JPS62676B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS62676B2 JPS62676B2 JP58095096A JP9509683A JPS62676B2 JP S62676 B2 JPS62676 B2 JP S62676B2 JP 58095096 A JP58095096 A JP 58095096A JP 9509683 A JP9509683 A JP 9509683A JP S62676 B2 JPS62676 B2 JP S62676B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- glycerol
- oxidase
- glucose
- glycerophosphate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
技術分野
本発明はα−グリセロホスフエートオキシダー
ゼの製造法に関する。 従来技術 α−グリセロホスフエートオキシダーゼ並びに
有用な、その調製及び抽出技術は、
Koditschek、L.K.およびUmbreit、W.W.の“ス
トレプトコカスフエイチウムF24のα−グリセロ
ホスフエートオキシダーゼ”、ジヤーナル オブ
バクテリオロジー、98巻、３号、1063〜1068頁
（1969年）並びにJacobs、N.J.およびVan
Demark、P.J.の“ストレプトコカス フエカリ
スのα−グリセロホスフエート酸化酵素の精製及
び性質”、アーカイブズ オブ バイオケミスト
リー アンド バイオフイジツクス、88巻、250
−255頁に記載されている。この酵素は酸素の存
在下にα−グリセロホスフエートを酸化してジヒ
ドロキシアセトンホスフエート及び過酸化水素を
生成するのに有用である。 上掲のKoditschek及びUmbreitは、検圧検定法
を含む様々な効力検定技術を用いて研究したスト
レプトコカス フエイチウムF24のα−グリセロ
ホスフエートオキシダーゼの諸性質を説明してい
る。ストレプトコカス フエイチウムの培養は１
％トリプトン、１％酵母エキス、0.5％
K2HRO4、0.1％グルコース及び1.5％アガールか
ら成るACアガール（以下AC媒質と呼ぶことがあ
る）の穿刺（stab）に保持した。これらの細胞は
媒質から分離し、酵素生成物を検定のため抽出し
た。 前述のJacobs及びVan Demarkは、彼等もその
研究において検出検定法を用いて、ストレプトコ
カス フエカリス10C1のα−グリセロホスフエ
ートオキシダーゼの諸性質について記載してい
る。彼等は上述のAC媒質（但しグルコース0.2
％）中でストレプトコカス フエカリスを生長さ
せた。彼等はストレプトコカス フエカリスから
の酵素は受媒質としてＬ−α−グリセロホスフエ
ートに対しては高度な特異性を示し、β−グリセ
ロホスフエート、グリセロール、ジヒドロキシア
セトンホスフエートもしくは１，２−プロパンジ
オールホスフエートに対しては認識できるような
活性を示さない旨報じている。 Jacob、N.J.およびVan Demark、P.J.は、ジ
ヤーナル オブ バクテリオロジー、79巻、532
−538頁（1960年）の報文“好気的及び嫌気的に
生長させたストレプトコカス フエカリスにおけ
るグリセロール酸化機構の比較”においてストレ
プトコカス フエカリスからの好気的及び嫌気的
生長細胞を用いた分類学的研究におけるグリセロ
ールの代謝について論じている。このストレプト
コカス フエカリスは前述のAC媒質で生長させ
ている。 Gunsalus、I.C.及びUmbreit、W.W.の“スト
レプトコカス フエカリスによるグリセロールの
酸化”、ジヤーナル オブ バクテリオロジー、
49巻、347〜357頁（1945年）はストレプトコカス
フエカリスの活性細胞懸濁物によるグリセロー
ルの酸化の検定研究結果を報告している。彼等は
検定にピルビン酸塩を添加することによつて、ピ
ルビン酸塩がH2O2のスカベンジヤーとして作用
するので、グリセロール酸化レベルを高くするこ
とを見出したが、α−グリセロホスフエートオキ
シダーゼの活性は記載されていない。 Gunsalus、I.C.の“ストレプトコカス フエカ
リスによる嫌気的グリセロール発酵生成物”（ジ
ヤーナル オブ バクテリオロジー、54巻、239
−244頁（1947年））は、グリセロールと１％まで
の酵母エキスを含む媒質中でのストレプトコカス
フエカリスの生長について報告している。 Gunsalusはグリセロールによるストレプトコ
カス フエカリスの生長は僅か（好気的生長）で
あるか殆んど認められない（嫌気的生長）旨報告
している。 Claridge、C.A.及びHendlin、D.、のストレプ
トコカス フエカリスによるグリセロールの酸
化”（ジヤーナル オブ バクテリオロジー、87
巻、1181−1186頁（1962年））は一般的なワルブ
ルグ検定を用いて行なつたストレプトコカス フ
エカリスによるグリセロールの利用に関する研究
を報告している。彼等は、彼等の検定においてグ
リセロールを素早く酸化する細胞を得るために、
１％のグリセロール（10g/）を補充した、１
g/のグルコースを含む媒質中でストレプトコ
カス フエカリスを生長させることを示唆してい
る。α−グリセロホスフエートオキシダーゼ活性
は記載されていない。 前述のいくつかの文献はグリセロールの酸化い
ついての研究を一般的に報じている。これらの文
献のうちの最初の二つ、即ち、“Koditschek及び
Umbreit”並びに“Jacobs及びVan Demark”の
みが彼等の検定でα−グリセロホスフエートオキ
シダーゼの存在を示している。しかし、いずれの
文献もα−グリセロホスフエートオキシダーゼ用
誘導質、そして好ましくはこれとグリコースを組
合せてバクテリアを生長させることによつてα−
グリセロホスフエートオキシダーゼが予想外の高
い収率で生成することは示唆していない。その他
の文献はその微生物菌株中にα−グリセロホスフ
エートオキシダーゼが存在することを示唆すらし
ていない。 発明の目的及び構成 本発明の目的は微生物を媒質中で生長させるこ
とによつてα−グリセロホスフエートオキシダー
ゼを高収率で製造することにある。 本発明に従えば、 ストレプトコカス、ペデイオコカスおよびラク
トバシラス属に属するα−グリセロホスフエート
オキシダーゼ生産性微生物の少なくとも一員を生
長させてα−グリセロホスフエートオキシダーゼ
を製造するに当り、前記一員をグリセロールおよ
びその同族体から選定されたα−グリセロホスフ
エートオキシダーゼ用誘導質を含む媒質中で、ピ
ルビン酸塩の不存在下に、生長させ、次いでα−
グリセロホスフエートオキシターゼを抽出するこ
とを特徴とするα−グリセロホスフエートオキシ
ダーゼの製造法が提供される。 発明の構成及び効果の具体的説明 上記成分のほかに、前記媒質がグルコースを含
むのも好ましく、更に酵母エキス、トリプトン及
びK2HPO4を含んで成るのも有益である。本発明
の更に好ましい態様では、前記媒質中に無機塩及
びビタミンを添加してα−グリセロホスフエート
オキシダーゼの収量を著しく増大させることがで
きる。 本発明の実施に際し使用出来るストレプトコカ
ス、ペデイオコカス、ラクトバシラス属の代表的
な種は、ストレプトコカス属のストレプトコカス
フエカリス（Streptococcus faecalis）、ストレ
プトコカス クリモリス（Streptococcus
cremoris）、ストレプトコカス サリヴエリアス
（Streptococcus salivarius）、ストレプトコカス
フエイチウム（Streptococcus faecium）；ラ
クトバシラス属のラクトバシラス プランテルム
（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス
カセイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス
デルブレエキイ（Lactobacillus
delbrueckii）、ラクトバシラス フアーメンタム
（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス
ペントアシテイカス（Lactobacillus
pentoaceticus）、ラクトバシラス ラクチス
（Lactobacillus lactis）、ラクトバシラス ブユ
クネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバシ
ラス レイクマニイ（Lactobacillus
leichmannii）；及びペデイオコカス属のペデイ
オコカス セリヴイジイエ（Pediococcus
cerevisiae）である。 これらの種のうち、好ましいのはストレプトコ
カス フエカリスであり、最も好ましいのはスト
レプトコカス フエカリスATCC12755である。 ストレプトコチ（Streptococci）はWood、A.
J.及びGunsalus、I.C.の“ストレプトコチの活性
休止細胞の製造”（ジヤーナル オブ バクテリ
オロジー、44巻、333−341頁（1942年））に記載
されている、「STP媒質」と呼ばれる媒質中で普
通生長する。以下に述べるように、STP媒質中で
ストレプトコカス フエカリスATCC12755を生
長させると、60〜80U／のα−グリセロホスフ
エートオキシターゼが製造される。 本明細書に記載するストレプトコカス フエカ
リスATCC12755なる名称の微生物は、最初
ATCC（American Type Culture Collection）
にストレプトコカス フエカリスATCC12755と
して寄託されたもので、ATCCのカタログ（1974
年、第11版）にその名称で掲載されている。この
ものは前記カタログお第12版でストレプトコカス
フエイチウムATCC12755と名称変更されてい
る。 本発明に従えば、前記微生物、特にストレプト
コカス フエカリスを炭素源として好ましくはグ
ルコースの添加及びα−グリセロホスフエートオ
キシダーゼ用誘導質の添加によつて改良したSTP
媒質中で生長させることによつてα−グリセロホ
スフエートオキシダーゼが高収量で取得される。
誘導員としてグリセロールを添加することによつ
てα−グリセロホスフエートオキシダーゼの収量
がグリセロールを添加しない場合に比較して３倍
以上も増加する。その他の有用なα−グリセロホ
スフエートオキシダーゼ誘導員はグリセロールの
同族体、例えば、３−メチル−１，２−プロパン
ジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−
プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、
１，２，４−ブタントリオール、モノアセチン、
１−モノプロピニオン、１−モノブチリン、モノ
ステアリン、モノオレイン及びトリラウリンなど
である。 誘導員の有用な量は、一般に、媒質リツトル当
り約1.0〜約10gの範囲内であることを見出した。
好ましい媒質の使用量は媒質リツトル当り約2.0
〜約5.0gである。 Wood及びGunsalusによつて、呼称されたSTP
媒質は、グルコース−1.0g/、酵母エキス−10
g/、トリプトン10g/及びK2HPO4−５g/を
含む。これらの成分の有用な範囲は、グルコース
約0.1〜3.0g/、酵母エキス約1.0〜20g/、好
ましくは約2.0〜10g/、トリプトン約５〜20g/
及びK2HPO4少なくとも約3.0g/、好ましく
は約3.0〜約5.0g/であることを確認した。 生長媒質においてトリプトンに代えて使用する
ことができる他の蛋白水解物としては、例えば、
Sheffield Chemical Div.of Kraftco Ccrp.（ユ
ニオン、ニユージヤージー）から市販のソイペプ
トン タイプＴ（Scy Peptone Type Ｔ）、エダ
ミン（Edamin）タイプＴ、フアームアミン
（Ferm Amine）タイプ、、及び、Ｎ−
Ｎアミン（Amine）タイプAT、BT、ET及び
YTT；Cudahy Laboratories（オマハ、ネブラス
カ）から市販のカゼイン ヒドロリセート
（Casein Hydrolysate）、アナトン（Anatone）、
ミクロバイオトン（Microbiotone）及びフアーマ
トン（Pharmatone）；Traders Protin Div.
Traders Oil Mill Co.（フオート ワース、テキ
サス）から市販のフアーマメデイア
（Pharmamedia）並びに硫酸アンモニウムがあげ
られる。 しかしながら、前記生長媒質中のトリプトンに
代えて上述の蛋白水解物の一つを使用した場合に
は、その蛋白水解物の最適量はトリプトンの最適
量と多少変動することがある。特に有用な、トリ
プトンの代替物は、ソイ ペプトン タイプＴ
で、これはトリプトンを用いた場合に比較してα
−グリセロホスフエートオキシダーゼの収量を５
倍以上も増加させる。 前記生長媒質中においてグルコースに代えて使
用できる、その他の有用な炭素源は、例えば、ク
エン酸、乳酸、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリ
ウム、アスパラギン酸、グルタミン酸、コーンシ
ロツプ、糖密、フラクトース、ラクトース、マル
トースおよびシユクローズである。 本発明の最も好ましい態様では、生長媒質中に
グルコース約0.5〜約3.0g/を添加する。 前記生長媒質中に有効量の無機塩類およびビタ
ミン類を添加するのが有利であることも見出し
た。ここにいう「有効量」なる語は、生長媒質中
に加えて酵素の収量を増加させるのに十分な量の
無機塩類及びビタミン類の量をいう。このような
無機塩及びビタミンの添加量は塩及びビタミンの
種類によつて変動する。この量は一般に少量で、
当業者であれば通常の実験により極めて容易に定
めることができる。 大規模な発酵器中でストレプトコカス フエカ
リスのような微生物を生長させて高収量の酵素を
取得する場合に、しばしば発泡が生ずる。この泡
立ちを制御するために、特に酵素を大バツチで製
造する場合に泡制御剤を使用するのが好ましい。
本発明の実施に際して有用な泡制御剤の一例は、
ダウケミカル社（ミツドランド、ミシガン）から
市販のポリグリコール（Polyglycol）Ｐ−2000で
ある。この消泡剤は酵素の生成を妨害することな
く生長媒質中で0.5g/までの量で使用できる。
しかし、一般には約0.1g/で泡を制御するのに
十分である。その他の泡制御剤（消泡剤）も使用
できる。その選定及び使用基準は発泡を制御する
（押える）ような濃度水準で酵素合成を抑制しな
いことである。 本発明において使用する微生物は合理的な温度
範囲で生長させてα−グリセロホスフエートオキ
シダーゼを製造することができる。良好な結果は
25〜42℃の温度範囲で得ることができる。最良の
結果は約30℃の温度で達せられる。細胞を生長さ
せた後グリセロホスフエートオキシダーゼは常法
に従つて抽出することができる。 本発明の実施を例示する、以下の例において次
の条件を使用した。 １ 培養 以下の例１〜５においてストレプトコカス
フエカリスATCC12755を用いた。 ２ 媒質 (a) 培養保存媒質。 培養保存には0.2％のグリセロールを含ま
せた、ミクロ検定培養アガール（Micro
Assay Culture agar）（Difco
Laboratories、デトロイト、ミシガン）を用
いた。 (b) 発酵媒質 (i) STP媒質（Wood及びGunsalus、1942）
g/ グルコース 1.0 酵母エキス 10.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 蒸留水 全量を１にする量 (ii) 改良STP媒質−Ａ g/ グルコース 1.0 トリプトン 10.0 酵母エキス 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 蒸留水 全量を１にする量 (iii) 改良STP媒質−Ｂ g/ グルコース 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 20.0ml ビタミン溶液 1.0ml 蒸留水 全量を１にする量 (iv) 改良STP媒質−Ｃ g/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 2.5ml ビタミン溶液 １ml 水道水 全量を１にする量 (c) ソルトソリユーシヨンPYS g/ Na3C6H5O7・2H2O「クエン酸ナトリウ
ム」 5.0 MnCl2・4H2O 3.0 ZnCl 2.0 FeCl3・6H2O 2.0 MgCl2・6H2O 50.0 CuCl2・2H2O 0.2 CaCl2・2H2O 0.75 CoCl2・2H2O 0.2 NaMoO4・2H2O 0.1 Na2B4O7・10H2O 0.1 蒸留水 全量を１にする量 (d) ビタミン溶液 mg/ チアミン・HCl 200 ｐ−アミノ安息香酸 200 ピリドキシン・HCl 200 リボフラビン 200 Ｄ−パントテン酸（カルシウム塩） 200 ホール酸 2.0 ビオチン 2.0 リボフラビンは加温して溶液中に溶解させ
る。このビタミン溶液は殺菌濾過し、そして
殺菌後媒質に加えた。 ３ 培養物の保存 培養物は0.2％のグリセロールを含ませたミ
クロ検定培養アガールの穿刺上に保存した。培
養物は少なくとも週に一度新鮮な穿刺上に移し
た。30℃で48時間温置の後穿刺を４℃で保存し
た。生物体の保存用の別の方法は液体窒素中で
の貯蔵である。この目的のため培養物はSTP媒
質中で20時間生長させた。次に細胞を分離し、
アレン（Allen）のソルトソリユーシヨン
（Allen、M.B.アーカイブス オブ マイクロ
バイオロジー、32巻、270−277頁、1959年）を
含む無菌の10％グリセロール水溶液中に再懸濁
させた。この懸濁物の少量を殺菌ガラスアンプ
ルに添加し、次に密封し、液窒中に貯蔵した。 ４ 発酵 (a) 接種剤の調製 ミクロ検定培養アガールで48時間生長させ
た培養を250mlエーレンマイヤーフラスコ中
の50mlの、STP媒質中に移した。フラスコを
30℃及び200rpmで振とうした。20時間の温
置後、内容物をソーバル（Sorvall）の冷凍
遠心機（RCIIB型、デユポン インスツルメ
ント社、ニユータウン、コネチカツト）にお
いて４℃、12000Xgで15分間遠心分離した。
上澄液は捨て、細胞はもとと同じ容積の無菌
水中に再懸濁した。この懸濁物を接種剤とし
て用いた。 (b) 酵素の製造 250mlエーレンマイヤーフラスコ中の25ml
の発酵媒質に上記（4.a）で述べたようにし
て調製した接種剤1.5mlを接種した。フラス
コを30℃で200rpmで振とうした。フラスコ
を20時間振とう後、それぞれのフラスコから
サンプル2.5mlを採取した。このサンプルを
ソーバル冷凍遠心機において19000Xgで15分
間遠心した。この細胞を脱イオン水2.5ml中
に再懸濁させた。この懸濁物を10倍に希釈し
た。この希釈懸濁液を乾燥細胞重量の決定及
びα−グリセロホスフエート（α−GP）オ
キシダーゼの検定用に用いた。 ５ 乾燥細胞重量の測定 乾燥細胞重量と660mmにおける吸光度の関係
を示す検量線を調製した。スペクトロニツク20
スペクトロフオトメータ（Spectronic 20
Spectrophotometer）（バウシユ アンド ロ
ーム、ロチエスター、ニユーヨーク）で吸光度
を測定し、乾燥細胞重量を検量線から計算し
た。 ６ α−グリセロホスフエート オキシダーゼ活
性の検定 α−GPオキシダーゼ活性は、α−GPオキシ
ダーゼによつてα−グリセロホスフエートを酸
化させるに際して放出されるH2O2によるロイ
コ染料のベルオキシダーゼ接触酸化を測定する
ことによつて決定した。酵素活性の一単位
（Ｕ）は37℃及びPH7.0で１分間当りに基質の１
μモルを製品に転換する酵素の量で定義する。 (a) 試薬 (i) KPバツフアー：0.1Mリン酸カリウム緩
衝液、PH7.0 (ii) 基質溶液：100mlのKPバツフアーにα−
グリセロホスフエート17.288gを溶解、 (iii) 染料溶液：100mlの脱イオン水に３，
3′−ジメトキシ−ベンチジン ジヒドロク
ロリド（Ｏ−ジアニジン）1gを溶解、 (iv) 洗浄剤：KPバツフアー10ml中にトリト
ン（Triton）Ｘ−100（ローム アンド
ハース、フイラデルフイア、ペンシルヴア
ニア、から市販のポリエトキシエチレン界
面活性剤）1gを溶解、 (v) バツフアー溶液：KPバツフアー50ml中
にホースラデイツシユ ペルオキシダーゼ
タイプ3.3mgを溶解し、これに染料溶
液1.1ml及び洗浄剤溶液6.6mlを添加し、
KPバツフアーで全量を100mlにする。 (b) 方法 試験管中にバツフアー溶液６ml及び基質溶
液１mlを水浴シエカー（ニユーブランズウイ
ツクサイエンテイフイツク、ニユーブランズ
ウイツク、ニユージヤージー）で37℃で15分
間で平衡状態にさせた。このサンプルをml当
り５−25mUのα−GPオキシダーゼを含むよ
うに稀釈した。正しく希釈したサンプル１ml
を平衡させた前記試験管に添加した。サンプ
ルの代りに脱イオン水１mlでブランクを調製
した。試験管を水浴シエカー中で37℃で振と
うした。色の展開を、スペクトロニツク20ス
ペクトロメーターを用いて430mmで５分毎に
１時間測定した。 染料に対する吸光係数を求め、光学濃度を
利用された基質の濃度に変換するのに用い
た。 ７ 物質移動係数（ＫL・ａ）の決定 物質移動係数は溶存酸素濃度と出口酸素濃度
とを監視することにより求めた。溶存酸素濃度
は前述の5.(b)項（α−GPオキシダーゼの製
造）で述べた膜電極を用いて求めた。 出口酸素濃度は磁気分析計（タイプCA150、
サーボメツクスコントローズ リミテツド、ク
ロウボロウ、サセツクス、英国）を用いて測定
した。 ＫL・ａの計算には次の関係式を用いた。 ＮA＝ＫL・ａ（Ｃ*−ＣL） 式中、ＮA＝物質移動速度 ＫL＝物質移動係数 ａ＝界面積 Ｃ*＝溶存酸素の飽和濃度 ＣL＝瞬間溶存酸素濃度 例 １ グリセロールの誘導効果 グリセロールの添加は酵素の製造に画期的な効
果をもつ。グリセロール２g/を含む媒質にお
いて最大の製造結果が得られた（第１表参照）。
更にグリセロール濃度を増大させても酵素の収量
は増大しなかつた。培養物の生長は大きく影響を
受けなかつた。即ち、乾燥細胞重量は高々20％程
度増大したのに対し、酵素収量の増大は３倍以上
であつた。
ゼの製造法に関する。 従来技術 α−グリセロホスフエートオキシダーゼ並びに
有用な、その調製及び抽出技術は、
Koditschek、L.K.およびUmbreit、W.W.の“ス
トレプトコカスフエイチウムF24のα−グリセロ
ホスフエートオキシダーゼ”、ジヤーナル オブ
バクテリオロジー、98巻、３号、1063〜1068頁
（1969年）並びにJacobs、N.J.およびVan
Demark、P.J.の“ストレプトコカス フエカリ
スのα−グリセロホスフエート酸化酵素の精製及
び性質”、アーカイブズ オブ バイオケミスト
リー アンド バイオフイジツクス、88巻、250
−255頁に記載されている。この酵素は酸素の存
在下にα−グリセロホスフエートを酸化してジヒ
ドロキシアセトンホスフエート及び過酸化水素を
生成するのに有用である。 上掲のKoditschek及びUmbreitは、検圧検定法
を含む様々な効力検定技術を用いて研究したスト
レプトコカス フエイチウムF24のα−グリセロ
ホスフエートオキシダーゼの諸性質を説明してい
る。ストレプトコカス フエイチウムの培養は１
％トリプトン、１％酵母エキス、0.5％
K2HRO4、0.1％グルコース及び1.5％アガールか
ら成るACアガール（以下AC媒質と呼ぶことがあ
る）の穿刺（stab）に保持した。これらの細胞は
媒質から分離し、酵素生成物を検定のため抽出し
た。 前述のJacobs及びVan Demarkは、彼等もその
研究において検出検定法を用いて、ストレプトコ
カス フエカリス10C1のα−グリセロホスフエ
ートオキシダーゼの諸性質について記載してい
る。彼等は上述のAC媒質（但しグルコース0.2
％）中でストレプトコカス フエカリスを生長さ
せた。彼等はストレプトコカス フエカリスから
の酵素は受媒質としてＬ−α−グリセロホスフエ
ートに対しては高度な特異性を示し、β−グリセ
ロホスフエート、グリセロール、ジヒドロキシア
セトンホスフエートもしくは１，２−プロパンジ
オールホスフエートに対しては認識できるような
活性を示さない旨報じている。 Jacob、N.J.およびVan Demark、P.J.は、ジ
ヤーナル オブ バクテリオロジー、79巻、532
−538頁（1960年）の報文“好気的及び嫌気的に
生長させたストレプトコカス フエカリスにおけ
るグリセロール酸化機構の比較”においてストレ
プトコカス フエカリスからの好気的及び嫌気的
生長細胞を用いた分類学的研究におけるグリセロ
ールの代謝について論じている。このストレプト
コカス フエカリスは前述のAC媒質で生長させ
ている。 Gunsalus、I.C.及びUmbreit、W.W.の“スト
レプトコカス フエカリスによるグリセロールの
酸化”、ジヤーナル オブ バクテリオロジー、
49巻、347〜357頁（1945年）はストレプトコカス
フエカリスの活性細胞懸濁物によるグリセロー
ルの酸化の検定研究結果を報告している。彼等は
検定にピルビン酸塩を添加することによつて、ピ
ルビン酸塩がH2O2のスカベンジヤーとして作用
するので、グリセロール酸化レベルを高くするこ
とを見出したが、α−グリセロホスフエートオキ
シダーゼの活性は記載されていない。 Gunsalus、I.C.の“ストレプトコカス フエカ
リスによる嫌気的グリセロール発酵生成物”（ジ
ヤーナル オブ バクテリオロジー、54巻、239
−244頁（1947年））は、グリセロールと１％まで
の酵母エキスを含む媒質中でのストレプトコカス
フエカリスの生長について報告している。 Gunsalusはグリセロールによるストレプトコ
カス フエカリスの生長は僅か（好気的生長）で
あるか殆んど認められない（嫌気的生長）旨報告
している。 Claridge、C.A.及びHendlin、D.、のストレプ
トコカス フエカリスによるグリセロールの酸
化”（ジヤーナル オブ バクテリオロジー、87
巻、1181−1186頁（1962年））は一般的なワルブ
ルグ検定を用いて行なつたストレプトコカス フ
エカリスによるグリセロールの利用に関する研究
を報告している。彼等は、彼等の検定においてグ
リセロールを素早く酸化する細胞を得るために、
１％のグリセロール（10g/）を補充した、１
g/のグルコースを含む媒質中でストレプトコ
カス フエカリスを生長させることを示唆してい
る。α−グリセロホスフエートオキシダーゼ活性
は記載されていない。 前述のいくつかの文献はグリセロールの酸化い
ついての研究を一般的に報じている。これらの文
献のうちの最初の二つ、即ち、“Koditschek及び
Umbreit”並びに“Jacobs及びVan Demark”の
みが彼等の検定でα−グリセロホスフエートオキ
シダーゼの存在を示している。しかし、いずれの
文献もα−グリセロホスフエートオキシダーゼ用
誘導質、そして好ましくはこれとグリコースを組
合せてバクテリアを生長させることによつてα−
グリセロホスフエートオキシダーゼが予想外の高
い収率で生成することは示唆していない。その他
の文献はその微生物菌株中にα−グリセロホスフ
エートオキシダーゼが存在することを示唆すらし
ていない。 発明の目的及び構成 本発明の目的は微生物を媒質中で生長させるこ
とによつてα−グリセロホスフエートオキシダー
ゼを高収率で製造することにある。 本発明に従えば、 ストレプトコカス、ペデイオコカスおよびラク
トバシラス属に属するα−グリセロホスフエート
オキシダーゼ生産性微生物の少なくとも一員を生
長させてα−グリセロホスフエートオキシダーゼ
を製造するに当り、前記一員をグリセロールおよ
びその同族体から選定されたα−グリセロホスフ
エートオキシダーゼ用誘導質を含む媒質中で、ピ
ルビン酸塩の不存在下に、生長させ、次いでα−
グリセロホスフエートオキシターゼを抽出するこ
とを特徴とするα−グリセロホスフエートオキシ
ダーゼの製造法が提供される。 発明の構成及び効果の具体的説明 上記成分のほかに、前記媒質がグルコースを含
むのも好ましく、更に酵母エキス、トリプトン及
びK2HPO4を含んで成るのも有益である。本発明
の更に好ましい態様では、前記媒質中に無機塩及
びビタミンを添加してα−グリセロホスフエート
オキシダーゼの収量を著しく増大させることがで
きる。 本発明の実施に際し使用出来るストレプトコカ
ス、ペデイオコカス、ラクトバシラス属の代表的
な種は、ストレプトコカス属のストレプトコカス
フエカリス（Streptococcus faecalis）、ストレ
プトコカス クリモリス（Streptococcus
cremoris）、ストレプトコカス サリヴエリアス
（Streptococcus salivarius）、ストレプトコカス
フエイチウム（Streptococcus faecium）；ラ
クトバシラス属のラクトバシラス プランテルム
（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス
カセイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス
デルブレエキイ（Lactobacillus
delbrueckii）、ラクトバシラス フアーメンタム
（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス
ペントアシテイカス（Lactobacillus
pentoaceticus）、ラクトバシラス ラクチス
（Lactobacillus lactis）、ラクトバシラス ブユ
クネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバシ
ラス レイクマニイ（Lactobacillus
leichmannii）；及びペデイオコカス属のペデイ
オコカス セリヴイジイエ（Pediococcus
cerevisiae）である。 これらの種のうち、好ましいのはストレプトコ
カス フエカリスであり、最も好ましいのはスト
レプトコカス フエカリスATCC12755である。 ストレプトコチ（Streptococci）はWood、A.
J.及びGunsalus、I.C.の“ストレプトコチの活性
休止細胞の製造”（ジヤーナル オブ バクテリ
オロジー、44巻、333−341頁（1942年））に記載
されている、「STP媒質」と呼ばれる媒質中で普
通生長する。以下に述べるように、STP媒質中で
ストレプトコカス フエカリスATCC12755を生
長させると、60〜80U／のα−グリセロホスフ
エートオキシターゼが製造される。 本明細書に記載するストレプトコカス フエカ
リスATCC12755なる名称の微生物は、最初
ATCC（American Type Culture Collection）
にストレプトコカス フエカリスATCC12755と
して寄託されたもので、ATCCのカタログ（1974
年、第11版）にその名称で掲載されている。この
ものは前記カタログお第12版でストレプトコカス
フエイチウムATCC12755と名称変更されてい
る。 本発明に従えば、前記微生物、特にストレプト
コカス フエカリスを炭素源として好ましくはグ
ルコースの添加及びα−グリセロホスフエートオ
キシダーゼ用誘導質の添加によつて改良したSTP
媒質中で生長させることによつてα−グリセロホ
スフエートオキシダーゼが高収量で取得される。
誘導員としてグリセロールを添加することによつ
てα−グリセロホスフエートオキシダーゼの収量
がグリセロールを添加しない場合に比較して３倍
以上も増加する。その他の有用なα−グリセロホ
スフエートオキシダーゼ誘導員はグリセロールの
同族体、例えば、３−メチル−１，２−プロパン
ジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−
プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、
１，２，４−ブタントリオール、モノアセチン、
１−モノプロピニオン、１−モノブチリン、モノ
ステアリン、モノオレイン及びトリラウリンなど
である。 誘導員の有用な量は、一般に、媒質リツトル当
り約1.0〜約10gの範囲内であることを見出した。
好ましい媒質の使用量は媒質リツトル当り約2.0
〜約5.0gである。 Wood及びGunsalusによつて、呼称されたSTP
媒質は、グルコース−1.0g/、酵母エキス−10
g/、トリプトン10g/及びK2HPO4−５g/を
含む。これらの成分の有用な範囲は、グルコース
約0.1〜3.0g/、酵母エキス約1.0〜20g/、好
ましくは約2.0〜10g/、トリプトン約５〜20g/
及びK2HPO4少なくとも約3.0g/、好ましく
は約3.0〜約5.0g/であることを確認した。 生長媒質においてトリプトンに代えて使用する
ことができる他の蛋白水解物としては、例えば、
Sheffield Chemical Div.of Kraftco Ccrp.（ユ
ニオン、ニユージヤージー）から市販のソイペプ
トン タイプＴ（Scy Peptone Type Ｔ）、エダ
ミン（Edamin）タイプＴ、フアームアミン
（Ferm Amine）タイプ、、及び、Ｎ−
Ｎアミン（Amine）タイプAT、BT、ET及び
YTT；Cudahy Laboratories（オマハ、ネブラス
カ）から市販のカゼイン ヒドロリセート
（Casein Hydrolysate）、アナトン（Anatone）、
ミクロバイオトン（Microbiotone）及びフアーマ
トン（Pharmatone）；Traders Protin Div.
Traders Oil Mill Co.（フオート ワース、テキ
サス）から市販のフアーマメデイア
（Pharmamedia）並びに硫酸アンモニウムがあげ
られる。 しかしながら、前記生長媒質中のトリプトンに
代えて上述の蛋白水解物の一つを使用した場合に
は、その蛋白水解物の最適量はトリプトンの最適
量と多少変動することがある。特に有用な、トリ
プトンの代替物は、ソイ ペプトン タイプＴ
で、これはトリプトンを用いた場合に比較してα
−グリセロホスフエートオキシダーゼの収量を５
倍以上も増加させる。 前記生長媒質中においてグルコースに代えて使
用できる、その他の有用な炭素源は、例えば、ク
エン酸、乳酸、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリ
ウム、アスパラギン酸、グルタミン酸、コーンシ
ロツプ、糖密、フラクトース、ラクトース、マル
トースおよびシユクローズである。 本発明の最も好ましい態様では、生長媒質中に
グルコース約0.5〜約3.0g/を添加する。 前記生長媒質中に有効量の無機塩類およびビタ
ミン類を添加するのが有利であることも見出し
た。ここにいう「有効量」なる語は、生長媒質中
に加えて酵素の収量を増加させるのに十分な量の
無機塩類及びビタミン類の量をいう。このような
無機塩及びビタミンの添加量は塩及びビタミンの
種類によつて変動する。この量は一般に少量で、
当業者であれば通常の実験により極めて容易に定
めることができる。 大規模な発酵器中でストレプトコカス フエカ
リスのような微生物を生長させて高収量の酵素を
取得する場合に、しばしば発泡が生ずる。この泡
立ちを制御するために、特に酵素を大バツチで製
造する場合に泡制御剤を使用するのが好ましい。
本発明の実施に際して有用な泡制御剤の一例は、
ダウケミカル社（ミツドランド、ミシガン）から
市販のポリグリコール（Polyglycol）Ｐ−2000で
ある。この消泡剤は酵素の生成を妨害することな
く生長媒質中で0.5g/までの量で使用できる。
しかし、一般には約0.1g/で泡を制御するのに
十分である。その他の泡制御剤（消泡剤）も使用
できる。その選定及び使用基準は発泡を制御する
（押える）ような濃度水準で酵素合成を抑制しな
いことである。 本発明において使用する微生物は合理的な温度
範囲で生長させてα−グリセロホスフエートオキ
シダーゼを製造することができる。良好な結果は
25〜42℃の温度範囲で得ることができる。最良の
結果は約30℃の温度で達せられる。細胞を生長さ
せた後グリセロホスフエートオキシダーゼは常法
に従つて抽出することができる。 本発明の実施を例示する、以下の例において次
の条件を使用した。 １ 培養 以下の例１〜５においてストレプトコカス
フエカリスATCC12755を用いた。 ２ 媒質 (a) 培養保存媒質。 培養保存には0.2％のグリセロールを含ま
せた、ミクロ検定培養アガール（Micro
Assay Culture agar）（Difco
Laboratories、デトロイト、ミシガン）を用
いた。 (b) 発酵媒質 (i) STP媒質（Wood及びGunsalus、1942）
g/ グルコース 1.0 酵母エキス 10.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 蒸留水 全量を１にする量 (ii) 改良STP媒質−Ａ g/ グルコース 1.0 トリプトン 10.0 酵母エキス 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 蒸留水 全量を１にする量 (iii) 改良STP媒質−Ｂ g/ グルコース 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 20.0ml ビタミン溶液 1.0ml 蒸留水 全量を１にする量 (iv) 改良STP媒質−Ｃ g/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 2.5ml ビタミン溶液 １ml 水道水 全量を１にする量 (c) ソルトソリユーシヨンPYS g/ Na3C6H5O7・2H2O「クエン酸ナトリウ
ム」 5.0 MnCl2・4H2O 3.0 ZnCl 2.0 FeCl3・6H2O 2.0 MgCl2・6H2O 50.0 CuCl2・2H2O 0.2 CaCl2・2H2O 0.75 CoCl2・2H2O 0.2 NaMoO4・2H2O 0.1 Na2B4O7・10H2O 0.1 蒸留水 全量を１にする量 (d) ビタミン溶液 mg/ チアミン・HCl 200 ｐ−アミノ安息香酸 200 ピリドキシン・HCl 200 リボフラビン 200 Ｄ−パントテン酸（カルシウム塩） 200 ホール酸 2.0 ビオチン 2.0 リボフラビンは加温して溶液中に溶解させ
る。このビタミン溶液は殺菌濾過し、そして
殺菌後媒質に加えた。 ３ 培養物の保存 培養物は0.2％のグリセロールを含ませたミ
クロ検定培養アガールの穿刺上に保存した。培
養物は少なくとも週に一度新鮮な穿刺上に移し
た。30℃で48時間温置の後穿刺を４℃で保存し
た。生物体の保存用の別の方法は液体窒素中で
の貯蔵である。この目的のため培養物はSTP媒
質中で20時間生長させた。次に細胞を分離し、
アレン（Allen）のソルトソリユーシヨン
（Allen、M.B.アーカイブス オブ マイクロ
バイオロジー、32巻、270−277頁、1959年）を
含む無菌の10％グリセロール水溶液中に再懸濁
させた。この懸濁物の少量を殺菌ガラスアンプ
ルに添加し、次に密封し、液窒中に貯蔵した。 ４ 発酵 (a) 接種剤の調製 ミクロ検定培養アガールで48時間生長させ
た培養を250mlエーレンマイヤーフラスコ中
の50mlの、STP媒質中に移した。フラスコを
30℃及び200rpmで振とうした。20時間の温
置後、内容物をソーバル（Sorvall）の冷凍
遠心機（RCIIB型、デユポン インスツルメ
ント社、ニユータウン、コネチカツト）にお
いて４℃、12000Xgで15分間遠心分離した。
上澄液は捨て、細胞はもとと同じ容積の無菌
水中に再懸濁した。この懸濁物を接種剤とし
て用いた。 (b) 酵素の製造 250mlエーレンマイヤーフラスコ中の25ml
の発酵媒質に上記（4.a）で述べたようにし
て調製した接種剤1.5mlを接種した。フラス
コを30℃で200rpmで振とうした。フラスコ
を20時間振とう後、それぞれのフラスコから
サンプル2.5mlを採取した。このサンプルを
ソーバル冷凍遠心機において19000Xgで15分
間遠心した。この細胞を脱イオン水2.5ml中
に再懸濁させた。この懸濁物を10倍に希釈し
た。この希釈懸濁液を乾燥細胞重量の決定及
びα−グリセロホスフエート（α−GP）オ
キシダーゼの検定用に用いた。 ５ 乾燥細胞重量の測定 乾燥細胞重量と660mmにおける吸光度の関係
を示す検量線を調製した。スペクトロニツク20
スペクトロフオトメータ（Spectronic 20
Spectrophotometer）（バウシユ アンド ロ
ーム、ロチエスター、ニユーヨーク）で吸光度
を測定し、乾燥細胞重量を検量線から計算し
た。 ６ α−グリセロホスフエート オキシダーゼ活
性の検定 α−GPオキシダーゼ活性は、α−GPオキシ
ダーゼによつてα−グリセロホスフエートを酸
化させるに際して放出されるH2O2によるロイ
コ染料のベルオキシダーゼ接触酸化を測定する
ことによつて決定した。酵素活性の一単位
（Ｕ）は37℃及びPH7.0で１分間当りに基質の１
μモルを製品に転換する酵素の量で定義する。 (a) 試薬 (i) KPバツフアー：0.1Mリン酸カリウム緩
衝液、PH7.0 (ii) 基質溶液：100mlのKPバツフアーにα−
グリセロホスフエート17.288gを溶解、 (iii) 染料溶液：100mlの脱イオン水に３，
3′−ジメトキシ−ベンチジン ジヒドロク
ロリド（Ｏ−ジアニジン）1gを溶解、 (iv) 洗浄剤：KPバツフアー10ml中にトリト
ン（Triton）Ｘ−100（ローム アンド
ハース、フイラデルフイア、ペンシルヴア
ニア、から市販のポリエトキシエチレン界
面活性剤）1gを溶解、 (v) バツフアー溶液：KPバツフアー50ml中
にホースラデイツシユ ペルオキシダーゼ
タイプ3.3mgを溶解し、これに染料溶
液1.1ml及び洗浄剤溶液6.6mlを添加し、
KPバツフアーで全量を100mlにする。 (b) 方法 試験管中にバツフアー溶液６ml及び基質溶
液１mlを水浴シエカー（ニユーブランズウイ
ツクサイエンテイフイツク、ニユーブランズ
ウイツク、ニユージヤージー）で37℃で15分
間で平衡状態にさせた。このサンプルをml当
り５−25mUのα−GPオキシダーゼを含むよ
うに稀釈した。正しく希釈したサンプル１ml
を平衡させた前記試験管に添加した。サンプ
ルの代りに脱イオン水１mlでブランクを調製
した。試験管を水浴シエカー中で37℃で振と
うした。色の展開を、スペクトロニツク20ス
ペクトロメーターを用いて430mmで５分毎に
１時間測定した。 染料に対する吸光係数を求め、光学濃度を
利用された基質の濃度に変換するのに用い
た。 ７ 物質移動係数（ＫL・ａ）の決定 物質移動係数は溶存酸素濃度と出口酸素濃度
とを監視することにより求めた。溶存酸素濃度
は前述の5.(b)項（α−GPオキシダーゼの製
造）で述べた膜電極を用いて求めた。 出口酸素濃度は磁気分析計（タイプCA150、
サーボメツクスコントローズ リミテツド、ク
ロウボロウ、サセツクス、英国）を用いて測定
した。 ＫL・ａの計算には次の関係式を用いた。 ＮA＝ＫL・ａ（Ｃ*−ＣL） 式中、ＮA＝物質移動速度 ＫL＝物質移動係数 ａ＝界面積 Ｃ*＝溶存酸素の飽和濃度 ＣL＝瞬間溶存酸素濃度 例 １ グリセロールの誘導効果 グリセロールの添加は酵素の製造に画期的な効
果をもつ。グリセロール２g/を含む媒質にお
いて最大の製造結果が得られた（第１表参照）。
更にグリセロール濃度を増大させても酵素の収量
は増大しなかつた。培養物の生長は大きく影響を
受けなかつた。即ち、乾燥細胞重量は高々20％程
度増大したのに対し、酵素収量の増大は３倍以上
であつた。
【表】
培養物は表示の濃度のグリセロールを補充した
STP媒質中で生長させた。 例 ２ 炭素源の効果 (a) グルコースの効果（その１） 第２表に示したように、培養物の生長はグル
コースの濃度に完全に依存した。グルコースを
含まない媒質で得られた乾燥細胞重量に比較し
て３g/のグルコースを添加した場合には乾
燥細胞重量が３倍増加した。グルコース濃度も
α−GPオキシダーゼの生成に重大な効果を呈
し、媒質中にグルコースのない場合には38％の
生成量低下を来した。酵素の生成量は、グルコ
ース濃度が1.0g/まではグルコース濃度の増
加に従つて増加した。グルコース濃度が更に増
加させるとα−GPオキシダーゼの生成量は低
下した。
STP媒質中で生長させた。 例 ２ 炭素源の効果 (a) グルコースの効果（その１） 第２表に示したように、培養物の生長はグル
コースの濃度に完全に依存した。グルコースを
含まない媒質で得られた乾燥細胞重量に比較し
て３g/のグルコースを添加した場合には乾
燥細胞重量が３倍増加した。グルコース濃度も
α−GPオキシダーゼの生成に重大な効果を呈
し、媒質中にグルコースのない場合には38％の
生成量低下を来した。酵素の生成量は、グルコ
ース濃度が1.0g/まではグルコース濃度の増
加に従つて増加した。グルコース濃度が更に増
加させるとα−GPオキシダーゼの生成量は低
下した。
【表】
前述の如く、培養はSTP媒質中で実施した。
グルコースの量は表示の通り変化させた。 (b) グルコースの効果（その２） グルコースの存在及び不存在下におけるα−
GPオキシダーゼの生長の結果を第３表に示し
た。媒質は炭素源を除き改良STP媒質−Ａを用
いた。
グルコースの量は表示の通り変化させた。 (b) グルコースの効果（その２） グルコースの存在及び不存在下におけるα−
GPオキシダーゼの生長の結果を第３表に示し
た。媒質は炭素源を除き改良STP媒質−Ａを用
いた。
【表】
ース
(c) グルコースと無機塩類及びビタミン類との組
合せ効果 第４表に示すように、グルコース2.0g/と
無機塩類及びビタミン類を共用した場合には培
養物の生長が増大し、そして驚くべきことに同
時に酵素生成量が著しく増加することが認めら
れた。
(c) グルコースと無機塩類及びビタミン類との組
合せ効果 第４表に示すように、グルコース2.0g/と
無機塩類及びビタミン類を共用した場合には培
養物の生長が増大し、そして驚くべきことに同
時に酵素生成量が著しく増加することが認めら
れた。
【表】
培養物は上記グルコース濃度の改良STP媒質
−Ｂで生長させた。 例 ３ グリセロール同族体の効果 我々はα−オキシダーゼが誘導性の酵素であ
り、そしてグリセロールで誘導されることを示し
た。グリセロールは基質、α−グリセロホスフエ
ートの前駆物質であり、そして容易に利用される
炭素源であるので、その濃度は発酵中に減少する
に違いない。それ故、発酵中にその濃度が減少し
ない誘導質、即ち無償の誘導質を見つけることは
有用である。この理由のために我々は多くのグリ
セロール同族体及びモノグリセリドについて試験
した。 以下の実験は振とうフラスコ中で実施した。α
−GPオキシダーゼの誘導は、試験したすべての
グリセロール同族体について得られた（第５表参
照）。グリセロールを媒質から除いた場合には酵
素量は対照の38％に減少した。この量は、グリセ
ロールの同族体を添加した場合には、エチレング
リコールは例外として、対照の50％に増加した。
エチレングリコールは酵素の合成を強く抑制し
た。
−Ｂで生長させた。 例 ３ グリセロール同族体の効果 我々はα−オキシダーゼが誘導性の酵素であ
り、そしてグリセロールで誘導されることを示し
た。グリセロールは基質、α−グリセロホスフエ
ートの前駆物質であり、そして容易に利用される
炭素源であるので、その濃度は発酵中に減少する
に違いない。それ故、発酵中にその濃度が減少し
ない誘導質、即ち無償の誘導質を見つけることは
有用である。この理由のために我々は多くのグリ
セロール同族体及びモノグリセリドについて試験
した。 以下の実験は振とうフラスコ中で実施した。α
−GPオキシダーゼの誘導は、試験したすべての
グリセロール同族体について得られた（第５表参
照）。グリセロールを媒質から除いた場合には酵
素量は対照の38％に減少した。この量は、グリセ
ロールの同族体を添加した場合には、エチレング
リコールは例外として、対照の50％に増加した。
エチレングリコールは酵素の合成を強く抑制し
た。
【表】
ール
【表】
培養物は２g/の酵母エキスを加えた改良
STP媒質−Ａ中で生長させた。但し、グリセロー
ルは上表のようにその同族体に置換した。 例 ６〜14 ストレプトコカス フエカリスに代えて他の微
生物を用いた場合の結果 ストレプトコカス フエカリスATCC12755に
代えて第６表に掲げた、他の様々な微生物を用い
て、α−グリセロホスフエート オキシダーゼの
製造実験を行なつた。使用媒質は改良STP媒質−
Ｃで、培養物は30℃及び37℃で生長させた。結果
を第６表に示す。
STP媒質−Ａ中で生長させた。但し、グリセロー
ルは上表のようにその同族体に置換した。 例 ６〜14 ストレプトコカス フエカリスに代えて他の微
生物を用いた場合の結果 ストレプトコカス フエカリスATCC12755に
代えて第６表に掲げた、他の様々な微生物を用い
て、α−グリセロホスフエート オキシダーゼの
製造実験を行なつた。使用媒質は改良STP媒質−
Ｃで、培養物は30℃及び37℃で生長させた。結果
を第６表に示す。
【表】
スフエイチウム
7 ストレプトコカ ATCC 8043 157 28
スフエイチウム
7 ストレプトコカ ATCC 8043 157 28
スフエイチウム
【表】
セリヴイジイエ
例 15〜18 これらの例は種々の微生物に対するグリセロー
ル単独の誘導効果を示す。媒質中にはピルビン酸
塩を存在させなかつた。 対照として用いた媒質は改良STP媒質Ｂと同じ
ものであつた。グリセロール媒質においてはグル
コース2.0g/をグリセロール2.0g/で置き換え
た。 比活性は660nmでの光学濃度によつて媒質中に
おいて製造されたＵ／Ｌを除すことによつて生長
量を補正した活性である。光学濃度は生長量の指
標である。いずれの場合にも表示のデータは１個
以上の実験の平均値である。
例 15〜18 これらの例は種々の微生物に対するグリセロー
ル単独の誘導効果を示す。媒質中にはピルビン酸
塩を存在させなかつた。 対照として用いた媒質は改良STP媒質Ｂと同じ
ものであつた。グリセロール媒質においてはグル
コース2.0g/をグリセロール2.0g/で置き換え
た。 比活性は660nmでの光学濃度によつて媒質中に
おいて製造されたＵ／Ｌを除すことによつて生長
量を補正した活性である。光学濃度は生長量の指
標である。いずれの場合にも表示のデータは１個
以上の実験の平均値である。
Claims (1)
- １ ストレプトコカス、ペデイオコカスおよびラ
クトバシラス属に属するα−グリセロホスフエー
トオキシダーゼ生産性微生物の少なくとも一員を
生長させてα−グリセロホスフエートオキシダー
ゼを製造するに当り、前記一員をグリセロールお
よびその同族体から選定されたα−グリセロホス
フエートオキシダーゼ用誘導質を含む媒質中で、
ピルビン酸塩の不存在下に、生長させ、次いでα
−グリセロホスフエートオキシダーゼを抽出する
ことを特徴とするα−グリセロホスフエートオキ
シダーゼの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74965076A | 1976-12-10 | 1976-12-10 | |
| US749650 | 1976-12-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58216686A JPS58216686A (ja) | 1983-12-16 |
| JPS62676B2 true JPS62676B2 (ja) | 1987-01-08 |
Family
ID=25014618
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14667077A Granted JPS5372892A (en) | 1976-12-10 | 1977-12-08 | Production of alphaa glycerophosphate oxidase |
| JP9509883A Granted JPS58216688A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製法 |
| JP9509683A Granted JPS58216686A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製造法 |
| JP58095097A Granted JPS58216687A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製造方法 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14667077A Granted JPS5372892A (en) | 1976-12-10 | 1977-12-08 | Production of alphaa glycerophosphate oxidase |
| JP9509883A Granted JPS58216688A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58095097A Granted JPS58216687A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (4) | JPS5372892A (ja) |
| CA (1) | CA1095447A (ja) |
| DE (2) | DE2755033C2 (ja) |
| FR (1) | FR2392113A1 (ja) |
| GB (1) | GB1585909A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1095447A (en) * | 1976-12-10 | 1981-02-10 | Prakash S. Masurekar | Process for the production of a-glycero-phosphate oxidase |
| JPS6022915B2 (ja) * | 1978-07-20 | 1985-06-04 | 東洋醸造株式会社 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 |
| US4463095A (en) | 1982-11-26 | 1984-07-31 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Process for producing α-glycerophosphate oxidase |
| JPS6023835B2 (ja) * | 1983-08-09 | 1985-06-10 | 東洋醸造株式会社 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼ |
| GB2213822B (en) * | 1987-12-15 | 1991-12-18 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of l-´-glycerophosphate oxidase and application thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1095447A (en) * | 1976-12-10 | 1981-02-10 | Prakash S. Masurekar | Process for the production of a-glycero-phosphate oxidase |
| JPS5730470A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-18 | Hitachi Ltd | Automatic switching device of multiple-system color television receiver |
-
1977
- 1977-12-02 CA CA292,229A patent/CA1095447A/en not_active Expired
- 1977-12-08 JP JP14667077A patent/JPS5372892A/ja active Granted
- 1977-12-09 DE DE19772755033 patent/DE2755033C2/de not_active Expired
- 1977-12-09 DE DE19772760244 patent/DE2760244C2/de not_active Expired
- 1977-12-09 FR FR7737116A patent/FR2392113A1/fr active Granted
- 1977-12-12 GB GB5164677A patent/GB1585909A/en not_active Expired
-
1983
- 1983-05-31 JP JP9509883A patent/JPS58216688A/ja active Granted
- 1983-05-31 JP JP9509683A patent/JPS58216686A/ja active Granted
- 1983-05-31 JP JP58095097A patent/JPS58216687A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB1585909A (en) | 1981-03-11 |
| DE2760244C2 (de) | 1986-03-06 |
| JPS58216688A (ja) | 1983-12-16 |
| DE2755033A1 (de) | 1978-06-15 |
| FR2392113B1 (ja) | 1980-01-04 |
| JPS58216687A (ja) | 1983-12-16 |
| CA1095447A (en) | 1981-02-10 |
| JPS62675B2 (ja) | 1987-01-08 |
| JPS5372892A (en) | 1978-06-28 |
| JPS5730470B2 (ja) | 1982-06-29 |
| JPS58216686A (ja) | 1983-12-16 |
| FR2392113A1 (fr) | 1978-12-22 |
| JPS6211598B2 (ja) | 1987-03-13 |
| DE2755033C2 (de) | 1985-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harrington et al. | Oxidation of methanol and formaldehyde by Pseudomonas methanica | |
| Smart et al. | Effect of oxygen on lactose metabolism in lactic streptococci | |
| Veiga da Cunha et al. | Sugar-glycerol cofermentations in lactobacilli: the fate of lactate | |
| Kaneko et al. | Acetoin fermentation by citrate-positive Lactococcus lactis subsp. lactis 3022 grown aerobically in the presence of hemin or Cu2+ | |
| W Hickey et al. | Metabolism of pyruvate and citrate in lactobacilli | |
| Eddy et al. | Interactions between ascorbic acid and bacteria | |
| Yousten et al. | Oxygen metabolism of catalase-negative and catalase-positive strains of Lactobacillus plantarum | |
| Bruhn et al. | Reduced nicotinamide adenine dinucleotide oxidase of Streptococcus diacetilactis | |
| US4166005A (en) | Process for the production of α-glycerophosphate oxidase | |
| Seeley et al. | An adaptive peroxidation by Streptococcus faecalis | |
| Brown et al. | End products and fermentation balances for lactic streptococci grown aerobically on low concentrations of glucose | |
| Wilson | RESPIRATORY ENZYME SYSTEMS IN SYMBIOTIC NITROGEN FIXATION I: The “Resting Cell” Technique as a Method for Study of Bacterial Metabolism | |
| Jacobs et al. | Formation of protoporphyrin from coproporphyrinogen in extracts of various bacteria | |
| London et al. | Pentitol metabolism in Lactobacillus casei | |
| JPS62676B2 (ja) | ||
| Hillman et al. | Acetoin production by wild-type strains and a lactate dehydrogenase-deficient mutant of Streptococcus mutans | |
| Harris et al. | Hydrogenase activity and the H2-fumarate electron transport system in Bacteroides fragilis | |
| Jurtshuk et al. | Quantitation of the tetramethyl-p-phenylenediamine oxidase reaction in Neisseria species | |
| Goldman | ENZYME SYSTEMS IN THE MYCOBACTERIA: I. The Isocitric Dehydrogenase | |
| Udaka et al. | Lactic oxidase of pneumococcus | |
| Pivnick et al. | Studies of Aeromonas formicans Crawford comb. nov. from soluble oil emulsions | |
| Pepper et al. | Electron transport in Bacillus popilliae | |
| Duvnjak et al. | Isolation and study of a strain of Candida tropicalis growing on n-alkanes | |
| Prins et al. | Oxidation of NADH in a Coupled Oxidase‐Peroxidase Reaction and its Significance for the Fermentation in Rumen Protozoa of the Genus Isotricha | |
| IWAMOTO et al. | Superoxide dismutase activity of lactobacilli |