JPS6284024A

JPS6284024A - 結合組織繊維加水分解物から抽出してなる繊維芽細胞増殖促進剤

Info

Publication number: JPS6284024A
Application number: JP60225666A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Ando; 安藤　義隆; Kenji Matsui; 松井　建次; Yutaka Ando; 裕安藤
Original assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Current assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Priority date: 1985-10-09
Filing date: 1985-10-09
Publication date: 1987-04-17
Also published as: JPH0424329B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔イ〕発明の目的本発明は、哺乳類及び鳥類等動物の皮膚、靭帯、血管壁
などを構成する結合組織繊維を出発原料となし、これよ
り、水溶性ペプチドを得て、さらに、これを分画して得
られる、繊維芽細胞増殖促進剤に関する。

（産業上の利用分野）本発明による繊維芽細胞増殖促進剤（以下、これを、細
胞増殖物質と略記する。）は、わが国の薬事法で定めら
れた、医薬品、医薬部外品、化粧品に広く利用すること
が出来る。その適応領域は、内科的疾患、皮膚、口腔、
眼、耳、鼻、肛門、陰部などの潰瘍（ただれ）、外傷な
どである。

さらに真体的に利用分野を述べれば、例えば、上述した
各部位に用いられる、絆創膏類、ガーゼ、リント布、バ
ルブ繊維（製紙［）、及び他の繊維を用いて織布された
素材に含ｔ！ｌ！！Ｌｋせて、局所に貼布して用いる医
療用又は、化粧料やさらに点眼点鼻などの薬剤、平削、
及び軟膏類又は液剤などに配合して用いることが出来る
。

又、本発明による細胞増殖物質は、皮膚及び真皮の発育
促進、皮膚の〜老化妨止、並びに創傷治癒促進、毛髪発
育促進を目的にした、各種の薬剤又は化粧料中に用いて
もよく、さらに、内部的な疾患としては、例えば、胃や
十二指腸潰瘍に対する治療に当って、直接又は、他の薬
剤と併、用して用いることが出来る。

すなわち、本発明による細胞増殖物質は組織の再生修復
に係わる、繊維芽細胞の活性を高める。

（従来の技術）結合組織繊維を出発原料となし、これより各種の抽出物
を得て、化粧料等に用いることは、古くから知られてい
る。とくに、最近では、その水溶性の加水分解物を用い
、保湿剤として化粧料への応用が進んでいる。

これらの加水分解物は、一般にエラスチンペプチドある
いは、コラーゲンペプチドと称されるが、その利用に当
っては、通常は、酸、アルカリ、プロテアーゼなどの各
種の酵素を用い、加水分解したものが用いられてきた。

そして、これらに関する公知刊行物を調査すれば、例え
ば第１表に示すものがある。

１第１表、公知刊行物（日本国特許庁発行）そのなかで
、本発明者が、目的となす細胞増殖物質の検索を行って
いる過程で、前装（第１表）中に示した、その（ホ）の
特許公開公報によれば、組織の構造蛋白を加水分解し、
これより分子量が１．０００〜７５，０００の各種の蛋
白ペプチドの複合物に、細胞増殖に対する刺激作用を有
することが開示されるに至った。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者は、第１表中に示きれる、それぞれの公知な抽
出条件をもとに、これらの有効利用をはかるために、適
正かつ正確な細胞増殖能を測定する試験法を確立する必
要があった。

すなわち、先ＩＲ（特開昭５９−１５２３３３号）にお
ける検索法にあっては、とくに具体的に示きれていない
が、従来、細胞増殖能について、これを評価する場合に
、株化した細胞が用いられてきた。

本発明者は、本発明を完成するに当り、皮膚の正常繊維
芽細胞をもとにし、評価する方法を採用（後記）した、
すなわち、その試験法とは、モルモットの皮膚正常繊維
芽細胞により行うものである。つまり、この試験法を確
立するに当っては、さまざまな株細胞を用いて検討を加
えたが、それらは、正常細胞とは異なり、生体における
細胞の機能モデルとはいいがたく、したがって、即、治
療分野に利用出来る、最善の試験法としては、株化され
ていない、正常な繊維芽細胞をもとに、これに対して直
接的に、増殖促進作用を有する物質の検索が必要であっ
た。

そこで、実験に当っては、公知なあらゆる方法で得られ
た結合組織繊維の加水分解物（水溶性のエラスチンペプ
チドやコラーゲンペプチド、及び両方が混在するペプチ
ドなど）をもとに、逐次、分画処理を進めながら、その
作用の著しい物質を求める方法を取った。その結果、こ
れらの水溶性ペプチドは、第３図に示すごと＜、ｍ維芽
細胞に対する増殖促進作用を示す成分は、１０，０００
以上の分子量には、はとんど含まれていないことがわか
った。きらに又、分子量１．０００以下の成分にはまっ
たく作用は無いことがわかった。同時に、分子量が１，
０００以下の成分にあっては、その高濃度投与は、細胞
に対して毒性作用を示すことがわかった。又、分子量５
．０００以下の成分にはほとんど増殖促進作用が見られ
ないこともわかった（第３図）。

このことから、結合組織繊維の加水分解物（エラスチン
、コラーゲン、又は、その両方を含む水溶性のペプチド
など）中の細胞増殖物質は、分子量がｓ、ｏｏｏ〜１０
．０００の範囲の間にあることがわかった。

一方、この細胞増殖物質の作用の程度について、既知の
繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ　：フイブログラスト　グ
ロス　ファクター）と比較してみれば、その作用は、Ｆ
ＧＦが極めて微量のｎｇ単位から作用を示すのに対し、
本試験で求められた、細胞増殖物質はＦＧＦと同様の細
胞増殖能を達成するには、ＦＧＦの１０４°１倍程度が
必要であり、又、最大投与量における作用の程度は、Ｆ
ＧＦと比べて、緩和なものであることがわかった（第２
〜３図）、シたがって、このことから、本物質とＦＧＦ
の作用機序とは；異なったものと推定される。−そして
目的とする物質を得るに当っては、前述したｓ　、ｏｏ
ｏ〜１０．Ｇｏｏの範囲の分子量から、これをξらに分
画して、単一なペプチドとなしても、その活性が向上し
ないことから、最終的には、作用ペプチドは複数である
ことを意味しており、結合組織繊維からの加水分解して
得られた水溶性ペプチドの本質は、その開発に当って目
的を達成する上で、最善の手段が、分子量５゜０００〜
１０．Ｇｏｏの間にある分画処理物を用いることが良い
ことがわかった。

（細胞増殖促進作用の測定に関する注解）細胞増殖促進
作用を表現す番方法は、今日一般に知られている成長因
子でも、的確に効力を表現する方法はない、細胞毒性を
表現する方法としては、さまざまな方法が示され、増殖
率の抑制として、細胞数、蒼白量等で定量的に示諮れる
。そこで本発明者らは、この細胞電性試験と逆に増殖率
の促進能について、定量的に表現する方法を鋭意検討し
た結果、目的物質を加えない対照群の細胞増殖率をゼロ
近くに抑制する事により、目的物質の細胞増殖物質を、
定量的に表現する方法を開発した。この方法をより具体
的に示せば、培養液に加える血清の量を調節する事によ
り行う方法である。

つまり、本試験法を確立するに当っては、きまざまの株
細胞で検討してきたが、それらは正常細胞とは異なり、
生体での細胞の機能のモデルとはいいがたいことから、
ここでは、正常組織から取り出した、初代細胞で検索す
ることとした。すなわち、モルモットの皮膚から無菌的
に細胞を分離し、一定期間継代した変異していない細胞
を対象として、目的物質の細胞増殖度を表現する事とし
た。たとえばモルモット（ハートレー系、雌）から採取
した繊維芽細胞は、５％牛脂児血清（ＦＢＳ）を添加し
たイーグルのＭＥＭ培地中で盛んに分裂増殖し、その倍
数増殖時間は、「第１図」に示す様に、約４８時間であ
り、採取後、約１年で株化した。

そこで本発明の目的物質の細胞増殖率表現のためには、
出来るだけ正常に近い細胞という条件から、採取後６ケ
月までに増殖継代した細胞を凍結保存する事により、目
的物質の分離の為に使用した。

この方法は、まず、直径３．５ｃｍのベトリデイシａ（
コーニング社製）に、１ｍｊ！の培養液あたり４〜５×
１０“個の細胞を植え、低濃度のＦＢＳを加えたイーグ
ルのＭＥＭ培地を、２〜３日目ごとに交換する。細胞数
は、２〜３日目ごとにビュルケルチュルクの血球計算盤
を用いて測定する。尚、この際同時に蛋白量、核酸量を
測定しても良い、目的物質は生理食塩水にて調製し、培
地あたり１０分の１の量を、培地交換の都度添加し、対
照には同量の生理食塩水のみ添加する。

〔口〕発明の構成本発明は、結合組織繊維の加水分解物中から分離（抽出
）した、水溶性ペプチドの分子量の範囲が、ｓ、ｏｏｏ
〜１０．０００のものを、繊維芽細胞増殖促進剤となす
ことから構成浮れる。又、その基本的な条件及び操作に
おける要旨は、次のＡ−Ｂで示すごとくであるが、さら
に具体的には、実施例により以下に詳記する。

（Ａ）抽出における出発原料、すなわち、結合組織繊維は、エ
ラスチン、コラーゲン等を含む哺乳動物及び鳥類などの
皮膚、靭帯、血管壁などである。

（Ｂ）実施例では、特定した抽出分離の条件下で、もっとも簡
易な方法を示すも、その抽出法としては、従来から知ら
れている塩析分離、有機溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲ
ル濾過、及び、イオンクロマト等々の、さまざまな蛋白
質の抽出法の組合わせにより得ることが出来る。

〔実施例−１〕水に可溶な結合組織繊維加水分解物は、公知の方法によ
って得ることが出来る０例えば、新鮮な哺乳動物及び鳥
類の凍結靭帯、あるいはそれらの皮膚又は血管壁１０ｋ
ｇを細砕し、精製水５０ｋを加える。これを希水酸化ナ
トリウム溶液でアルカリ処理した後、希硫ａ溶液を加え
て酸処理をした後、中和し、ブレンダーにて攪拌し、蛋
白分解酵素（プロナーゼ、エラスターゼ、コラゲナーゼ
等）を加えて部分的に加水分解した後、煮沸して酵素を
失活させ、濾過して水に可溶な結合組織繊維加水分解物
を得る。この水溶液を限外濾過膜（分画分子量１０．０
００、ミリポア製）で濾過し、通過した溶液（分子量１
０，０００以下）をきらに限外濾過膜（分画分子量ｓ　
、ｏｏｏ又は１゜０００）で濾過し、通過しない濃縮部
（分子量５．０００又は１，０００以上）を０．２２μ
ｍのフィルター（ミリポア製）で濾過した後、得られた
液、又は、得られた液を凍結乾燥して粉末となす。

〔実施例−２〕実施例−１と同様に、酸処理、アルカリ処理、さらに酵
素分解処理によって、水に可溶な結合組織繊維加水分解
物を得たのち、これに精製水を２倍量加えて、限外濾過
膜（分画分子量１０，０００）で濾過し、通過した溶液
をゲル濾過する。用いる担体としては、セファデックス
、アガロース、セファクリル等があげられるが、たとえ
ばセファデックスＧ−５０で分画して、分子量範囲５゜
０００〜１０，０００の分画を採取し、０．２２μｍの
フィルターにて無菌濾過した後、凍結乾燥して１００〜
１６０ｇの粉末を得る。

〔ハ〕発明の効果本発明による、結合組織繊維からの加水分解物からの抽
出分画物は、前記したごとくの、正常細胞によるｍ１ｍ
芽細胞増殖促進作用が明らかであり、細胞毒性を示きな
い、すなわち、本発明者らが研究（検索）中の過程で、
例えば、特開昭５９−１５２３３３号に示された、ｍ胞
増殖刺激作用物質が見出きれているが、これらは、その
分子量がｔ、ｏｏｏ〜７５．０００の範囲を規定し、そ
の範囲内にあるすべてのものが、細胞増殖刺激作用を有
するごとく報告されている。しかし、本発明者が新しく
開発した、前記した試験法によって、検索（追試）した
結果は、分子量１，０００以下の成分には、細胞毒性の
発現、きらに、１０．０００以上の成分には、はとんど
目的となす細胞増殖作用もないことがわかった。つまり
、従来から知られている、加水分解してなる水溶性のエ
ラスチンや、コラーゲン由来のペプチドには、保湿剤と
しての機能はあっても、本発明が目的となす、細胞増殖
物質ではないことがわかったのである。

このことは、これらの抽出物の医薬及び化粧品類への応
用に当っては、最も重要となる。すなわち、第１に安全
性の確保が充分に配慮されてし）ることが、医薬及び化
粧料への配合に当って（士、何よりも大切な要件であり
、正常細胞に対して、毒性を示す様では、それは本発明
の目的とする用途としては不適格となるからである。

本発明による細胞増殖物質は、その安全性からも優れた
ものであり、又、外傷損傷部位に対する作用は、本発明
によるごとく、分子量が５，０００〜１０，０００の範
囲の成分に活性があることから、これを用いることは、
損傷部の治癒効果を高めるのに最善である。尚、外用塗
布剤（料）を目的となす場合では、その用いる量を、細
胞増殖作用の程度から求めるときは、粉末換算で０．１
２前後が適量と推定出来る。

次に、二〜三の皮膚塗擦料を製し、その処方を示す。

〔処方例１：クリーム〕本発明の物質・・・・・・・・・・　０．１ｇステアリ
ン酸・・・・・・・・・・　１４．Ｏワセリン・拳拳・
拳・・・・・・・　２．０モノステアリン酸グリセリン
・・・　２．５メリオキシ工チレンソルビクン七ノステ
アリンｗＩｘステル　・　・　　　１．５香料・防腐剤
・・・・・・・・・・　適量プロピレングリフール・・
・・・・　１０．０水にて　・・・・・・・・・・・・
　１００とする。

〔処方例２：乳液〕本発明の物質・・・・・・・・・・　０．１ｇステアリ
ン酸・・・・・・−・・・　２．０セタノール・・曇・
−・・・拳−・　１．５ワセリン−・・・・―・・・・
・・　３．０ラノリンアルコール−・・・・・−２，０
流動パラフイン・・・・・・・・・　１０．０ぎリオ會
シエチレンモハしイン酸エステル（ｔｏ　　Ｅ、Ｏ，）
・　　　２．０ｇ香料・防腐剤・・・・・・・・・・　
適量グリセリン・・・・・・・・・・・　３．０プロピ
レングリコール・嗜・嘲・・　５．０水にて・・・・・
・・・・・・・・１００とする。

〔処方例３：ローシッン（毛髪用又は肌用）〕本発明の
物質・・・・・・・・・・　０．１に９５′１アルコー
ルｅ−−−−−−−２０，０プロピレングリコール・・
・・・−３，０香料・防腐剤・・・・・・・・・・　適
量水にて・・・・・・・・・・・・−１００とする。

〔処方例４：被覆保護剤〕ガーゼ又はリント布や、フラーゲン不織布に、処方例１
〜３を塗布、又は、本発明の物質を適当量含浸させ、必
要により、抗生物質、副腎皮質ホルモン剤、その他、抗
炎症剤などとの処方を組み、外傷部などに貼付する剤と
なす、（本発明物質を直接、局所損傷部に散布し、ガー
ゼ等で被覆する剤となしても良い、）上記した処方例によるものは、外用塗布を主体として用
いる際の、一つの形態を示したものであるが、外傷（切
傷）、火傷などにおいて、皮膚組織の再生修復作用を早
める。又、外傷のない肌に対しては、荒れ症肌に有効で
あり、肌の老化を防ぎ、小じわの防止に役立つ。

ただし、本発明による細胞増殖物質は、これを従来の結
合組織繊維から、加水分解して得られた、水溶性のベブ
デドなど（例えば、第１表中に示すごとくの、広い範囲
にわたる分子量分布をもった抽出物）と対比するとき、
肌に対する保湿性又は湿潤性効果は、公知な従来の抽出
物の方が高くこの点では劣る。

しかし、細胞増殖促進作用については、第１表中に示す
ごとくの抽出物が、ゼロ又は、ごく弱い作用しかないの
に対して、本発明による抽出物では、第２〜３図に示す
ごとく、活性が高いことである。

【図面の簡単な説明】

一第１図は、本発明において用いた細胞の増殖曲線であ
る。第２図は、結合組織繊維加水分解物を培地あたり１．０
ｍｇ／ｍｆｆ１　　添加したもの（イ）、及びＯ６Ｌｍ
ｇ／ｍｅ　　添加したもの（ロ）の細胞増殖曲線を示す
、尚、（ハ）は対照群（生理食塩水添加群）の増殖曲線
である。第３図は本発明の繊維芽細胞増殖促進剤を培地あたり０
．５ｍｇ／ｍｆｆ１添加したもの（ａ）、結合組織繊維
加水分解物の分子量１０．０００以上のフラクシヨンを
、＠地あたり０．５ｍｇ／ｍｅ添加したもの（ｂ）、及
び分子量５．０００以下のフラクションを、培地あたり
０．５ｍｇ／ｍｊ！添加したもの（Ｃ）の細胞増殖曲線
である。尚、（ｄ）は対照群を示す。第４図は本発明の繊維芽細胞増殖促進剤のセファデック
スＧ−５０による溶出曲線である。麟Ｖ＠１Ｉ３１１麟２１１請；ｐａｎ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）結合組織繊維を加水分解して、分子量が５，０００〜１
０，０００の範囲にある水溶性ペプチドを抽出してなる
繊維芽細胞増殖促進剤。