JPS62500659A - 精製し３回クロ−ニングした肝炎ａ型ウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 肝炎人捜ウィルス（ＨＡＹ）は世界中に分布している。

アメリカ合衆国において１年に１ｏｑｏｏｏ症例という多くの肝炎（ＤＨＸ因と なり、これは＃よとんどの先進国におけると同様に臨床的な肝炎のおよそ２Ｇ− ２５パーセントになる。このウィルスは先進国全体で高度に地方流行性であり、 そこで１０才までに入口の実際上１００囁に感染する。

腸ウィルスの性質を多く持つピコルナウィルスで腸ウィルスに分類される。この ウィルスは主として糞−経口感染で広がシ、水で伝播または食物で伝播する病気 の多くの病源となりてきた。しかしながら、このウィルスは人と人の接触で広が るのが最も一般的でＴｏｊ）、Ｉ（ＡＶの非経口伝達は非常に稀である。

アメリカ特許第４１４４ｓ６６号（プロポスト（Ｐｒｏｖｏｓｔ）等）明細書に は試験管内での肝炎Ａ型りィルス細胞培養の開発が示されている。しかしながら 、プロポスト（Ｐｒｏｖｏｓｔ　）等は）ＬＡＹを産生ずるために人間よ）下等 な霊長＠において少くとも５回の継代接種を必要とする異った株（１））ＩＡｖ を使用している。本発明者等のアメリカ特許出ｍ第５６６．１６５号の発明は、 ）ｌＡｖが人間の臨床試料かから直接採られ、アフリカ　ミドリザル腎＠（ＡＧ ＭＫ）−次細胞培誉で分離し、段階的に継代接種可能であることを示すものであ る。

デマー等、イン７エクシ冒ン　アンド　イムニティー３２巻１号、４月、１９８ １年、５８Ｂ−５９５頁（Ｄａｅｍｅｒ１９８１、ｐｐ５８Ｂ−３９３）。

パーセル等、「ヘパタイティスＡ　ウィルス」印刷中（Ｐｕｒｃｅｌｌ　ｅｔ　 ａｌ、’　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ａ　Ｖｉｒｕｓ’　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ　）　。

本出頴に先立って特許手続く従い、肝炎人型ウィルス）ＩＭ−１７５株をアメリ カン　タイプ　カルチャー　コレクシ璽ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　ｉｃ寄託した。したがって寄託は永続し 、特許の発行により一般に容易に利用できる。

有用性 肝炎人型ウィルスのＨＭ−１７５株の親株を５回クローニングしたものは、チン パンジーおよびキヌザルのような他の霊長類で抗体を産生ずるが病気をおこさな い浚秀なワクチンになる。野生型ウィルスの攻撃からのチンパンジーの感染防御 はワクチンの有意さの証明となる。

本発明 アフリカミドリザル腎臓−次細胞培養で１０および２０の継代接種した細胞培養 馴ｇ！ＨＭ−１７５ヒト肝炎ＡｆＪウイルスは、チンパンジーで弱毒化するが、 第１表に示すように、肝疾、＠り生化学的徴候無しに、Ａ型肝炎抗体の誘導によ り明らかなような血清変化を生ずる。こＯ物毒化した株を予じめ接種された人型 肝炎抗体を産生じたチンパンジーは、第２表に示すように、−人免疫反応が生じ ている回復期の初期に攻撃が起らないかぎ）、感染性肝炎Ａｆｉウィルスに攻撃 されたとき、肝炎の発病から感染防御された。同じものを接種されたキヌザルは 、肝炎を発病したが、野生型ウィルスの場合よシ軽度であった（第１表および第 １図）。組織培養継代接種ウィルスの弱毒化の安定性を、第５表に示すように、 予じめ接種された動物の急性相糞を別のチンパンジーに接種（経皮、望ましくは 静脈内）することによって示した。接種された動物は肝炎の生化学的徴候を生じ なかったが、Ａ型肝炎抗体を産生じた。

肝炎入車ウィルスのＨＭ−ｆ７５株の種母培養を継代接種レベル１０．２０およ び５Ｇで末端希釈によシ３回クローニングした（第２図）。継代接種レベル２０ からの二種のクローンをチンパンジーで弱毒化されたかどうか評価した。試験し た２種クローンは、接種したチンパンジーに肝炎を起さなかった。クローンナＩ Ｋよシ、６国中３匹の動物に抗体が産生され、クローンナ２によシ接種した動物 ４菌中５四に抗体が産生じた。

肝炎Ａｍウィルスの）ＩＭ−１７５株を５回クローニングしたウィルス物質を利 用することによシ、これが生きたＭＡＹと同様にチンパンジーの効果的なワクチ ンであることが示された。

このワクチンは人間、チンパンジーおよびキヌザルを含む循乳動物または高等霊 長類に利用できる。５回クローニングしたウィルス物ｆｆ（ＡＸ）は、ワクチン として適する均一ウィルスの調製のために、２回クローニングしたウィルス（２ Ｘ）よシ均質性で優れている。ここで説明するウィルスの穐母培養は継代接種レ ベル１０および２０で末端希釈することによシ５回クローニングしたウィルシン グ　カンパニー　１９６５年１４４−１４５頁ｅｄ、、　Ｂｕｒｇｅｓｓ　Ｐｕ ｂ、　Ｃｏ、、１９６３．　ｐｐ、１４４−１４５）。

希釈の目的は、この手順での最高希釈の陽性試験管の内容物が単一ウィルス粒子 よシ生じ、このため製品の生物学的均一性が得られることである。

末端希釈によるクローニングについて、均一なウィルスまたはワクチンを得るに は３Ｘが最適であると見い出された。５Ｘｔ−選択したことは下記の参考文献と も一致する：レンネット　アンド　シェミット、「ダイアグノスティック　プロ シープ為ア　フォア　バイラル　アンド　リケセシャル　イン７エクシ冒ンズ」 、アメリカンバフリック　へルス　アソシエイ７四７５ｍ、１９７９年１０２頁 （Ｌｅｎｎｅｔｔ　ａｎｄ　Ｓｃｈｍｉｄｔ、％ＤムａｇｎｏｓｔムＣＰｒｏｃ ｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｖｉｒａｌ　ａｎｄ　Ｒｉｃｋｓｅｔｔｉａｌ　Ｉｎｆｅ ｃｔｉｏｎｓ、　’ＡｍｅｒｉｃａｎＰｕｂｌｉｃＨｅａ！ｔｈＡｓｓｏｃｉａ ｔｉｏｎ、　５ｅｄ、、　１９７？。

ｐａｇｅ　１０２）；およびダルベツコ　アンド　ボグト、「プラク　７オーメ イシｌン　アンド　アイソレイシ覆ンオブ　ピエア　ラインズ　ウィズ　ボリオ マイエリティス　パイラシズ」、ジャーナル　オブ　エクスベリメンタル　メデ ィシ７９９壱１６７−１８２頁、１９５４年（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ａｎｄ　Ｖｏ ｇｔ、％Ｐｌａｇｕｅ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎｏｆ 　Ｐｕｒｅ　Ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ ｅｓ、’　Ｊ、Ｅｘｐ。

ヒト肝炎大型ウィルスのＨＭ−１７５株はこの国に輸入され、イン７エクシ冒ン 　アンド　イムニティー　３２巻１号、４月、１９８１年３８８−４９５頁（Ｉ ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ、　５２　（１）ｅ　Ａｐｒｉｌ　 １９８１．　ｐａｇｅｓ　５８８−５９５　）に記載されている。

実施例１ ウィルスのりｑ−ニングは次のようにして行った：未りローニングウィルスのプ ールｔ−１０から１０　まで段階希釈した。各希釈物をアフリカ　ミドリザルー 次細胞培養を使って９本の試験管に接種した。細胞を生育させ、その細胞の中で ウィルスを生育させ、８週後に採集した。

この時点で肝炎大型ウィルス抗原の存在を各試験について調べた。最高希釈、す なわち１０　希釈の試験管の中に陰性と陽性がいくつかづつあった。統計学的解 析に基き、この希釈で陽性試験管の内容物は単一ウィルス粒子より由来したもの である。陰性の試験管にウィルスは含まれていなかった。陽性の試験管の内、各 宋端希釈列から２本の試験管を集めた。これらについて次々に第２回、第５回と 同じクローニング操作を行った。末端希釈での試験管の第３回目のクローニング で、これらの試験管２本と対照の未接種のものを集めた。単一ウィルス粒子由来 のこれらの陽性の試験管を種母培養をつくるために膨張させた。この種母培養を 生育させ、チンパンジーの実験に使用した（第２図）。

実施？１４２ 糧母培養物の使用。希釈し々い３回クローニングした種母培誉物または同じもの を希釈したものをチンパンジーに接種した。希釈しない埋置ウィルスは、３回ク ローニングした試験管からつくった；これを使って更に細胞に接種することくよ りウィルスｔを多くシ、次いでこの接種した培養物を集めて多量のウィルスの源 とした。これが拡大した種母ウィルス源となった。引きつづき、これを使い、希 釈しないまま、またはこの種母を１０倍希釈したものを使ってチンパンジーに接 種した。

動物への接種。チンパンジーに静脈内または経口的のどちらかで接種し、以後４ −６週間１週毎に採血して肝酵Ｘ　（ＡＩ、Ｔ、アラニンアミノトランスフェラ ーゼ）の上昇および抗ＨＡＹ抗体を測定した。＃木上昇は動物におけるＡ型肝炎 の存在を示し、抗体の存在は感染防御を示す（第４表）。クローンナ１（ＴＣ継 代２０または２１）を静脈内または経口的に１５匹の感受性チンパンジーのうち １１四に感染させ、そのうち２匹のみが軽度の肝炎を起した。１１匹の感染させ たチンパンジーはワクチン投与後５−８週間で感染防御抗体に反応した。クロー ンφ２　（ＴＣ継代２０）を静脈内経路で４匹の感受性チンパンジーに接ｉした 。４匹のうち１匹の動物のみが非常に軽度の、すれすれの肝炎を示した。４匹す べてが感染防第１表 ＨＡＶ　ＨＭ−１７５株の弱毒化：動物試験扁　（範囲）Ａ　（範囲） ０　７　３１４　（１０９−４１９）　１０　４７７７　（１，６５１−１５， ９１）１０　７　６２　（４１−７５）　試験せず２０　５　４８　（３７−６ １）　７５５１６　（’１．０６２−１へ２３０）２０および２１”　１０　６ ０　、（！８−８７）　５２９５６　（２，２６５−５，７９９）＋ 無ＨＡＹ　６　５７　（４１−８ｆ）　４　４１０　（４８３−９２７）”）Ｉ ＡＶの非感染希釈 第　２　表 免疫チンパンジーの野生型）１ＡＶ攻撃に対する反応最大人ＬＴ　（ｆｉ大）： Ｐ／Ｎ 人−〇　ＴＣＰ−１０９，５６４２２，８９４７ＴＣＰ−２０９，１６５２ａ３ Ａ−５３ＴＣＰ−２０１ｔ４　２８０　２Ａ１人−５４ＴＣＰ−２０表８　５７ 　１１Ｌ３人−５５無　Ｌ５　４０２　２４０ 第　５　表 ワクチン投与チンパンジーから の弱毒化）ＩＡＶを接種する試み 第４表 ＭＡＹ、　）ＬＭ−１７５株を５回クローニングした時のチンパンジーの反応ン ジー　接ｍ源　ＴＣＩＩ）上昇酵素　（ＡＪ（週）９９５　りｏ−７＋１　Ｐ− ２０１０Ｉｖ　７３　６５　−−　−−Ａ−４７クローｙ＋Ｉ　Ｐ−２４１０’ ＩＶ　５７　４５　−−　５Ａ−６７りｏ−ｙ＋２Ｐ−２０１０１Ｖ　７８　６ Ｂ　−−５Ａ−６８ｐｏ−７４４Ｐ−９１０ＩＶ’　５０　５４　−　４ＲＩＡ 　（Ｎ／Ｓ）−４ ＭＯＯＯＬ／Ｇ）Ｉ　ＭＯＯＬ／Ｊ−ＷＨＥＰＡＴＩＴＩＳ　Ａ　ＶＩＲＵＳ　 （ＨＭ−１７５）　ＩＮ　ｎ５ｓＵＥ　ＣＵＬＴＵＲＥ：ｔｏｏｌ ＦＩＧ、２ 国際調査報告 １°ｌｆｉ＃ｌｌ＠ＩＩ″ｌ　ＡＤｅｌｌｅａ＋１″′″′Ｎ”　ｏｒｒ／ｎａ ｌ１１；／ｎ１７ｆ；９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）均一ウィルス組成物である肝炎Ａ型の弱毒化生ウィルス注射を高等霊長類 に注射することにより、該高等霊長類に感染防御抗体反応を起させる方法。 （２）均一ウィルス組成物は、継代接種レベルが少くとも１０−３０の３回クロ ーニング物質である請求の範囲第（１）項記載の方法。 （３）弱毒化生ウィルスがＨＭ−１７５株である請求の範囲第（１）項記載の方 法。 （４）高等霊長類への注射が、変化していない（野生型）肝炎Ａ型ウィルスによ り起るＡ型肝炎に対して感染防御を与えるワクチン投与の形である請求の範囲第 （１）項記載の方法。 （５）肝炎Ａ型の弱毒化生ウィルスを経皮注射により投与する請求の範囲第（１ ）項記載の方法。 （６）肝炎Ａ型の弱毒化生ウィルスを経口的に投与する請求の範囲第（１）項記 載の方法。 （７）弱毒化後にワクチンとして使用できる、３回クローニングした肝炎Ａ型ウ ィルス、ＨＭ−１７５株を含む哺乳動物のための改良ワクチン。