JPS62500882A - ペルオキシダ−ゼ酵素活性のアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペルオキシダーゼ酵素活性のアッセイ 本発明は、改良された酵素イムノアッセイまたは酵素リンク免疫吸収体シッセイ に関し、そしてさらに特定すれば基質溶液の増加した安定性および減少した基質 ドリフトを生ずる、ペルオキシダーゼ酵素活性を測定するためのクロモゲン基質 としてペルオキシダーゼと共に使用するための水性Ｎ−メチルピロリドン中のテ トラアルキルベンジジン溶液に関する。

酵素イムノアッセイおよび酵素リンク免疫吸収体アンセイは、アッセイ操作中の 未知物質のための標識としてペルオキシダーゼのような酵素の使用と、そしてサ ンプル中の未知物質の量の指示として該酵素活性の測定とを含んでいる。

１９８１年１１月２日に公開されたオランダ特許出願ｍ８００１９７２において 、ペルオキシダーゼ酵素の基質として、３．３“、５．５’−テトラアルキルベ ンジジンクロモゲンをペルオキシダーゼと共に使用することが以前に提案された 。該公開出願中に指摘されているように、該クロモゲンは単独では水に効果的に 溶解することができず、そして基質中に水とジメチルスルホキシド、１．４−ジ オキサン、またはジメチルホルムアミドのような水混和性非プロトン有機溶媒と の混合物中のクロモゲンの溶液を使用することが提案されているが、これら溶媒 のすべては生物学的見地からは有毒もしくは有害である。しかしながら、そのよ うな基質溶液は、有機溶媒一般がそうであるが前記有機溶媒は該基質溶液がそれ らの意図する目的に使用される特発色強度を減少する傾向を有すること、および そのような基質溶液は室温において不安定であり、ベルオキシダーゼ不存在にも かかわらず増加した発色を示すという欠点を有することが判明した。“基質ドリ フト′と呼ばれるこのバックグラウンド色の強度の変化は、酵素イムノアッセイ または酵素リンク免疫吸収体アッセイにおけるそのような基質溶液の有用性を大 きく制限する。

今や、３．３’　、５．５’−テトラアルキルベンジジンクロモゲンまたはその 酸塩と過酸化物とを水性緩衝化基質媒体中においてペルオキシダーゼと反応させ る酵素イムノアッセイまたは酵素リンク免疫吸収体アッセイにおいて、該クロモ ゲンまたはその酸塩をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）５ないし２０ｖｏ１％を 含有する水性媒体の溶液に提供する工程は、基質溶液の増大した安定性と減少し た基質ドリフト、および生物学的有害性および毒性がないという形の改善された 結果を提供することが判明した。

本発明において有用なりロモゲンは、アルキル基が炭素原子工ないし５個をめい めい含む任意の３．３′、５．５’−テトラアルキルベンジジンを含み、特にを 用なものは３．３′、５．５’−テトラメチルベンジジンおよび３，３°、５． ５’−テトラエチルベンジジンである。塩酸塩のような酸塩もを用である。基質 溶液中に存在するクロモゲンの量は、その活性を測定すべきペルオキシダーゼの 性状および濃度に依存して大幅に変化し得るが、一般にクロモゲン濃度は０．５ ないし１０ｍＭ。

好ましくは工ないし３ＩＩＩＭまで変化し得る。存在するペルオキシダーゼの量 も存在するクロモゲンの量に応じ変化することができ、工ないし２０ｍＭの範囲 、好ましくは工ないし６ｍＭである。過酸化水素、尿素ペルオキシドのような任 意の有用な過酸化物を基質溶液中に使用することができる。溶液中にｐＨを４な いし７に維持する酢酸塩護衝剤のような緩衝剤を含めることも望ましい。

水性基質混合物中に存在するＮ−メチルピロリドンの量は存在するクロモゲンの 濃度に依存し、クロモゲンの濃度が高ければ高いほど、該クロモゲンを可溶化す るＮＭＰの高い濃度を必要とする。一般にＮＭＰの濃度は最小にすることが望ま しい。クロモゲンを可溶化するのに必要とするＮＭＰの量は、クロモゲンを同程 度可溶化するのに必要とする１、４−ジオキサンまたはジメチルスルホキシドの 量より遥かに少ない。水の体積の５ないし２０％のＮ’ＭＰ濃度を使用すること ができるが、５ないしｌ　Ｑ　ｖｏ１％を使用するのが好ましい。クロモゲン濃 度が１ないし２ｍＭのオーダーの時、６ないし８ｖ０１％を使用することによっ てすぐれた結果が得られる。

本発明の基質溶液は、好ましくは、Ｎ−メチルピロリドン５ないし５０ν０１％ と３．３’、５．５’−テトラアルキルベンジジン１ないし１０ｍＭとを含有す る水溶液よりなる第１のストック溶液を、過酸化物４ないし４０ｍＭを含をする 水性緩衝溶液よりなる第２のストック溶液およびもし必要であれば所望濃度を得 るための水と混合することにより、使用前新たに１Ｐｉｌ製される。ストック溶 液はキットの形で供給することができ、該キットはそのほかに、慣用の停止剤溶 液の供給、抗体もしくは抗原を塗布した容器、および抗原スタンダードとを含む 。

本発明の改良は、発色化合物を生成するクロモゲンと過酸化物との反応を触媒す る任意の酵素のペルオキシダーゼ活性を測定するために使用することができる。

ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼはもっとも広く使用されるそ のような酵素であるが、他のペルオキシダーゼも使用することができる。

酵素活性の測定は、通常の態様で基質溶液を該酵素を含有している標本と可視色 が発色するようにインキュベートすることによって実施される。定量的測定のた めには、基質溶液との反応は一定時間後、例えばフッ化ナトリウムのような水溶 性フッ化物の水溶液ｐｌ！３ないし６．または硫酸、塩酸等のような酸のような 慣用の停止剤を加えることによって停止される。水溶液フッ化物は安定な青色を 提供するから、水溶性フッ化物が好ましい。

本発明の改良は、均質もしくは不均質アッセイであろうと、シングルもしくはダ ブル抗体アッセイであろうと、そして酵素リンク免疫吸収体アッセイを含む通常 のイムノアッセイ操作に使用することができる。

３．３°、５，５°−テトラメチルベンジジン１．５　ｍＭの濃度がワサビペル オキシダーゼのペルオキシダーゼ酵素活性を測定するために満足であることが判 明した。水中約７．５ｖｏ１％のＮ−メチルピロリドンは室温において１．５ｍ Ｍに等しい該クロモゲンの量を溶液に維持することが判明した。ジメチルホルム アミドの大体同量はクロモゲンのそのような濃度を溶液中に維持するのに等しく 有効であることが判明したが、ジメチルスルホキシドまたは１．４−ジオキサン の約１５ｖｏ１％がそのような１．５１溶液の適切性を維持するために必要であ った。

該クロモゲンを水およびジオキサンと混合した時可視的な黄色が出現し、発色の 強さは存在するジオキサンの量に比例する。それ故水とジオキサンとの混合物は 過剰なバックグラウンド色のため酵素活性の測定に使用できなかった。

以下の実施例は本発明の性格をその範囲に対する限定として働くことなしにさら に詳細に例証することを意図する。

実施例１ 以下の３種類の基質水溶液が調製された。

Ａ、ジメチルスルホキシド１５ｖｏ１％を含有する水Ｂ、ジメチルホルムアミド ７．５　νＯ１％を含有する水Ｃ，Ｎ−メチルピロリドン７．５ｖｏ１％を含有 する水容溶液はそのほかに３．３’　、５，５°−テトラメチルベンジジン１． ５ｍＭ。

過酸化水素４　ｍＭ、および酢酸ナトリウム４ｍＭを含有した。

各溶液を室温で放置し、そしてその３７０ｎｍにおける吸収を水をブランク標準 として使用し、調製後期定時間毎に分光光度計で測定し、以下の結果を得た。

３７０ｎｍにおける吸収 ０　０、０２９　０．０２　０．０１４０、５　０．１２５　０．０６２　０． ０３３１、５　０．２０５　０．１０４　０．０５１２、０　０．２９５　０． １４２　０．０７２、５　０．３　＆　４　０．１８１　０．０８６３、　ＯＯ ，４３５０，２１６０，１０８３、５０，５０４０，２４９０，１３ ４，００，５６６０，２７８０，１５２５、００，６２１０，３０２０，１７１ 見られるように、Ｎ−メチルピロリドンを含有する溶液は他の二つの溶液よりも 実質上少ない当初の吸収を示し、加えてこの溶液による吸収は、実質上減少した 基質ドリフトの証拠として、他の二つの溶液よりも這かに低い割合で増加した。

それ故、Ｎ−メチルピロリドンを含有する新しく調製した基質溶液が色吸収のバ ックグラウンドレベルが許容できなくなる前にペルオキシダーゼ活性の測定に使 用できる時間は、他の非プロトン有機溶媒に比較して著しく延長される。

加えて、酸またはｐｈｉ　３ないし６の酢酸塩緩衝液中のフン化ナトリウムのよ うな慣用の停止剤の使用は、ワサビペルオキシダーゼの活性を測定のためにＮ− メチルピロリドンを含有する基質溶液を使用する場合、３０分以上の色強度の安 定性を与えた。

実施例２ トリス（５０＋Ｍ）ウシ血清アルブミン（１％）、ポリオキシエチレンソルビタ ンモノラウレート（ポリソルベート２０）　（０，０５％）およびアジ化ナトリ ウム（０，１％）、ｐＨ７，８（すべて％は重量による）の水性緩衝液中に１８ １０００に希釈したワサビペルオキシダーゼ抗ヒトＩｇＧ複合体の形の標準テス ト溶液が調製された。３゜３°、５，５°−テトラメチルベンジジン（１，５ｍ Ｍ）　、　Ｎ−メチルピロリドン（７，５ｖｏ１％）、過酸化水素（４ｍＭ）、 および酢酸ナトリウム（８０ｍＭ）を含有する基質水溶液ｐＨ５，１が調製され た。

標準テスト溶液のいくつかの２０μ１部分標本の各自を基準溶液の２００μｌと 混合し、各混合物を色信号を発生する種々の時間室温でインキュベートすること により、一連のテストが実施された。

各自はフッ化ナトリウムＣ０，１ｗｔ％）および酢酸ナトリウム（２０１）を含 有し、塩酸でｐＨ３，５へ関節された停止水溶液Ｏ８５成と混合することによっ て停止された。各標本は停止した基質溶液をブランクスタンダートとして使用し 、停止直後−回、そして３０分後再び３１０ｎｍにおける吸収を分光光度計で測 定することによって測定された。結果を以下の表に示す。

１０　０．１１８　０．１１４ １５　０、１７８　０．１７２ ２０　０、２３０　０．２２３ ２５　０、２８７　０．２８０ ３０　０、３４６　０．３４０ ワサビペルオキシダ一ゼ複合体を含まない停止した基質溶液は、水ブランクと比 較して停止直後０．０１７および３０分後ｏ、ｏｉｓとベリ定された。

Ｎ−メチルピロリドンの代わりにジメチルスルホキシド１５％を含有する基質溶 液について実施された同じテスト操作は、基質ブランク溶液の測定が約２倍高か ったことを除き、非常に類似した結果を与えた。

実施例３ 酵素基質成分として以下の溶液を含んでいる酵素イムノアソセイキントのプロト タイプが開発された。

１）　３．３’、５．５’−テトラメチルベンジジン（７，５ｍＭ）　、　Ｎ− メチルピロリドン（４０ｖｏ１％） ２）過酸化水素（５ｍＭ）、酢酸ナトリウム（１００ｍＭ）　、　ｐＨ５，０３ ）アジ化ナトリウム（０，２ｗｔ％）、酢酸ナトリウム（２０ｓｉＭ）。

ｐＨ３，５ ４）トリス（５０ｍＭ）、ウシ血清アルブミン（１％）、ポリオキシエチレンソ ルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）　（。　０．０５％）、アジ化 ナトリウム（０，０１％）、ｐＨ７，８（すべての％は重量による）を含む水性 Ｂ　ｆＪｊ液中の抗ヒｌ−１ｇＧへ結合したワサビペルオキシダーゼの冷凍した く一４℃）１：１０００希釈液 溶液１）ないし３）は室温で、溶液４）は−４℃において貯蔵した。貯蔵中一定 間隔で溶液１）の部分標本を溶液２）で１対４の比で希釈し、３．３’、５．５ °−テトラメチルベンジジン１．５　ｍＭおよび過酸化水素４ｍＭを含有する作 業用基質溶液を調製した。溶液４）の部分標本は毎日解凍した。次に該溶液は、 信号発生のため５分だけが許容され、そして信号発生直後各テストについて１０ 回の読みがなされ、平均されたことを除き、上記実施例２に記載の操作に−よっ てテストされた。結果は高度に一貫性があり、５０日までの貯蔵期間の間１．０ ２９と１．１０２との間を変動した。ストック溶液の安定貯蔵のこの期間は実際 上の有用性のために適切である。

国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．３，３′，５，５′−テトラアルキルベンジジンクロモゲンもしくはその酸 塩と過酸化物とが水性緩衝液中においてペルオキシダーゼと反応する酵素イムノ アッセイもしくは酵素リンク免疫吸収体アッセイにおいて、前記クロモゲンをＮ −メチルピロリドン５ないし２０ｖｏｌ％を含有する水性基質媒体中の溶液に提 供することよりなる改良。
2. ２．前記クロモゲンの濃度は１ないし２ｍＭであり、Ｎ−メチルピロリドンの濃 度は６ないし８ｖｏｌ％である第１項記載のアッセイ。
3. ３．前記クロモゲンは３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンまたはその 酸塩である第１項記載のアッセイ。
4. ４．前記クロモゲンは３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンまたはその 酸塩であり、Ｎ−メチルピロリドンの濃度は６ないし８ｖｏｌ％である第２項記 載のアッセイ。
5. ５．前記反応はｐＨ３ないし６の水溶性フッ化物水溶液の添加によって停止され る第１項記載のアッセイ。
6. ６．前記反応はｐＨ３ないし６の水溶性フッ化物水溶液の添加によって停止され る第２項記載のアッセイ。
7. ７．前記反応はｐＨ３ないし６の水溶性フッ化物水溶液の添加によって停止され る第３項記載のアッセイ。
8. ８．前記反応はｐＨ３ないし６の水溶性フッ化物水溶液の添加によって停止され る第４項記載のアッセイ。
9. ９．Ｎ−メチルピロリドン５ないし５０ｖｏｌ％と、３，３′，５，５′−テト ラアルキルベンジジンまたはその酸塩１ないし１０ｍＭとを含有する水溶液より なる、３，３′，５，５′−テトラアルキルベンジジンクロモゲンと過酸化物と を水性基質媒体中においてペルオキシダーゼと反応させることを含む酵素イムノ アッセイまたは酵素リンク免疫吸収体アッセイ操作に使用するためのストック溶 液。