察された同し分子量（２６Ｋ）の蛋白質である
のは疑いない。３５０００ｄ種は、有毒ピーク■で検出
できる小蛋白質である見込が最も高く、有毒ピーク■に
も存在するが、類似分子量の無関係な蛋白質によって隠
されている。未分別抽出液からの３５０００ｄ蛋白質の
損失はあまり明白ではない。この分子量範囲に多数のＢ
ｔｉ結晶蛋白質が存在するからである。
の種を確認するため、未分別抽出液中に存在する蛋白質
に１２５■て標識をつけ、放射性トレーサーとして働か
せた。これらの放射性抽出液をＲＢＣゴーストと一緒に
培養し、続いて５ＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフ
法にかけると、２蛋白質が特異的かつ緊密にゴースト膜
に結合されることを示した・これらの結合蛋白質の分子
量は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより２６０００ｄ及び３５００
０ｄと推定された。２６０００ｄ蛋白質が、抽出液から
除去され膜フラクションに結合されるのが５Ｏ５−ＰＡ
ＧＥで観察された同し分子量（２６Ｋ）の蛋白質である
のは疑いない。３５０００ｄ種は、有毒ピーク■で検出
できる小蛋白質である見込が最も高く、有毒ピーク■に
も存在するが、類似分子量の無関係な蛋白質によって隠
されている。未分別抽出液からの３５０００ｄ蛋白質の
損失はあまり明白ではない。この分子量範囲に多数のＢ
ｔｉ結晶蛋白質が存在するからである。
クリーブランドらが記載したペプチド地図作成手法［ク
リープラント・ディー・ダブリュー（Ｃ１−ｅｖｅｌａ
ｎｄ、 ０．Ｗ、ン、フィ’７シヤー・ニス・ジー（Ｆ
ｌ−ｓｃｈｅｒ、 Ｓ、Ｇ、）、キルシュナー・エム・
ダブリュー（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ、 Ｍ、Ｗ、）及びレ
ムリ・ニー・ケイ（Ｌｅｍ−ｍｌｉ、 Ｕ、に、）（１
９７７年） Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５２
巻１１０２−１１０６頁コによって、２６０００ｄ蛋白
質と３５０００ｄ蛋白質を比較した。画工白質には同族
関係が立証できなかった。これは、２６に蛋白質に向け
られた抗血清が３５０００ｄ蛋白質やピーク■に存在す
るとの蛋白質とも相互反応しないというｙ０見と一致し
ている。
リープラント・ディー・ダブリュー（Ｃ１−ｅｖｅｌａ
ｎｄ、 ０．Ｗ、ン、フィ’７シヤー・ニス・ジー（Ｆ
ｌ−ｓｃｈｅｒ、 Ｓ、Ｇ、）、キルシュナー・エム・
ダブリュー（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ、 Ｍ、Ｗ、）及びレ
ムリ・ニー・ケイ（Ｌｅｍ−ｍｌｉ、 Ｕ、に、）（１
９７７年） Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５２
巻１１０２−１１０６頁コによって、２６０００ｄ蛋白
質と３５０００ｄ蛋白質を比較した。画工白質には同族
関係が立証できなかった。これは、２６に蛋白質に向け
られた抗血清が３５０００ｄ蛋白質やピーク■に存在す
るとの蛋白質とも相互反応しないというｙ０見と一致し
ている。
これらの画工白質のＲＢＣゴースト膜への緊密す結合が
偶然的であって、分子間の相同に関係していないものと
結論される。
偶然的であって、分子間の相同に関係していないものと
結論される。
これらのデータに基づいて、３５０００ｄ蛋白質（３５
Ｋ）は類のない双し類特異的毒素であることが、はぼ確
実と考えられた。これが真実ならば、Ｒ８Ｃゴーストを
使用してこの蛋白質をビーク■から特異的に吸°収てき
るはずである。上記のゲルミ」過実験からのフラクンヨ
ン３０を１２５１で放射性の標識をつけ、ＲＢＣゴース
トで吸収させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥと更にオートラジオ
グラフ法での分析から、ゴースト膜に結合する唯一の放
射性バントの存在が明らかになった。この蛋白質の分子
量は３５０００ｄと決定された。未標識抽出イαで行っ
た同様の実験では、ＲＢＣゴーストでの吸収により、毒
性がピーク■から特異的に除かれ、吸収後、脂質膜に濃
縮されることが明らかになった。この３５０００ｄｉ白
質は上て確認された３５に蛋白質であると結論される。
Ｋ）は類のない双し類特異的毒素であることが、はぼ確
実と考えられた。これが真実ならば、Ｒ８Ｃゴーストを
使用してこの蛋白質をビーク■から特異的に吸°収てき
るはずである。上記のゲルミ」過実験からのフラクンヨ
ン３０を１２５１で放射性の標識をつけ、ＲＢＣゴース
トで吸収させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥと更にオートラジオ
グラフ法での分析から、ゴースト膜に結合する唯一の放
射性バントの存在が明らかになった。この蛋白質の分子
量は３５０００ｄと決定された。未標識抽出イαで行っ
た同様の実験では、ＲＢＣゴーストでの吸収により、毒
性がピーク■から特異的に除かれ、吸収後、脂質膜に濃
縮されることが明らかになった。この３５０００ｄｉ白
質は上て確認された３５に蛋白質であると結論される。
実施例３ 等電点の決定
精製された放射性標識つきの３５に蛋白質を結合させた
ＲＢＣゴースト膜を、オファレルが記載した二次元７’
１ ％泳動［オファレル・ピー・エッチ（０’Ｆａｒｒ
ｅｌｌ、 Ｐ、）１．）（１９７５年） Ｊ、 ８ｉｏ
１． Ｃｈｅｍ、 ２５０＠４００７−４０２１頁〕に
よって分析し、第一次元の分雑な等電、焦点合せにより
、また第二次元の分離を分子量によって行なった。ｐｉ
勾配中の蛋白質の位置から、等電点（ｐＨ）の正確な測
定ができる。二次元ゲルのオートラジオグラフ法から、
６．５の等重点をもつ単一蛋白質の存在が確認された。
ＲＢＣゴースト膜を、オファレルが記載した二次元７’
１ ％泳動［オファレル・ピー・エッチ（０’Ｆａｒｒ
ｅｌｌ、 Ｐ、）１．）（１９７５年） Ｊ、 ８ｉｏ
１． Ｃｈｅｍ、 ２５０＠４００７−４０２１頁〕に
よって分析し、第一次元の分雑な等電、焦点合せにより
、また第二次元の分離を分子量によって行なった。ｐｉ
勾配中の蛋白質の位置から、等電点（ｐＨ）の正確な測
定ができる。二次元ゲルのオートラジオグラフ法から、
６．５の等重点をもつ単一蛋白質の存在が確認された。
３５０００ ｔｌに近い分子量をもつ抽出液中の他方の
蛋白質も、類似の等電点をもつが、ゴースト膜への結合
をまったく示さなかった。
蛋白質も、類似の等電点をもつが、ゴースト膜への結合
をまったく示さなかった。
上の実施例は、独特の性状をもった新規な双し類毒素を
明白に確認している。これらの性状は、分子量約３５０
００ｄ＋ ３０００ｒｌ、等電点約６．５＋ ０．３、
及び脂質膜に結合する能力を包含している。３５に蛋白
質のほか、双し類幼虫への特異的毒性をもった少なくと
も一つの追加蛋白質がある。 分子量約６６０００ｄ＋
４０００ｄをもっこの種は、３５０００ｄ＋ ３００
０ｄ蛋白貿の前駆物質と考えられ、活性のためには処理
を必要としよう。いずれにせよ、６６０００ｄ蛋白質か
ら３５０００ｄへの転化による活性の損失は認められず
、３５０００ ｄ断片が双し類毒性の全範囲を含むこと
を立証している。殺幼虫活性をもつそれより小さい断片
は検出できず、２６０００ｄ蛋白質と３５０００［ｊの
双し類毒素又は６６０００ｄ前駆物質との間に相同の証
拠は見られなかった。
明白に確認している。これらの性状は、分子量約３５０
００ｄ＋ ３０００ｒｌ、等電点約６．５＋ ０．３、
及び脂質膜に結合する能力を包含している。３５に蛋白
質のほか、双し類幼虫への特異的毒性をもった少なくと
も一つの追加蛋白質がある。 分子量約６６０００ｄ＋
４０００ｄをもっこの種は、３５０００ｄ＋ ３００
０ｄ蛋白貿の前駆物質と考えられ、活性のためには処理
を必要としよう。いずれにせよ、６６０００ｄ蛋白質か
ら３５０００ｄへの転化による活性の損失は認められず
、３５０００ ｄ断片が双し類毒性の全範囲を含むこと
を立証している。殺幼虫活性をもつそれより小さい断片
は検出できず、２６０００ｄ蛋白質と３５０００［ｊの
双し類毒素又は６６０００ｄ前駆物質との間に相同の証
拠は見られなかった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、以下を特徴とする新規ポリペプチド。 （ａ）変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にゲル
電気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３０
００ｄ。 （ｂ）連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せ（イソエレク
トリックフォーカッシング）により測定される等電点が
約６．５±０．３。 （ｃ）全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （ｄ）双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣ＿５＿０は
０．０５μｇ／ｍｌ未満。 ２、以下を特徴とする新規ポリペプチド。 （ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が、約６６
０００ｄ±４０００ｄ。 （ｂ）これを蛋白分解的消化にかけると、次の特徴をも
つポリペプチドを生ずる。 （１）変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にゲル
電気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３０
００ｄ。 （２）連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せにより測定さ
れる等電点が約６．５±０．３。 （３）全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （４）双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣ＿５＿０は
０．０５μｇ／ｍｌ未満。 （ｃ）双し類幼虫に対し特異的な毒性をもつ。 ３、バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラ
エレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ ｖａｒ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）の胞子と細
胞砕片を実質的に含まない特許請求の範囲第１項のポリ
ペプチド。 ４、バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラ
エレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ ｖａｒ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）の胞子と細
胞砕片を実質的に含まない特許請求の範囲第２項のポリ
ペプチド。 ５、非選択的細胞溶解因子を実質的に含まない特許請求
の範囲第１項のポリペプチド。 ６、非選択的細胞溶解因子を実質的に含まない特許請求
の範囲第２項のポリペプチド。 ７、２６Ｋの細胞溶解性蛋白質を実質的に含まない特許
請求の範囲第１項のポリペプチド。 ８、２６Ｋの細胞溶解性蛋白質を実質的に含まない特許
請求の範囲第２項のポリペプチド。 ９、バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラ
エレンシス菌を培養し、このポリペプチドを回収するこ
とを含む、以下を特徴とするポリペプチドの製法。 （ａ）変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にゲル
電気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３０
００ｄ。 （ｂ）連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せにより測定さ
れる等電点が約６．５±０．３。 （ｃ）全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （ｄ）双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣ＿５＿０は
０．０５μｇ／ｍｌ未満。 １０、バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イス
ラエレンシス菌を培養し、このポリペプチドを回収する
ことを含む、以下を特徴とするポリペプチドの製法。 （ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が、約６６
０００ｄ±４０００ｄ。 （ｂ）これを蛋白分解的消化にかけると、次の特徴をも
つポリペプチドを生ずる。 （１）変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にゲル
電気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３０
００ｄ。 （２）連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せにより測定さ
れる等電点が約６．５±０．３。 （３）全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （４）双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣ＿５＿０は
０．０５μｇ／ｍｌ未満。 （ｃ）双し類幼虫に対し特異的な毒性をもつ。 １１、バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イス
ラエレンシス菌を培養することによって得られ、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥでの測定で約６６０００ｄ±４０００ｄの分
子量をもつポリペプチドの蛋白分解的消化を含む、以下
を特徴とするポリペプチドの製法。 （ａ）変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にゲル
電気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３０
００ｄ。 （ｂ）連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せにより測定さ
れる等電点が約６．５±０．３。 （ｃ）全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （ｄ）双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣ＿５＿０は
０．０５μｇ／ｍｌ未満。 １２、天然又は合成の燐脂質小胞へのポリペプチドの結
合を含む、特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド
の製法。 １３、特許請求の範囲第１項に定義されたポリペプチド
を天然又は合成燐脂質小胞に吸収させたものの殺幼虫有
効量を含む、双し類幼虫向けの殺幼虫組成物。 １４、天然又は合成燐脂質小胞へのポリペプチドの結合
を含む、双し類幼虫に対して活性のあるバシラス・スリ
ンギエンシス・バラエティ・イスラエレンシスのポリペ
プチドの製法。 １５、天然又は合成燐脂質小胞に吸収された、双し類幼
虫に対して活性のあるバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・イスラエレンシスのポリペプチドの殺幼虫有
効量を含む、双し類幼虫向けの殺幼虫組成物。 １６、ポリペプチドがバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・イスラエレンシスの胞子や細胞砕片を実質的
に含まない、特許請求の範囲第１３項に記載の組成物。 １７、ポリペプチドが非選択的細胞溶解因子を実質的に
含まない、特許請求の範囲第１３項に記載の組成物。 １８、ポリペプチドが２６Ｋ細胞溶解性蛋白質を実質的
に含まない、特許請求の範囲第１３項に記載の組成物。 １９、適当な担体との混合物中に特許請求の範囲第１項
又は第２項に記載のポリペプチドの殺幼虫有効量を含む
、双し類幼虫向けの殺幼虫組成物。 ２０、ポリペプチドがバシラス・スリンギエンシス・バ
ラエティ・イスラエレンシスの胞子や細胞砕片を実質的
に含まない、特許請求の範囲第１９項に記載の組成物。 ２１、ポリペプチドが非選択的細胞溶解因子を実質的に
含まない、特許請求の範囲第１９項に記載の組成物。 ２２、ポリペプチドが２６Ｋ細胞溶解性蛋白質を実質的
に含まない、特許請求の範囲第１９項に記載の組成物。 ２３、下記の特徴をもつポリペプチドの殺幼虫有効量で
双し類幼虫を又は双し類幼虫のいるところを処理するこ
とを含む、双し類幼虫の殺虫法。 ａ）変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にゲル電
気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３００
０ｄ。 （ｂ）連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せにより測定さ
れる等電点が約６．５±０．３。 （ｃ）全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （ｄ）双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣ＿５＿０は
０．０５μｇ／ｍｌ未満。 ２４、下記の特徴をもつポリペプチドの殺幼虫有効量で
双し類幼虫を又は双し類幼虫のいるところを処理するこ
とを含む、双し類幼虫の殺虫法。 （ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が、約６６
０００ｄ±４０００ｄ。 （ｂ）これを蛋白分解的消化にかけると、次の特徴をも
つポリペプチドを生ずる。 （１）変性洗剤ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にゲル
電気泳動での測定により、分子量約３５０００ｄ±３０
００ｄ。 （２）連続線型ｐＨ勾配中の等電焦点合せにより測定さ
れる等電点が約６．５±０．３。 （３）全体の溶血（細胞の溶解）を起こさず、また毒性
を失わずに、種々の赤血球膜に結合する能力、及び （４）双し類幼虫に対する毒性があり、ＬＣ＿５＿０は
０．０５μｇ／ｍｌ未満。 （ｃ）双し類幼虫に対し特異的な毒性をもつ。
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|---|---|---|---|
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