JPS6277330A - 形質転換体からペプチドまたは蛋白質を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は形質転換体からペプチドまたは蛋白質を装造す
る方法に関する。更に詳ｊボするならば、ペプチドを高
生産する形質転換体の培養液、または該培養液から得ら
れる菌体を殺菌剤で処理した後、菌体を物理的に破砕す
ることなく緩衝液中に懸濁し、上記ペプチドを１記緩引
溶液中に抽出せしめ、次いで精製覆ることを特徴とする
ペプチドの製造法に係る。

従来の技術 近年、遺伝子工学、とりわけ組み換えＤＮＡ技術の急速
な進歩に伴ない、それまで、生体からの分離・精製に頼
っていた多くの生理活性ペプチドまたは蛋白質を微生物
を用いて大組生産さゼることが可能となった。これによ
り、従来は、その存在が知られるのみであった生理活性
ペプチドまたは蛋白質も、その構造、機能、作用機作の
解析とともに、薬剤として使用することさえも可能とな
っている。例えば、インシコリン、成長ホルモン等は既
に治療薬として製品化されてｉＪ３つ、又、治療薬とし
て製品化すべく臨床試朋段階にあるものも多い。

この様に、組め換えＤＮＡ技術は多くの生理活性ペプチ
ドまたは蛋白質を薬剤として使用する事を可能にし、ま
たいかに効率良く目的物質を生産ざゼるかという点に多
くの工夫かなされ、改良技術が提案されてぎた。例えば
、ベクターの改良、新しいホスト−ベクター系の開発、
培地、培捻条イ１の改良、更に、最近では、プロティン
エンジニアリングを用いたより安定なアミノ酸配列の開
発などが行われている。

しかしながら、このような形質転換体から生理活性ペプ
チドまたは蛋白質（蛋白質も○め、以下単にペプチドと
略す）を効率良く仙出し、薬剤として使用覆るに足る純
度にまで精製する技術は未だ確立されていない。

従来、組み換え微生物（形質転換体）によって高生産さ
れている目的ペプチドを抽出・精製するには、まず培養
微生物を殺菌剤を用いて死菌としだ後（抽出工程を完全
に密閉して行うことができる場合には除かれることもあ
る）、菌体を機械的に破砕し、この破砕懸濁液から目的
ペプチドを抽出・精製する方法によっていた。

例エバ、Ｓｈ　ｉ　ｒａ　ｉ　、丁、らは、ウサギＴＮ
Ｆ（１５５アミノ酸残基よりなる）を生産するように形
質転換された大腸菌からウサギＴＮＦを抽出・精製する
に当たり、まず、培養した菌体を破砕し、上清と沈渣に
分け、上清を叶酊−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂカ
ラムに付し、次いで６０’Ｃ１３０分間熱処理を施し、
再びＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂおよび
５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００カラムに付すという工
程を経て精製している（特開昭６Ｏ−１９７１９）。又
、特願昭５９−２８１３７６においては、ヒト−ガンマ
−インターフェロンを、その産生菌より抽出・精製する
のに、菌体を破砕しこれにボリエヂレンイミンを添加、
遠心して得た上清を、ＱＡＥ−３ｅＤｈａｄｅｘ　Ａ−
２５、Ｃ）Ｉ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂカラム
に付し、次いで塩析し、これによる沈漬をバッファーに
溶解後、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００カラムに付す
という工程を経て最終精製品を得ている。また、ジュネ
ンデック社の研究グループも、やはり菌体な破砕し、強
力な蛋白変性剤に接触させることでペプチドを変性・可
溶化した後抽出し、精製工程において変性剤を除去して
変性した蛋白を復元することににつで目的ペプチドを得
る方法を特開昭５９−１６１３２１において開示してい
る。更に、米国特許第４．４７６、０４９　＠において
は、塩酸グアニジンをプロテアーゼインヒビターとして
用いる形質転換体からヒトー免疫インターフエ［１ンを
抽出する際、菌体を破砕後、その遠心上清をシワ力に吸
看させた後カラムに付し、次いで抗ヒト免疫インターフ
ェロンモノクローナル抗体を用いたカラムで精製して最
終精製品を得ている。この他、特開昭５９−１８６９９
５に開示されているヒト免疫インターフェロンの精製に
おいても、まず菌体を破砕し、得られる遠心上清をモノ
クローナル抗体を用いたカラムに付した後、バッファー
で溶出し、再度モノクローナル抗体を用いたカラムに付
して最終精製品を得ている。

このように、上記いずれの例においてもまず目的ペプチ
ドを生産する培養形質転換体の菌体を何らかの方法で破
砕し、その破砕懸濁液を遠心分離してその上清、又は沈
渣のいずれかを精製過程に付すという形式で行なわれで
いる。また、精製過程にａ３いてはいずれも、数回のカ
ラム操作、又は遠心分離、透析、溶解などの複雑な操作
を組み合せることによってはじめて最終精製品を得てい
る。

このような方法は菌体が少量の場合には比較的容易であ
るが、大量の菌体を効率良く破砕することは必ずしも容
易ではなく、また破砕の際に菌体が飛び散らないよう安
全性を考慮した設備が必要とされる。また、菌体を破砕
した！Ｊ潤液は粘度が高くなっており、大量の懸濁液を
遠心分離することにも困難が伴う。

更には菌体を破砕することで目的ペプチドがプロテアー
ゼによる分解を受は易いという欠点を有している。この
プロテアーゼによる目的ペプチドの分解を防御覆ること
に関しては、例えばプロテアーゼインヒビターを添加し
て分解を抑える（前出の米国特許第４．４７６、０４９
号）、或いは蛋白変性剤を用いて目的ペプチドを凝集・
沈降させることで抽出効率を上げる（＃ｊ出の特開昭５
９−１６１３２１　）方法等が開示されているが、いず
れも上記問題を充分に１Ｉｌｌ！ｉ′決するものとは言
いガい。

更に、菌体破砕によって起る根本的問題は、菌体を破砕
した懸濁液の遠心上清または沈渣からの抽出液には多く
の不純物（夾雑物）を含むため、目的ペプチドが、他の
多くの物質との混合物となってしまうことである。この
ことが特１ご、後に続く精製工程を複雑、困難なものと
している。工程が複雑化することは、多くの時間、手間
、費用を要するばかりでなく、回収率の低下を伴う。即
ち、菌体を破砕するという工程が、目的ペプチドの分解
、夾雑物との混合、精製工程の繁雑化をもたらし、それ
によって目的ペプチドの回収率の低下を招いている。

一方、近汗目的とするペプチドを細胞外（ペリプラズム
又は培地中）に分泌生産さＵることにより、抽出液中の
不純物を少なくし或いはプロテアーゼによる分解をでき
るだけ少なくし、目的物質の精製を容易にしようとする
試みも多くなされているが、効率よく分泌させる技術や
分泌過程でおこる前駆体の正しいプロセシング（通常分
泌ペプチド又は蛋白質はその前駆体が何らかの分解過程
を経て分泌される）などにおいて、実用上まだ解決すべ
き問題が種々残されている。

発明が解決しようとする問題点 以上詳しく述べたように、従来の形質転換体から目的ペ
プチドを得る方法はいずれも固有の解決づ−べぎ欠点を
右している。

そこで、本発明の目的も菌体を破砕することなく、形質
転換体から目的とするペプチドを簡単な操作で且つ効率
良く抽出・精製する方法を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明名等ｔま、上記した問題点を解決するために、種
々研究・検討した結果、所定の殺菌剤を使用することに
よって菌体を破砕することなく、目的ペプチドを菌体外
に特異的に溶出させることができ、それによって極めて
簡単な抽出・精製工程のみで効率良く、しかも純粋な目
的ペプチドが得られることを見い出し、本発明を完成さ
せたものである。。

即ち、本発明の形質転換体から目的ペプチドを製造する
方法は、該ペプチドを高生産する形￥！１転換体のｊａ
ｆｆｉ液、または該培養液から臂られる菌体を殺菌剤で
処理した後、菌体を物理的に破砕覆ることなく、緩衝液
中に懸濁し、上記ペプチドを上記緩衝液中に溶出せしめ
、次いでこれを精製することを特徴とする。

本発明の方法において使用することのできる形質転換体
は、目的ペプチドを高生産することのできる、組み換え
ＤＮＡ技術によって作製される形質転換体であり、例え
ばペプチドを細胞総蛋白足０３０％以上生産する大腸菌
を挙げることができる。

更に具体的に例示するならば、８壊死因子（Ｔ　ＮＦ）
の横ｂ８．　Ｍ仏子の上流にファージ遺伝子由来のプロ
モーター領域を有し、且つ該構造遺伝子の翻訳終止を暗
号化する塩基配列の直後に大腸菌泣伝子由来の転写終止
を暗号化する塩基配列くターミネータ−）が挿入された
ＤＮＡ断片を含むプラスミドによって形質転換された大
腸菌である。該大腸菌１ユ、本件出願と同日出願になる
″新規プラスミドａ３よびその利用″に記載されたプラ
スミドであるｐＰＩ−１４丁ＮＦＳ丁８．ｐ丁４１Ｎ［
３丁８或いは、上記ｐＴ４ＴＮＦＳＴ８上のｒｏｐ（ｒ
ｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ）で表わされる
プラスミドＤＮＡ複製を制御している遺伝子の機能が欠
如しているプラスミドであるｐＴ４Ｔｌ’１ｌｓＴ８ｒ
ｏｐ−によって形Ｔ１転換された大腸菌である。なあ、
ここにいうペプチドとは、例えば癌壊死因子（ＴＮＦ）
のようなペプチド（蛋白質を含む）をいう。

本発明の方法においては、まず上記形質転換体の培青液
または該培養液から得られる菌体を殺菌剤で処理する。

使用しうる殺菌剤は、グルコン酸クロルヘキシジン（ヒ
ビテン）や塩化ベンザルコニウム等の殺菌剤である。と
りねり、グルコン酸クロルヘキシジンは特願昭５９−２
８１３７７にも示したように、組み換え微生物の殺菌剤
として有用なものであるが、本発明によるペプチドを緩
衝液中に溶ｎｊさせる目的という点からも、最も優れた
殺菌剤である。

本発明の方法において考慮に入れるべき重要な点は、上
記殺菌剤の足である。殺菌剤の開は、使用覆る菌体濃度
（例えばＯＤ　６６０の濁度で表わす）に依存し、各々
の場合にお（）る最適濃度を決定する必要がある。例え
ば、後述する実施例て示ず、ＴＮＦを産生ずる形質転換
体（大腸菌）の場合、最終菌体濃度が約２０（○Ｄ６６
０）であるときの好ましいグルコン酸クロルヘキシジン
の濃度は０．０８〜０．２０％である。０．０８％以下
では十分な殺菌効果を得ることができず、また０、　２
０％以上になると、ＴＮＦの緩衝液中への溶出量が減少
することが観察された。更に、最終菌体濃度が約３５（
ＯＤ６６ｏ）である場合の好ましい′ｆＡ度は約０．２
０〜０．２４％であった。

殺菌を行うには、通常、培養液中に上記濃度の殺菌剤を
添加した後、２０〜３０℃で１時間撹拌する。

次いで遠心分離によって菌体を集め、緩衝液中に懸濁し
て、目的ペプチドを該緩衝液中に溶出せしめる。緩衝液
はトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等から適宜選択さ
れるが、とりわけトリス−塩酸緩衝液が好ましい。緩衝
液のｐＨはペプチドの溶出性に影響しないが、溶出され
るペプチドに影響を与えないようｐ［１６〜９、好まし
くはＩ）Ｈ７〜８の範囲のものを使用する。

なお、通常は上記したように培養液中に殺菌剤を添加し
て殺菌を行うが、まず培養液から遠心分離によって菌体
を分離し、該菌体を上記濃度の殺菌剤を含む緩衝液中に
懸濁して行うことも可能である。

次いで菌体を懸濁した緩衝液を遠心分離して上清分画（
Ｓｌと略す）を１ｑる。更に所望により、菌体から目的
ペプチドを抽出するため、上記遠心分離で得られた菌体
く沈漬）を同じ緩衝液に懸濁し、遠心分離を行い、上清
分画（Ｓ２とＩＢ８す）を１■る。目的ペプチドは上記
Ｓ　１　（）５よびＳ２分画に１−ｊｊ異的に溶出され
、これを用いて目的ペプチドを精製する。なあ、培普終
了後、培養液を遠心分離することによって得られる上清
分画（Ｓと略す）にも目的ペプチドが少量（約１７１０
〜１／２０）含まれているが、該Ｓ分画には多くの不純
物、殺菌剤が同時に含まれており、またその容量も大で
あるから、通常は次の精製工程には使用しない。

精製には目的ペプチドの性質に応じて各種のカラム、例
えば叶へＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ、　ＣＭ−Ｃｅｌｌｕ
ｒｏｓｅ。

ＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ等のカラムを用いる。本発明
の方法においては、緩衝液中に目的ペプチドが特異的に
溶出されているため、従来の精製法のように、最終精製
品を得るまでに多くの繁雑な操作を経る必要はなく、１
〜２回のカラム操作で高純度（９９％以上）のものを取
得することができる。

以下の実施例において、本発明の方法を更に詳細に説明
するが、本発明の範囲は何等これに限定されるもので（
，１ない。

実施例　１ 各濃度のグルコン酸クロルヘキシジンによる殺菌及びＴ
ＮＦ抽出の効果を検討した。

使用した形質転換体は、ＴＮＦを高生産する大腸菌形質
転換株Ｗ３１．１０／１）１４丁ＮＦＳ’ｒ８ｒｏｐ−
（Ｔ　Ｎ　Ｆ構造遺伝子の上流にＴ４ファージのｇｅｎ
ｅ　３２道伝子断片由来のプロモーターを有し、該構造
遺伝子の翻訳終止コドンの直後に、大胆菌由来ｔｒｐ　
ａターミネータ−が挿入され、更にプラスミドＤＮＡ複
製を制御している領域（ｒｏｐ　：　ｒｅｐｒｅｓｓｏ
ｒ　ｏｆｐｒｉｍｅｒ）が欠如しているＤＢＲ３２２由
来のプラスミドで形質転換された大腸菌：本件出願と同
日出願の“新規プラスミドおよびその利用″に記載〕で
ある。

上記ＴＮＦを高生産する大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／
ｐＴ４丁ＮＦＳ丁８ｒｏｐ−を、１０μｇ／ｍｆｆ１テ
トラサイクリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中、３７℃で対数
増殖期後期まで培養した。１ｑられた培養液０．３ｍｌ
を、同じ組成のＬＢ培地３０ｍ１に植菌し、３７℃で対
数増殖期の後期まで培養した。

この様にして得られた培養液２０ｒｎｆ！を種菌として
、３ｆｌの醗酵槽を用い、２．１！培地中で培養した。

培養の条件は以下の通りであった。

培地：ＧＣ培地（２％グリセリン、３％カザミノ酸、０
．５％に２　ＨＰＯ４。

０．２％酵母エキス、 ０．１％Ｍ（Ｊ　ＳＯ＋　・７Ｈ２０；ｐＨ６，５、１
０μ３／７！テトラサ イクリンを含む） 消泡剤としてニラサンディスフオーム ＣＣ−４３８（０，００２５％）使用（日本油脂■製）
培養温度、時間：３７°Ｃ１１７時間 通気ｌ：’ｌｖｖｍ（溶存酸素”＋　ｐｐｍ以上になる
ように撹拌速度を制御した） １７時間培養後培養液を３０’Ｃ迄冷却した後通気を止
め、これに２０％グルコン酸クロルヘキシジン水溶液を
第１表に示すように、０．０８〜０．２８％の各濃度と
なるように添加し、３０°Ｃ１６００ｒｌ）ＩＩＩで１
時開撹拌した（Ｔ分画）。次いで該Ｔ分画から５００μ
Ｊを分取し、１２．　ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離し
て集菌した。この沈渣をＰ分画、上清をＳ分画とした。

Ｐ分画（菌体）に１０ｍＭ　ｔ’リス−塩Ｍ緩衝液（Ｄ
Ｈ８，０）　２００μβを加え、均一になるように懸濁
した後、１２．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して上清
（Ｓ１分画）と菌体を分離した。得られた菌体を再度１
０ｒｒＩ旧〜リス−塩酸緩衝液（ｐＩ−１８，０）２０
０　μ、Ｑに懸濁した後、ｔ２．００Ｏｒｐｍ　、　５
分間遠心分離して上清（８２分画）と菌体（ｐｌ）１分
画）を分離した。

かくして得られた各分画について、ＳＯＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（以下、５Ｏ３−ＰＡＧＥと略す
〉により分析するとともに、８１分画についてＴＮＦ活
性を測定した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによる解析は、以下に示す方法により
行った。ＰあＪ：びｐｐｔ分画については、２００Ｉｉ
ρ培養液より得られた各分画を１５０ｔｉ、ｌｊ　　Ｓ
ＤＳサンプル溶液（１０％グリセリン、５％２−メルカ
プトエタノール、２３％ＳＯ３，６２，５ｍＭトリス−
塩酸バッファー、ｐＨ６，８）に懸濁し、また、Ｔ、Ｓ
、Ｓ’！および８２分画については、その７５μｆに同
量の２倍濃度のＳＤＳサンプル溶液を加え、ｉ　ｏ　Ｏ
’Ｃで１０分間加熱した。その一部を常法に従い、１５
％５Ｏ３−ＰＡＧＥで分離し、コーマシブルーによる蛋
白染色を行い、分子量約１８にの位置に表われるＴＮＦ
蛋白に相当するバンドによってその溶出但を検定した。

ＴＮＦ活性の測定は／ｉ’ｖｆｆ、　／ｌ／、／、　ｔ
ｙｙｙｔ＃ｉｆｆｔｗダ１、　ｌ；、　、　ｌｙ１Ｍ／
ｌｔｙｉｉｗｓ、　　／１１．　　Ｉ’ｉｃｉ、　　ｆ
、　）　ｙｏ／　ｌ　ｌｊ、ｆ〜ｌｈ’　ｋｔｙｔｉｅ
ｚ／’ｒ　ｂｒｓｓ、　ｉｅｙ　Ｌｉ矛（１９８１）に
記載の方法を若干改善し、以下のように行った。

即ち、１０％牛脂児血清、０．１％Ｎａ　ＨＣＯ：ｌお
よび０．０３％グルタミンを含むイーグルＭＥＭ培地で
段階的に稀釈した試料０．１ｒｎｆ！に対し、対数増殖
期にあるマウスＬｉｆｔ胞の亜株であるＬ−９２９細胞
（ＡＴＣＣ奇託番号：　ＣＣＬ−１）　６　Ｘ　１０５
箇／ｄの浮遊液（上記培地中）　　０．１ｍ！！を９６
穴の平底型組織培養マイクロプレート（ＮｔＪｎＣ社製
）の各穴に加えた。各穴には予じめ最終１μｇ／ｒｄに
なるようにアクチノマイシンＤ（／１．ｙ矛ρｔ　ｔＪ
ｅｚｉｒｔｙ／ｓ社製）を加えておいた。次に上記マイ
クロプレー１へを５％ＣＯ２を含む空気中、３１℃で約
１８時間培養した。培養後、−上清を捨て２０％メタノ
ールを含む０．５％クリスタルバイオレット水溶液をＯ
，１ｍずつ各穴に加え付着しているＬ−９２９ｍ胞を１
５分、室温で染色した。

続いて、染色したマイクロプレートを水で充分洗浄後３
３％酢酸水溶液０．１ｍｌを加えて染色された細胞から
色素を抽出し、その抽出液の５７７闇にあける吸光度を
Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　）ｌｕｌｔｉｓｋａｎ　Ｓｐｅｃｔ
ｒｏｐｈｏ−ｔｏｍｅｔｅｒで測定した。試料を加えて
いない対照の吸光度の５０％の値に相当する試料の稀釈
倍率の逆数を試料のＴＮＦ活性とし、単位（Ｕ）／ｄで
表示した。１つの試料について最低４回の測定を行い、
その平均値を算出し表示した。

得られた５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を第１図に示す。

第１図から明らかなように、グルコン酸クロルヘキシジ
ン濃度が０．０８％以上で充分な殺菌効果があるが０．
２４％以上になると、ＴＮＦ？３白質が３１．３２分画
よりｐｐｔ分画に多く視れる様になった。又、殺菌剤の
各濃度において上清分画（Ｓ。

Ｓｌおよび８２分画）はＴＮＦ蛋白以外のバンドがほと
んど見られないのに対し、Ｔ、Ｐ、およびｐｐｔ分画で
は夾雑物（大腸菌宿主由来の蛋白質〉が非常に多く見ら
れた。また、殺菌剤の濃度が０．２％を越えると、Ｓｌ
および８２分画のＴＮＦ蛋白量（は減少する傾向が見ら
れた。以上の事から、グルコン酸り［１ルｆ＼キシジン
を０．０８〜０．２０％の濃度となる様添加して殺菌処
理し、３１．３２分画からＴ　Ｎ　Ｆ　＠　Ｗ＋〜製す
るのが非常に効率的であると考えられた。

尚、通常物理的に菌体を破砕１゛る場合は、２分両を適
当なバッフｊ・−に懸濁し、マントンゴーリン（）ｌａ
ｎｔｏｎ−Ｇａｕ　ｌ　ｉ　ｎ）、フレンチプレス（Ｆ
Ｉ”ｅｎＣｈＰｒｅｓｓ）等のホ゛しジナイザーを用い
て破砕した後遠心分離し、その上清を粗抽出液とづる。

この場合は、宿主大腸菌に由来づる蛋白質のほと／Ｖど
は粗抽出液に移行する。

次いで、ＴＮＦ活性測定の結果＠第１表に示す。

第　　　１　　　表 第１表に示されるように、ＴＮＦ活性は、グルコン酸ク
ロルヘキシジン無添加（未殺菌）のサンプルの８１分画
が４．９ｘ１０７　Ｕ／ｍｌであったのに対し、グルコ
ン酸クロルヘキシジン処理をした８１分画では、０．０
８〜０．１６％添加の場合、４．４×１０８　Ｕ／ｄ　
（未殺菌の場合の約９倍）、また０、２０％以上では１
．５Ｘ　１０８υ／ｍ！！の値を示した。

尚、ＴＮＦ蛋白は、第１図の５ＤＳ−ＰＡＧＥにみられ
る如く、殺菌剤（グルコン酸クロルヘキシジン）処理に
より培養液上清中（Ｓ画分）に若干溶出され、また９９
１画分にも残存するが、特に該殺菌剤の濃度がＯ，Ｏａ
％〜０．１６％においては、＄１と８２画分には全ＴＮ
　Ｆｆｆｉの６０〜７０％が溶出されているものと判断
される。このように抽出時においてＴＮＦの損失はある
が、Ｓｌおよび８２両分には夾ｍ蛋白質はほとんど含ま
れておらず（第１図参照：仝蛋白質の８０％以上かＴＮ
Ｆ蛋白と考えられる）、抽出時に菌体の破砕というめん
どうな操作が不要なことおよび以後の精製工程が容易に
なることから、実用面ではこの損失を充分補うことがで
きるしのと考えられる。

丈癒伝−２ＴＮＦの精製 実施例１で、ＴＮＦ高生産形質転換株の培養液（約２．
１））を０．１２％のグルコン酸クロルヘキシジン濃度
で処理した場合の、３１．３２分画を合わせ、４０〜６
０％の飽和硫安沈澱画分を、ｌ’ｒｉｓ−ＨＩＱ緩衝液
（ｐＨ８，０）に溶解後、同緩衝液（ｐＨ８，Ｏ）で平
衡化した叶ＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂ　（
ファルマシア製）に付した。次に同緩衝液で充分洗浄後
、ＯｍＨ〜２００ｍＭ直線′ａ度勾配をもつ塩化ナトリ
ウム溶液（ＴｒｉＳ−Ｈ（Ｊ）　）ｆｌｌ液液ｐｔ」８
．ｏ）で溶出した。得られたＴＮＦ活性を有する両分に
ついて、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、Ｔ
ＮＦ蛋白の純度は９５％以上であった。続いて、更に純
度を高めるため得られたＴＮＦ活性画分を２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）に透析し、同緩衝液で平衡化し
たＣ）Ｉ−３ｅｐｈａｒＯｓｅ　ＣＬ−６８（ファルマ
シア製）に付し、同緩衝液で充分洗浄後、Ｑｍ）ｌ〜２
００ｍＭ直線濃度勾配をもつ塩化す］・リウム溶液（２
０ｍ）（リンＭ　Ｆ、　液液、ｐＨ６，０）で溶出した
。この結果得られたＴＮＦ活牲画分を、５Ｏ３−ＰＡＧ
Ｅにより分析した結果、純度９９％以上であった。

発明の効果 以上、詳しく説明したように、本発明の形質転換体から
ペプチドを製造覆る方法は、従来行われてきた菌体の破
砕工程を伴う方法に比較して、ｈ間、手間、費用を大幅
に節減することができる。

また、目的ペプチドが溶出するＫｌＡＨ液中には夾雑物
が少ないので、高純度の目的ペプチドを極めて容易に精
製づることが可ｆｊＦとなり、医薬品として使用するこ
とのできる高純度ペプチドを工業的に大量生産できる極
めて有用な方法であるといえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は培養液を種々の濃度のグルコン酸クロルヘキシ
ジンで処理後の各画分（Ｔ、Ｓ、Ｐ。 ３１．３２．ｔ）ｔ）ｔ　　：本分参照）の５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを示ず写真である。図中％はグルコン酸クロルヘ
キシジンの濃度を示す。 特ＺＣ［出願人　サントリー株式会社 （外５名）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペプチドを高生産する形質転換体の培養液、また
   は該培養液から得られる菌体を殺菌剤で処理した後、菌
   体を物理的に破砕することなく、緩衝液中に懸濁し、上
   記ペプチドを上記緩衝液中に溶出せしめ、次いでこれを
   精製することを特徴とする、形質転換体から目的ペプチ
   ドを製造する方法。
2. （２）上記殺菌剤がグルコン酸クロルヘキシジンである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）上記ペプチドが癌壊死因子活性を有することを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）上記緩衝液のｐＨが６〜９の範囲であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）上記形質転換体が、ペプチドを高生産する大腸菌
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
6. （６）上記形質転換体が、癌壊死因子の構造遺伝子の上
   流にファージ遺伝子由来のプロモーター領域を有し、且
   つ該構造遺伝子の翻訳終止を暗号化する塩基配列の直後
   に大腸菌遺伝子由来の転写終止を暗号化する塩基配列（
   ターミネーター）が挿入されたＤＮＡ断片を含むプラス
   ミドによって形質転換された大腸菌である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
7. （７）上記プラスミドが、ｒｏｐ（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ
   　ｏｆｐｒｉｍｅｒ）で表わされるプラスミドＤＮＡ複
   製を制御している遺伝子の機能が欠如しているプラスミ
   ドである特許請求の範囲第５項記載の方法。
8. （８）上記プラスミドがｐＰＬＴ４ＴＮＦＳＴ８または
   ｐＴ４ＴＮＦＳＴ８で表わされるプラスミドである特許
   請求の範囲第５項記載の方法。
9. （９）上記プラスミドがｐＴ４ＴＮＦＳＴ８ｒｏｐ＾−
   で表わされるプラスミドである特許請求の範囲第６項記
   載の方法。