JPS6254476B2 - - Google Patents
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- JPS6254476B2 JPS6254476B2 JP12438580A JP12438580A JPS6254476B2 JP S6254476 B2 JPS6254476 B2 JP S6254476B2 JP 12438580 A JP12438580 A JP 12438580A JP 12438580 A JP12438580 A JP 12438580A JP S6254476 B2 JPS6254476 B2 JP S6254476B2
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
本発明は微生物の作用によりML−236Bラクト
ン、ML−236Bカルボン酸、その低級アルキルエ
ステルまたはそのアルカリ金属塩（以下、ML−
236B化合物と総称する。）を変換して式
で示されるML−236B誘導体もしくはこの閉環ラ
クトン体を製造する方法に関するものである。上
記式中、R1は水素原子；メチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなどの
低級アルキル基；ナトリウム、カリウムなどのア
ルカリ金属を示す。R2は基
The present invention produces ML-236B lactone, ML-236B carboxylic acid, its lower alkyl ester, or its alkali metal salt (hereinafter referred to as ML-236B carboxylic acid) through the action of microorganisms.
Collectively called 236B compounds. ) to convert the formula The present invention relates to a method for producing the ML-236B derivative or its ring-closed lactone. In the above formula, R 1 represents a hydrogen atom; a lower alkyl group such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl; or an alkali metal such as sodium or potassium. R 2 is the group
【式】 または【formula】 or
【式】を示
す。
前記一般式（）を有するML−236B誘導体も
しくはこの閉環ラクトン体はコレステロールの合
成を阻害することにより、血中の脂質を低下させ
る作用を有し、例えば高脂血症治療剤、動脈硬化
予防薬として医薬に使用することが出来る。
前記式（）で示される物質の中、
式
で示されるる物質をＭ−３と略称し、式
で示される物質をＭ−４と略称し、式
で示される物質をイソＭ−4′と略称する。
Ｍ−３はML−236Bの化学変換生成物として
（特開昭56−150037）、またＭ−４は動物に対する
ML−236Bラクトン投与実験中にその代識産物と
して（特開昭57−2240）、本出願人の研究室で既
に分離されていたものである。
前記式（）で示されるML−236B誘導体もし
くはこの閉環ラクトン体はいずれもコレステロー
ル合成阻害作用を有するが、特にＭ−４のコレス
テロール合成阻害作用は顕著であり、ML−236B
ラクトンの10倍以上の阻害作用を示す。しかしな
がら、Ｍ−４はML−236Bラクトンを投与した動
物の代識産物としてのみ得られていたものであ
り、量産性に乏しく、従つて本物質の経済的な生
産方法を検討していたところ、微生物の作用によ
り、ML−236B化合物を式（）を有するML−
236B誘導体もしくはこの閉環ラクトン体に変換
せしめ得ることを見出し、本発明を完成した。
ML−236BラクトンおよびML−236Bカルボン
酸自体は既知物質であり、青カビの一種ペニシリ
ウム・チトリヌムの代識産物より分離、精製され
た物質で、次式に示される化学構造を有してお
り、実験動物から分離した酵素系や培養細胞系に
おいてコレステロールの生合成をその律速酵素の
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル・コエン
ザイムＡリダクターゼと競合することにより阻害
し、動物の個体レベルにおいても強力な血清コレ
ステロールの低下作用を示すことが知られている
（特開昭50−155690号、ジヤーナル・オブ・アン
チビオテイクス 29巻 1346〜1348頁 1976
年）。[Formula] is shown. The ML-236B derivative having the general formula () or its ring-closed lactone has the effect of lowering blood lipids by inhibiting the synthesis of cholesterol, and is used, for example, as a therapeutic agent for hyperlipidemia and as a preventive agent for arteriosclerosis. It can be used as a medicine. Among the substances represented by the above formula (), the formula The substance represented by is abbreviated as M-3 and has the formula The substance represented by is abbreviated as M-4 and has the formula The substance represented by is abbreviated as isoM-4'. M-3 is a chemical conversion product of ML-236B (Japanese Patent Application Laid-open No. 56-150037), and M-4 is a chemical conversion product for animals.
This product had already been isolated in the applicant's laboratory as a surrogate product (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-2240) during an experiment in which ML-236B lactone was administered. The ML-236B derivative represented by the above formula () or its ring-closed lactone form has an inhibitory effect on cholesterol synthesis, but the inhibitory effect on cholesterol synthesis of M-4 is particularly remarkable, and ML-236B
Shows 10 times more inhibitory action than lactone. However, M-4 was obtained only as a surrogate product from animals administered with ML-236B lactone, and it was not suitable for mass production.Therefore, when we were considering an economical method for producing this substance, we found that Due to the action of microorganisms, the ML-236B compound has the formula ()
The present invention was completed by discovering that it can be converted into a 236B derivative or its ring-closed lactone. ML-236B lactone and ML-236B carboxylic acid themselves are known substances, separated and purified from a representative product of Penicillium titrinum, a type of blue mold, and have the chemical structure shown in the following formula. It inhibits cholesterol biosynthesis in enzyme systems isolated from animals and in cultured cell systems by competing with its rate-limiting enzyme, 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, and is a powerful serum inhibitor even at the individual animal level. It is known to have a cholesterol-lowering effect (Japanese Patent Application Laid-open No. 155690/1976, Journal of Antibiotics, Vol. 29, pp. 1346-1348, 1976)
Year).
【式】および[expression] and
【式】
同様にML−236Bカルボン酸低級アルキルエス
テルは次式
（式中、R3は低級アルキル基を示す。）で示され
（特開昭53−84954）、ML−236Bカルボン酸のア
ルカリ金属塩としては金属塩（特開昭53−
56314）があげられ、これらもまたコレステロー
ル阻害作用を示すことが知られている。
ML−236B化合物を前記式（）で示される
ML−236B誘導体もしくはこの閉環ラクトン体に
変換せしめ得る微生物としてはアブシデイア
（Absidia）属、カニンガメラ
（Cunninghamella）属、シンセフアラストラム
（Syncephalastrum）属およびストレプトマイセ
ス（Streptomyces）属に属するML−236B化合物
変換菌があげられる。これらに属する微生物の
中、特に
アブシテイア・コエルレア IFO 4423
（Absidia coerulea）
カニンガメラ・エチヌラータ IFO 4445
（Cunninghamella echinulata）
シンセフアラストラム・ラセモーサム IFO
4814（Syncephalastrum racemosum）
シンセフアラストラム・ラセモーサム IFO
4828（Syncephalastrum racemosum）
ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス
NRRL 1233（Streptomyces
roseochromogenus）
ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス
IFO 3363（Streptomyces roseochromogenus）
ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス
IFO 3411（Streptomyces roseochromogenus）
ストレプトマイセス・ハルステデイ IFO
3199（Streptomyces halstedii）
ストレプトマイセス・プラテンシス NRRL
2364（Streptomyces platensis）
ストレプトマイセス・フアルビシマス
NRRLB−1453（Streptomyces fulvissimus）
が好適である。
本発明において好適に用いられる微生物は、公
的な菌保存機関（IFOまたはNRRL）より入手可
能である。
ML−236B化合物を前記式（）で示される物
質に変換せしめるには、ML−236B化合物を含む
培地で微生物菌（生菌または休止菌体系）を培養
するか、場合によつてはこれらの微生物の酵素抽
出液（無細胞抽出液）をML−236B化合物と接触
せしめることによつても達成される。
この場合、微生物（生菌）培養では培養条件に
よつてカルボン酸型、ラクトン型、アルカリ金属
塩または低級アルキルエステル型として生成す
る。また休止菌体系および酵素抽出液（無細胞抽
出液）ではアルカリ金属塩として得られる。
あるいは、ML−236B化合物から微生物変換に
よつて得られるカルボン酸型をそのまま、または
ラクトン型に変換した後、所望により化学的常
法、例えばジアゾアルカンまたは塩を形成する物
質と処理することにより、これらを低級アルキル
エステル型もしくはアルカリ金属塩として得るこ
ともできる。また、同様に例えばアルカリ金属塩
を所望により化学的常法によつて処理することに
より、低級アルキルエステル型に変換することも
できる。
次に実施例を示す。
実施例 １
下記組成の培地100mlを含有する500ml容坂口フ
ラスコ20本にアブシテイア・コエルレア
IFO4423を植菌し、26℃、120s.p.m.で振盪培養
し、２日後、ML−236B Na塩を最終濃度で0.05
％になるように添加して更に５日間26℃、120s.
p.m.で培養する。
培地組成
グルコース 2.0％
K2HPO4 0.15
MgSO4・7H2O 0.15
NH4NO3 0.1
ペプトン 0.1
C.S.L 0.2
イーストエキストラクト 0.1
ZnSO4・7H2O 0.001
水道水 残
（PH7.0に調整）
培養終了後、変換反応液を過し、液をトリ
フルオロ酢酸でPH３に調整した。次いで、１の
酢酸エチルで３回抽出するとＭ−３、Ｍ−４及び
イソＭ−4′を含む区分が得られる。この中、Ｍ−
３区分は薄層クロマトグラフイー（TLC）（プレ
ート；メルク社製シリカゲル Art5715溶媒；ベ
ンゼン：アセトン：酢酸＝50：50：３）によりＲ
f値0.2を示す。Ｍ−３区分の抽出液を飽和食塩溶
液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後、触媒量の
トリフルオロ酢酸を添加してラクトン化した。次
いで上記抽出液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液
で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後、減圧乾固し
た。残渣をローバー・カラム（メルク社製RP−
８サイズＡ）を用い、25％アセトニトリルで溶出
し、Ｍ−３のラクトン体として385mgを得た。
Ｍ−３ラクトンの特性値
(1) 融点：63〜67℃
(2) 質量分析値（M+）：424（C23H36O7）
(3) 紫外部吸収スペクトル（メタノール）：
末端吸収のみ
(4) 赤外部吸収スペクトル（KBr）νnaxcm-1：
3300、1720
(5) NMRスペクトル（CDCl3）δppm：
5.9（1H、二重二重線、Ｊ＝1.5、５Hz）
5.5（1H、多重線）
4.3（2H、多重線）
3.9（1H、二重二重線、Ｊ＝３、５Hz）
実施例 ２
実施例１に示したのと同組成の培地100mlを含
有する500ml容坂口フラスコ20本にアブシテイ
ア・コエルレアIFO4423を植菌し、26℃、12s.p.
m.で振盪培養し、２日後、ML−236B Na塩を最
終濃度で0.05％になるように添加して更に５日間
26℃、120s.p.m.で培養する。
培養終了後、変換反応液を過し、液をトリ
フルオロ酢酸でPH３に調整した。次いで、１の
酢酸エチルで３回抽出するとＭ−３、イソＭ−
4′およびＭ−４を含む区分が得られる。この中、
イソＭ−4′とＭ−４は双方共薄層クロマトグラフ
イー（TLC）（プレート；メルク社製シリカゲル
Art5715溶媒；ベンゼン：アセトン：酢酸＝
50：50：３）によりＲf値0.45を示す。上記抽出
液を飽和食塩溶液で洗浄し、ジアゾメタンのエー
テル溶液を加え、30分放置後、減圧乾固した。残
渣をローバー・カラム（メルク社製Si60、サイズ
Ａ）にかけ、ベンゼン：酢酸エチル＝１：１の系
で精製するとイソＭ−4′メチルエステルを含む区
分（活性区分）とＭ−４メチルエステルを含む
区分（活性区分）に分けられる。活性区分は
200mgが得られた。活性区分をローバー・カラ
ム（メルク社製RP−８サイズＡ）を用い、35％
アセトニトリルで溶出し、イソＭ−4′メチルエス
テルの精製標品78mgが無色油状体として得られ
た。なお本操作におけるジアゾメタンに代えて、
適当なジアゾアルカンを使用すると該当するイソ
Ｍ−4′のアルキルエステルが得られる。イソＭ−
4′メチルエステルは次の特性を有する。
(1) NMRスペクトル
重クロロホルム中、内部標準にTMSを使用
して、100MHzで測定したNMRスペクトルを第
１図に示す。
(2) マススペクトル
Ｎ・Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフル
オロアセトアミドでシリル化した後、日本電子
製Ｄ−300型を用いて測定した。
Ｍ／ｅ：654（M+）、552、462、372、272、
233、231
(3) 紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）
λnax（ｎｍ）：229、234.8、244.5
(4) 赤外部吸収スペクトル（薄膜法）
第２図に示す。
(5) TLC
TLCプレート；メルク社製シリカゲル
Art5715
溶媒；ベンゼン：アセトン（１：１）
Ｒf値 0.88
実施例 ３
実施例１に示したのと同組成の培地100mlを含
有する500ml容坂口フラスコ20本にアブシデイ
ア・コエルレアIFO4423を植菌し、26℃、120s.
p.m.で振盪培養し、２日後、ML−236B Na塩を
最終濃度で0.05％になるようにな添加して更に５
日間26℃、120s.p.m.で培養する。
培養終了後、変換反応液を過し、液をトリ
フルオロ酢酸でPH３に調整した。次いで、１の
酢酸エチルで３回抽出するとＭ−３とＭ−４とイ
ソＭ−4′を含む区分が得られる。この中、Ｍ−４
とイソＭ−4′は双方共薄層クロマトグラフイー
（TLC）（プレート；メルク社製シリカゲル
Art5715溶媒；ベンゼン：アセトン：酢酸＝50：
50：３）によりＲf値0.45を示す。上記抽出液を
飽和食塩溶液で洗浄し、ジアゾメタンのエーテル
溶液を加え、30分放置後、減圧乾固した。残渣を
ローバー・カラム（メルク社製Si60、サイズＡ）
にかけ、ベンゼン：酢酸エチル＝１：１の系で精
製するとイソＭ−4′メチルエステルを含む区分
（活性区分）とＭ−４メチルエステルを含む区
分（活性区分）に分けられる。活性区分は
185.3mgが得られた。活性区分をローバー・カ
ラム（メルク社製RP−８、サイズＡ）を用い、
35％アセトニトリルで溶出し、Ｍ−４メチルエス
テルの精製標品20mgが無色油状体として得られ
た。なお本操作におけるジアゾメタンに代えて、
適当なジアゾアルカンを使用すると該当するＭ−
４のアルキルエステルが得られる。
Ｍ−４メチルエステルは次の特性を有する。
(1) NMRスペクトル
重クロロホルム中内部基準にTMSを使用し
て200MHzで測定した。
（CDCl3）δppm：
0.88（3H、ｔ、Ｊ＝7.3Hz）
0.89（3H、ｄ、Ｊ＝6.5Hz）
1.12（3H、ｄ、Ｊ＝6.8Hz）
1.1〜1.7（10H、ｍ）
2.34（1H、sex、Ｊ＝７Hz）
2.3〜2.5（2H、ｍ）
2.49（2H、ｄ、Ｊ＝6.4Hz）
2.58（1H、ｍ）
3.72（3H、ｓ）
3.78（1H、ｍ）
4.25（1H、quin、Ｊ＝７Hz）
4.4（1H、ｍ）
5.42（1H、ｍ）
5.56（1H、ｍ）
5.90（1H、ｄ、ｄ、Ｊ＝9.8、5.6Hz）
5.99（1H、ｄ、Ｊ＝9.8Hz）
(2) マススペクトル
Ｎ・Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフル
オロアセトアミドでシリル化した後、日本電子
製Ｄ−300型を用いて測定した。
Ｍ／ｅ：654（M+）、552、462、372、290、
272、233、231
(3) 紫外部吸収スペクトル（エタノール溶液）
λnax（ｎｍ）：230.1、237.3、246.4
(4) 赤外部吸収スペクトル（薄膜法）cm-1：
3400、2950、1730
(5) TLC
TLCプレート；メルク社製シリカゲル
Art5715
溶媒；ベンゼン：アセトン（１：１）
Ｒf値 0.88
実施例 ４
カニンガメラ・エチヌラータ IFO 4445を用
い、実施例１と同様に操作してＭ−３ラクトンを
得た。
実施例 ５
シンセフアラストラム・ラセモーサム IFO
4828を用い、実施例１と同様に操作してＭ−３ラ
クトンを得た。
実施例 ６
シンセフアラストラム・ラセモーサム IFO
4814を用い、実施例１と同様に操作してＭ−３ラ
クトンを得た。
実施例 ７
ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス
NRRL 1233を用い、実施例１と同様に操作して
Ｍ−３ラクトンを得た。
実施例 ８
ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス
IFO 3363を用い、実施例１と同様に操作してＭ
−３ラクトンを得た。
実施例 ９
ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス
IFO 3411を用い、実施例１と同様に処理してＭ
−３ラクトンを得た。
実施例 10
ストレプトマイセス・ハルステデイ IFO
3199を用い、実施例１と同様に処理してＭ−３ラ
クトンを得た。
実施例 11
ストレプトマイセス・プラテンシス NRRL
2364を用い、実施例１と同様に操作してＭ−３ラ
クトンを得た。
実施例 12
ストレプトマイセス・フアルビシマス
NRRLB−1453を用い、実施例１と同様に操作し
てＭ−３ラクトンを得た。
実施例 13
アブシデイア・コエルリアIFO 4423を用いて
実施例２と同様に操作して、ML−236B Na塩の
変換反応液1.9を得た。変換反応液を過し、
液をトリフルオロ酢酸でPH3.0に調整した。次
いで、１の酢酸エチルで３回抽出するとＭ−３
とイソＭ−4′とＭ−４を含む区分が得られる。上
記抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム
で脱水後、触媒量のトリフルオロ酢酸を添加して
ラクトン化した。次いで上記抽出液を５％炭酸水
素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで
脱水後、減圧乾固した。残渣をローバー・カラム
（メルク社製Si60サイズＡ）にかけ酢酸エチルで
溶出しイソＭ−4′ラクトン区分とＭ−４ラクトン
区分を分離採取した。イソＭ−4′ラクトン区分を
ベンゼン：酢酸エチル（１：１）の系で精製し、
イソＭ−4′ラクトン198mgが得られた。更にこれ
をローバー・カラム（メルク社製RP−８サイズ
Ａ）を用い、35％アセトニトリルで溶出し、イソ
Ｍ−4′ラクトンの精製標品82mgが得られた。
イソＭ−4′ラクトンは次の特性を有する。
(1) NMRスペクトル
重クロロホルム中、内部標準にTMSを使用
して100MHzで測定したNMRスペクトルを第３
図に示す。
(2) 紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）
λnax（ｎｍ）：229、234.8、244.5
(3) 赤外部吸収スペクトル（薄膜法）
第４図に示す。
実施例 14
カニンガメラ・エチヌラータ IFO 4445を用
い、実施例13と同様に操作してイソＭ−4′ラクト
ンを得た。
実施例 15
シンセフアラストラム・ラセモーサム IFO
4814を用い、実施例13と同様に操作してイソＭ−
4′ラクトンを得た。
実施例 16
シンセフアラストラム・ラセモーサム IFO
4828を用い、実施例13と同様に操作してイソＭ−
4′ラクトンを得た。
実施例 17
ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス
NRRL 1223を用い、実施例13の方法に従つてイ
ソＭ−4′ラクトンを得た。
実施例 18
実施例13と同様に操作して、ローバー・カラム
で分離したＭ−４区分を同様に精製してＭ−４ラ
クトンを得た。
Ｍ−４ラクトンは次の物性値を有する。
(1) NMRスペクトル
重クロロホルム中、内部標準にTMSを使用
して、60MHzで測定したNMRスペクトルを第
５図に示す。
(2) 紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）
λnax（ｎｍ）＝230、236.7、244.6
(3) 赤外部吸収スペクトル（薄膜法）cm-1
3400、2950、1725
(4) TLC
TLCプレート：メルク社製シリカゲル
Art5715
溶媒；ベンゼン：アセトン：酢酸＝50：50：３
Ｒf値 0.62
実施例 19
実施例１と同様に操作して得た酢酸エチル抽出
液を飽和食塩溶液で洗浄し、ジアゾメタンのエー
テル溶液を加え30分放置後、減圧乾固した。残渣
をローバー・カラム（メルク社製Si60サイズＡ）
にかけ、ベンゼン：酢酸エチル（１：１）の系で
精製し、再度ローバー・カラム（メルク社製RP
−８サイズＡ）にかけ、35％アセトニトリルで溶
出し、Ｍ−３メチルエステルの精製標品を得た。
なお本操作におけるジアゾメタンに代えて適当な
ジアゾアルカンを使用すると該当するＭ−３のア
ルキルエステルが得られる。
Ｍ−３メチルエステルの物性値は次の通りであ
る。
(1) 質量分析（M+）：456
(2) 元素分析値：C24H40O8として
計算値 Ｃ；60.53 Ｈ；8.77
実測値 Ｃ；61.02 Ｈ；8.90
(3) 紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）
末端吸収のみ
(4) 赤外部吸収スペクトル（液膜法）
νnaxcm-1；3300、1720
(5) NMRスペクトル（CDCl3）δppm：
5.9（1H、二重二重線、Ｊ＝1.5、５Hz）
5.3（1H、多重線）
4.2〜3.8（3H、多重線）
3.6（3H、一重線）
2.6（2H、二重線）
(6) 旋光度〔α〕２０ Ｄ：＋35゜（Ｃ＝1.02、メタノ
ール）
実施例 20
下記組成の培地100mlを含有する500ml容坂口フ
ラスコ20本にアブシデイア・コエルレア IFO
4423を植菌し、26℃、120s.p.m.で振盪培養し、
２日後、ML−236B Na塩を最終濃度で0.05％に
なるように添加して更に５日間26℃、120s.p.m.
で培養する。
培地組成
グルコース 2.0％
Na2HPO4 0.15
MgSO4・7H2O 0.15
NH4NO3 0.1
ペプトン 0.1
C.S.L 0.2
イーストエキストラクト 0.1
ZnSO4・7H2O 0.001
水道水 残
（PH7.0に調整）
培養終了後、変換反応液を過し、液をHP
−20カラム（三菱化成社製）に吸着させ、水洗
後、50％アセトンでＭ−４ナトリウム塩、イソＭ
−4′ナトリウム塩およびＭ−３ナトリウム塩を含
有する区分を溶出し、凍結乾燥品830mgを得た。
これを高速液体クロマトグラフイー（カラム：マ
イクロボンダパツクC18、40％メタノール１ml／
min）によりくり返し精製し、Ｍ−４ナトリウム
塩、イソＭ−4′ナトリウム塩を各々32mg、280mg
得た。
Ｍ−４ナトリウム塩およびイソＭ−4′ナトリウ
ム塩は次の特性を有する。
Ｍ−４ナトリウム塩
(1) NMRスペクトル
重メタノール中、内部基準にTMSを使用し
て200MHzで測定した。
（CD3OD）δppm：
0.91（3H、ｔ、Ｊ＝7.5Hz）
0.92（3H、ｄ、Ｊ＝７Hz）
1.12（3H、ｄ、Ｊ＝７Hz）
1.1〜1.8（10H、ｍ）
2.25（1H、ｄ、ｄ、Ｊ＝15、7.6Hz）
2.34（1H、ｄ、ｄ、Ｊ＝15、5.5Hz）
2.2〜2.4（3H、ｍ）
2.48（1H、ｍ）
3.68（1H、ｍ）
4.07（1H、ｍ）
4.28（1H、ｍ）
5.36（1H、ｍ）
5.48（1H、ｄ、ｄ、Ｊ＝３、２Hz）
5.88（1H、ｄ、ｄ、Ｊ＝9.6、5.3Hz）
5.98（1H、ｄ、Ｊ＝9.8Hz）
(2) 紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）
λnax（ｎｍ）：230.0、237.2、245.0
(3) 赤外部吸収スペクトル（KBr法）cm-1：
3400、2900、1725、1580
(4) TLC
TLCプレート；メルク社製シリカゲル Art
5715
溶媒；ベンゼン：アセトン：酢酸（50：50：
３）
Ｒf値 0.45
イソＭ−4′ナトリウム塩
(1) 紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）
λnax（ｎｍ）；229（sh）、235、245（sh）
(2) 赤外部吸収スペクトル（KBr法）cm-1
3400、2850、1710、1580
(3) TLC
TLCプレート；メルク社製シリカゲル Art
5715
溶媒；ベンゼン：アセトン：酢酸（50：50：
３）
Ｒf値 0.45
実施例 21
カニンガメラ・エチヌラータ IFO 4445を用
い、実施例３と同様に操作してＭ−４メチルエス
テルを得た。
実施例 22
ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス
NRRL 1233を用い、実施例３と同様に操作して
Ｍ−４メチルエステルを得た。
実施例 23
シンセフアラストラム・ラセモーサム IFO
4814を用い、実施例３と同様に操作してＭ−４メ
チルエステルを得た。
実施例 24
シンセフアラストラム・ラセモーサム IFO
4828を用い、実施例３と同様に操作してＭ−４メ
チルエステルを得た。
コレステロール合成阻害作用
前記式（）で示される化合物はコレステロー
ル合成経路上の律速酵素として知られる３−ヒド
ロキシ−３−メチルグルタリル・コエンザイムＡ
リダクターゼ（３−hydroxy−３−methyl−
glutaryl−Co Ａ reductase）を特異的に阻害す
ることが分つた。これらの化合物のコレステロー
ル合成阻害作用〔ジヤーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）234巻2835
頁（1959年）記載の方法で測定〕を第１表に示
す。[Formula] Similarly, ML-236B carboxylic acid lower alkyl ester is expressed by the following formula: (In the formula, R 3 represents a lower alkyl group.) (JP-A-53-84954), and the alkali metal salt of ML-236B carboxylic acid is a metal salt (JP-A-53-84954).
56314), and these are also known to exhibit cholesterol inhibitory effects. The ML-236B compound is represented by the above formula ()
Examples of microorganisms that can be converted into ML-236B derivatives or their ring-closed lactones include ML-236B compound conversions belonging to the genus Absidia, Cunninghamella, Syncephalastrum, and Streptomyces. Bacteria can be given. Among these microorganisms, especially Absyteia coerulea IFO 4423
(Absidia coerulea) Cunningamela etinulata IFO 4445
(Cunninghamella echinulata) Synthephalastrum racemosum IFO
4814 (Syncephalastrum racemosum) Syncephalastrum racemosum IFO
4828 (Syncephalastrum racemosum) Streptomyces roseochromogenus
NRRL 1233 (Streptomyces
roseochromogenus) Streptomyces roseochromogenus
IFO 3363 (Streptomyces roseochromogenus) Streptomyces roseochromogenus
IFO 3411 (Streptomyces roseochromogenus) Streptomyces halsteadei IFO
3199 (Streptomyces halstedii) Streptomyces platensis NRRL
2364 (Streptomyces platensis) Streptomyces falbicimus
NRRLB-1453 (Streptomyces fulvissimus) is preferred. Microorganisms preferably used in the present invention are available from public microorganism repositories (IFO or NRRL). In order to convert the ML-236B compound into the substance represented by the above formula (), microorganisms (live or dormant) can be cultured in a medium containing the ML-236B compound, or in some cases, these microorganisms can be This can also be achieved by contacting an enzyme extract (cell-free extract) with the ML-236B compound. In this case, in the culture of microorganisms (living bacteria), it is produced as a carboxylic acid type, lactone type, alkali metal salt, or lower alkyl ester type depending on the culture conditions. In addition, it is obtained as an alkali metal salt in a resting bacterial system and an enzyme extract (cell-free extract). Alternatively, the carboxylic acid form obtained by microbial conversion from the ML-236B compound may be used as it is or after being converted into the lactone form, if desired, by treatment with a conventional chemical method, such as a diazoalkane or a salt-forming substance, These can also be obtained as lower alkyl esters or alkali metal salts. Similarly, for example, an alkali metal salt can be converted into a lower alkyl ester type by treating it with a conventional chemical method, if desired. Next, examples will be shown. Example 1 Absyteia coerulea was added to 20 500 ml Sakaguchi flasks containing 100 ml of a medium with the following composition.
IFO4423 was inoculated and cultured at 26℃ with shaking at 120s.pm.After 2 days, ML-236B Na salt was added to the final concentration of 0.05.
% and then incubated at 26℃ for 120s for another 5 days.
Culture at pm. Medium composition Glucose 2.0% K 2 HPO 4 0.15 MgSO 4・7H 2 O 0.15 NH 4 NO 3 0.1 Peptone 0.1 CSL 0.2 Yeast extract 0.1 ZnSO 4・7H 2 O 0.001 Tap water Remainder (adjusted to PH7.0) After completion of culture The conversion reaction solution was filtered, and the pH of the solution was adjusted to 3 with trifluoroacetic acid. It is then extracted three times with 1 of ethyl acetate to obtain a fraction containing M-3, M-4 and isoM-4'. Among these, M-
The three sections were separated by thin layer chromatography (TLC) (plate: Merck silica gel Art5715 solvent; benzene:acetone:acetic acid = 50:50:3).
Indicates an f value of 0.2. The extract of M-3 was washed with a saturated saline solution, dehydrated with sodium sulfate, and then lactonized by adding a catalytic amount of trifluoroacetic acid. Next, the above extract was washed with a 5% aqueous sodium bicarbonate solution, dehydrated with sodium sulfate, and then dried under reduced pressure. Transfer the residue to a Rover column (Merck RP-
8 size A) and eluted with 25% acetonitrile to obtain 385 mg of M-3 as a lactone. Characteristic values of M-3 lactone (1) Melting point: 63-67℃ (2) Mass spectrometry value (M + ): 424 (C 23 H 36 O 7 ) (3) Ultraviolet absorption spectrum (methanol): Only terminal absorption (4) Infrared absorption spectrum (KBr) ν nax cm -1 : 3300, 1720 (5) NMR spectrum (CDCl 3 ) δppm: 5.9 (1H, double doublet, J=1.5, 5Hz) 5.5 (1H, 4.3 (2H, multiplet) 3.9 (1H, double doublet, J = 3, 5Hz) Example 2 A 500ml Sakaguchi flask containing 100ml of a medium with the same composition as shown in Example 120 The books were inoculated with Absyteia coerulea IFO4423 and incubated at 26℃ for 12s.p.
After 2 days, ML-236B Na salt was added to the final concentration of 0.05% for another 5 days.
Incubate at 26℃ and 120s.pm. After the cultivation was completed, the conversion reaction solution was filtered, and the pH of the solution was adjusted to 3 with trifluoroacetic acid. Then, extracting 1 three times with ethyl acetate yields M-3, isoM-
A section containing 4' and M-4 is obtained. Among these,
Both IsoM-4' and M-4 were prepared using thin layer chromatography (TLC) (plate; Merck silica gel).
Art5715 Solvent; Benzene: Acetone: Acetic acid =
50:50:3) shows an R f value of 0.45. The above extract was washed with a saturated sodium chloride solution, an ether solution of diazomethane was added, and after standing for 30 minutes, it was dried under reduced pressure. The residue was applied to a Rover column (Merck Si60, size A) and purified using a benzene:ethyl acetate ratio of 1:1 to separate the fraction containing isoM-4' methyl ester (active fraction) and the M-4 methyl ester. It is divided into containing categories (active categories). The activity category is
200mg was obtained. The activity was divided into 35% using a Rover column (Merck RP-8 size A).
Elution with acetonitrile gave 78 mg of purified isoM-4' methyl ester as a colorless oil. Note that instead of diazomethane in this operation,
Use of the appropriate diazoalkanes provides the corresponding alkyl esters of isoM-4'. IsoM-
4' methyl ester has the following properties: (1) NMR spectrum Figure 1 shows the NMR spectrum measured at 100MHz in deuterated chloroform using TMS as an internal standard. (2) Mass spectrum After silylation with N.O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, measurement was performed using JEOL Model D-300. M/e: 654 (M + ), 552, 462, 372, 272,
233, 231 (3) Ultraviolet absorption spectrum (methanol solution) λ nax (nm): 229, 234.8, 244.5 (4) Infrared absorption spectrum (thin film method) Shown in Figure 2. (5) TLC TLC plate; Merck silica gel
Art5715 Solvent; Benzene: Acetone (1:1) R f value 0.88 Example 3 Twenty 500 ml Sakaguchi flasks containing 100 ml of a medium with the same composition as shown in Example 1 were inoculated with Absidia coerulea IFO4423, 26℃, 120s.
After 2 days, ML-236B Na salt was added to a final concentration of 0.05% and cultured with shaking at pm.
Incubate at 26°C and 120s.pm for days. After the cultivation was completed, the conversion reaction solution was filtered, and the pH of the solution was adjusted to 3 with trifluoroacetic acid. Then, extraction is performed three times with ethyl acetate of 1 to obtain a fraction containing M-3, M-4, and isoM-4'. Among these, M-4
and IsoM-4' were both prepared using thin layer chromatography (TLC) (plate; silica gel manufactured by Merck & Co.).
Art5715 Solvent; Benzene: Acetone: Acetic acid = 50:
50:3) shows an R f value of 0.45. The above extract was washed with a saturated sodium chloride solution, an ether solution of diazomethane was added, and after standing for 30 minutes, it was dried under reduced pressure. Transfer the residue to a Rover column (Merck Si60, size A)
When purified using a benzene:ethyl acetate ratio of 1:1, it is divided into a fraction containing isoM-4' methyl ester (active fraction) and a fraction containing M-4 methyl ester (active fraction). The activity category is
185.3mg was obtained. The activity was divided using a Rover column (Merck RP-8, size A).
Elution with 35% acetonitrile gave 20 mg of purified M-4 methyl ester as a colorless oil. Note that instead of diazomethane in this operation,
Using a suitable diazoalkane, the corresponding M-
The alkyl ester of 4 is obtained. M-4 methyl ester has the following properties. (1) NMR spectrum Measured at 200MHz in deuterated chloroform using TMS as an internal standard. (CDCl 3 ) δppm: 0.88 (3H, t, J = 7.3Hz) 0.89 (3H, d, J = 6.5Hz) 1.12 (3H, d, J = 6.8Hz) 1.1~1.7 (10H, m) 2.34 (1H , sex, J=7Hz) 2.3-2.5 (2H, m) 2.49 (2H, d, J=6.4Hz) 2.58 (1H, m) 3.72 (3H, s) 3.78 (1H, m) 4.25 (1H, quin, J=7Hz) 4.4 (1H, m) 5.42 (1H, m) 5.56 (1H, m) 5.90 (1H, d, d, J=9.8, 5.6Hz) 5.99 (1H, d, J=9.8Hz) (2 ) Mass spectrum After silylation with N.O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, measurement was performed using JEOL D-300 model. M/e: 654 (M + ), 552, 462, 372, 290,
272, 233, 231 (3) Ultraviolet absorption spectrum (ethanol solution) λ nax (nm): 230.1, 237.3, 246.4 (4) Infrared absorption spectrum (thin film method) cm -1 : 3400, 2950, 1730 (5) TLC TLC plate; Merck silica gel
Art5715 Solvent; Benzene: Acetone (1:1) R f value 0.88 Example 4 Using Cunninghamella etinulata IFO 4445, M-3 lactone was obtained in the same manner as in Example 1. Example 5 Synthesphalastrum racemosaum IFO
M-3 lactone was obtained using 4828 in the same manner as in Example 1. Example 6 Synthesphalastrum racemosaum IFO
M-3 lactone was obtained using 4814 in the same manner as in Example 1. Example 7 Streptomyces roseochromogenus
M-3 lactone was obtained using NRRL 1233 in the same manner as in Example 1. Example 8 Streptomyces roseochromogenus
Using IFO 3363, perform the same operation as in Example 1 to obtain M
-3 lactone was obtained. Example 9 Streptomyces roseochromogenus
Using IFO 3411, M
-3 lactone was obtained. Example 10 Streptomyces halsteadii IFO
3199 was treated in the same manner as in Example 1 to obtain M-3 lactone. Example 11 Streptomyces platensis NRRL
M-3 lactone was obtained using 2364 in the same manner as in Example 1. Example 12 Streptomyces falbicimus
M-3 lactone was obtained using NRRLB-1453 in the same manner as in Example 1. Example 13 Using Absidia coerulia IFO 4423, the same procedure as in Example 2 was carried out to obtain ML-236B Na salt conversion reaction solution 1.9. Filter the conversion reaction solution,
The pH of the solution was adjusted to 3.0 with trifluoroacetic acid. Then, extracting 1 with ethyl acetate three times yields M-3.
A section containing isoM-4' and M-4 is obtained. The above extract was washed with saturated brine, dehydrated with sodium sulfate, and then lactonized by adding a catalytic amount of trifluoroacetic acid. Next, the above extract was washed with a 5% aqueous sodium bicarbonate solution, dehydrated with sodium sulfate, and then dried under reduced pressure. The residue was applied to a Rover column (Si60 size A manufactured by Merck & Co.) and eluted with ethyl acetate to separate and collect the isoM-4' lactone fraction and the M-4 lactone fraction. The isoM-4′ lactone fraction was purified using a benzene:ethyl acetate (1:1) system,
198 mg of isoM-4'lactone was obtained. This was further eluted with 35% acetonitrile using a Rover column (RP-8 size A manufactured by Merck & Co.) to obtain 82 mg of a purified sample of isoM-4' lactone. IsoM-4' lactone has the following properties. (1) NMR spectrum The NMR spectrum measured at 100MHz in deuterated chloroform using TMS as an internal standard is the third
As shown in the figure. (2) Ultraviolet absorption spectrum (methanol solution) λ nax (nm): 229, 234.8, 244.5 (3) Infrared absorption spectrum (thin film method) Shown in Figure 4. Example 14 Using Cunninghamella etinulata IFO 4445, the same procedure as in Example 13 was carried out to obtain isoM-4' lactone. Example 15 Synthesphalastrum racemosum IFO
IsoM-4814 was prepared in the same manner as in Example 13.
4′lactone was obtained. Example 16 Synthesphalastrum racemosum IFO
4828 and the same procedure as in Example 13 to obtain isoM-
4′lactone was obtained. Example 17 Streptomyces roseochromogenus
IsoM-4' lactone was obtained using NRRL 1223 and following the method of Example 13. Example 18 In the same manner as in Example 13, the M-4 fraction separated on the Rover column was similarly purified to obtain M-4 lactone. M-4 lactone has the following physical properties. (1) NMR spectrum Figure 5 shows the NMR spectrum measured at 60MHz in deuterated chloroform using TMS as an internal standard. (2) Ultraviolet absorption spectrum (methanol solution) λ nax (nm) = 230, 236.7, 244.6 (3) Infrared absorption spectrum (thin film method) cm -1 3400, 2950, 1725 (4) TLC TLC plate: Merck & Co. Made of silica gel
Art5715 Solvent; Benzene: Acetone: Acetic acid = 50:50:3 R f value 0.62 Example 19 The ethyl acetate extract obtained in the same manner as Example 1 was washed with a saturated sodium chloride solution, and an ether solution of diazomethane was added. After standing for 30 minutes, it was dried under reduced pressure. Transfer the residue to a Rover column (Merck Si60 size A)
It was purified using a benzene:ethyl acetate (1:1) system, and then purified using a Rover column (Merck RP).
-8 size A) and eluted with 35% acetonitrile to obtain a purified sample of M-3 methyl ester.
Note that if a suitable diazoalkane is used in place of diazomethane in this operation, the corresponding alkyl ester of M-3 can be obtained. The physical properties of M-3 methyl ester are as follows. (1) Mass spectrometry (M + ): 456 (2) Elemental analysis value: C 24 H 40 O 8 Calculated value C; 60.53 H; 8.77 Actual value C; 61.02 H; 8.90 (3) Ultraviolet absorption spectrum (methanol Solution) Terminal absorption only (4) Infrared absorption spectrum (liquid film method) ν nax cm -1 ; 3300, 1720 (5) NMR spectrum (CDCl 3 ) δppm: 5.9 (1H, double doublet, J = 1.5 , 5Hz) 5.3 (1H, multiplet) 4.2 to 3.8 (3H, multiplet) 3.6 (3H, singlet) 2.6 (2H, doublet) (6) Optical rotation [α] 20 D : +35° (C= 1.02, methanol) Example 20 Absidia coerulea IFO was added to 20 500 ml Sakaguchi flasks containing 100 ml of a medium with the following composition.
4423 and cultured with shaking at 26℃ and 120s.pm.
After 2 days, ML-236B Na salt was added to a final concentration of 0.05% and incubated at 26°C for another 5 days at 120s.pm.
Cultivate with Medium composition Glucose 2.0% Na 2 HPO 4 0.15 MgSO 4・7H 2 O 0.15 NH 4 NO 3 0.1 Peptone 0.1 CSL 0.2 Yeast extract 0.1 ZnSO 4・7H 2 O 0.001 Tap water Remainder (adjusted to PH7.0) After completion of culture , filter the conversion reaction solution, and HP
-20 column (manufactured by Mitsubishi Kasei Corporation), and after washing with water, M-4 sodium salt, isoM
The fraction containing -4' sodium salt and M-3 sodium salt was eluted to obtain 830 mg of lyophilized product.
This was subjected to high performance liquid chromatography (column: Microbondapak C 18 , 40% methanol 1ml/
32 mg and 280 mg of M-4 sodium salt and isoM-4' sodium salt, respectively.
Obtained. M-4 sodium salt and isoM-4' sodium salt have the following properties. M-4 sodium salt (1) NMR spectrum Measured in heavy methanol at 200MHz using TMS as an internal standard. (CD 3 OD) δppm: 0.91 (3H, t, J = 7.5Hz) 0.92 (3H, d, J = 7Hz) 1.12 (3H, d, J = 7Hz) 1.1 to 1.8 (10H, m) 2.25 (1H, d, d, J = 15, 7.6Hz) 2.34 (1H, d, d, J = 15, 5.5Hz) 2.2 - 2.4 (3H, m) 2.48 (1H, m) 3.68 (1H, m) 4.07 (1H, m) 4.28 (1H, m) 5.36 (1H, m) 5.48 (1H, d, d, J = 3, 2Hz) 5.88 (1H, d, d, J = 9.6, 5.3Hz) 5.98 (1H, d, J =9.8Hz) (2) Ultraviolet absorption spectrum (methanol solution) λ nax (nm): 230.0, 237.2, 245.0 (3) Infrared absorption spectrum (KBr method) cm -1 : 3400, 2900, 1725, 1580 (4 ) TLC TLC plate; Merck silica gel Art
5715 Solvent; Benzene: Acetone: Acetic acid (50:50:
3) R f value 0.45 IsoM-4' sodium salt (1) Ultraviolet absorption spectrum (methanol solution) λ nax (nm); 229 (sh), 235, 245 (sh) (2) Infrared absorption spectrum (KBr method) cm -1 3400, 2850, 1710, 1580 (3) TLC TLC plate; Merck silica gel Art
5715 Solvent; Benzene: Acetone: Acetic acid (50:50:
3) R f value 0.45 Example 21 M-4 methyl ester was obtained in the same manner as in Example 3 using Cunninghamella etinulata IFO 4445. Example 22 Streptomyces roseochromogenus
M-4 methyl ester was obtained using NRRL 1233 in the same manner as in Example 3. Example 23 Synthesphalastrum racemosum IFO
4814 and operated in the same manner as in Example 3 to obtain M-4 methyl ester. Example 24 Synthesphalastrum racemosum IFO
M-4 methyl ester was obtained using 4828 in the same manner as in Example 3. Cholesterol synthesis inhibitory effect The compound represented by the formula () is 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A, which is known as the rate-limiting enzyme on the cholesterol synthesis pathway.
Reductase (3-hydroxy-3-methyl-
glutaryl-CoA reductase). Cholesterol synthesis inhibitory effect of these compounds [Journal of Biological Chemistry (J.Biol.Chem.) Vol. 234, 2835
(1959)] are shown in Table 1.
第１図はイソＭ−4′メチルエステルのNMRス
ペクトルを示し、第２図は同物質の赤外吸収スペ
クトルを示す。第３図はイソＭ−4′ラクトンの
NMRスペクトルを示し、第４図は同物質の赤外
吸収スペクトルを示す。第５図はＭ−４ラクトン
のNMRスペクトルを示す。
Figure 1 shows the NMR spectrum of isoM-4' methyl ester, and Figure 2 shows the infrared absorption spectrum of the same substance. Figure 3 shows isoM-4' lactone.
The NMR spectrum is shown, and FIG. 4 shows the infrared absorption spectrum of the same substance. Figure 5 shows the NMR spectrum of M-4 lactone.
Claims (1)
酸、その低級アルキルエステルまたはそのアルカ
リ金属塩（以下、これらをML−236B化合物と総
称する。）を式 （式中、R1は水素原子、低級アルキル基またはア
ルカリ金属を示し、R2は基 【式】 または【式】を示 す。） を有するML−236B誘導体またはこの閉環ラクト
ン体に変換しうるアブシデイア属、カニンガメラ
属、シンセフアラストラム属またはストレプトマ
イセス属に属する微生物を、ML−236B化合物を
含有する培地で培養するか、あるいはこれらの微
生物の酵素抽出液とML−236B化合物とを接触せ
しめて、ML−236B化合物を前記式（）を有す
るML−236B誘導体またはこの閉環ラクトン体に
変換せしめ変換反応物を含む系より前記式（）
を有するML−236B誘導体またはこの閉環ラクト
ン体を採取することを特徴とする前記式（）を
有するML−236B誘導体またはこの閉環ラクトン
体の製造法。[Scope of Claims] 1. ML-236B lactone, ML-236B carboxylic acid, lower alkyl ester thereof, or alkali metal salt thereof (hereinafter collectively referred to as ML-236B compound) having the formula (In the formula, R 1 represents a hydrogen atom, a lower alkyl group, or an alkali metal, and R 2 represents a group Indicates [formula] or [formula]. ) or a microorganism belonging to the genus Absidia, Caningamela, Synthephalastrum, or Streptomyces that can be converted into a closed ring lactone form is cultured in a medium containing the ML-236B compound, or Enzyme extracts of these microorganisms are brought into contact with the ML-236B compound to convert the ML-236B compound into the ML-236B derivative having the above formula () or its ring-closed lactone form, and the above formula is converted from a system containing the conversion reactant. ()
A method for producing an ML-236B derivative having the formula () or a closed-ring lactone thereof, the method comprising collecting the ML-236B derivative having the formula () or a closed-ring lactone thereof.
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