JPS627508B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫化学的反応を利用し生化学的成分
を高感度に又容易に安定に正確にかつ簡単に測定
出来る、芯物質及び壁材料よりなるマイクロカプ
セル及びマイクロカプセルを使用する検査方法に
関する。 本発明者らは先に壁表面に抗原もしくは抗体を
結合させたマイクロカプセルを使用して抗原−抗
体凝集反応により検体中の抗体もしくは抗原を検
出する方法を提案した（特願昭54−1555号）。
又、このマイクロカプセルの比重を特定の範囲に
設定すれば、抗原−抗体凝集反応による抗原又は
抗体の測定がより有利に行われること、さらにマ
イクロカプセルの壁材料によつては検出感度がよ
り高められることも見出した。 本発明者らの一連のこれら発明は、羊の赤血球
を担体粒子として使用する場合における品質のバ
ラツキや不十分な判定精度、避けられない非特異
反応による判定妨害、コスト高等あるいはポリス
チレンラテツクス、ポリエステル、ナイロン、カ
オリン粒子等の有機又は無機粒子を用いる場合に
おける感度低下や再現性不良等の従来の欠点を、
抗原又は抗体を結合させたマイクロカプセルを提
供することによつて克服するという思想に基いて
いる。今、本発明者らは、これらマイクロカプセ
ルを標識物質で標識するか、カプセルの芯物質中
に標識物質を含有、もしくは分散せしめることに
より、より高い精度で生化学的成分を検出できる
ことを見出した。標識はマイクロカプセル自体に
付してもよいし、マイクロカプセルに結合させた
抗原もしくは抗体に付すこともできる（以下簡単
に標識マイクロカプセルと称する）。マイクロカ
プセルを使用して壁材の表面を標識することによ
つて、羊の赤血球等の天然物を使用するときの前
記欠点は勿論克服できるし、さらに標識物質を芯
物質に混入することができるから、従来の標識法
にない新しいメリツトを提供することができる。 本発明におけるマイクロカプセルの標識物質と
しては、抗原・抗体の標識に用いられるアイソト
ープ、酵素、蛍光物質の他、芯物質に混入使用す
る紫外線吸収物質等も使用出来る。ことができ
る。 本発明に使用することができるアイソトープ標
識物質としては、たとえば¹²⁵I、¹³¹Iなどのラジオ
アイソトープ等を挙げることができる。 更に詳しくは、熊原、鎮目著「新版ラジオイム
ノアツセイ」、第３〜10頁、1977年（朝倉書店
刊）に記載されている。 本発明において標識物質として用いられる代表
的な酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ア
ルカリフオスフアターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラ
ーゼ、マレイン酸脱水素酵素、グルコース−６−
リン酸脱水素酵素、ペルオキシダーゼ、等が挙げ
られる。 本発明において標識物質として用いられる代表
的は螢光物質としては、スチルベン及びその誘導
体（即ち４・4′−ジアミノスチルベン誘導体、
４・4′−ジアミノスチルベンジスルホン酸誘導
体、アミノスチルベン２・2′−ジスルホン酸の誘
導体等）、クマリン誘導体、ベンズオキサゾール
誘導体ビスオキサゾール、ピラゾリン誘導体、
４・4′−ビストリアジニルなどがある。 例えば

【式】

などが使用出来る。 本発明において標準物質として用いられる紫外
線吸収物質としては、サリチル酸誘導体、例え
ば、フエニルサクシレート、４−ｔ−ブチルフエ
ニルサクシレート、４−オクチルフエニルサクシ
レート、ビスフエノールＡ−ジサクシレート、ベ
ンゾフエノン誘導体、例えば、２−ヒドロキシ４
−メトキシベンゾフエノン、２−ヒドロキシ−４
−メトキシ−2′−カルボキシベンゾフエノン、２
−ヒドロキシ−４−オクトキシベンゾフエノン、
２−ヒドロキシ−４−ステアリロキシベンゾフエ
ノン、４−ドデシロキシ−２−ヒドロキシベンゾ
フエノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−５−
スルホベンゾフエノントリヒドレート、２−ヒド
ロキシ−４−メトキシベンゾフエノン−５−スル
ホン酸、２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ
−３−メタクリロキシ）プロボキシベンゾフエノ
ン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−4′−メチル
ベンゾフエノン、２−ヒドロキシ−４−ベンゾイ
ロキシベンゾフエノン、５−クロル−２−ヒドロ
キシベンゾフエノン、２・４−ジヒドロキシベン
ゾフエノン、２・2′−ジヒドロキシ−４−メトキ
シベンゾフエノン、２・2′−ジヒドロキシ−４・
4′−ジメトキシベンゾフエノン、２・2′−ジヒド
ロキシ−４−ｎ−オクトキシベンゾフエノン、Ｏ
−ベンゾイル安息香酸メチル、２・2′・４・4′−
テトラヒドロキシベンゾフエノン；ベンゾトリア
ゾール誘導体、例えば、２−（2′−ヒドロキシ−
5′−メチルフエニル）ベンゾトリアゾール、２−
（2′−ヒドロキシ−3′−ｔ−ブチル−5′−メチルフ
エニル）−５−クロロベンゾトリアゾール、２−
（2′−ヒドロキシ−3′・5′−ジ−ｔ−ブチルフエニ
ル）−５−クロロベンゾトリアゾール、２−（2′−
ヒドロキシ−3′・5′−ジベンジルフエニル）ベン
ゾトリアゾール、２−（2′−ヒドロキシ−4′−オ
クトキシフエニルベンゾトリアゾール）などが使
用出来る。 前記標識物質は、目的とする免疫検査や測定法
あるいは壁材料に応じて、又測定しようとする成
分の種類や含有量、抗原、抗体の性質に対応して
適宜選択して使用することが出来る。標識物質と
してアイソトープ以外の上記物質を用いる場合に
は廃棄物処理の問題、取扱い上の安全性の問題、
標識物の保存性の問題などの観点より一層好まし
い。更に、これにより高感度でありかつ簡便で安
価であるという利点も得られる。 標識物質をマイクロカプセルにラベルする方法
としては種々の方法を用いることができ、例え
ば、アルデヒド架橋法、臭化シアン法、カルボジ
イミド架橋法、アルキル化法等従来より知られた
種々の処理方法が用いられ（千畑一郎著「固定化
酵素」講談社（昭和50年）等参照）、格別限定さ
れるものではないが、結合抗原、結合抗体の活性
が失なわれないことが重要である。結合方法とし
て一般的なものは、グルタルアルデヒド等のアル
デヒド類を用いるものである。この他、トルエン
−２・４−ジイソシアネート、Ｎ・N′・Ｏ−フ
エニレンジマレイミド、ｍ−マレイミドベンゾイ
ル、Ｎ−ハイドロキシルサクシンイミドエステル
等の架橋剤を用いて化学的に結合させてもよい。 特に、マイクロカプセル内部に標識する場に
は、芯物質となる油性物質に標識物質を分散する
ことによつて行うことができる。 また酵素を標識物質として使用する場合には、
酵素の不安定性、保存性を改善することができ抗
原−抗体反応の阻害を防止きるという点でマイク
ロカプセルへの封入は特に好ましい。螢光染料を
使用する標識も、マイクロカプセル内に行えば、
免疫反応を阻害することがないため、検体の検出
必要感度に応じて増量することも可能であるとい
う点で特に好ましい。 上記のように、標識物質を芯物質中に含有もし
くは分散せしめる場合においては、標識物の選択
や含有量の自由度が大きく、目的に応じて適切な
物質の選定が可能となるばかりか、直接抗原や抗
体と接触しないため、標識物質が壁外の種々の物
質や条件（PH、温度等）によつて阻害、変質、酸
化、不活性化等の影響をうけることがなく、免疫
反応を効率的に進めることも可能となるなどのメ
リツトがある。 例えば、酵素を用いた免疫検査方法は従来、酵
素自身の不安定性により、標識物質としての保存
性、安定性更には検査方法自体の正確性、再現性
などの点で問題があるとされていたが、マイクロ
カプセルの芯物質中に酵素を用いた標準マイクロ
カプセルの場合、このような欠点は大巾に解消で
きる。 又本発明はこのように芯物質をマイクロカプセ
ル化しているので単に両者を混合したもの或は単
にコーチングしたものに比して芯物質の均一性や
壁材料の被覆性が優れ、高感度で且安定性、正確
性、再現性のある製品を得ることが出来る特徴を
有している。 本発明は又免疫反応を行わせる際の担体として
用いることが出来る。例えば、酵素免疫法の担体
として又本発明に従来血球、例えば赤血球、白血
球、リンパ球、ガラス球などが検体中の成分の検
出に使用されているが表面に必要な抗原抗体を結
合させることにより、それらの代りに用いること
が出来る。 本発明に於ては標識したマイクロカプセルの表
面に測定しようとする検体の成分に対応する抗原
又は抗体を直接、又は間接に免疫反応を行わせた
後、未反応の抗原又は抗体と抗原体反応物を常法
により分離し、いずれかに含まれているマイクロ
カプセル中のアイソトープ量、酵素活性螢光量、
紫外分光吸収等を適宜測定することにより検体中
に含まれている極めて微量の抗原又は抗体の含有
量を測定することが出来る。具体的には例えば、
螢光物質においては、螢光光度計または、螢光偏
光光度計などにより螢光量を測定できる。 また、磁気物質においては、電磁気特性などの
測定により定量できる。紫外線吸収物質において
は、分光光度計などにより定量できる。更に、マ
イクロカプセルの濁度や透過率の測定、標準物質
の定量においてレーザー光を用いるとより好まし
い。 なお、該マイクロカプセルはそのまゝ測定に供
してもよいし、測定に先立つてマイクロカプセル
を破壊したのち測定することもできる。 本発明においては、IgG、IgM、IgE、IgA、イ
ンシユリン、Ｈ_B抗原、α−フエトプロテン、ヒ
ユーマングロースホルモン、レニン、ガストリ
ン、LH、FSH、コーチゾール、アンギオテンシ
ン、ACTH、Ｃ−ペプチド、CEA、グルカゴ
ン、アルドステロンなどの生化学成分が検出測定
できる。 本発明にて検出、測定し得る生化学成分は、上
記の生化学的成分に限定されるものではなく、抗
原もしくは抗体となりえる成分であればよいこと
は勿論である。 本発明におけるマイクロカプセルに抗原、抗体
を結合させる方法としては、アルデヒド架橋法、
臭化シアン法、カルボジイミド架橋法、アルキル
化法等従来より知られた種々の処理方法が用いら
れ（千畑一郎著「固定化酵素」講談社（昭和50
年）等参照）、格別限定されるものではないが、
結合抗原、結合抗体の活性が失なわれないことが
重要である。結合方法として一般的なものは、グ
ルタルアルデヒド等のアルデヒド類を用いるもの
である。 本発明におけるマイクロカプセルの壁材として
は、抗原又は抗体を活性を失なわしめることなく
結合しうるもので、カプセル化が可能なものであ
ればとくに限定されない。たとえば、アミノ基又
はイミノ基を有する壁材として、蛋白質（たとえ
ばコラーゲン、ゼラチン、カゼインなど）やポリ
アミノ酸、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポ
リウレタン、ポリウレア、ポリウレタンウレア等
の樹脂；水酸基を有する壁材として、セルロース
及びその誘導体（たとえば、メチルセルロース、
エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
など）、アラビヤゴム、デンプン等が挙げられ
る。 種々の壁材及びカプセル化方法については、た
とえば、近藤朝士著「マイクロカプセル」日刊工
業新聞社（昭和45年）、近藤保、小石真純著「マ
イクロカプセル」三共出版株式会社（昭和52年）
等に記載されている。 カプセルの芯物質となる油性物質としては、天
然鉱物油、動物油、植物油及び合成油等、通常マ
イクロカプセルの分野で使用される油性物質が挙
げられる。その詳細は、OLS−2153635、US−
4003589、同3836383等に記載されている。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ 無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合
体（GANTREZ−AN−139、分子量約25000、ゼ
ネラルアニリンアンドフイルム社製）10％水溶液
25ｇに尿素2.5ｇとレゾルシン0.25ｇ及び塩化ア
ンモニウム0.3ｇを添加して撹拌溶解し、20％苛
性ソーダー水溶液で系のPHを4.0に調整した。標
識物質として螢光染料white flour blue（クマリ
ン誘導体、CI Fluoresent Brighting Agent 91
住友化学製）１ｇを含むジイソプロピルナフタレ
ン11.8ｇ、塩素化パラフイン13.2ｇの混合物26ｇ
を上記水溶液中に、混合乳化しドロツプサイズが
６μになるように調製した。 更に37％ホルムアルデヒド水溶液6.4ｇを加え
60℃にて２時間加熱した。 生成したカプセルを２回水洗し得られたカプセ
ル1.0ｇを採り、10mlのリン酸緩衝液にサスペン
ドした。 次に25％グルタルアルデヒド水溶液を100μ
混合し、25℃で１時間反応させた。遠沈後リン酸
緩衝液で洗滌した。次に抗ヒトIgG（28mgAb／
ml）0.05mlに生理食塩水0.95mlを加え混合した溶
液を調製した。次いでこれを上記グルタルアルデ
ヒド処理マイクロカプセル２ml（0.25％濃度）と
混合し、37℃、１時間インキユベートした後一昼
夜冷蔵庫に放置した。 次に0.2％グリシン含有食塩水で２回洗滌した
後、１mlの３％BSAを含むリン酸緩衝液で再浮
遊して試薬を得た。 血中の梅毒抗体を測定するためTP抗原（トレ
ポネーマパリーダム（ニコラス株））を25KHZの
音波により粉砕した。この抗原をガラスプレート
上に塗布して乾燥した後アセトンにて固定した、
この上に希釈血清25μをのせ37℃で１時間反応
させた。次にリン酸緩衝液で洗滌後、上記試薬を
のせ37％で１時間反応させた。螢光光度計にて螢
光強度を測定し、梅毒抗体を簡便に精度良く微量
測定することができた。 実施例 ２ 実施例１に於て芯物質として２−ヒドロキシ−
４−メトキシベンゾフエノンを使用し、同様な処
理によりマイクロカプセルを得た。更に実施例１
と同様のグルタルアルデヒド処理後、抗HCGを
結合させ実施例１と同様にして検体中のHCGの
量を250〜340nｍの紫外吸収で簡易に微量検出す
ることが出来た。 実施例 ３ 無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合
体（GANTREZ−AN139.分子量約25000ゼネラル
アニリン／アンドフイルム社製）の10％水溶液25
ｇに、尿素2.5ｇとレゾルシン0.25ｇ及び塩化ア
ンモニウム0.3ｇを添加して、撹拌、溶解し20％
苛性ソーダ水溶液で系のPHを4.0に調整した。こ
れに、１％の油溶性青色染料０−79（CI−ソル
ベントブルー55）を含有するイソパラフイン18.0
ｇを上記水溶液中に乳化分散し、水中油型エマル
ジヨンを生成させ、ドロツプサイズが平均７μ附
近で撹拌を止めた。この乳化物に水25ｇと37％の
ホルムアルデヒド水溶液6.7ｇを加え、更に系の
温度を常温から65℃に調整後、２時間反応させ
た。このようにして得た比重が約0.80のマイクロ
カプセルは残存ホルマリン保護コロイド等を除去
するために３回下記組成のリン酸緩衝液で洗滌し
た。 リン酸緩衝液の組成 NaCl ８ｇ KCl 0.2ｇ Na₂HPO₄・12H₂o 2.9ｇ KH₂PO₄ 0.2 H₂Oを加へ １とする 洗滌したマイクロカプセル0.5ｇをとり、５ml
のリン酸緩衝液に再び分散する。これに抗原であ
る卵白アルブミン（生化学工業K.K）の１％水溶
液１mlを添加し、続いてグルタルアルデヒド（25
％）100μを添加後、常温で１時間反応結合さ
せた。遠沈後リン酸緩衝液で洗滌し、再びマイク
ロカプセル0.5ｇを５mlリン酸緩衝液に分散す
る。 抗原−抗体反応による粒子凝集の評価上述の方
法で作製した１％の抗原結合マイクロカプセル25
μをドロツパーで採取し、マイクロプレート上
のうさぎの抗体を含む全血（血液凝固防止剤とし
てヘパリンを含有。以下同じ）希釈列（陽性試
料）及び抗体のない全血希釈列（陰性試料）に
各々滴下し、よくプレートを振つて混和する。室
温下に約10分放置し、血球が沈降し上層の血液層
表面へ浮上したマイクロカプセルの凝集反応の有
無を肉眼又は顕微鏡により判定した。マイクロカ
プセルが着色しているため凝集反応の有無の判別
が簡単にできる上、比重の小さいメリツトを活か
して全血を使用し表面層に浮遊した状態での判定
が可能となるので有利である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 壁表面に抗原又は抗体を結合せしめると共
   に、壁表面に標識物質で標識するか、カプセルの
   芯物質中に標識物質を含有、もしくは分散せしめ
   た芯物質及び壁材料よりなる免疫検査用マイクロ
   カプセル。