JPS6282345A - 二酸化炭素計測方法及び計測用センサ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔１既　　要〕 微生物を用いた二酸化炭素（ＣＯＺ）センサーが開示さ
れる。本発明のＣＯ２センサーは、アンペロメトリック
にＣＯ２を計測できるという点で画期的であり、医療、
環境、醗酵工業プロセスをはじめとする数多（の計測分
野において有利に使用することができる。本発明のセン
サーでは、微生物菌体の寿命を長く保つことができ、ま
た、測定誤差を小さくすることができる。

〔産業上の利用分野〕

本発明は、溶液中あるいは空気中の二酸化炭素の濃度を
測定するための方法及び装Ｈに関する。

本発明は、さらに詳しく述べると、微生物機能と電気化
学的な電極を利用した二酸化炭素計測方法、そして二酸
化炭素計測用センサーに関する。本発明は、上記した通
り、医療、環境、醗酵工業プロセスをはじめとする数多
くの計測分野において有利に利用することができる。

〔従来の技術〕

計測の分野において、二酸化炭素の計測が重要視されて
いることは周知の通りである。従来、二酸化炭素計測用
のセンサーとしては、特に体液（血液）中の二酸化炭素
成分の測定を目的として、ポテンシオメトリーに基づく
二酸化炭素電極が開発され、そして実際に用いられてい
る（このタイプの二酸化炭素電極についての詳細は、例
えば、Ｊ、Ｗ、セパ−リングハウス（Ｓｅｖｅｒｉｎｇ
ｈｏｕｓｅ）及び八、Ｆ、フ′ラドレイ（Ｂｒａｄｌｅ
ｙ）、　Ｊ、Ａ　ｐｌ、Ｐｈ　５ｉｏｌ、、　１３゜５
１５（１９５８）を参照されたい）。しかし、このポテ
ンショメトリックな方式の二酸化炭素電極は、その構成
に原因して、測定に際して発生するいろいろな問題点を
存する。例えば、この方式では、夾雑物質の影響を受け
やすい、感度がネルンストの式により左右されるために
あるレベル以上の感度の向上を計ることができない、な
どの問題点がある。

本発明者らは、これらの問題点を解決すべく研究を行な
った結果、二酸化炭素を資化する微生物の呼吸活性が微
生物近傍の二酸化炭素の濃度変化により変わることに着
目し、この呼吸活性の変１ヒを酸素電極により検出して
二酸化炭素４度の定星を行なうのが問題点の解決につな
がることを見い出した。本発明者らの開発した、アンベ
ロメトリーに基づく二酸化炭素計測用センサー（二酸化
炭素センサー）は、昭和６０年１０月３日付けで別途出
潮した特許出願明細書に開示されるように、例えば血液
のような体液等の溶液中あるいは空気中の二酸化炭素の
濃度を測定するための計測用センサーであって、酸素電
極と、該酸素電極のカソードの近傍に固定されたもので
あって前記二酸化炭素を選択的に資化可能な微生物と、
前記カソードの全体及び前記微生物のそれぞれを被）Ｗ
したガス透過性膜とを組み合わせて含んでなることを特
徴とする。この二酸化炭素センサーの構造は、例えば、
添付の第２図に略示して示される通りである。

図中の７はセンサ一本体（酸素電極）であり、春 カソード５及びアノード６を有している。酸素電極７ば
、また、その内部に電解液８を有している。

酸素電極７は、そのカソード５の部分が完全に覆われる
ようにテフロン（商品名）製のガス透過性膜４で被覆さ
れている。さらに、この膜４の外側に配置された微生物
３の固定化膜２もまたテフロン製のガス透過性膜１で被
覆されている。９は、ガス透過性膜を固定するための輪
ゴム（０リングでもよい）である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らがこのたび開発した二酸化炭素センサーは、
従来のポテンショメトリックな二酸化炭素電極よりもよ
り高怒度な計測を可能にすることができ、また、センサ
ーの応用分野も拡げることができる。しかし、このよう
なセンサーの構造では、微生物菌体及び酸素電極のカソ
ードの全体をガス透過性膜で覆っているため、菌体付近
が乾燥しやすく、したがって、センサーの寿命が影響を
被る恐れが大である。また、ガス透過性膜を通過した二
酸化炭素が微生物により資化されないうちに再びガス透
過性膜から抜は出て、新たな測定誤差を生む恐れもある
。本発明者らの開発した二酸化炭素センサーにおいて発
生する恐れのあるこれらの問題点が、いま本発明が解決
しようとする問題点である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上述の問題点を解決すべく研究を行なっ
た結果、微生物菌体の近傍に緩衝液のだめ又は層を設け
ることにより、微生物菌体の乾燥による寿命の低下を防
止するとともに、ガス透過性膜を通過した二酸化炭素が
敗逸しにくいような構造の二酸化炭素センサーを提供し
得ることを見い出した。

本発明は、その１つの面によれば、例えば体液などの溶
液中あるいは空気中の二酸化炭素の濃度を測定するため
の計測方法であって、前記溶液あるいは空気中の二酸化
炭素をガス透過性膜により選択的に透過させ、透過せる
二酸化炭素を前記ガス透過性膜に接して配された緩衝液
中で炭酸及び（又は）炭酸イオンの形となし、この炭酸
及び（又は）炭酸イオンを前記緩衝液に接していて二酸
化炭素を選択的に資化可能な微生物で資化し、その際に
ひきおこされる前記緩衝液中の酸素濃度の減少を酸素電
極により電流値として測定し、この電流値の変化量から
二酸化炭素の濃度を測定することを特徴とする二酸化炭
素計測方法にある。

本発明は、そのもう１つの面によれば、溶液中あるいは
空気中の二酸化炭素の濃度をアンペロメ１−リーに基い
て４＋１定するための計測用センサーであって、酸素電
極と、該酸素電極のカソードの近傍に固定されたもので
あって前記二酸化炭素を選択的に資化可能な微生物と、
該微生物を取り囲んで配置された緩衝液だめと、前記緩
衝液だめを覆って配置されたガス透過性膜とを組み合わ
せて含んでなることを特徴とする二酸化炭素計測用セン
サーにある。

本発明の実施において有利に使用することのできる微生
物は、二酸化炭素を選択的に資化可能な微生物、例えば
ヒドロゲノモナス属、その他の属に属する菌体である。

本発明者らは、ヒドロゲノモナス属ＴＩＴ／ＦＪ−００
０１菌（微工研菌寄第８４７３号）。

未同定のＴＩＴ／ＦＪ−０００２菌（微工研菌寄第８４
７４号）を用いて、特に好ましい結果を得ることができ
た。

これらの菌体の菌学的諸性質は次の通りである。

１、’　ＴＩＴ／ＦＪ−０００１菌（工業技術院微生物
工業技術研究所、微生物受託番号：徹工研菌寄第８４７
３号）−酸化炭素を主な炭素源２窒素ガスを主な窒素源
、水素ガス及び酸素ガスを化学エネルギー源とし、その
他通常使用される無機化合物と水により増殖させること
が可能な微生物である。

ｆａ）　　形態的性質 ビーフェキス０．３％、ペプトン０．５％の寒天培地上
で３０℃で４日間培養するときは１×４〜５ミクロンの
桿菌で直状または油状、７日間培養では、上記の形も若
干残るが大部分は長径が１．９〜２．１ミクロンの短稈
形となる。大部分は単独に存在するが、まれに２個位つ
ながっていることもある。液体培養したときも同様だが
、凹形の変化に要する時間はやや短縮される。ずなわら
、多形性を示す。運動性なし。ライフソン（Ｌｅｉｆｓ
ｏｎ）法による染色によっては鞭毛は見当らない。胞子
の形成は見られない。ダラム陰性。非抗酸性。

（ｂ）　　培養的性質 （１）　　肉汁寒天平板培養：生育して黄色の平滑で光
沢あるコロニーを形成する。コロニーは円形。色素の拡
散は見られない。

（２）肉汁寒天斜面培養：肉汁寒天平板培養に同じ。

（３）肉汁液体培養二表面発育は認められない。

粘質物生成のために培養液の粘性がやや増加する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育しない。液化も見ら
れない。

（５）　　リドマスミルク：凝固、液化は見られない。

長時間培養するときはアルカリ性となる。

（Ｃ）　　生理的性質 硝酸塩の還元：陰性 脱窒反応：陰性 ＭＲテスト：陰性 ｖ−ｐテスト：陰性 インドール生成：陰性 硫化水素の生成：陽性 デンプンの加水分解：陰性 クエン酸の利用（にｏｓｅｒ培地）：陽性クエン酸の利
用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地）：陽性硝酸塩の利用
：陽性 色素の菌体外生成：陰性 アンモニウム塩の利用：陽性 ウレアーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の温度範囲　３０℃付近（２０℃〜３４℃）が良好 生育のｐＨ範囲　７．０付近（４，０〜８．６）が良好 酸素に対する態度　好気性、但し嫌気性においてわずか
ながら生育す る。

０−Ｆテスト（ｌｌｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法による）
：陰性炭素源の資化性、酸及びガスの生成（資化性、酸
及びガスの生成があるもの、ないもの、不明瞭なものを
、それぞれ＋、−１士で示す）無機培地による生育性：
無機化合物のみの固体または液体培地で培養するときは
、水素ガスおよび酸素ガスの共存下に、炭酸ガス又は−
酸化炭素および窒素ガスを固定利用して旺盛に生育する
。

以上の性質、特に無機培地で水素ガス、酸素ガス、炭酸
ガス共存下で生育するという著しい特徴によって、本国
は明らかにヒドロゲノモナス属に分類されると考えられ
る〔バーシーズ・マニュアル・オブ・デターミナティブ
・ハタテリオロジイ（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ）８版、　Ｔｈｅ　ＷｉｌＨａｒｍｓ　＆　
Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ／Ｂａｌｔｉｍｏｒａ
による〕。

しかしながら、ヒドロゲノモナス属は一般に極性鞭毛を
持つとされる点、又ヒドロゲノモナス属については窒素
ガス固定能力が知られておらず、また、例えばヒドロゲ
ノモナス・ニートロバ＾ＴＣＣ１７７０７も窒素ガス固
定能力を示さない点、本国は既記載のヒドロゲノモナス
属とは昇る点があるので、別に属を設けるのが本来適当
かも知れない。

しかし一方、過去において本国と同様の性質を持つ菌が
分離され、窒素ガス固定能力を知られないままにヒドロ
ゲノモナス属に分類されている菌も当然あると考えられ
る。従って本国も差し当りヒドロゲノモナス属とするの
が適当と考える。

２、　　ＴＩＴ／ＦＪ−０００２菌（工業技術院微生物
工業技術研究所、微生物受託番号：微工研菌寄第８４７
４号）本国の同定は完了していない。しかし、科学的性
質として、二酸化炭素を資化する微生物であることはす
でに確認済みである。また、本国は好熱性を有すると考
えられる。

上記した微生物は、この技術分野において一般的に用い
られている手法により酸素電極上に固定することができ
る。微生物をその呼吸活性を維持させたま＼膜中に固定
化する微生物膜の調製法としては、例えば、微生物を化
学的に■りに結合させる方法（共有結合法）、微生物を
合成高分子や天然高分子マトリンラス中に包括固定化す
る方法（包括法）、物理的に膜に吸着させる方法（吸着
法）などがある。多孔性ニトロセルロースの膜にｉ敦生
物を吸着固定して微生物膜を調製するのがとりわけ有利
である。

酸素濃度の減少を測定するために用いられる酸素電極と
しては、ポーラ口型、ガルバニ型などの酸素電極をあげ
ることができる。特にガルバニ型の酸素電極は、特別な
増幅器の使用が不要となるので、簡便なセンサーの製作
に有利に使用することができる。

また、二酸化炭素及び酸素を透過させるために用いられ
るガス透過性膜としては、シリコーンゴム膜や含ふっ素
高分子膜９例えばテフロン（商品名）のようなポリテト
ラフルオロエチレン（ＰＴＦＩＥ）膜、テトラフルオロ
エチレンとへキサフルオロプロピレンの共重合体（ＦＥ
Ｐ）の膜などをあげることができる。

微生物菌体を取り囲んで配置されるべき緩衝液だめの緩
衝液は、それにガス透過性膜を透過せる二酸化炭素を吸
収させるため、高ｐＨ値を有していることが必要である
。二酸化炭素ガスは、炭酸及び（又は）炭酸イオンの形
で緩衝液に溶け、より微生物に取り込まれやすい状態と
なる。本発明では、使用する緩衝液の種類及びｐｌ−１
値を適宜選択することを通じて、微生物の活性を長ＦＪ
Ｊ間にわたって安定に保つことができるばかりでなく、
ガス透過性膜を通して二酸化炭素が再び外部に散逸する
のを防ぐ効果があり、安定した測定が可能になる。適当
な緩衝液の一例として、０．０５Ｍ　ＫＨ２ＰＯ。

／Ｎａ０ｔｌ　緩衝液をあげることができる。

さらに、緩衝液だめそのものには、／！（Ｉ＋定効率と
精度を高めるため、酸素電極のカソードの全体及び微生
物を包み込む形で透析膜を配置するのが望ましい。適当
な透）１膜の例として、アセチルセルロースフィルムな
どをあげることができる。

〔実施例〕

本例では、第１図に黙示されるような構造をもった二酸
化炭素計測用センサーを製作した。図中の７は酸素電極
本体であり、白金からなるカソード５及び鉛からなるア
ノード６を有している。この電極の電解液８は、ＩＮ　
ＫＯＨであった。酸素電極７の先端部分は、そのカソー
ド５の部分が完全に覆われるようにテフロン（商品名）
製のガス透過性膜４で被覆されている。また、この膜４
の外側に配置された微生物３の固定化膜２は、その全体
を包み込む形でアセチルセルロース製の透析膜１０で被
覆されている。さらに、固定化微生物２と透析膜１０は
、図示される通り、テフロン（商品名）製のスペーサ１
１によりため込んだ高ｐＨ値の緩衝液１３中に浸されて
おり、また、この緩衝液１３と外側とはテフロン（商品
名）製のガス透過性膜１３を介して接触するように構成
されている。９は、ガス透過性膜を固定するための輪ゴ
ム（Ｏリングでもよい）である。このセンサーの装作例
を以下に示す： 予め滅菌した坂ロフラスコに、ビーフェキス０．３％、
ペプトン０．５％及び蒸留水９９．２％からなる液体培
地Ｌｏｏｍ　ｌを加えた。この培地にヒドロゲノモナス
属ＴＩＴ／ＦＪ　−０００１菌（微工研菌寄第８４７３
号）を接種し、好気的条件下で３０℃で４日間培養した
。次いで、菌を培地ごと５　ｍｌ！の量で採取し、これ
を孔径０．２μｍの多孔性ニトロセルロース製多孔）漠
」二に吸引濾過し、０．０５Ｍ　Ｋ１１ＺＰＯ４／Ｎａ
０ＩＩ緩衝液（ｐｌ！５．５）で洗浄した。

次いで、上記のようにして菌を濾過した膜２を、第１図
に示されるように、菌体３のついている側をガルバニ型
の酸素電極７のカソード５の面に向けて配置し、さらに
その外側を菌体固定膜２及び酸素１に極のカソード５の
部分が完全に覆われるようにアセチルセルロース製の透
析膜１０で包み込んだ。さらに、これらを、スペーサ１
１によりため込んだ０．０５Ｍ　Ｋ１１ｚＰＯ４／Ｎａ
０１１　緩衝Ｍ（ｐＨ７，５）中に浸し、外部とテフロ
ン（商品名）製のガス透過性膜１２で接触するようにし
た。最後に、輪ゴム９で固定することによって、図示の
二酸化炭素センサーが完成した。

本例では、二酸化炭素計測の一例として、緩衝液中の溶
存二酸化炭素濃度の測定を行なった。二酸化炭素によっ
て溶存酸素濃度が変化することが考えられたので、ｐＨ
を５〜８に保った緩衝液中に炭酸塩溶液を加え、炭酸イ
オンの一部を溶存二酸化炭素に変え、測定した。以下に
この測定の実際を示す： 上記のようにして製作した二酸化炭素センサーを０．０
５Ｍ　Ｋ１１ｚＰＯ４／Ｎａ０１１緩衝液（３０℃、　
　ｐＨ５，５）５０ｍ７！中に浸漬し、安定するまで放
置した。次いで、緩衝液中の溶存二酸化炭素濃度を測定
するため、Ｉ　Ｎ　Ｋ２ＣＯ３を緩衝液中に加え、炭酸
イオンの一部を二酸化炭素に変えることにより供給した
。

測定の結果、第３図に示されるような安定な検量線が得
られた。この図から、Ｋ２ＣＯ３？Ｍ度の変化（溶存二
酸化炭素濃度の変化）に対応してセンサーの電流値が減
少し、この電流値の変化量から溶存二酸化炭素濃度を測
定できることが判る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、二酸化炭素センサーをアンペロメトリ
ックに製作することができるので、夾雑物質の影舌を減
らし、従来のポテンショメトリックな二酸化炭素電極よ
りもより高感度な計測を可能にすることができ、また、
センサーの応用分野も拡げることができる。また、本発
明によれば、微生物菌体を乾燥させることなく保存する
ことができるので、微生物電極（センサー）自体の寿命
をのばすことが可能になる。また、ガス通過性膜を通過
した二酸化炭素が再びガス透過性膜を通って散逸するの
を防ぐことができので、安定した測定特性をえることが
可能になる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の二酸化炭素センサーの好ましい一例
を示した構造図、 第２図は、本発明者らが開発し、別途特許出願した二酸
化炭素センサーの好ましい一例を示した構造図、そして 第３図は、第１図に図示の本発明のセンサーを用いて得
られた検量線の一例である。 図中、２は固定化微生物膜、３は微生物、４はガス透過
性膜、５はカソード、１０は透析膜、１２はガス透過性
膜、そして１３は緩衝液である。 二酸化炭素センサーの構造図 第１　図 ２・・・固定化微生物膜 ３・・・微生物 ４・・・ガス透過性膜 ５・・・カソード １０・・・透析膜 １２・・・ガス透過性膜 １３・・・緩衝液 二酸化炭素センサーの構造図 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、溶液中あるいは空気中の二酸化炭素の濃度を測定す
   るための計測方法であって、前記溶液あるいは空気中の
   二酸化炭素をガス透過性膜により選択的に透過させ、透
   過せる二酸化炭素を前記ガス透過性膜に接して配された
   緩衝液中で炭酸及び（又は）炭酸イオンの形となし、こ
   の炭酸及び（又は）炭酸イオンを前記緩衝液に接してい
   て二酸化炭素を選択的に資化可能な微生物で資化し、そ
   の際にひきおこされる前記緩衝液中の酸素濃度の減少を
   酸素電極により電流値として測定し、この電流値の変化
   量から二酸化炭素の濃度を測定することを特徴とする二
   酸化炭素計測方法。 ２、前記ガス透過性膜がシリコーンゴム膜である、特許
   請求の範囲第１項に記載の二酸化炭素計測方法。 ３、前記ガス透過性膜が含ふっ素高分子膜である、特許
   請求の範囲第１項に記載の二酸化炭素計測方法。 ４、前記微生物がヒドロゲノモナス属に属する菌体であ
   る、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記
   載の二酸化炭素計測方法。 ５、前記酸素電極がガルバニ型酸素電極である、特許請
   求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の二酸化
   炭素計測方法。 ６、前記緩衝液が高ｐＨ値を有している、特許請求の範
   囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の二酸化炭素計
   測方法。 ７、溶液中あるいは空気中の二酸化炭素の濃度をアンペ
   ロメトリーに基いて測定するための計測用センサーであ
   って、酸素電極と、該酸素電極のカソードの近傍に固定
   されたものであって前記二酸化炭素を選択的に資化可能
   な微生物と、該微生物を取り囲んで配置された緩衝液だ
   めと、前記緩衝液だめを覆って配置されたガス透過性膜
   とを組み合わせて含んでなることを特徴とする二酸化炭
   素計測用センサー。 ８、前記緩衝液だめ内に透析膜が配置されていて、前記
   カソードの全体及び前記微生物を包み込んでいる、特許
   請求の範囲第７項に記載の二酸化炭素計測用センサー。 ９、前記酸素電極がガルバニ型酸素電極である、特許請
   求の範囲第７項又は第８項に記載の二酸化炭素計測用セ
   ンサー。 １０、前記ガス透過性膜がシリコーンゴム膜である、特
   許請求の範囲第７項、第８項又は第９項に記載の二酸化
   炭素計測用センサー。 １１、前記ガス透過性膜が含ふっ素高分子膜である、特
   許請求の範囲第７項、第８項又は第９項に記載の二酸化
   炭素計測用センサー。 １２、前記微生物がヒドロゲノモナス属に属する菌体で
   ある、特許請求の範囲第７項〜第１１項のいずれか１項
   に記載の二酸化炭素計測用センサー。 １３、前記緩衝液だめの緩衝液が高ｐＨ値を有している
   、特許請求の範囲第７項〜第１２項のいずれか１項に記
   載の二酸化炭素計測用センサー。