JPS6285863A - ヌクレオチド配列決定のためのオ−トメ−シヨン可能な方法 - Google Patents
ヌクレオチド配列決定のためのオ−トメ−シヨン可能な方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［１８発明の分野］
本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの塩基配列を
決定づるための新規な方法に関するものである。本発明
の方法は、オートメーション化可能であり、また放射性
標識の使用を必要としない。
決定づるための新規な方法に関するものである。本発明
の方法は、オートメーション化可能であり、また放射性
標識の使用を必要としない。
この方法はまた、特異的部位でＤＮＡまたはＲＮＡ分子
の配列を変更するために用いられることができ、これに
より該分子の部位特異的変異生成を与える。
の配列を変更するために用いられることができ、これに
より該分子の部位特異的変異生成を与える。
［２０発明の背景］
ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドの鎖からなる、長
い糸状の巨大分子である。同様にＲＮＡは、リボヌクレ
オチドの鎖から構成される。あるヌクレオチドは、１つ
のヌクレオシド、すなわち五炭糖に結合した窒素含有塩
基、および該ヌクレオシドの五炭糖のＣ−５（５°とし
て示される。）に付着した水酸基で、通常エステル化さ
れたコないしそれ以上のリン酸基から構成される。この
ような化合物は、ヌクレオシド５゛−ホスフェート（ヌ
クレオシド５−リン酸〉または５−ヌクレオチドと呼ば
れる。ＤＮＡの分子においては、五炭糖は、デオキシリ
ボースであり、一方ＲＮＡの分子においては、五炭糖は
リポースである。窒素含有塩基は、アデニンもしくはグ
アニンのようなプリン誘導体、またはシトシン、チミン
（デオキシリボヌクレオチドにおける）もしくはウラシ
ル（リボヌクレオチドにあける）のようなピリミジン誘
導体であり得る。従って、ＤＮＡの主要なヌクレオチド
は、デオキシアデノシン５−三リン酸（ｄＡＴＰ＞ 、
デオキシグアノシン５−三リン酸（ｄＧＴＰ） 、デオ
キシシチジン５−三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシ
チミジン５′−三リン酸（ｄＴＴＰ）である。ＲＮＡの
主要なヌクレオチドは、アデノシン５−三リン酸（ＡＴ
Ｐ＞ 、グアノシン５′−三１ノン酸（ＧＴＰ） 、シ
チジン５′−三リン酸（ｃＴＰ）およびウリジン５−三
リン酸（ＵＴＰ）である。
い糸状の巨大分子である。同様にＲＮＡは、リボヌクレ
オチドの鎖から構成される。あるヌクレオチドは、１つ
のヌクレオシド、すなわち五炭糖に結合した窒素含有塩
基、および該ヌクレオシドの五炭糖のＣ−５（５°とし
て示される。）に付着した水酸基で、通常エステル化さ
れたコないしそれ以上のリン酸基から構成される。この
ような化合物は、ヌクレオシド５゛−ホスフェート（ヌ
クレオシド５−リン酸〉または５−ヌクレオチドと呼ば
れる。ＤＮＡの分子においては、五炭糖は、デオキシリ
ボースであり、一方ＲＮＡの分子においては、五炭糖は
リポースである。窒素含有塩基は、アデニンもしくはグ
アニンのようなプリン誘導体、またはシトシン、チミン
（デオキシリボヌクレオチドにおける）もしくはウラシ
ル（リボヌクレオチドにあける）のようなピリミジン誘
導体であり得る。従って、ＤＮＡの主要なヌクレオチド
は、デオキシアデノシン５−三リン酸（ｄＡＴＰ＞ 、
デオキシグアノシン５−三リン酸（ｄＧＴＰ） 、デオ
キシシチジン５−三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシ
チミジン５′−三リン酸（ｄＴＴＰ）である。ＲＮＡの
主要なヌクレオチドは、アデノシン５−三リン酸（ＡＴ
Ｐ＞ 、グアノシン５′−三１ノン酸（ＧＴＰ） 、シ
チジン５′−三リン酸（ｃＴＰ）およびウリジン５−三
リン酸（ＵＴＰ）である。
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のプリンおよびピリミジン塩基
の配列は、該分子において含まれる遺伝子情報をコード
化する。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の糖およびリン酸基は
、巨大分子の骨、格を形成する、構造的らせんをなす。
の配列は、該分子において含まれる遺伝子情報をコード
化する。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の糖およびリン酸基は
、巨大分子の骨、格を形成する、構造的らせんをなす。
詳細には、それぞれのヌクレオチドの糖部分は、以下の
ように隣接するヌクレオチドの糖部分にホスホジエステ
ル ブリッジによって結合されている。すなわち、１つ
のヌクレオチドの五炭糖の３−水酸基は、ホスホジエス
テル結合によって隣接するヌクレオチドの五炭塘の５−
水酸基に連結される。該ヌクレオチド鎖の一方の末端は
５°−水酸基を有し、また該ヌクレオチド鎖の使方の末
端は、３′−水酸基を有し、これゆえヌクレオチド鎖は
極性を有する。一般に、ヌクレオチド鎖の塩基配列は、
５′から３゛への方向（５゛−→３゛方向）において記
載される。
ように隣接するヌクレオチドの糖部分にホスホジエステ
ル ブリッジによって結合されている。すなわち、１つ
のヌクレオチドの五炭糖の３−水酸基は、ホスホジエス
テル結合によって隣接するヌクレオチドの五炭塘の５−
水酸基に連結される。該ヌクレオチド鎖の一方の末端は
５°−水酸基を有し、また該ヌクレオチド鎖の使方の末
端は、３′−水酸基を有し、これゆえヌクレオチド鎖は
極性を有する。一般に、ヌクレオチド鎖の塩基配列は、
５′から３゛への方向（５゛−→３゛方向）において記
載される。
デオキシリボヌクレオチド間のホスホジエステル結合の
形成は、酵素ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される。
形成は、酵素ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される。
ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの鎖の合成を触媒するのに
以下の成分を必要とする；鋳型鎖［ｔｅｍｐｌｅｔｅ
５ｔｒａｎｄｌ（例えば−１ＤＮＡ分子）、プライマー
（すなわち遊離３−水酸基を有する短いＤＮＡあるいは
ＲＮＡ鎮で必って、これは−重鎮の鋳型の特異的部位に
ハイブリッド形成される。〉。ＤＮＡポリメラーゼによ
って触媒された、鋳型鎮の伸長は、鋳型に沿って５゛→
３°方向において進行する。反応は、到来ヌクレオチド
の最内方のリン原子にあける、鋳型の３−ヒドロキシル
末端の求核効撃によって発生し、ホスホジエステル ブ
リッジが形成され、そしてピロリン酸が放出される。Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、到来ヌクレオチドの塩基が鋳型鎖
にあけるヌクレオチドの塩基に相補性でおる場合にのみ
、ホスホジエステル結合の形成を触媒する。すなわち、
到来ヌクレオチドは、鋳型と正しいワトソンークリック
型塩基対を形成しなければならない。これゆえＤＮＡポ
リメラーゼは鋳型に指示された酵素（［ｔｅｍｐｌａｔ
ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ］ 、鋳型依存性
酵素〉である。
以下の成分を必要とする；鋳型鎖［ｔｅｍｐｌｅｔｅ
５ｔｒａｎｄｌ（例えば−１ＤＮＡ分子）、プライマー
（すなわち遊離３−水酸基を有する短いＤＮＡあるいは
ＲＮＡ鎮で必って、これは−重鎮の鋳型の特異的部位に
ハイブリッド形成される。〉。ＤＮＡポリメラーゼによ
って触媒された、鋳型鎮の伸長は、鋳型に沿って５゛→
３°方向において進行する。反応は、到来ヌクレオチド
の最内方のリン原子にあける、鋳型の３−ヒドロキシル
末端の求核効撃によって発生し、ホスホジエステル ブ
リッジが形成され、そしてピロリン酸が放出される。Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、到来ヌクレオチドの塩基が鋳型鎖
にあけるヌクレオチドの塩基に相補性でおる場合にのみ
、ホスホジエステル結合の形成を触媒する。すなわち、
到来ヌクレオチドは、鋳型と正しいワトソンークリック
型塩基対を形成しなければならない。これゆえＤＮＡポ
リメラーゼは鋳型に指示された酵素（［ｔｅｍｐｌａｔ
ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ］ 、鋳型依存性
酵素〉である。
逆転写酵素もまた鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼでおる
か、ＲＮＡをその鋳型として必要とする。
か、ＲＮＡをその鋳型として必要とする。
その他の酵素であるＲＮＡポリメラーセは、ＤＮＡ鋳型
に相補性でおる活性化リボヌクレオチド前駆体の重合を
触媒する。エシェリキア・コリ［Ｅ、Ｃｏｌ ｉｌＤ
Ｎ ＡポリメラーゼＩおよび丁４ＤＮＡポリメラーゼの
ような、いくつかのポリメラーゼはまた、非対合末端に
おいて作用する３゛→５′エキソヌクレアーゼ活性８有
する。この３゛→５゛エキンヌクレアーゼ活性は、不合
が続く前に誤って対合したｊＷＩを除去する、すなわち
誤って対合した塩基を伸長する鎖の外へ修正する［ｅｄ
ｉｔｌことにより「ブルーフリーディング（［ｐｒｏｏ
ｒ−ｒｅａｄｒｎｇｌ。
に相補性でおる活性化リボヌクレオチド前駆体の重合を
触媒する。エシェリキア・コリ［Ｅ、Ｃｏｌ ｉｌＤ
Ｎ ＡポリメラーゼＩおよび丁４ＤＮＡポリメラーゼの
ような、いくつかのポリメラーゼはまた、非対合末端に
おいて作用する３゛→５′エキソヌクレアーゼ活性８有
する。この３゛→５゛エキンヌクレアーゼ活性は、不合
が続く前に誤って対合したｊＷＩを除去する、すなわち
誤って対合した塩基を伸長する鎖の外へ修正する［ｅｄ
ｉｔｌことにより「ブルーフリーディング（［ｐｒｏｏ
ｒ−ｒｅａｄｒｎｇｌ。
校正）」機能を与える。
（２，１，ＤＮＡ配列決定）。
いくつかの異なる手段が、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の塩
基配列を決定するために現在用いられている。これらの
アプローチはかなり異なっているが、現在用いられてい
る方法のいずれもが以下の共通の要素を有している： （ａ）それぞれの分子が１つの共通の末端（５′もしく
は３゛）を有している放射活性なポリヌクレオチドの集
団を製造するための方法：（ｂ）１つの共通の末端を有
するが、シングル塩ｌ［ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ］の増
加における他の末端での長さにおいて異なるポリヌクレ
オチドの整列を、放射活性なポリヌクレオチドのこの集
団から製造するための方法；および （ｃ）通常は、オートラジオグラフが作製される高解析
変性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動的分離に
よる、サイズにより分子の集団を宝庫するための方法。
基配列を決定するために現在用いられている。これらの
アプローチはかなり異なっているが、現在用いられてい
る方法のいずれもが以下の共通の要素を有している： （ａ）それぞれの分子が１つの共通の末端（５′もしく
は３゛）を有している放射活性なポリヌクレオチドの集
団を製造するための方法：（ｂ）１つの共通の末端を有
するが、シングル塩ｌ［ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ］の増
加における他の末端での長さにおいて異なるポリヌクレ
オチドの整列を、放射活性なポリヌクレオチドのこの集
団から製造するための方法；および （ｃ）通常は、オートラジオグラフが作製される高解析
変性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動的分離に
よる、サイズにより分子の集団を宝庫するための方法。
配列は、オートラジオグラムにおいて得られる「バンド
」ないしは「ラダー［１ａｄｄｅｒ］ｌから推論される
。
」ないしは「ラダー［１ａｄｄｅｒ］ｌから推論される
。
特定の配列決定方法が、以下の分節においで述べられる
。
。
（２，１，１，プラス／マイナスＤＮＡ配列決定法）
プラス／マイナスＤＮＡ配列決定゛法（サンガーとコー
ルソン［Ｓａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎｌ、１
９７５．Ｊ、ト１ｏ１゜Ｂｉｏｌ、９４：４４１−４４
８）は、以下のことを包含するものである。
ルソン［Ｓａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎｌ、１
９７５．Ｊ、ト１ｏ１゜Ｂｉｏｌ、９４：４４１−４４
８）は、以下のことを包含するものである。
ＤＮＡポリメラーゼは最初に、プライマーであるオリゴ
ヌクレオチドを伸長する、および４つの活性化ヌクレオ
チド前駆体（その１つは３２Ｐで標識される。）の存在
下に鋳型を複製するために用いられる。理想的に、合成
は、非同時性でかつ可能なかぎりランダムでおり、これ
によって異なる長さのオリゴヌクレオチドの最大数が、
前駆体よりいずれも出発して、形成される。過剰な未反
応ヌクレオチドは除去され、そしてＤＮＡ鎖の混合物は
２つに分けられる。次に述べるように、一方の半分は「
マイナス」システムに従って処理され、他方は「プラス
」システムに従って処理される。
ヌクレオチドを伸長する、および４つの活性化ヌクレオ
チド前駆体（その１つは３２Ｐで標識される。）の存在
下に鋳型を複製するために用いられる。理想的に、合成
は、非同時性でかつ可能なかぎりランダムでおり、これ
によって異なる長さのオリゴヌクレオチドの最大数が、
前駆体よりいずれも出発して、形成される。過剰な未反
応ヌクレオチドは除去され、そしてＤＮＡ鎖の混合物は
２つに分けられる。次に述べるように、一方の半分は「
マイナス」システムに従って処理され、他方は「プラス
」システムに従って処理される。
（ａ）「マイナス」システム：ランダムな長さの敢ｑ４
標識されたオリゴヌクレオチド（これらは、鋳型ＤＮＡ
へ、なおハイブリッド形成される。）の混合物は、４つ
の別々の反応混合物に分けられ、３つの活性化ヌクレオ
チド前駆体の存在下にＤＮＡポリメラーゼと再びインキ
ュベートされる。
標識されたオリゴヌクレオチド（これらは、鋳型ＤＮＡ
へ、なおハイブリッド形成される。）の混合物は、４つ
の別々の反応混合物に分けられ、３つの活性化ヌクレオ
チド前駆体の存在下にＤＮＡポリメラーゼと再びインキ
ュベートされる。
すなわち、４つのヌクレオシド−５−三リン酸の１つが
それぞれの反応混合物から除かれている。それぞれの鎖
の伸長は、鋳型に沿う限りにおいて進行する。いい代え
れば、それぞれの鎖は、除かれている残基の取込みの部
位の前の位置においてそれの３゛末端で終了する。例え
ば、−Ａシステムにおいては、ｄＡＴＰが、反応混合物
から除かれているヌクレオチドでおり、そしてそれぞれ
の鎖は、成長する鎖中に取込まれるであろうｄＡＴＰ残
基の曲の位置において、それの３′末端で終了する。
それぞれの反応混合物から除かれている。それぞれの鎖
の伸長は、鋳型に沿う限りにおいて進行する。いい代え
れば、それぞれの鎖は、除かれている残基の取込みの部
位の前の位置においてそれの３゛末端で終了する。例え
ば、−Ａシステムにおいては、ｄＡＴＰが、反応混合物
から除かれているヌクレオチドでおり、そしてそれぞれ
の鎖は、成長する鎖中に取込まれるであろうｄＡＴＰ残
基の曲の位置において、それの３′末端で終了する。
それゆえ、インキュベーション明間の終了時点て、それ
ぞれの反応混合物は、それぞれ共通の５゛末端を有する
が、３゛末端での艮ざにおいて異なるＤＮＡ分子の集団
を含むであろう。それぞれの反応混合物における異なる
長さの放射標識ヌクレオチドは、変性ポリアクリルアミ
ドゲルにおける電気泳動によって、サイズに従い分画さ
れる。なあ、それぞれの反応混合物は、別々のレーンに
おいて分画される。ＤＮＡに沿うそれぞれの残基の相対
位置は、局在され得、そしてＤＮＡの配列は、得られた
ゲルのオー１へラジオグラフから推論される。
ぞれの反応混合物は、それぞれ共通の５゛末端を有する
が、３゛末端での艮ざにおいて異なるＤＮＡ分子の集団
を含むであろう。それぞれの反応混合物における異なる
長さの放射標識ヌクレオチドは、変性ポリアクリルアミ
ドゲルにおける電気泳動によって、サイズに従い分画さ
れる。なあ、それぞれの反応混合物は、別々のレーンに
おいて分画される。ＤＮＡに沿うそれぞれの残基の相対
位置は、局在され得、そしてＤＮＡの配列は、得られた
ゲルのオー１へラジオグラフから推論される。
このシステムのみでは、配列を確証するのに通常十分で
ないために、第二の同様なシステムである。
ないために、第二の同様なシステムである。
以下に述べるプラスシステムが、これと組合せて通常用
いられる。
いられる。
（ｂ）「プラス」システム：ランダムな長さの放射標識
されたオリゴヌクレオチド（これらは鋳型ＤＮＡへなお
ハイブリット形成される。）の混合物が、４つの別々の
反応混合物に別けられ、このそれぞれか、４つの活性化
ヌクレＡヂト面駆体の１つのみの存在下においてＤＮＡ
ポリメラーゼと再びインキュベートされる。例えば、＋
Ａシステムにおいては、ｄＡＴＰのみが反応混合物中に
存在する。ＤＮＡ分子の集団は、それぞれ共通の５゜末
端を有するが、すべての鎖は、デオキサデノシン残基で
終了する異なる長さを有するであろう。
されたオリゴヌクレオチド（これらは鋳型ＤＮＡへなお
ハイブリット形成される。）の混合物が、４つの別々の
反応混合物に別けられ、このそれぞれか、４つの活性化
ヌクレＡヂト面駆体の１つのみの存在下においてＤＮＡ
ポリメラーゼと再びインキュベートされる。例えば、＋
Ａシステムにおいては、ｄＡＴＰのみが反応混合物中に
存在する。ＤＮＡ分子の集団は、それぞれ共通の５゜末
端を有するが、すべての鎖は、デオキサデノシン残基で
終了する異なる長さを有するであろう。
ｄＡＴＰ残基の位置は、変性ポリアクリルアミドゲルに
あける電気泳動によりサイズによってそれぞれの反応混
合物にあけるＤＮＡ鎖を分画した後に得られるオートラ
ジオグラフにおけるバンドによって、示されるであろう
。なお、それぞれの反応混合物は別々のレーンにおいて
分画される。通常これらは、−へシステムにおける相応
するバンドより１残基大きなものであるオリゴヌクレオ
チド産物であろうが、１以上の連続的なｄＡＴＰ残基が
ある場合、−八および＋Ａシステムにおけるバンド間の
距離は、このような連続的な残基の数を示すものであろ
う。
あける電気泳動によりサイズによってそれぞれの反応混
合物にあけるＤＮＡ鎖を分画した後に得られるオートラ
ジオグラフにおけるバンドによって、示されるであろう
。なお、それぞれの反応混合物は別々のレーンにおいて
分画される。通常これらは、−へシステムにおける相応
するバンドより１残基大きなものであるオリゴヌクレオ
チド産物であろうが、１以上の連続的なｄＡＴＰ残基が
ある場合、−八および＋Ａシステムにおけるバンド間の
距離は、このような連続的な残基の数を示すものであろ
う。
このプラス／マイナス システムに関して、確かな結果
を得るために、種々の基準が満足させられなければなら
ない。例えば、すべてのＤＮＡフラグメントは同様の５
′末端を有しなければならず、またＤＮＡポリメラーゼ
のフレノウ［Ｋｌｅｎｏｗｌフラグメントが、ＤＮＡポ
リメラーゼの５゛エキソヌクレアーゼ活性を消去するた
めに用いられなければならない。さらにまた、ヌクレオ
チドはサイズに従い分画されることが必須である。理想
的に、すべての可能な長さのオリゴヌクレオチドは、す
べての残基がプラスおよびマイナスシステムにおいて表
わされるように、最初の反応混合物中に存在すべきであ
るが、このことを達成することは、ある産物が他のもの
がない場合であってもかなり高い収率で形成されるため
に困難なことである。これは、ポリメラーゼが異なる部
位において異なる割合で作用すること、ないしはこの効
果は鋳型の二次溝道に部分的に関連するものであること
を提唱するものであった。サンガーら［Ｓａｎｇｅｒ
ｅｔ ａｌ、 ］（上記）は、合成がポリメラーゼのか
なり高い濃度において短い時間で行なわれた場合に、最
高の結果が得られることを報告しているが、頻繁にいく
つかの期待された産物が欠除している。これは、該方法
の限界を構成するものであり、またなぜプラスおよびマ
イナスシステムの双方を使用する必要性があるかの１つ
の理由である。与えられたヌクレオチドの連続進行は、
配列決定のプラス／マイナス方法が、用いられた場合の
主要な困難性を表わす。
を得るために、種々の基準が満足させられなければなら
ない。例えば、すべてのＤＮＡフラグメントは同様の５
′末端を有しなければならず、またＤＮＡポリメラーゼ
のフレノウ［Ｋｌｅｎｏｗｌフラグメントが、ＤＮＡポ
リメラーゼの５゛エキソヌクレアーゼ活性を消去するた
めに用いられなければならない。さらにまた、ヌクレオ
チドはサイズに従い分画されることが必須である。理想
的に、すべての可能な長さのオリゴヌクレオチドは、す
べての残基がプラスおよびマイナスシステムにおいて表
わされるように、最初の反応混合物中に存在すべきであ
るが、このことを達成することは、ある産物が他のもの
がない場合であってもかなり高い収率で形成されるため
に困難なことである。これは、ポリメラーゼが異なる部
位において異なる割合で作用すること、ないしはこの効
果は鋳型の二次溝道に部分的に関連するものであること
を提唱するものであった。サンガーら［Ｓａｎｇｅｒ
ｅｔ ａｌ、 ］（上記）は、合成がポリメラーゼのか
なり高い濃度において短い時間で行なわれた場合に、最
高の結果が得られることを報告しているが、頻繁にいく
つかの期待された産物が欠除している。これは、該方法
の限界を構成するものであり、またなぜプラスおよびマ
イナスシステムの双方を使用する必要性があるかの１つ
の理由である。与えられたヌクレオチドの連続進行は、
配列決定のプラス／マイナス方法が、用いられた場合の
主要な困難性を表わす。
（２，１，２，チェイン ターミネータ−法［ｄｉｄｅ
ｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄｌ）サンガーら、１９７７年、プロシーデイング
オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ サイエンシズ
オブ ザ ユナイテット ステートオブ アメリカ
−７４： ５４６３ ［５ａｎＧｅｒ’ ｅｔａｌ、
、 １９７７、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ｔｌ、Ｓ、Ａ、 ７４：５４６３］の「ジデオキシ
」鎖末端ＤＮＡ配列決定法［”ｄｉｄｅｏｘｙ”ｃｈａ
ｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｌはまた、短いＤＮＡプライマ
ーにハイブリッド形成される、−重鎖ＤＮＡ鋳型の相補
性の放射標識複製を合成するＤＮＡポリメラーゼの能力
の使用を行なうものである。合成は、４つのデオキシヌ
クレオシド５−三リンｒ！ＩＬ（ｄＮＴＰ）のすべて（
これらの１つ、またはそれ以上が３２ｐで標識される。
ｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄｌ）サンガーら、１９７７年、プロシーデイング
オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ サイエンシズ
オブ ザ ユナイテット ステートオブ アメリカ
−７４： ５４６３ ［５ａｎＧｅｒ’ ｅｔａｌ、
、 １９７７、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ｔｌ、Ｓ、Ａ、 ７４：５４６３］の「ジデオキシ
」鎖末端ＤＮＡ配列決定法［”ｄｉｄｅｏｘｙ”ｃｈａ
ｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｌはまた、短いＤＮＡプライマ
ーにハイブリッド形成される、−重鎖ＤＮＡ鋳型の相補
性の放射標識複製を合成するＤＮＡポリメラーゼの能力
の使用を行なうものである。合成は、４つのデオキシヌ
クレオシド５−三リンｒ！ＩＬ（ｄＮＴＰ）のすべて（
これらの１つ、またはそれ以上が３２ｐで標識される。
）、ならびに４つのｄＮＴＰの１つの２’、３”ジデオ
キシヌクレオシド三リン酸類似体の存在下において行な
われる。４つの別々のインキュベーション混合物は、そ
れぞれが４つのジデオキシヌクレオチド類似体の１つの
みを、含んで調製される。該類似体が取込まれると、成
長する鎖の３゛末端はもはやＤＮＡポリメラーゼに対す
る基質ではなく、これゆえに、ざらに伸長されることは
全く不可能である。インキュベーション期間の終了時点
で、それぞれの反応混合物は、共通の５゛末端を有する
が、ヌクレオチド塩基特異的３°末端への長さにおいて
異なるＤＮＡ分子の集団を、含んでいるであろう。ＤＮ
Ａ分子の集団のそれぞれは、次に変性され、ゲル電気泳
動によってサイズに従って分画される。なおそれぞれの
反応混合物は、別々のレーンにおいて分画される。ゲル
のオートラジオグラフィーは、配列に推論されることを
許容する。
キシヌクレオシド三リン酸類似体の存在下において行な
われる。４つの別々のインキュベーション混合物は、そ
れぞれが４つのジデオキシヌクレオチド類似体の１つの
みを、含んで調製される。該類似体が取込まれると、成
長する鎖の３゛末端はもはやＤＮＡポリメラーゼに対す
る基質ではなく、これゆえに、ざらに伸長されることは
全く不可能である。インキュベーション期間の終了時点
で、それぞれの反応混合物は、共通の５゛末端を有する
が、ヌクレオチド塩基特異的３°末端への長さにおいて
異なるＤＮＡ分子の集団を、含んでいるであろう。ＤＮ
Ａ分子の集団のそれぞれは、次に変性され、ゲル電気泳
動によってサイズに従って分画される。なおそれぞれの
反応混合物は、別々のレーンにおいて分画される。ゲル
のオートラジオグラフィーは、配列に推論されることを
許容する。
関心のＤＮＡ配列の複数の複製を得るための一重鎮バタ
テリオファージＭ１３、およびそれの「万能プライマー
」配列の使用は、ジデオキシ鎖末端ＤＮＡ配列決定法の
有用性を極めて高めるものであった。しかしながら該方
法は、サイズによるＤＮＡ産物の分画を絶対的に必要と
し、そしてこれゆえゲル電気泳動を含むものでおる。
テリオファージＭ１３、およびそれの「万能プライマー
」配列の使用は、ジデオキシ鎖末端ＤＮＡ配列決定法の
有用性を極めて高めるものであった。しかしながら該方
法は、サイズによるＤＮＡ産物の分画を絶対的に必要と
し、そしてこれゆえゲル電気泳動を含むものでおる。
（２，１，３，’？ツクムーギルバート［ＭａＸａｍ−
Ｇｉ Ｉｂｅｒｔ 法） ＤＮＡ配列決定のマクサム−ギルバート法は、化学的配
列決定方法である（マクサムとギルバート、１９７７年
、プロシーディング オブ ザナショナル アカデミ−
オブ サイエンシズオブ す ユナイテッド ステート
オブ アメリカ ７４ ： ５６０ ［Ｍａｘａｍ
ａｎｄ Ｇ１１ｂｅｒｔ、１９７７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５６０１） 、
１ ツの分離したＤＮＡフラグメントの３°または５
′末端のいずれかを放射性標識した後、該ＤＮＡのアリ
コート（部分標本、 ［ａｌｉｑｕｏｔｌ）が、４つの
別々の反応混合物中に移され、該反応混合物のそれぞれ
は、ＤＮＡを１つの塩基特異的様式において部分分解す
る。ＤＮＡ配列は、得られるオートラジオグラムにおい
て出現するラダー［１ａｄｄｅｒｌから推論される。
Ｇｉ Ｉｂｅｒｔ 法） ＤＮＡ配列決定のマクサム−ギルバート法は、化学的配
列決定方法である（マクサムとギルバート、１９７７年
、プロシーディング オブ ザナショナル アカデミ−
オブ サイエンシズオブ す ユナイテッド ステート
オブ アメリカ ７４ ： ５６０ ［Ｍａｘａｍ
ａｎｄ Ｇ１１ｂｅｒｔ、１９７７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５６０１） 、
１ ツの分離したＤＮＡフラグメントの３°または５
′末端のいずれかを放射性標識した後、該ＤＮＡのアリ
コート（部分標本、 ［ａｌｉｑｕｏｔｌ）が、４つの
別々の反応混合物中に移され、該反応混合物のそれぞれ
は、ＤＮＡを１つの塩基特異的様式において部分分解す
る。ＤＮＡ配列は、得られるオートラジオグラムにおい
て出現するラダー［１ａｄｄｅｒｌから推論される。
（２，１，４，ＲＮ△配列決定〉
主要なＲＮＡ配列分析術は、５°および３“末端標識処
方を用いるものである。（イングランドとオーレンベッ
ク、’１９７８年、ネイチャー２ ７ ５ ： ５
６ １ ［Ｅｎｇｌａｎｄ ａｎｄ Ｕｈｌｅ
ｎｂｅｃｋ、１９７Ｂ。
方を用いるものである。（イングランドとオーレンベッ
ク、’１９７８年、ネイチャー２ ７ ５ ： ５
６ １ ［Ｅｎｇｌａｎｄ ａｎｄ Ｕｈｌｅ
ｎｂｅｃｋ、１９７Ｂ。
Ｎａｔｕｒｅ ２７５：５６１１）。放射性標識に続き
、ＲＮＡは、塩基特異的ＲＮアーゼ（［ＲＮａｓｅ］、
リボヌクレアーゼ）または化学品を用いてフラグメント
化される。
、ＲＮＡは、塩基特異的ＲＮアーゼ（［ＲＮａｓｅ］、
リボヌクレアーゼ）または化学品を用いてフラグメント
化される。
ＤＮＡ配列決定法と同様に、オリゴリボヌクレオチドの
集団のそれぞれは、変性ポリアクリルアミドゲルにおけ
る高解析電気泳動によりサイズによって分画される。配
列は次に該ゲルに相応するオートラジオグラムから推論
される。
集団のそれぞれは、変性ポリアクリルアミドゲルにおけ
る高解析電気泳動によりサイズによって分画される。配
列は次に該ゲルに相応するオートラジオグラムから推論
される。
（２，１，５，配列決定のオートメーション）上記に述
べた配列決定法に対するいくつかの主要な障害は、烈し
い労働、時間浪費および容易にオー１ヘメーシヨン化さ
れないことである。オートメーションでの現在の試みは
、オートラジオグラフにおけるバントないしはラダーの
光学密度を「読む」ための濃度計の使用を含むものであ
る。
べた配列決定法に対するいくつかの主要な障害は、烈し
い労働、時間浪費および容易にオー１ヘメーシヨン化さ
れないことである。オートメーションでの現在の試みは
、オートラジオグラフにおけるバントないしはラダーの
光学密度を「読む」ための濃度計の使用を含むものであ
る。
これらの技術は、ゲルレーンが直線であることを要求し
、またざらに操作者による注意深いモニターリングを必
要とする。
、またざらに操作者による注意深いモニターリングを必
要とする。
（２，２，部位特異的変異生成）
ＤＮＡを変異生成するために現在用いられている方法は
、アルキル化剤、ミドマイシンＣ１電離放射線もしくは
紫外放射線のような変異誘発要因での処理を含む生体内
［ｉｎ ｖｉｖｏ］技術、または、重亜硫酸塩で誘発さ
れた欠失ループ変異生成のような試験管内（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ）技術を含むものである。
、アルキル化剤、ミドマイシンＣ１電離放射線もしくは
紫外放射線のような変異誘発要因での処理を含む生体内
［ｉｎ ｖｉｖｏ］技術、または、重亜硫酸塩で誘発さ
れた欠失ループ変異生成のような試験管内（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ）技術を含むものである。
しかしながら、これらの方法は、非特異的様式において
多重塩基置換を得るのに適当である。
多重塩基置換を得るのに適当である。
ＤＮＡにおける選択的部位で特異的塩基置換をもたらす
ために、いくつかの方法が進展してきている（用いられ
る方法の簡単なＮ観に関しては、ザコーら、１９８４年
、ヌクレイツク アシツズリサーチ １２ （６）：６
６１５〜６６２８およびアバルズアら、１９８４年、プ
ロシーディングオブ デ ナショナル アカデミ−オブ
ナイエンシズ ８１ ： ２０３０〜２０３４［Ｚａ
ｋｏｕｒ ｅｔａｌ、、１９８４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １２（Ｇ）：６６１５−
６８２８ ａｎｄ Ａｂａｒｚｕａ ｅｔ ａ
ｌ、、１９８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。
ために、いくつかの方法が進展してきている（用いられ
る方法の簡単なＮ観に関しては、ザコーら、１９８４年
、ヌクレイツク アシツズリサーチ １２ （６）：６
６１５〜６６２８およびアバルズアら、１９８４年、プ
ロシーディングオブ デ ナショナル アカデミ−オブ
ナイエンシズ ８１ ： ２０３０〜２０３４［Ｚａ
ｋｏｕｒ ｅｔａｌ、、１９８４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １２（Ｇ）：６６１５−
６８２８ ａｎｄ Ａｂａｒｚｕａ ｅｔ ａ
ｌ、、１９８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。
ＳＣｉ、８１：２０３０−２０３４］を参照のこと。〉
。１つの方法は、ウィルスのＤＮＡ鋳型または組換え型
ＤＮＡ中へ、ヌクレオチド配列内に予め選択された変化
をコード化する合成オリゴヌクレオチドを挿入すること
を含むものである。この方法は、有効でありかつ塩基置
換変異の任意のタイプを製造できるものでおるが、導入
されるそれぞれ異なる変異は、該変異をコード化し、か
つウィルスのもしくは組換ＤＮＡにおいて生成されるべ
き付着端に対して相補性である非反復［ｕｎｉｑｕｅｌ
オリゴヌクレオチドの合成を必要とする。
。１つの方法は、ウィルスのＤＮＡ鋳型または組換え型
ＤＮＡ中へ、ヌクレオチド配列内に予め選択された変化
をコード化する合成オリゴヌクレオチドを挿入すること
を含むものである。この方法は、有効でありかつ塩基置
換変異の任意のタイプを製造できるものでおるが、導入
されるそれぞれ異なる変異は、該変異をコード化し、か
つウィルスのもしくは組換ＤＮＡにおいて生成されるべ
き付着端に対して相補性である非反復［ｕｎｉｑｕｅｌ
オリゴヌクレオチドの合成を必要とする。
第２の方法（ジョートルら、１９８０年、プロシーディ
ング オブ デ ナショナル アカデミ−オブ サイエ
ンシズ オブ ザ ユ犬イテッド ステート オブ ア
メリカ ＬＬ：５３７５〜５３７９ ［５ｈｏｒｔｌｅ
ｅｔ ａｌ、、１９８０．Ｐｒｏｃ。
ング オブ デ ナショナル アカデミ−オブ サイエ
ンシズ オブ ザ ユ犬イテッド ステート オブ ア
メリカ ＬＬ：５３７５〜５３７９ ［５ｈｏｒｔｌｅ
ｅｔ ａｌ、、１９８０．Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ Ｔγ：５３γ５
−５３７９］）は、ＤＮＡ分子中に微小な一重鎖ギャッ
プを導入し、−その後に誤対合ＤＮＡ合成［ｍ１ｓ−ｒ
ｅｐａｉｒ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓｌ、すなわち
該ギャップにおける非相補性ヌクレオチドの誤った取込
み［ｍ１ｓ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］を伴なうこ
とを含むものである。ギャップ中へのα−チオール ヌ
クレオチドの取込みは、非相補性ヌクレオチドの切断を
最小化する。リン上の酸素の代わりに硫黄原子を含むデ
オキシリボヌクレオシド（１−チオ）−三リン酸類似体
が、鋳型ＤＮＡに相補性であるＤＮＡ鎖の合成に関する
基質として用いられた場合、該類似体は、相応する非修
飾ヌクレオシド三リン酸のものと同様な割合で、チオモ
ノホスフェートとして取込まれる。しかしながら該ホス
フォロチエートは、エシェリキア・コリＤＮＡポリメラ
ーゼ■あるいはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３°→５
°エキソヌクレアーゼ活性によって加水分解されず、こ
れゆえ誤対合した塩基は、修正されない。アバルズアら
［Ａｂａｒｚｕａ ｅｔ ａｌ。１（１９７４，Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１ ：２０３０−
２０３４）は、ウィルスの一重鎖環状ＤＮＡを、エシェ
リキア・コリエキソヌクレアーゼ■で順次消化された３
−ヒドロキシル末端を有する線状二重鎖Ｄ’ＮＡの混合
物と、種々のハイブリッド分子に存在する、得られる、
新たに生成する３−ヒドロキシル末端が関心の領域にお
よぶ［５ｐａｎ１条件下で、アニーリングすることによ
って生成されたギャップ化環状ＤＮＡを用いる、この技
術の修正を報告している。
−５３７９］）は、ＤＮＡ分子中に微小な一重鎖ギャッ
プを導入し、−その後に誤対合ＤＮＡ合成［ｍ１ｓ−ｒ
ｅｐａｉｒ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓｌ、すなわち
該ギャップにおける非相補性ヌクレオチドの誤った取込
み［ｍ１ｓ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］を伴なうこ
とを含むものである。ギャップ中へのα−チオール ヌ
クレオチドの取込みは、非相補性ヌクレオチドの切断を
最小化する。リン上の酸素の代わりに硫黄原子を含むデ
オキシリボヌクレオシド（１−チオ）−三リン酸類似体
が、鋳型ＤＮＡに相補性であるＤＮＡ鎖の合成に関する
基質として用いられた場合、該類似体は、相応する非修
飾ヌクレオシド三リン酸のものと同様な割合で、チオモ
ノホスフェートとして取込まれる。しかしながら該ホス
フォロチエートは、エシェリキア・コリＤＮＡポリメラ
ーゼ■あるいはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３°→５
°エキソヌクレアーゼ活性によって加水分解されず、こ
れゆえ誤対合した塩基は、修正されない。アバルズアら
［Ａｂａｒｚｕａ ｅｔ ａｌ。１（１９７４，Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１ ：２０３０−
２０３４）は、ウィルスの一重鎖環状ＤＮＡを、エシェ
リキア・コリエキソヌクレアーゼ■で順次消化された３
−ヒドロキシル末端を有する線状二重鎖Ｄ’ＮＡの混合
物と、種々のハイブリッド分子に存在する、得られる、
新たに生成する３−ヒドロキシル末端が関心の領域にお
よぶ［５ｐａｎ１条件下で、アニーリングすることによ
って生成されたギャップ化環状ＤＮＡを用いる、この技
術の修正を報告している。
塩基変更は、ミスマツチの［ｍｉｓ−ｍａｔｃｈｅｄ］
２−チオデオキシリボヌクレオシド三リン酸類似体の
取込みによって誘発され、ＤＮＡ修復合成に続く。
２−チオデオキシリボヌクレオシド三リン酸類似体の
取込みによって誘発され、ＤＮＡ修復合成に続く。
用いられた第３の方法は、あるＤＮＡポリメラーゼの不
義［１ｎｆｉｄｅｌｉｔｙｌに基づくものであり、シン
グルな［ｓｉｎｇｌｅｌ非相補性デオキシヌクレオシド
三リン酸の存在下における非プルーフリーデングＤＮＡ
ポリメラーゼによるプライマーの伸長を含み、この後、
合成は、４つのデオキシヌクレオチド基質のすべての存
在下において、かなり精密なりＮＡポリメラーゼにより
完了される。この方法の経正において、ザコーら［Ｚａ
ｋｏｕｒ ｅｔ ａｌ、］（１９８４年、ヌクレイツク
アシツズ リサーチ １２ （１６） ：６６
１５〜６６２８ ［１９８４゜Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １２（１６）：６６１５−６
６２８］）は、ΦＸ１７４鋳型上の予め選択された２つ
の異なる位置に直接隣接した１つの位置へ、プライマー
末端を伸長するために、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを
用いた。次に、ニワトリ骨髄芽球腫ウィルス由来のエラ
ー傾向性（［ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅｌ 、誤りがちな
〉ＤＮＡポリメラーゼが、指定され位置に高い効率でシ
ングルな非相補性ヌクレオチドを挿入するために用いら
れた。
義［１ｎｆｉｄｅｌｉｔｙｌに基づくものであり、シン
グルな［ｓｉｎｇｌｅｌ非相補性デオキシヌクレオシド
三リン酸の存在下における非プルーフリーデングＤＮＡ
ポリメラーゼによるプライマーの伸長を含み、この後、
合成は、４つのデオキシヌクレオチド基質のすべての存
在下において、かなり精密なりＮＡポリメラーゼにより
完了される。この方法の経正において、ザコーら［Ｚａ
ｋｏｕｒ ｅｔ ａｌ、］（１９８４年、ヌクレイツク
アシツズ リサーチ １２ （１６） ：６６
１５〜６６２８ ［１９８４゜Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １２（１６）：６６１５−６
６２８］）は、ΦＸ１７４鋳型上の予め選択された２つ
の異なる位置に直接隣接した１つの位置へ、プライマー
末端を伸長するために、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを
用いた。次に、ニワトリ骨髄芽球腫ウィルス由来のエラ
ー傾向性（［ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅｌ 、誤りがちな
〉ＤＮＡポリメラーゼが、指定され位置に高い効率でシ
ングルな非相補性ヌクレオチドを挿入するために用いら
れた。
［３０発明の概要］
本発明は、放射活性またはゲル電気泳動法を必要としな
い、ＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定するための新規なオ
ートメーション可能な方法を示すものである。この方法
はまた、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の部位特異的変
異生成を行なうために用いられ得る。
い、ＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定するための新規なオ
ートメーション可能な方法を示すものである。この方法
はまた、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の部位特異的変
異生成を行なうために用いられ得る。
本発明の配列決定法は、既知の窒素含有塩基を有する１
つの活性化ヌクレオチド前駆体くヌクレオシド５−三リ
ン酸を、配列決定されるべき１つのプライマー起動され
た［ｐｒｉｍｅｄｌ−重鎮ヌクレオチド鋳型と１つの鋳
型依存性ポリメラーゼ（［ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｌ、鋳型に指示されたポリメラ
ーゼ）からなる反応混合物中゛へ添加することを含むも
のである。反応条件は、プライマーの３゛末端から１ヌ
クレオチド残基向こうに位置した部位で一重鎖鋳型に相
補性である場合にのみ、ヌクレオチド前駆体の取込みが
許されるように調整される。反応が起こるのに充分な時
間が経過した後、反応混合物は、取込まれなかった前駆
体が除去され、一方プライマー起動された鋳型およびポ
リメラーゼは反応混合物中に保たれるように、洗浄され
る。洗浄液ないし流出液は、前駆体の取込みに関して検
定される。流出液中の取込まれなかった前駆体の検知の
ために用いられ得る方法は、分光法、放射性標識および
計数、電気化学的方法ならびに伝導率法が含まれるが、
これらに限定ざれるものではない。反応混合物中に添加
された流出液中のヌクレオチド前駆体のすべての検知は
、添加された前駆体が、成長する鎖中に取込まれなかっ
たこと、およびそれゆえにヌクレオチド配列の一部でな
いことを示すものでおる。しかしながら、添加されたも
のよりも少ないヌクレオチド前駆体が流出液中に検知さ
れた場合には、これは、添加された前駆体が成長する鎖
中に取込まれたこと、およびそれゆえに、該配列の次の
ヌクレオチドであることを示すものである。
つの活性化ヌクレオチド前駆体くヌクレオシド５−三リ
ン酸を、配列決定されるべき１つのプライマー起動され
た［ｐｒｉｍｅｄｌ−重鎮ヌクレオチド鋳型と１つの鋳
型依存性ポリメラーゼ（［ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｌ、鋳型に指示されたポリメラ
ーゼ）からなる反応混合物中゛へ添加することを含むも
のである。反応条件は、プライマーの３゛末端から１ヌ
クレオチド残基向こうに位置した部位で一重鎖鋳型に相
補性である場合にのみ、ヌクレオチド前駆体の取込みが
許されるように調整される。反応が起こるのに充分な時
間が経過した後、反応混合物は、取込まれなかった前駆
体が除去され、一方プライマー起動された鋳型およびポ
リメラーゼは反応混合物中に保たれるように、洗浄され
る。洗浄液ないし流出液は、前駆体の取込みに関して検
定される。流出液中の取込まれなかった前駆体の検知の
ために用いられ得る方法は、分光法、放射性標識および
計数、電気化学的方法ならびに伝導率法が含まれるが、
これらに限定ざれるものではない。反応混合物中に添加
された流出液中のヌクレオチド前駆体のすべての検知は
、添加された前駆体が、成長する鎖中に取込まれなかっ
たこと、およびそれゆえにヌクレオチド配列の一部でな
いことを示すものでおる。しかしながら、添加されたも
のよりも少ないヌクレオチド前駆体が流出液中に検知さ
れた場合には、これは、添加された前駆体が成長する鎖
中に取込まれたこと、およびそれゆえに、該配列の次の
ヌクレオチドであることを示すものである。
本発明の配列決定法は、容易にオートメーション化され
る。例えば、反応室は、反応室へ供給する５つの貯蔵器
（それぞれのヌクレオチド前駆体だめのものおよび１つ
の洗浄緩衝液のためのもの）に付着され得る。反応容器
はまた、検定のために用いられる検知装置、例えば分光
測光器、シンチレーションカウンター、ガイガーーミュ
ーラーカウンター、伝導率ないしは電気化学的セルなど
、中に流出液を供給する出口をまた有すべきである。
る。例えば、反応室は、反応室へ供給する５つの貯蔵器
（それぞれのヌクレオチド前駆体だめのものおよび１つ
の洗浄緩衝液のためのもの）に付着され得る。反応容器
はまた、検定のために用いられる検知装置、例えば分光
測光器、シンチレーションカウンター、ガイガーーミュ
ーラーカウンター、伝導率ないしは電気化学的セルなど
、中に流出液を供給する出口をまた有すべきである。
理想的に、検定装置および、反応室の入口および出口を
調整するバルブは、反応混合物に添加されるべき特定の
ヌクレオチド前駆体を選択すること、流出液の該装置の
読みを記録すること、および成長する鎖中にどのヌクレ
オチドが取込まれたかを決定し、そして記録し、これに
よりヌクレオチド配列の印刷出力を最終的に与えること
をプログラムされたコンピューターによって制御され得
る。
調整するバルブは、反応混合物に添加されるべき特定の
ヌクレオチド前駆体を選択すること、流出液の該装置の
読みを記録すること、および成長する鎖中にどのヌクレ
オチドが取込まれたかを決定し、そして記録し、これに
よりヌクレオチド配列の印刷出力を最終的に与えること
をプログラムされたコンピューターによって制御され得
る。
本発明の配列決定法は、既在の方法にまざるいくつかの
利点を有している： （ａ）放射性標識が必要とされない（しかしながら、こ
れらを用いることは可能である〉 ；（ｂ）ナイスによ
るポリヌクレオチドの分画か必要とされない； （ｃ）ゲル電気泳動が必要とされず、これゆえ、配列決
定ゲルにおけるバンドないしラダーを読むことにより推
論することを、配列が必要としない：および （ｄ）配列情報は、反応進行時に得られ、これゆえ配列
決定の間にふるい別けられることを、結果に許容するこ
と。
利点を有している： （ａ）放射性標識が必要とされない（しかしながら、こ
れらを用いることは可能である〉 ；（ｂ）ナイスによ
るポリヌクレオチドの分画か必要とされない； （ｃ）ゲル電気泳動が必要とされず、これゆえ、配列決
定ゲルにおけるバンドないしラダーを読むことにより推
論することを、配列が必要としない：および （ｄ）配列情報は、反応進行時に得られ、これゆえ配列
決定の間にふるい別けられることを、結果に許容するこ
と。
本発明の他の実ｉ態様において、配列決定法の変更は、
配列内における特定のヌクレオチド部位で、ＤＮＡまた
はＲＮＡを変容するないしは変異生成するために用いら
れ得る。この実施態様において、部位特異的変異生成は
次のようにして達成される。鋳型鎖に相補性のヌクレオ
チド鎖の単段階合成が、鋳型鎖が既知のヌクレオチド配
列であることを除いて、ＤＮＡ配列決定に関して上記に
述べたようにして行なわれる。鋳型のヌクレオチド配列
が既知であるゆえ、一段一段添加されるヌクレオチド前
駆体の順序は既知でおる。合成は、変えられるべき残基
の前のヌクレオチド残基で停止される。反応混合物へ添
加される次のヌクレオチド前駆体は、反応室における反
応条件下においてポリメラーゼによって修正され得ない
もので市って、このヌクレオチド塩基は配列において望
まれる変異である。該ヌクレオチドは、誤対合される（
すなわち、塩基は、その残基において鋳型鎖に相補性で
ない。〉が、該ヌクレオチドは、成長する鎖中に取込ま
れ、そして鋳型依存性ポリメラーゼによって修正されな
いであろう。望まれる部位特異的変異のそれぞれが行な
われた後に、ＤＮＡまたはＲＮＡの残りの部分の合成は
段階的様式における進行を必要としないゆえ、４つの活
性化ヌクレオチド前駆体のすべてか反応混合物に添加さ
れ、伸長が完了する。
配列内における特定のヌクレオチド部位で、ＤＮＡまた
はＲＮＡを変容するないしは変異生成するために用いら
れ得る。この実施態様において、部位特異的変異生成は
次のようにして達成される。鋳型鎖に相補性のヌクレオ
チド鎖の単段階合成が、鋳型鎖が既知のヌクレオチド配
列であることを除いて、ＤＮＡ配列決定に関して上記に
述べたようにして行なわれる。鋳型のヌクレオチド配列
が既知であるゆえ、一段一段添加されるヌクレオチド前
駆体の順序は既知でおる。合成は、変えられるべき残基
の前のヌクレオチド残基で停止される。反応混合物へ添
加される次のヌクレオチド前駆体は、反応室における反
応条件下においてポリメラーゼによって修正され得ない
もので市って、このヌクレオチド塩基は配列において望
まれる変異である。該ヌクレオチドは、誤対合される（
すなわち、塩基は、その残基において鋳型鎖に相補性で
ない。〉が、該ヌクレオチドは、成長する鎖中に取込ま
れ、そして鋳型依存性ポリメラーゼによって修正されな
いであろう。望まれる部位特異的変異のそれぞれが行な
われた後に、ＤＮＡまたはＲＮＡの残りの部分の合成は
段階的様式における進行を必要としないゆえ、４つの活
性化ヌクレオチド前駆体のすべてか反応混合物に添加さ
れ、伸長が完了する。
本発明のこの実施態様において用いられる反応室および
貯蔵器は、１つの余分な貯蔵器が必要とされる以外は、
上記のＤＮＡ配列決定に関して）小べたものと同様のも
のである。本発明の部位特異的変異生成法は、オートメ
ーション可能であり、またコンピューターによって制御
され得るものである。この場合において、コンピュータ
ーは、固有の順序において既知の配列のそれぞれのヌク
レオチドを添加すること、それぞれのヌクレオチドが取
込まれたことを確証するために流出液の装置の読みを記
録すること、ミスマツチの類似体を次に添加すること、
ならびに最後に、反応混合物中へ４つのヌクレオチドの
すべてを添加することをプログラムされている。
貯蔵器は、１つの余分な貯蔵器が必要とされる以外は、
上記のＤＮＡ配列決定に関して）小べたものと同様のも
のである。本発明の部位特異的変異生成法は、オートメ
ーション可能であり、またコンピューターによって制御
され得るものである。この場合において、コンピュータ
ーは、固有の順序において既知の配列のそれぞれのヌク
レオチドを添加すること、それぞれのヌクレオチドが取
込まれたことを確証するために流出液の装置の読みを記
録すること、ミスマツチの類似体を次に添加すること、
ならびに最後に、反応混合物中へ４つのヌクレオチドの
すべてを添加することをプログラムされている。
［４０発明の詳）ホコ
本発明は、オートメーション可能であり、かつ放射活性
またはゲル電気泳動を必要としない、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａを配列決定するための新たな方法を示すものである。
またはゲル電気泳動を必要としない、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａを配列決定するための新たな方法を示すものである。
加えて、本発明はＤＮＡまたはＲＮＡ配列の部位特異的
変異生成のための方法を含むものである。
変異生成のための方法を含むものである。
（４，１，配列決定）
本発明の配列決定法は次のことを含むものである。配列
決定されるべき−ｆｆｉ鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、
特異的部位において、短いオリゴヌクレオチドプライマ
ーで起動［ｐｒｉｍｅ］される。
決定されるべき−ｆｆｉ鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、
特異的部位において、短いオリゴヌクレオチドプライマ
ーで起動［ｐｒｉｍｅ］される。
プライマー起動された鋳型および鋳型依存性ポリメラー
ゼは、未反応のヌクレオチド前駆体の、プライマー起動
された鋳型および鋳型依存性ポリメラーゼからの分離を
許容する反応室中へ入れられる。鋳型が一重鎖ＤＮＡ分
子である場合、Ｄ’Ｎ△依存性ＤＮＡポリメラーゼまた
はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが用いられ得る。鋳
型が一重鎖ＲＮＡ分子でおる場合、逆転写酵素（すなわ
ち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ〉が用いられ得る
。
ゼは、未反応のヌクレオチド前駆体の、プライマー起動
された鋳型および鋳型依存性ポリメラーゼからの分離を
許容する反応室中へ入れられる。鋳型が一重鎖ＤＮＡ分
子である場合、Ｄ’Ｎ△依存性ＤＮＡポリメラーゼまた
はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが用いられ得る。鋳
型が一重鎖ＲＮＡ分子でおる場合、逆転写酵素（すなわ
ち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ〉が用いられ得る
。
一度に１つずつの、特定な活性化ヌクレオチド前駆体が
反応室に添加され、そして反応することが許される。添
加されるヌクレオチドは、反応混合物中に用いられた鋳
型およびポリメラーゼの性質に依存してデオキシリボヌ
クレオチドかり小ヌクレオチドのいずれかであり得る。
反応室に添加され、そして反応することが許される。添
加されるヌクレオチドは、反応混合物中に用いられた鋳
型およびポリメラーゼの性質に依存してデオキシリボヌ
クレオチドかり小ヌクレオチドのいずれかであり得る。
例えば、鋳型が一重鎖ＤＮＡ分子である場合、用いられ
るポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであ
り得、この場合においては添加されるヌクレオチドはデ
オキシリボヌクレオチドであるべきである。
るポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであ
り得、この場合においては添加されるヌクレオチドはデ
オキシリボヌクレオチドであるべきである。
二重鎖ＤＮＡが用いられる場合、ポリメラーゼはＤＮＡ
依存性ＲＮＡポリメラーゼであり１ｑ、この場合におい
ては、添加されるヌクレオチドはり小ヌクレオチドであ
るべきである。同様に、鋳型が４鎖ＲＮＡ分子でおる場
合、用いられるポリメラーゼは逆転写酵素、ずなわちＲ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでおり、この場合におい
ては、添加されるヌクレオチドは、デオキシリボヌクレ
オチドでなければならない。しかしながら、いずれの場
合においても、一度には１つのタイプのヌクレオチドの
みが添加される。例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ市るいはｄＣＴＰのいずれかが反応に添加されるが、
これらのデオキシリボヌクレオチドの混合物は添加され
久公。同様に、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰあるいはＣＴＰ
のいずれかか反応に添加されるが、これらのり小ヌクレ
オチドの混合物は添加され姪。
依存性ＲＮＡポリメラーゼであり１ｑ、この場合におい
ては、添加されるヌクレオチドはり小ヌクレオチドであ
るべきである。同様に、鋳型が４鎖ＲＮＡ分子でおる場
合、用いられるポリメラーゼは逆転写酵素、ずなわちＲ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでおり、この場合におい
ては、添加されるヌクレオチドは、デオキシリボヌクレ
オチドでなければならない。しかしながら、いずれの場
合においても、一度には１つのタイプのヌクレオチドの
みが添加される。例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ市るいはｄＣＴＰのいずれかが反応に添加されるが、
これらのデオキシリボヌクレオチドの混合物は添加され
久公。同様に、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰあるいはＣＴＰ
のいずれかか反応に添加されるが、これらのり小ヌクレ
オチドの混合物は添加され姪。
添加されたヌクレオチド前駆体の塩基が鋳型に相補性で
おる場合、すなわち、該ヌクレオチド前駆体が、プライ
マー鎖の３°末端から１ヌクレオチド残基向こうに位置
する部位で鋳型とワトソンークリック型塩基対を形成し
得る場合、該ヌクレオチド前駆体は、成長する鎖中へ取
込まれるであろう。ヌクレオチド前駆体の塩基が、プラ
イマー鎖の３°末端から１ヌクレオチド残基向こうに位
置する部位で鋳型に相補性で・よい場合、該ヌクレオチ
ド前駆体は、成長する鎖中へ取込まれないであろう。ポ
リメラーゼ反応が生起するのに充分な時間がもたらされ
た後、反応室は、プライマー起動された鋳型から未反応
のヌクレオチド前駆体を分離するために「洗浄」される
。次に洗浄液ないし流出液は、流出液にあけるヌクレオ
チド前駆体の通を測定するために検定される。流出液中
の取込まれなかった前駆体を検知するために用いられ得
る方法は、吸収もしくは螢光分光のよう゛な分光学的方
法、放射性標識および計数（ヌクレオチド前駆体が放射
標識される場合）、ならびに電気化学的もしくは伝導率
法を含むものであるが、これらに限定されるものではな
い。
おる場合、すなわち、該ヌクレオチド前駆体が、プライ
マー鎖の３°末端から１ヌクレオチド残基向こうに位置
する部位で鋳型とワトソンークリック型塩基対を形成し
得る場合、該ヌクレオチド前駆体は、成長する鎖中へ取
込まれるであろう。ヌクレオチド前駆体の塩基が、プラ
イマー鎖の３°末端から１ヌクレオチド残基向こうに位
置する部位で鋳型に相補性で・よい場合、該ヌクレオチ
ド前駆体は、成長する鎖中へ取込まれないであろう。ポ
リメラーゼ反応が生起するのに充分な時間がもたらされ
た後、反応室は、プライマー起動された鋳型から未反応
のヌクレオチド前駆体を分離するために「洗浄」される
。次に洗浄液ないし流出液は、流出液にあけるヌクレオ
チド前駆体の通を測定するために検定される。流出液中
の取込まれなかった前駆体を検知するために用いられ得
る方法は、吸収もしくは螢光分光のよう゛な分光学的方
法、放射性標識および計数（ヌクレオチド前駆体が放射
標識される場合）、ならびに電気化学的もしくは伝導率
法を含むものであるが、これらに限定されるものではな
い。
以上に述べたプロセスは、次のようにしてオートメーシ
ョン化され得る。反応室は、反応掌中へ供給する５つの
貯蔵至（その１つは、洗浄用緩衝液を含み、また他の４
つはそれぞれ１つの特定のヌクレオチド前駆体を含む。
ョン化され得る。反応室は、反応掌中へ供給する５つの
貯蔵至（その１つは、洗浄用緩衝液を含み、また他の４
つはそれぞれ１つの特定のヌクレオチド前駆体を含む。
）に接続され得る。
反応室はまた、１つの出口バルブを有すべきで必り、こ
れによって、１つの特定のヌクレオチド前駆体の添加お
よび適切な反応時間の経過の後に、流出液が該出口バル
ブを通って、検定において用いられる検知装置のフロー
セル［ｆ １ｏｖｕ−ｃｅｌ ｌ ］中に移動するよう
に反応室が洗浄され得るものとなる。
れによって、１つの特定のヌクレオチド前駆体の添加お
よび適切な反応時間の経過の後に、流出液が該出口バル
ブを通って、検定において用いられる検知装置のフロー
セル［ｆ １ｏｖｕ−ｃｅｌ ｌ ］中に移動するよう
に反応室が洗浄され得るものとなる。
本発明のこの実施態様の種々の構成要素が第１図におい
て図式的に説明される。貯蔵器および検出器は、どのヌ
クレオチド塩基が反応室に添加されたかを、また得られ
た流出液の検出器の読みを記録するコンピューターに接
続され得る。理想的に、該コンピューターは、どのヌク
レオチド前駆体を次に反応室中へ供給すべきか選択する
こと、および取込まれたヌクレオチドを記録し、これに
より、配列の印刷出力を最終的に与えることをプログラ
ムされることができる。
て図式的に説明される。貯蔵器および検出器は、どのヌ
クレオチド塩基が反応室に添加されたかを、また得られ
た流出液の検出器の読みを記録するコンピューターに接
続され得る。理想的に、該コンピューターは、どのヌク
レオチド前駆体を次に反応室中へ供給すべきか選択する
こと、および取込まれたヌクレオチドを記録し、これに
より、配列の印刷出力を最終的に与えることをプログラ
ムされることができる。
（４，２，部位特異的変異生成）
本発明の第２の実施態様において、配列決定法の変更が
、任意のヌクレオチド配列の部位特異的変異生成の基礎
として用いられ得る。本発明のこの様式によると、特異
的部位で変異生成されるべき既知配列を有する一重鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡは、短いオリゴヌクレオチドプライマ
ーで起動される。
、任意のヌクレオチド配列の部位特異的変異生成の基礎
として用いられ得る。本発明のこの様式によると、特異
的部位で変異生成されるべき既知配列を有する一重鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡは、短いオリゴヌクレオチドプライマ
ーで起動される。
このプライマー起動された鋳型および鋳型依存性ポリメ
ラーゼは、該プライマー起動された鋳型およびポリメラ
ーゼからの未反応ヌクレオチド前駆体の分離を許す反応
室に入れられる。鋳型か一重鎖ＤＮＡ分子であると、Ｄ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメラーセが用いられ得、また鋳型が一重鎖ＲＮＡ
分子でおると、逆転写酵素（すなわち、ＲＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ）が用いられ得る。
ラーゼは、該プライマー起動された鋳型およびポリメラ
ーゼからの未反応ヌクレオチド前駆体の分離を許す反応
室に入れられる。鋳型か一重鎖ＤＮＡ分子であると、Ｄ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメラーセが用いられ得、また鋳型が一重鎖ＲＮＡ
分子でおると、逆転写酵素（すなわち、ＲＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ）が用いられ得る。
既知配列のそれぞれの活性化ヌクレオチド前駆体が、反
応室へ添加され反応がなされる。添加されるヌクレオチ
ドは、反応混合物中に用いられた鋳型およびポリメラー
ゼの性質に依存して、デオキシリボヌクレオチドあるい
はりポヌクレオチドのいずれかであり得る。例えば、鋳
型か一重鎖ＤＮＡ分子である場合、用いられるポリメラ
ーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得、こ
の場合、添加されるヌクレオチドはデオキシリボヌクレ
オチドであるべきである。同様に、鋳型が一重鎖ＲＮＡ
分子である場合、用いられるポリメラーゼは逆転写酵素
、すなわちＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるが、
この場合において添加されるヌクレオチドは、デオキシ
リボヌクレオチドでなければならない。あるいはまた、
特殊機能ＲＮＡポリメラーゼが有用であるプロモーター
（すなわち、Ｔ７ プロモーターおよびポリメラーゼ）
を含む二重鎖ＤＮＡ鋳型が用いられた場合、添加される
ヌクレオチドは、リボヌクレオチドであるべきである。
応室へ添加され反応がなされる。添加されるヌクレオチ
ドは、反応混合物中に用いられた鋳型およびポリメラー
ゼの性質に依存して、デオキシリボヌクレオチドあるい
はりポヌクレオチドのいずれかであり得る。例えば、鋳
型か一重鎖ＤＮＡ分子である場合、用いられるポリメラ
ーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得、こ
の場合、添加されるヌクレオチドはデオキシリボヌクレ
オチドであるべきである。同様に、鋳型が一重鎖ＲＮＡ
分子である場合、用いられるポリメラーゼは逆転写酵素
、すなわちＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるが、
この場合において添加されるヌクレオチドは、デオキシ
リボヌクレオチドでなければならない。あるいはまた、
特殊機能ＲＮＡポリメラーゼが有用であるプロモーター
（すなわち、Ｔ７ プロモーターおよびポリメラーゼ）
を含む二重鎖ＤＮＡ鋳型が用いられた場合、添加される
ヌクレオチドは、リボヌクレオチドであるべきである。
本発明の一実施態様においては、一度には一つのタイプ
のヌクレオチドのみが添加される。例えば、ｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰあるいはｄＣＴＰのいずれかが、反
応に添加されるが、これらのデオキシリボヌクレオチド
の混合物は添加され望見。同様に、ＡＴＰ、ＬＪＴＰ、
ＧＴＰあるいはＣＴＰのいずれかが、反応に添加される
が、これらのりポヌクレオチドの混合物は添加されＡ
ＣＩＮ。この方法の第２の実施態様においては、一度に
３つまでのヌクレオチドが、合成を迅速化するために添
加され得る。このアプローチは、鋳型の配列が既知であ
るゆえに容易である。
のヌクレオチドのみが添加される。例えば、ｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰあるいはｄＣＴＰのいずれかが、反
応に添加されるが、これらのデオキシリボヌクレオチド
の混合物は添加され望見。同様に、ＡＴＰ、ＬＪＴＰ、
ＧＴＰあるいはＣＴＰのいずれかが、反応に添加される
が、これらのりポヌクレオチドの混合物は添加されＡ
ＣＩＮ。この方法の第２の実施態様においては、一度に
３つまでのヌクレオチドが、合成を迅速化するために添
加され得る。このアプローチは、鋳型の配列が既知であ
るゆえに容易である。
ポリメラーゼ反応が生起するのに充分な時間がもたらさ
れた後、反応容器は、プライマー起動された鋳型から未
反応のヌクレオチド前駆体を分離するために、「洗浄」
される。次に洗浄液ないし流出液は、ヌクレオチドが、
実際に、成長する鎖中へ取込まれたことを確証するため
に、流出液中のヌクレオチド前駆体の存在または不在を
測定するために検定され得る。流出液中の取込まれなか
った前駆体を検出するために用いられ得る方法には、吸
光または螢光分光のような分光学的方法、放射性標識お
よび計数（ヌクレオチド前駆体が放射性標識されること
を与える）、および電気化学的または伝導率方法が含ま
れるが、これらに限定されるものではない。
れた後、反応容器は、プライマー起動された鋳型から未
反応のヌクレオチド前駆体を分離するために、「洗浄」
される。次に洗浄液ないし流出液は、ヌクレオチドが、
実際に、成長する鎖中へ取込まれたことを確証するため
に、流出液中のヌクレオチド前駆体の存在または不在を
測定するために検定され得る。流出液中の取込まれなか
った前駆体を検出するために用いられ得る方法には、吸
光または螢光分光のような分光学的方法、放射性標識お
よび計数（ヌクレオチド前駆体が放射性標識されること
を与える）、および電気化学的または伝導率方法が含ま
れるが、これらに限定されるものではない。
段階的添加およびそれぞれのヌクレオチドのもしくは、
３つまでのヌクレオチドのグループの反応は続（プられ
、そして最後に、変異生成されるべき残基の前にあるヌ
クレオチド位置で停止される。
３つまでのヌクレオチドのグループの反応は続（プられ
、そして最後に、変異生成されるべき残基の前にあるヌ
クレオチド位置で停止される。
反応混合物に添加される次のヌクレオチドは、反応室に
おける条件下において、該ポリメラーゼにより伸長する
鎖から修正され得ないヌクレオチドである。例えば、該
ヌクレオチドは、該ポリメラーゼにより修正され得ない
類似体である。この類似体塩基は、配列において望まれ
る変異である。
おける条件下において、該ポリメラーゼにより伸長する
鎖から修正され得ないヌクレオチドである。例えば、該
ヌクレオチドは、該ポリメラーゼにより修正され得ない
類似体である。この類似体塩基は、配列において望まれ
る変異である。
該類似体は、類似体塩基が鋳型におけるヌクレオチド残
基とワトソンークリック型塩基対を、形成しないもので
はあるが、変異生成されるために成長する鎖中に取込ま
れ、そしてこの誤対合した類似体は、成長する鎖から修
正されないであろう。
基とワトソンークリック型塩基対を、形成しないもので
はあるが、変異生成されるために成長する鎖中に取込ま
れ、そしてこの誤対合した類似体は、成長する鎖から修
正されないであろう。
ポリメラーゼ反応が生起するのに充分な時間がもたらさ
れた後、反応室は洗浄され、そして流出液が、類似体の
取込みを確証するために検定され得る。所望の部位特異
的変異生成が達成された後は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子
の残りの部分の合成は段階的様式において進行する必要
がなく、それゆえ、伸長を完了するために、４つの非修
飾ヌクレオチド前駆体のすべてが反応混合物に添加され
る。本発明の実施態様の一実施例が第３図に描かれる。
れた後、反応室は洗浄され、そして流出液が、類似体の
取込みを確証するために検定され得る。所望の部位特異
的変異生成が達成された後は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子
の残りの部分の合成は段階的様式において進行する必要
がなく、それゆえ、伸長を完了するために、４つの非修
飾ヌクレオチド前駆体のすべてが反応混合物に添加され
る。本発明の実施態様の一実施例が第３図に描かれる。
本発明において用いられ得るヌクレオチド類似体には、
リン上の１つの酸素原子の代わりに１つの硫黄原子を含
むデオキシリボヌクレオシド（１−チオ）−三リン酸が
包含される。これらの類似体は、相応する非修飾ヌクレ
オシド三リン酸のものと同様の割合でチオモノホスフェ
−１・とじて取込まれる。しかしながら該ホスノオロチ
ェート結合は、エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼ
エもしくはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３゛→５′エ
キソヌクレアーゼによって加水分解されず、それゆえ、
誤対合された塩基としての類似体の取込みは、修正され
得ない。他の類似体も、本発明のこの実施態様の実施に
おいて使用され得る。
リン上の１つの酸素原子の代わりに１つの硫黄原子を含
むデオキシリボヌクレオシド（１−チオ）−三リン酸が
包含される。これらの類似体は、相応する非修飾ヌクレ
オシド三リン酸のものと同様の割合でチオモノホスフェ
−１・とじて取込まれる。しかしながら該ホスノオロチ
ェート結合は、エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼ
エもしくはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３゛→５′エ
キソヌクレアーゼによって加水分解されず、それゆえ、
誤対合された塩基としての類似体の取込みは、修正され
得ない。他の類似体も、本発明のこの実施態様の実施に
おいて使用され得る。
上述したこのプロセスは、以下のようにしてオートメー
ション化され得る。反応室は、該反応室中へ供給する５
つの貯Ｒ器（その１つは洗浄用緩衝液を含んでおり、ま
た、他の４つのそれぞれは１つの特定のヌクレオチド前
駆体を含む。）に接続されることができる。ざらに、反
応室は、それぞれの類似体のための１つの貯蔵器に接続
されるべきである。反応室はまた、出口バルブを有して
おり、これによって、特定のヌクレオチド前駆体の添加
および適切な反応時間の経過の後、流出液が、検定にお
いて使用される検出装置のノロ−セル中へ、該出口バル
ブを通って移動するように該反応室が洗浄され得るもの
となる。貯蔵器および検出装置は、段階的様式において
添加されるヌクレオチドの選択を制皿し、反応室へ添加
されたそれぞれのヌクレオチド塩基の成功した取込みを
記録し、また得られた流出液の検定の読みを記録するコ
ンピューターに接続されることができる。
ション化され得る。反応室は、該反応室中へ供給する５
つの貯Ｒ器（その１つは洗浄用緩衝液を含んでおり、ま
た、他の４つのそれぞれは１つの特定のヌクレオチド前
駆体を含む。）に接続されることができる。ざらに、反
応室は、それぞれの類似体のための１つの貯蔵器に接続
されるべきである。反応室はまた、出口バルブを有して
おり、これによって、特定のヌクレオチド前駆体の添加
および適切な反応時間の経過の後、流出液が、検定にお
いて使用される検出装置のノロ−セル中へ、該出口バル
ブを通って移動するように該反応室が洗浄され得るもの
となる。貯蔵器および検出装置は、段階的様式において
添加されるヌクレオチドの選択を制皿し、反応室へ添加
されたそれぞれのヌクレオチド塩基の成功した取込みを
記録し、また得られた流出液の検定の読みを記録するコ
ンピューターに接続されることができる。
理想的に、所望の部位特異的変異ないし変異群を有する
既知のヌクレオチド配列は、簡単にコンピューター中に
供給されることができ、これゆえプロセスを容易とする
。
既知のヌクレオチド配列は、簡単にコンピューター中に
供給されることができ、これゆえプロセスを容易とする
。
以下の分節は、本発明をざらに詳細に述べるものである
。
。
（４，３，反応室および構成要素）
配列決定されるぺぎＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明にお
いて利用されるポリメラーゼ反応における鋳型として与
えられ、それゆえ、配列決定されるべき分子は一重鎖で
あるべきである。しかしながら鋳型は線状あるいは環状
であり得る。これゆえ、任意の一重鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子が本発明の方法に従って配列決定され得る。
いて利用されるポリメラーゼ反応における鋳型として与
えられ、それゆえ、配列決定されるべき分子は一重鎖で
あるべきである。しかしながら鋳型は線状あるいは環状
であり得る。これゆえ、任意の一重鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子が本発明の方法に従って配列決定され得る。
本発明の実施において用いられるプライマー、ポリメラ
ーゼおよび活性化ヌクレオチド前駆体の選択は、配列決
定される鋳型の性質に依存する。
ーゼおよび活性化ヌクレオチド前駆体の選択は、配列決
定される鋳型の性質に依存する。
例えば配列決定される鋳型がＤＮＡで、ある場合、用い
られるプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは双方の混合
物であり得る。用いられるポリメラーぜはＤＮＡ依存性
ポリメラーゼであるべきである。
られるプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは双方の混合
物であり得る。用いられるポリメラーぜはＤＮＡ依存性
ポリメラーゼであるべきである。
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが用いられる場合、デ
オキシリボヌクレオチド前駆体が反応において用いられ
るで必ろう。また、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは
、反応において用いられるためのりポヌクレオチド前駆
体を必要とする。しかしながら、配列決定されるべき鎖
がＲＮＡである場合、用いられるポリメラーゼはＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼであるべきで、この場合にお
いてはデオキシリボヌクレオチド前駆体が反応において
用いられるであろう。
オキシリボヌクレオチド前駆体が反応において用いられ
るで必ろう。また、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは
、反応において用いられるためのりポヌクレオチド前駆
体を必要とする。しかしながら、配列決定されるべき鎖
がＲＮＡである場合、用いられるポリメラーゼはＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼであるべきで、この場合にお
いてはデオキシリボヌクレオチド前駆体が反応において
用いられるであろう。
本発明のざらに別の実施態様においては、鋳型はプロモ
ーターをコード化する染色体のような二重鎖ＤＮＡ分子
であり得る。本発明のこの様式によると、ポリメラーゼ
は、プロモーターを識別し、またｍＲＮＡの転写を開始
するものであるべきである。それゆえ、用いられるヌク
レオチドはりボヌクレオチドである。
ーターをコード化する染色体のような二重鎖ＤＮＡ分子
であり得る。本発明のこの様式によると、ポリメラーゼ
は、プロモーターを識別し、またｍＲＮＡの転写を開始
するものであるべきである。それゆえ、用いられるヌク
レオチドはりボヌクレオチドである。
いずれの場合においても、用いられるポリメラーゼは、
高いレベルの正確さを有すべきである。
高いレベルの正確さを有すべきである。
すなわち、ポリメラーゼは、反応の忠実性の高いレベル
を保証するために重合の前に正しい塩基対を要求すべき
である。エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼエのよ
うないくつかのポリメラーゼは、５°→３°エキソヌク
レアーゼ活性を有するものである。本発明の１つの様式
によると、５゛→３°エキソヌクレアーゼにおいて低い
ポリメラーゼが好まれる。５°→３゛エキソヌクレアー
ゼ活性において低いポリメラーゼの一例は、エシェリキ
ア・コリＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメント
でおる。本発明の実施において用いられ得るその他のポ
リメラーゼには、ＡＭＶ逆転写酵素、エシェリキア・コ
リＲＮＡポリメラーゼおよび小麦胚ＲＮＡポリメラーセ
■が含まれるが、これらに限定されるものではない。
を保証するために重合の前に正しい塩基対を要求すべき
である。エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼエのよ
うないくつかのポリメラーゼは、５°→３°エキソヌク
レアーゼ活性を有するものである。本発明の１つの様式
によると、５゛→３°エキソヌクレアーゼにおいて低い
ポリメラーゼが好まれる。５°→３゛エキソヌクレアー
ゼ活性において低いポリメラーゼの一例は、エシェリキ
ア・コリＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメント
でおる。本発明の実施において用いられ得るその他のポ
リメラーゼには、ＡＭＶ逆転写酵素、エシェリキア・コ
リＲＮＡポリメラーゼおよび小麦胚ＲＮＡポリメラーセ
■が含まれるが、これらに限定されるものではない。
反応の容量は変更できるものでおるが、本発明の好まし
い実Ｍ態様においては、容量は１ミリリツトル以下とす
べきである。
い実Ｍ態様においては、容量は１ミリリツトル以下とす
べきである。
反応容器は、未反応ヌクレオチド前駆体かポリメラーぜ
および反応生成物から分離されるように設計されるべき
である。理想的に、反応容器は、４つのヌクレオチド前
駆体の、それぞれおよび、１ないしそれ以上の洗浄用緩
衝液が反応室中に供給され、該反応室は、洗浄液ないし
流出液中のヌクレオチドを検定するために用いられ得る
装置のフローセル中へ供給される出口を有して提供され
るように設計される。出口は、反応時間の間は閉じられ
ているが、反応の終了時点で開かれて、洗浄用緩衝液が
反応室中に供給された場合に、流出液の排除をもたらす
。
および反応生成物から分離されるように設計されるべき
である。理想的に、反応容器は、４つのヌクレオチド前
駆体の、それぞれおよび、１ないしそれ以上の洗浄用緩
衝液が反応室中に供給され、該反応室は、洗浄液ないし
流出液中のヌクレオチドを検定するために用いられ得る
装置のフローセル中へ供給される出口を有して提供され
るように設計される。出口は、反応時間の間は閉じられ
ているが、反応の終了時点で開かれて、洗浄用緩衝液が
反応室中に供給された場合に、流出液の排除をもたらす
。
おるいはまた、反応容器は、連続フローシステムの一部
であり得る。この実施態様においては、流速は、反応容
器の上流に注入されるヌクレオチド前駆体が、検出器上
へ通過する前に、ポリメラーゼおよびヌクレオチド鋳型
と反応する（これが配列における次の塩基である場合）
のに充分な時間反応容器中にあるように調整される。
であり得る。この実施態様においては、流速は、反応容
器の上流に注入されるヌクレオチド前駆体が、検出器上
へ通過する前に、ポリメラーゼおよびヌクレオチド鋳型
と反応する（これが配列における次の塩基である場合）
のに充分な時間反応容器中にあるように調整される。
反応が液体緩衝液において実行される場合は、出口バル
ブに間挿された適当な孔径を有する膜が、未反応ヌクレ
オチド前駆体が流出液と共に通過することを許容する一
方、反応生成物およびポリメラーゼを保持するように用
いられ得る。この実施態様において、選択される孔径は
、未反応ヌクレオチド前駆体の通過をなさせるのに充分
でおるが、プライマー起動された鋳型またはポリメラー
ゼを通過させない大きさとされるべきである。
ブに間挿された適当な孔径を有する膜が、未反応ヌクレ
オチド前駆体が流出液と共に通過することを許容する一
方、反応生成物およびポリメラーゼを保持するように用
いられ得る。この実施態様において、選択される孔径は
、未反応ヌクレオチド前駆体の通過をなさせるのに充分
でおるが、プライマー起動された鋳型またはポリメラー
ゼを通過させない大きさとされるべきである。
他の実施態様において、ポリメラーゼまたはプライマー
起動された鋳型は、不溶性の不活性支持体に固定化され
得、これゆえ重合反応は、不活性支持体の表面で生起す
る。プライマー起動された鋳型が固定化された場合、出
口バルブに間挿されたフリツｌ−［ｆｒｉｔ］の孔径は
、付着したＤＮＡおよびプライマーを有する支持体の通
過を阻止するのに充分に小さいものであることのみを必
要とする。
起動された鋳型は、不溶性の不活性支持体に固定化され
得、これゆえ重合反応は、不活性支持体の表面で生起す
る。プライマー起動された鋳型が固定化された場合、出
口バルブに間挿されたフリツｌ−［ｆｒｉｔ］の孔径は
、付着したＤＮＡおよびプライマーを有する支持体の通
過を阻止するのに充分に小さいものであることのみを必
要とする。
出口バルブより下にポリメラーゼを保持するために適切
なサイズの分子トラップ［ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａ
ｐｌがある。このトラップを通しての流れの逆行によっ
て、ポリメラーゼは、試みられる次のヌクレオチド前駆
体と共に反応器を逆通過する。
なサイズの分子トラップ［ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａ
ｐｌがある。このトラップを通しての流れの逆行によっ
て、ポリメラーゼは、試みられる次のヌクレオチド前駆
体と共に反応器を逆通過する。
ざらに別の実施態様において、反応容器は、反応混合物
におけるそれぞれの成分の移動を特異的に遅延する物質
を充填されたカラムを含み得る。
におけるそれぞれの成分の移動を特異的に遅延する物質
を充填されたカラムを含み得る。
多孔質膜は、列挙としては少ないが、透析膜（オ料、ニ
トロセルロースまたは酢酸セルロースのような任意の不
活性な固形材料から溝成され得る。
トロセルロースまたは酢酸セルロースのような任意の不
活性な固形材料から溝成され得る。
（４，４，反応混合物に添加されるヌクレオチド前駆体
の選択） 本発明の重合反応は、実質的にプライマー末端群のすべ
てが、同じ位置に伸長されるように同時的に進行される
べきでおる。反応のそれぞれの段階が完了へ進行したこ
とを確証するため、および得られたバックグラウンド、
ないしはノイズの読みを最小化するために、種々の予防
措置およびアプローチが取られ得る。
の選択） 本発明の重合反応は、実質的にプライマー末端群のすべ
てが、同じ位置に伸長されるように同時的に進行される
べきでおる。反応のそれぞれの段階が完了へ進行したこ
とを確証するため、および得られたバックグラウンド、
ないしはノイズの読みを最小化するために、種々の予防
措置およびアプローチが取られ得る。
（４，４，１，配列決定）
ＤＮＡを配列決定するための方法の好ましい実施態様に
おいて、ヌクレオチ下前駆体の既知過剰が反応室に添加
され、反応することをなされ、そして次に検出器を流れ
すぎた。取込まれた連続する塩基の数は、流出液中に検
知されるヌクレオチドの相対量によって決定される。例
えばｄＡＴＰの４当遵（反応室中のＤＮＡのモル量に関
して）か添加され、そして流出液信号の総和がｄＡＴＰ
の４として期待されたものの５０％であった場合、２つ
の連続するｒＡＪヌクレオチドが取込まれたことが推断
され得る。この技術は、配列にあける繰返したヌクレオ
チドを示すことおよび反応時間を短縮することを与える
。
おいて、ヌクレオチ下前駆体の既知過剰が反応室に添加
され、反応することをなされ、そして次に検出器を流れ
すぎた。取込まれた連続する塩基の数は、流出液中に検
知されるヌクレオチドの相対量によって決定される。例
えばｄＡＴＰの４当遵（反応室中のＤＮＡのモル量に関
して）か添加され、そして流出液信号の総和がｄＡＴＰ
の４として期待されたものの５０％であった場合、２つ
の連続するｒＡＪヌクレオチドが取込まれたことが推断
され得る。この技術は、配列にあける繰返したヌクレオ
チドを示すことおよび反応時間を短縮することを与える
。
ＤＮＡを配列決定するための方法の好ましい実施態様に
おいて、「誤り」いいかえれば同時的に伸長されないプ
ライマー鎖は、流出液のバックグラウンド吸収を最小化
するように、悪化する信号対ノイズ比ゆえに必要と思わ
れた場合、矯正のためのヌクレオチド前駆体の、それぞ
れの添加で屈服させられる。これは、任意の一段階に関
して反応混合物へ添加される適切なヌクレオチドの特有
な選択によって達成される。一実施態様において、誤り
を屈服させるために、プライマー鎖中に首尾よく取込ま
れた最後から二番目のヌクレオチドが、反応混合物中に
添加される次のヌクレオチド前駆体であるべきである。
おいて、「誤り」いいかえれば同時的に伸長されないプ
ライマー鎖は、流出液のバックグラウンド吸収を最小化
するように、悪化する信号対ノイズ比ゆえに必要と思わ
れた場合、矯正のためのヌクレオチド前駆体の、それぞ
れの添加で屈服させられる。これは、任意の一段階に関
して反応混合物へ添加される適切なヌクレオチドの特有
な選択によって達成される。一実施態様において、誤り
を屈服させるために、プライマー鎖中に首尾よく取込ま
れた最後から二番目のヌクレオチドが、反応混合物中に
添加される次のヌクレオチド前駆体であるべきである。
洗浄し、さらに流出液を検定した後、該ヌクレオチド前
駆体が伸長したプライマー鎖中に取り込まれなかったこ
とを測定した場合、任意の順序で、他の３つのヌクレオ
チドのそれぞれが、一度に一つずつ試され得る。信号対
ノイズ比が非常に高いものとなった場合、蓄積したノイ
ズは、伸長する鎖中に首尾よく取込まれた最後のヌクレ
オチドの添加によって矯正される。
駆体が伸長したプライマー鎖中に取り込まれなかったこ
とを測定した場合、任意の順序で、他の３つのヌクレオ
チドのそれぞれが、一度に一つずつ試され得る。信号対
ノイズ比が非常に高いものとなった場合、蓄積したノイ
ズは、伸長する鎖中に首尾よく取込まれた最後のヌクレ
オチドの添加によって矯正される。
このプロセスは、完全な配列が得られるまで必要であれ
ば繰返される。例えば、本発明の方法を用いて得られた
配列が、ｒＡＴＧ ＣＴＡＪであると決定された場合
、配列試伎において添加されるべきヌクレオチド前駆体
は、ｄＴＴＰである。
ば繰返される。例えば、本発明の方法を用いて得られた
配列が、ｒＡＴＧ ＣＴＡＪであると決定された場合
、配列試伎において添加されるべきヌクレオチド前駆体
は、ｄＴＴＰである。
従って、いくつかのプライマー鎖が今だ５番目のヌクレ
オチドＩＴＪまで伸長していない。それゆえこれらは、
反応混合物中の残りのプライマー鎖より２ヌクレオチド
残基短い場合、ｄＴＴＰの添加は、この短い方のプライ
マーを、これらが、母集団において主要なプライマー分
子より常に１ヌクレオチドだけ短いものであるよう屈服
させるであろう。結果として、「誤り」は、必要な場合
、すなわちバックグラウンドないしノイズが非常に高い
場合に、消去されるように屈服させられる。
オチドＩＴＪまで伸長していない。それゆえこれらは、
反応混合物中の残りのプライマー鎖より２ヌクレオチド
残基短い場合、ｄＴＴＰの添加は、この短い方のプライ
マーを、これらが、母集団において主要なプライマー分
子より常に１ヌクレオチドだけ短いものであるよう屈服
させるであろう。結果として、「誤り」は、必要な場合
、すなわちバックグラウンドないしノイズが非常に高い
場合に、消去されるように屈服させられる。
誤りは、次にｄＡＴＰの添加を繰返すことによって、上
記の例において正されることができる。
記の例において正されることができる。
本発明のＤＮＡを配列決定するための方法の代換的な実
施態様においては、ヌクレオチド前駆体のそれぞれの取
込みの後、同じ前駆体の追加的な吊が、すべてのプライ
マー末端が同じ位置に延長されたことをＢ認するために
添加される。この手順は、完全な配列が得られるまで繰
返される。
施態様においては、ヌクレオチド前駆体のそれぞれの取
込みの後、同じ前駆体の追加的な吊が、すべてのプライ
マー末端が同じ位置に延長されたことをＢ認するために
添加される。この手順は、完全な配列が得られるまで繰
返される。
（４，４，２，部位特異的変異生成）
ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型の配列が既知であるゆえ、ヌク
レオチド前駆体は、固有な配列において充分過剰な量で
かつ完全な反応を確証するのに充分な時間で添加される
。ヌクレオチ下前駆体は、実施例において両川されるプ
ログラムにおけるように１度にひとつづつ添加されるこ
とができ、また、３つまでのヌクレオチド前駆体が１度
に添加されることもできる。
レオチド前駆体は、固有な配列において充分過剰な量で
かつ完全な反応を確証するのに充分な時間で添加される
。ヌクレオチ下前駆体は、実施例において両川されるプ
ログラムにおけるように１度にひとつづつ添加されるこ
とができ、また、３つまでのヌクレオチド前駆体が１度
に添加されることもできる。
例えば、第３図に示される合成に関して、修飾されるべ
き部位において、正常に適合する塩基は「Ｃ」である。
き部位において、正常に適合する塩基は「Ｃ」である。
鋳型、プライマーおよびポリメラーゼの溶液に対して、
ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの過剰な渠が添加される。未反
応の前駆体を流出した後、ｄＣＴＰの過剰な吊が第３番
目の塩基までの合成を完了させるために添加される。ｄ
ＣＴＰが流出された後、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴ
ＴＰの過剰な屑が、修飾される部位までの合成を行なう
ために添加される。
ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの過剰な渠が添加される。未反
応の前駆体を流出した後、ｄＣＴＰの過剰な吊が第３番
目の塩基までの合成を完了させるために添加される。ｄ
ＣＴＰが流出された後、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴ
ＴＰの過剰な屑が、修飾される部位までの合成を行なう
ために添加される。
あるいはまた、不溶性の不活性支持体上に固定されたＤ
ＮＡ鋳型とプライマーを有するものであって、ポリメラ
ーゼがヌクレオチド前駆体と共に反応器を通過し、かつ
該ポリメラーゼは反応器の出口バルブより下の分子トラ
ップに姿いて保持されるシステムが用いられる。修飾さ
れるヌクレオチドの前の鎖の位置の合成の間は、ポリメ
ラーゼは該１〜ラツプを逆洗することによって循環され
る。しかしながら、その時点で、エラー傾向性ポリメラ
ーゼ（すなわちニワトリ骨髄芽球腫ウィルスポリメラー
ゼのようなブルー７リーデイング機能を有しないもの）
が取込まれるヌクレオチド前駆体の１当累と共に用いら
れた。エラー傾向性ポリメラーゼが反応器から流出され
た後、配列合成は、適切なヌクレオチド前駆体および循
環される高性能［ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌ ｉｔｙ］ポリ
メラーゼを用いで続けられる。
ＮＡ鋳型とプライマーを有するものであって、ポリメラ
ーゼがヌクレオチド前駆体と共に反応器を通過し、かつ
該ポリメラーゼは反応器の出口バルブより下の分子トラ
ップに姿いて保持されるシステムが用いられる。修飾さ
れるヌクレオチドの前の鎖の位置の合成の間は、ポリメ
ラーゼは該１〜ラツプを逆洗することによって循環され
る。しかしながら、その時点で、エラー傾向性ポリメラ
ーゼ（すなわちニワトリ骨髄芽球腫ウィルスポリメラー
ゼのようなブルー７リーデイング機能を有しないもの）
が取込まれるヌクレオチド前駆体の１当累と共に用いら
れた。エラー傾向性ポリメラーゼが反応器から流出され
た後、配列合成は、適切なヌクレオチド前駆体および循
環される高性能［ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌ ｉｔｙ］ポリ
メラーゼを用いで続けられる。
（４，５，流出液中の取込まれなかったヌクレオチド前
駆体の検知） ヌクレオチドに関する、任意の定量的検定が流出液中の
取込まれなかったヌクレオチドの検知に用いられ得る。
駆体の検知） ヌクレオチドに関する、任意の定量的検定が流出液中の
取込まれなかったヌクレオチドの検知に用いられ得る。
流出液中の取込まれなかったヌクレオチドを検知するた
めに用いられるいくつかの方法には、吸収もしくは螢光
分光のような分光学的方法、放ｑ寸性標識および計数（
ヌクレオチド前駆体が放射標識されることを与える。）
、ならびに電気化学的もしくは伝導率法が含まれるが、
もちろんこれらに限定されるものではない。これらの方
法のいくつかが以下により詳細に述べられる。
めに用いられるいくつかの方法には、吸収もしくは螢光
分光のような分光学的方法、放ｑ寸性標識および計数（
ヌクレオチド前駆体が放射標識されることを与える。）
、ならびに電気化学的もしくは伝導率法が含まれるが、
もちろんこれらに限定されるものではない。これらの方
法のいくつかが以下により詳細に述べられる。
（４，５，１，吸収分光学）
ヌクレオチドが紫外域における光を（例えば、２５４ｎ
ｍの波長または２５０〜２８０ｎｍの範囲で）吸収する
ゆえに、紫外域にあける流出液の吸光度量は、反応室へ
添加された特定のヌクレオチドが成長するヌクレオチド
鎖中に取込まれたか否かを示すことができる。より詳し
くは、流出液の吸光度は、成長するヌクレオチド鎖中へ
のヌクレオチド前駆体の取込みと逆相関する。すなわち
、ヌクレオチド前駆体が成長するヌクレオチド鎖中に取
込まれた場合、流出液中にはより少ないヌクレオチドが
存在し、そして流出液の吸光度は相応するより低いレベ
ルで記録されるであろう（すなわち、吸光度の読みにお
ける、より低い増加があるだろう。）。ヌクレオチド前
駆体が成長する鎖中に取込まれなかった場合、添加され
たすべてのヌクレオチドが流出液とともに洗い流され、
そして流出液の吸光度は増加する。換言すれば、流出液
の相対吸光度は、反応室へ添加された特定のヌクレオチ
ド前駆体が鎖中へ取込まれたか否かを、そしてそれゆえ
ヌクレオチド配列の次の塩基であるか否かを示すもので
ある。本発明のこの実施態様の該段階の例が、第２図に
おいて図式的に示される。
ｍの波長または２５０〜２８０ｎｍの範囲で）吸収する
ゆえに、紫外域にあける流出液の吸光度量は、反応室へ
添加された特定のヌクレオチドが成長するヌクレオチド
鎖中に取込まれたか否かを示すことができる。より詳し
くは、流出液の吸光度は、成長するヌクレオチド鎖中へ
のヌクレオチド前駆体の取込みと逆相関する。すなわち
、ヌクレオチド前駆体が成長するヌクレオチド鎖中に取
込まれた場合、流出液中にはより少ないヌクレオチドが
存在し、そして流出液の吸光度は相応するより低いレベ
ルで記録されるであろう（すなわち、吸光度の読みにお
ける、より低い増加があるだろう。）。ヌクレオチド前
駆体が成長する鎖中に取込まれなかった場合、添加され
たすべてのヌクレオチドが流出液とともに洗い流され、
そして流出液の吸光度は増加する。換言すれば、流出液
の相対吸光度は、反応室へ添加された特定のヌクレオチ
ド前駆体が鎖中へ取込まれたか否かを、そしてそれゆえ
ヌクレオチド配列の次の塩基であるか否かを示すもので
ある。本発明のこの実施態様の該段階の例が、第２図に
おいて図式的に示される。
理想的に、伸長は、同時的様式において進行されるへき
である。
である。
本発明の一実施態様によると、流出液の吸光度は２５４
．０ｍの波長で計測され得る。それぞれのヌクレオチド
前駆体は、固有な比吸収最大（すなわち最大吸収の波長
〉を有する。しかしながら、結果として、流出液の吸光
度は、特定の反応からの流出液を測定した場合に、添加
されたそれぞれのヌクレオチド前駆体に関する比波長吸
収最大でリセットされ得る。
．０ｍの波長で計測され得る。それぞれのヌクレオチド
前駆体は、固有な比吸収最大（すなわち最大吸収の波長
〉を有する。しかしながら、結果として、流出液の吸光
度は、特定の反応からの流出液を測定した場合に、添加
されたそれぞれのヌクレオチド前駆体に関する比波長吸
収最大でリセットされ得る。
本発明の他の実施態様において、流出液は、ヌクレオチ
ドによって吸収される波長で励起される発光された螢光
物質で一側面を被覆された検出器セルを通過ぎゼられる
ことかできる。流出液中のヌクレオチドの存在は、これ
ゆえ螢光の消光により検知され得る。
ドによって吸収される波長で励起される発光された螢光
物質で一側面を被覆された検出器セルを通過ぎゼられる
ことかできる。流出液中のヌクレオチドの存在は、これ
ゆえ螢光の消光により検知され得る。
（４，５，２，標識された前駆体の検知）ヌクレオチド
前駆体は、３２Ｐ、３Ｈもしくは３５Ｓ（β−エミッタ
ー）、または１３１１（γ−エミッター）のような適当
な放射性同位元素で標識されることができる。流出液は
、任意の適当な検出器、好ましくはフローセルを備えた
検出器を用いて、放射標識された前駆体の存在に関し検
定され得る。例えば、ベータ活性の測定は、ガスイオン
化法（例えば、ガイガーーミューラー カウンター）ま
たはシンチレーションカウンティングを用いた装置によ
って達せられ得る。同様にカンマ活性の測定は、市販に
得られうるカンマカウンターによって検知され計数され
得る。
前駆体は、３２Ｐ、３Ｈもしくは３５Ｓ（β−エミッタ
ー）、または１３１１（γ−エミッター）のような適当
な放射性同位元素で標識されることができる。流出液は
、任意の適当な検出器、好ましくはフローセルを備えた
検出器を用いて、放射標識された前駆体の存在に関し検
定され得る。例えば、ベータ活性の測定は、ガスイオン
化法（例えば、ガイガーーミューラー カウンター）ま
たはシンチレーションカウンティングを用いた装置によ
って達せられ得る。同様にカンマ活性の測定は、市販に
得られうるカンマカウンターによって検知され計数され
得る。
（４，５，３，電気化学的検知〉
電気化学的検知は、酸化または還元反応を受けることの
できる化学品の酸化、または還元を誘導する様式におい
てフローセルを横切る電位を適用することを含むもので
ある。
できる化学品の酸化、または還元を誘導する様式におい
てフローセルを横切る電位を適用することを含むもので
ある。
（４，５，４伝導率検知）
伝導率検知は、適用された電位に対するフローセル中の
溶液の抵抗を測定することを含むものでおる。溶質濃度
における非常にわずかな変化が、溶液の抵抗において検
知可能な変化をもたらし得る。
溶液の抵抗を測定することを含むものでおる。溶質濃度
における非常にわずかな変化が、溶液の抵抗において検
知可能な変化をもたらし得る。
（４，６，オートメーションおよびコンピューターの使
用 理想的に、本発明の方法は、オ−トメーション化され得
、また、前駆体の選択および添加を１ｔｉｌ制御し、そ
れぞれの添加されたヌクレオチドからの流出液に関して
得られた吸光度の読みを記録すること、ならびにこのよ
うにして得られた配列を印刷出力することをプログラム
されたコンピューターによって規整され得る。このよう
なプログラムのフローチャートが第４図に示される。第
４図において表わされる案によると、ヌクレオチドの首
尾よい取込みは、第４．４節において述べられるような
最後から二番目のヌクレオチド前駆体の添加へと続く。
用 理想的に、本発明の方法は、オ−トメーション化され得
、また、前駆体の選択および添加を１ｔｉｌ制御し、そ
れぞれの添加されたヌクレオチドからの流出液に関して
得られた吸光度の読みを記録すること、ならびにこのよ
うにして得られた配列を印刷出力することをプログラム
されたコンピューターによって規整され得る。このよう
なプログラムのフローチャートが第４図に示される。第
４図において表わされる案によると、ヌクレオチドの首
尾よい取込みは、第４．４節において述べられるような
最後から二番目のヌクレオチド前駆体の添加へと続く。
最初の実施例は、高圧液体クロマトグラフィーポンプお
よび紫外線検知器に接続された第５図に示される反応器
の使用に関するものである。ポンプ、切換えバルブおよ
び注入器は、第２の実施例において再現されるもののよ
うな、ベーシック言語で書かれたプログラムを実行する
ゆだねられたコンピューターによって制御され得る。
よび紫外線検知器に接続された第５図に示される反応器
の使用に関するものである。ポンプ、切換えバルブおよ
び注入器は、第２の実施例において再現されるもののよ
うな、ベーシック言語で書かれたプログラムを実行する
ゆだねられたコンピューターによって制御され得る。
（５，実 例：オリゴヌクレオチド配列の決定）反応容
器は、１７−塩基プライマーとハイブリット形成された
Ｍ１３ Ｍｐｌｏ ＤＮＡの２００μΩを、開口さ
れた装填孔を通じて、充填された。
器は、１７−塩基プライマーとハイブリット形成された
Ｍ１３ Ｍｐｌｏ ＤＮＡの２００μΩを、開口さ
れた装填孔を通じて、充填された。
該容器は密封され、そして００２５４の読みが安定化す
るまで緩衝液で洗浄された。取込みに関して試験された
最初の塩基はｄＧＴＰであった。インキュベーションの
後、流出液の０Ｄ２５４の読みの総和は、ｄＧＴＰの０
．０７０ｍｏｌが取込まれたことを示した。ｄＧＴＰで
の追加的なインキュベーションは、何らさらに取込みを
もたらさなかった。
るまで緩衝液で洗浄された。取込みに関して試験された
最初の塩基はｄＧＴＰであった。インキュベーションの
後、流出液の０Ｄ２５４の読みの総和は、ｄＧＴＰの０
．０７０ｍｏｌが取込まれたことを示した。ｄＧＴＰで
の追加的なインキュベーションは、何らさらに取込みを
もたらさなかった。
過剰なｄＣＴＰとの反応および流出液の０Ｄ２５４の読
みの総和は、ｄＣＴＰのＱ、１（３ｎｍｏｌの取込みを
示した。反応容器中の溶液は次に回収され、そして約０
．１１ｎｍｏｌのＤＮＡが存在することが測定された。
みの総和は、ｄＣＴＰのＱ、１（３ｎｍｏｌの取込みを
示した。反応容器中の溶液は次に回収され、そして約０
．１１ｎｍｏｌのＤＮＡが存在することが測定された。
ブライマー鎖は、１つのＧによって、続いて２つのＣに
よって伸長されたゆえに、鋳型鎖のプライマー配列後の
、最初の３つのヌクレオチドの配列はＣＧＧであること
が推論された。
よって伸長されたゆえに、鋳型鎖のプライマー配列後の
、最初の３つのヌクレオチドの配列はＣＧＧであること
が推論された。
（６，実施例：用いられたコンピュータープログラム）
以下の配列決定プログラムにおいて、ｒｓＥＱＪプログ
ラムは、配列決定実行のための基本的な、操作パラメー
ターを確立する。オペレーターは、オートマチック制御
またはオペレーター制御の選択を最初に与えられる。オ
ートマチック選択が）πばれた場合、次の決定は、ノイ
ズ消去ルートが使用されるか否かであり、またそれが使
用された場合、いくつの塩基が進行した後に行なうかで
ある。
ラムは、配列決定実行のための基本的な、操作パラメー
ターを確立する。オペレーターは、オートマチック制御
またはオペレーター制御の選択を最初に与えられる。オ
ートマチック選択が）πばれた場合、次の決定は、ノイ
ズ消去ルートが使用されるか否かであり、またそれが使
用された場合、いくつの塩基が進行した後に行なうかで
ある。
オートマチック実行においては、回転パルプは最初に正
しく位置されていることが本質的であり、それゆえ、助
長する注意が、バルブセツティングをチェックするため
にオペレーターに対してスクリーン上に出される。
しく位置されていることが本質的であり、それゆえ、助
長する注意が、バルブセツティングをチェックするため
にオペレーターに対してスクリーン上に出される。
付加的な操作パラメーターが、次に吟味され、そしてオ
ペレーターによって変更され得る； （１）洗浄流速、
（２）装填流速、（３）反応流速（通常はＯ）、（４〉
反応器への移動時間、（５）反応時間、（６）塩基使用
を決定するための閾値限界、（７）全実行時間。これら
の値は、所望される場合、ハードコピーで印刷され得る
。該プログラムは次にプログラムｒＷＪヘエグジットさ
れる。
ペレーターによって変更され得る； （１）洗浄流速、
（２）装填流速、（３）反応流速（通常はＯ）、（４〉
反応器への移動時間、（５）反応時間、（６）塩基使用
を決定するための閾値限界、（７）全実行時間。これら
の値は、所望される場合、ハードコピーで印刷され得る
。該プログラムは次にプログラムｒＷＪヘエグジットさ
れる。
ｒＷＪプログラムは、配列を決定されたように蓄積する
ためにデータファイルを開設する一方、系を洗浄するこ
とを開始する。ｒＷＪは次に、注入すること、インキュ
ベートすること、およびｄＡＴＰの取り上げを評価する
ことに関して、応答し得るｒＬＡＴＪプログラムを呼び
出す。
ためにデータファイルを開設する一方、系を洗浄するこ
とを開始する。ｒＷＪは次に、注入すること、インキュ
ベートすること、およびｄＡＴＰの取り上げを評価する
ことに関して、応答し得るｒＬＡＴＪプログラムを呼び
出す。
ｒＬＡＴＪは最初に、流れを装填流速へ低減し、そして
注入器をｇ填にセラ１−する。次にｄＡＴＰ装填に回転
バルブがセットされる。分析ファイルｒＡＪが、次に、
実行を副面すること、およびデータを得ること援助する
ために呼び出される。
注入器をｇ填にセラ１−する。次にｄＡＴＰ装填に回転
バルブがセットされる。分析ファイルｒＡＪが、次に、
実行を副面すること、およびデータを得ること援助する
ために呼び出される。
最初にｄＡＴＰのアリＤ −１−（［ａｌ １ｑｕｏｔ
ｌ、部分標本）が注入され、ｒｓＥＱＪにおいて設定さ
れた時間の間インキュベ−１〜される反応器へ移動する
。
ｌ、部分標本）が注入され、ｒｓＥＱＪにおいて設定さ
れた時間の間インキュベ−１〜される反応器へ移動する
。
同時に回転バルブは、洗浄にセットされる。インキュベ
ーションの後、反応容器はモニター中へ洗浄され、そし
て吸収ピーク積分および評価が始まる。この実行の結果
はスクリーン上に表示される。
ーションの後、反応容器はモニター中へ洗浄され、そし
て吸収ピーク積分および評価が始まる。この実行の結果
はスクリーン上に表示される。
取込みが起こった場合、この塩基はデータファイル中へ
入力され、一方取込みが起こらなかった場合には、試験
される次の塩基が決められる。首尾よい塩基取込みが今
だ起こっていない場合、塩基はＡ、Ｃ，ＧおよびＴの順
序で単純に試される。
入力され、一方取込みが起こらなかった場合には、試験
される次の塩基が決められる。首尾よい塩基取込みが今
だ起こっていない場合、塩基はＡ、Ｃ，ＧおよびＴの順
序で単純に試される。
以前の取込みがあった場合には、試される次の塩基は取
込まれた最後から二番目のものである。これは、不完全
に停止した鎖に対して、今首尾よく取込まれた塩基の一
段階後ろに）Ｗませることをもたらす。ｒｓＥＱＪプロ
グラムにおいて決められたように、これらの不完全鎖は
、最後から二番目の取込まれた塩基を試した後に、最後
に取込まれた塩基を繰返すことによって局面へと進めら
れ得る。
込まれた最後から二番目のものである。これは、不完全
に停止した鎖に対して、今首尾よく取込まれた塩基の一
段階後ろに）Ｗませることをもたらす。ｒｓＥＱＪプロ
グラムにおいて決められたように、これらの不完全鎖は
、最後から二番目の取込まれた塩基を試した後に、最後
に取込まれた塩基を繰返すことによって局面へと進めら
れ得る。
変異生成プログラムは、配列決定手順と同様な様式にお
いて、成長するヌクレオチド鎖へのメクレオチド前駆体
の連続的な添加を制御する。しかしながら、取込みによ
って決定される塩基添加の配列に代わり、塩基の添加は
、ユーザーによって入力された配列によって規整される
。プログラムは、慶賀生成のための位置までの固有の塩
基を連続的に添加し、その位置において、変異生成する
塩基が添加される。その取込みの後、すべての塩基が添
加されそして復製が完了へと進行する。
いて、成長するヌクレオチド鎖へのメクレオチド前駆体
の連続的な添加を制御する。しかしながら、取込みによ
って決定される塩基添加の配列に代わり、塩基の添加は
、ユーザーによって入力された配列によって規整される
。プログラムは、慶賀生成のための位置までの固有の塩
基を連続的に添加し、その位置において、変異生成する
塩基が添加される。その取込みの後、すべての塩基が添
加されそして復製が完了へと進行する。
（６，１，配列決定プログラム）
ＢＡＳＩＣ： ５ＥＱ
１ ＰＲＩＮＴ”Ｃ０ＰＹＲＩＧＨＴ １９８５ ＤＲ
，ＲＯＢＥＲＴ Ｊ、ＨＥＬＡＭＥ叶“２ ＦＯＲＹ＝
ＩＴＯ１００ ３ＮＥＸＴ Ｙ ５ ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、”Ｃ０ＰＹＲＩＧＩＩＴ
１９８５ ＤＲ，ＲＯＢＥＲＴ Ｊ、ＮＥＬ へ
トＩＥＤＥ“ １０ ＣＬＥＡＲ １２Ａ＝０ １３１＝０ １４ Ｑ＄＝’“Ｏ゛。
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１６ Ｔ＄＝“０“。
１７ ＩＮＰＵＴ’“ＩＳ ＴＨＩＳ Ａ ）ＩＡＮＵ
ＡＬ ＩＮＪＥＣＴ ＴＥＳＴ ＲＵＮ’ゴ＄１８
ＩＦ ｒ＄＝”Ｙ“’ ＧＯＴＯ３０１９ＩＮＰＩＪＴ
”ＤＯＹｏｕ ＷＩＳＨＴＯＡＣＴＩＶＡＴＥ Ｎ０
ＩＳＥＥＬＩ）ＩＩＮＡＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ”
Ｎｉ２ＯＩＦ Ｎ＄＝“Ｙ“”ＩＮＰＵＴ ”ＨＯ
Ｗ ）ＩＡＮＹ ＢＡＳＥＳ Ｂ［ＦＯＲＥＮＯ
ＩＳＥ ＥＬＩ門ＩＮＡＴＩＯＮ“旧３ＯＰＲＩＮＴ
“’ＤＡ丁Ｐ＝＃Ｉ ＤＣＴＰ＝＃２ ＤＧＴＰ−
４３ＤＴＴＰ＝＃ｄＷＡＳＨ＝＃６ （＆５）” ４０ ＰＲＩＮＴ ”Ｄｏ ＹＯＵ ＷＩＳＨ
ＴＯ５ＴＥＰ ＴＨＥ ＶへＬＶＥ？”５０ Ｉ
ＮＰＵＴ Ｓ＄ ６０ １Ｆ Ｓ＄＝”Ｎ“’ ＴＨＥＮ ＧＯＴＯ１４
５７０ＩＦ Ｓ＄−”Ｙ’“ ＴＨＥＮ ８０８０ Ｘ
Ｃ０）Ｉ ｌ０ＦＦ ９０ ＸＣ０Ｍ ２ＯＮ １００ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ １１ＯＮＥＸＴ Ｙ １２０ ＸＣ０Ｍ ２ＯＦＦ １３０ ＸＣ０）Ｉ ｌ０Ｎ １４０ ＧＯＴＯ４０ １４５ＣＬＥＡＲ １５０ＰＲＩＮＴ ’ゴＯＣＨ八へＧＥ ＴＨＥ Ｄ
ＥＦＡＵＬＴ ＶＡＬＵＥＳ （）Ｏｒ Ｃ０ＮＴＲ
０Ｌ ＶＡＲＩ八ＢＬへＳ”１６０ ＰＲＩＮＴ ’“
ＥＮＴＥＲＹ ＦＯＬＬＯΔＥＤ
ＢＹｆ？Ｅ１’ＵｒｌＮ“ １６５ ＰＲＩＮＴ １７０ ＩＮＰＵＴ “ＤＯＹｏｕ ＷＡＮＴ
Ｔｏ ＣＨＡｈｌＧＥ ＴＨＥ ＷＡＳＨＦＬＯ
ＷＲＡＴＥ （，５）’“Ｙ＄１８０ ＩＦ Ｙ＄＝
“Ｙ“ＴＨＥＮ ＧＯＴＯ２００１９０ＩＦ Ｙ＄＝’
“ＮｏＧＯＴＯ２２０２００ＩＮＰＵＴ ”ＥＮＴＥ
ＲＴＨＥ ＮＥＷ ＷＡＳＨＦＬＯＷＲＡＴＥ”Ｗ
２１０ ＧＯＴＯ２３０ ２２０Ｗ＝、５ ２３０ ＩＮＰＵＴ ’“Ｄｏ Ｙｏｕ ＷＡ
ＮＴ 丁ＯＣＨＡＮＧＥ ＴＨＥ ＬＯＡＤＦＬＯ
ＷＲＡＴＥ （，２）”Ｙ＄ ２４０ ＩＦ Ｙ＄＝”Ｙ’“ ＴＨＥＮ Ｇｏ
ｌｏ ２６０２５０ ＩＦ Ｙ＄＝“Ｎ” ＴＨＥＮ
ＧＯＴｏ ２８０２６０ ＩＮＰＵＴ ’“ＥＮＴ
ＥＲＴＨＥ ＮＥΔ しＯＡＤ ＦＬＯＷＲＡＴＥ
”Ｌ２６５ ＧＯ３ＵＢ ３０００ ２６９ ＣＬＥＡＲ ２７０ＧＯＴｏ ２９０ ２８０ Ｌ＝、２ ２９０ ＩＮＰｔＪＴ“’Ｄｏ ＹＯＵ ＷＡＮ
Ｔ Ｔｏ ＣＨＡＮＧＥ ＴＨＥ ＲＥＡＣＴＩ
ＯＮＦＬＯＷＲＡＴＥ （０）”Ｙ＄ ３００ ＩＦ Ｙ＄＝“Ｙ” ＴＨＥＮ ＧＯＴＯ３２
０３１０ＩＦ Ｙ＄＝”Ｎ” ＴＨＥＮ ＧＯＴＯ３４
０３２０ＩＮＰＵＴ ”ＥＮＴＥＲＮＥＷ ＲＥＡ
ＣＴＩＯＮ ＦＬＯＷＲＡＴＥ“°Ｒ３３０ＧＯＴＯ
３６０ ３４０Ｒ＝０ ３６０ ＩＮＰｔＪＴ ”ＤＯＹｏｕ ＷＡＮＴ
Ｔｏ ＣＨＡＮＧＥ Ｔｌ（ＡＶＥＬ ＴＩ
ＩＩＥＴＯＲＥＡＣＴＯＲ（，４７）’“Ｙ＄３７０
ＩＦ Ｙ＄−’“Ｙ“ＴＨＥＮ ＧＯＴＯ３９０３８０
ＩＦ Ｙ＄＝”Ｎ” ＴＩＩＥＮ ＧＯＴＯ４１０３９
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ＩＭＥ”Ｔ４００ ＧＯＴＯ４１５ ４１０丁＝、３ ４１５ Ｔ＝１＋、１ ４２０ ＩＮＰＵＴ”Ｄｏ ＹＯｔｌ ＷＡＮＴ
Ｔｏ ＣＨＡＮＧＥ ＴＨＥ ＲＥＡＣＴＩ
ＯＩ４ＴＩＭＥ？（１，５）’“Ｙ＄ ４３０ ＩＦ Ｙ＄＝“Ｙ” ＴＨＥＮ ４５０４４０
ＩＦ Ｙ＄＝“Ｎ“” ＴＨＥＮ ４７０４５０
ＩＮＰＵＴ ”ＥＮＴＥＲＮＥＷ ＲＥＡＣＴＴＯ
Ｎ ＴＩＭＥ”Ｉ４５５ Ｉ＝Ｉ＋Ｔ ４６０ ＧＯＴｏ ４８０ ４７０ Ｉ＝１．５＋Ｔ ４７５ ＣＬＥＡＲ ４８０ＰＲＩＮＴ ”Ｄｏ Ｙｏｕ ＷＡＮＴ
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２００００ ４８３Ａ（２）＝２００００ ４８４ Ａ（３）＝２００００ ４８５ Ａ（４）＝２００００ ４８６ ＰＲＩＮＴ ’“ＡＤＥＮＩＮＥ＝’“Ａ（１
）；４８７ ＰＲＩＮＴ ”ＣＹＴＯ３ＩＮＥ−’“Ａ
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八ＲＥＡ ＬＩＭＩＴ ＦＯＲＥへＣＨＢＡＳ
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１６ ＩＮＰＵＴ ”ＧＵＡＮＩＮＥ“’Ａ（３）５１
８ ＩＮＰＵＴ“ＴＨＹＨＩＮＥ“’Ａ（４）５２０
ＣＬＥＡＲ ５３０Ｅ１＝３．５ ５３５ ＰＲＩＮＴ ”Ｄｏ ＹＯＵ 臀ＡＮ
Ｔ ＴＯＣＨＡＮＧＥ 丁ＨＥ ＲＵＮ丁ＩＮビ
；Ｅｌ ５３７ ＩＮＰＵＴ Ｙ＄ ５３９ ＩＦ Ｙ＄・ＩＩ Ｎ ＩＩ 丁ＨＥＮ
５５０５４０ ＩＮＰＵＴ °’ＥＮＴＥＲＮ
ＥＷ Ｉ’１ｌＪＮ ＴＩＭＥ ＶＡＬＵＥ”Ｅ
１５４１ ＰＲＩＮＴ ５４２ ＰＲＩＮＴ ’■旧Ｓ ＶＡＬＵＥ
ＷＩＬＬ ＡＵＴＯＨＡＴＩＣ八ＬＬＹ ＢＥへＮ
ＴＥＲＥＤ ＩＮＴＯ“。
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ＡＬＹＳＩＳ ＡＮＤ ＩＮＴＥＧＩ′？ＡＴＩＯＮ
ＦＩＬＥＳ’“ ５４５ ＰＲＩＮＴ ５５０ ＧＯ３ＵＢ ２０００ ６００ ＣＬＥＡＲ ６０５ＰＲＩＮＴ ６１０ ＩＮＰＵＴ ”ＤＯＹｏｕ ＷＡＮＴ
八 ＰＲＩＮＴＯＵＴ ＯＦ ＴＨＥＯＰＥＲＡＴ
ＩＯＮ ＰＡＲＡＭＥＴＥＲ３？’“Ｙ＄６２０ ＩＦ
Ｙ＄＝’“Ｙ” ＩＩＩＥＮ ＧＯＴＯ６４０６３
０ＩＦ Ｙ＄＝’“Ｎｏ“ ＴＨＥＮ ＧＯＴＯ７１０
６４０ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、“’ＬＯＡＤ ＦＬＯＷ
ＲＡＴＥ”、Ｌ６５０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、”ＷＡ
ＳＨＦＬＯＷＲＡＴＥ”；Ｗ６６０ ＰＲＩＮＴ ＃
Ｐ、”ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＦＬＯＷＲＡＴＥ”；Ｐ６
７０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、”ＴＲＡＶＥＬ ＴＩ）
ＩＥ”；Ｔ−，１６８０ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、”ＲＥＡＣ
ＴＩＯＮ Ｔｌｌ４Ｅ“、Ｉ−Ｔ６９０ ＰＲＩＮ
Ｔ ＃Ｐ、゛ＡＲＥＡ 丁ＨＲＥＳＨＯＬＤ Ｖ八
し叶Ｓ Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ“。
ＡＬＹＳＩＳ ＡＮＤ ＩＮＴＥＧＩ′？ＡＴＩＯＮ
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ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、”ＲＵＮ 丁Ｉ）ＩＥ”；Ｅ
１７１０ ＩＮＰＵＴ ”ＤＯＹＯＵ ＷＡＮＴ
ＴＯ５ＴＡＲＴ？”Ｙ＄７２０ ＩＦ Ｙ＄＝”
Ｎ” 丁ｔ（ＥＮ ＧＯ丁０ γ１０７３０ ＣＨ
ＡＩＮ”−“ ２０００ ＰＲＩＮＴ ＃に、’“ＬＩＳＴｏｏ；
“Ａ１１ 、ＩＴ“２０１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”
Ｖ’“２０２０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ５ ２０３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２０４
０８ＥＸＴ Ｙ ２Ｏ５０ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２０６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）；２１
００ ＰＲＩＮＴ ＃に、“ＬＩＳＴ“°；′″Ａ“
１：１１３１“２１１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ” ２１２０ ＦＯＲＹ＝打０５ ２１３０ ＰＲＩＮＴ １１に、ＣＨＲ＄（９）；２
１４０ ＮＥＸＴ Ｙ ２１５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２１６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）１２２
００ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＬＩＳＴ−”Ａ”、“Ｃ“
２２１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ”２２２０ Ｆ
ＯＲＹ＝ＩＴＯ５ ２２３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２２４０
ＮＥＸＴ Ｙ ２２５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２２６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）；２３
００ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＬＩＳＴ’“；“Ａｌｌ
、ＨＤ１＋２３１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ” ２３２０ ＦＯＲＹ＝１丁０５ ２３３０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２３４
０ ＮＥＸＴ Ｙ ２３５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２３６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７） ；２
４００ ＰＲＩＮＴ ＃に、”１１８丁”、”Ｉ”
、”Ａ”２４１０ ＰＲＩＮＴ ＃逢＋Ｖｌ＋２４２
０ ＦＯＲＹ＝１１０１１ ２４３０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２４４
０５ＥＸＴ Ｙ ２４５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＩＩ、１２４７０ ＰＲ
ＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２４８０ ＰＲＩＮＴ
＃に、Ｅ１ ２４９Ｑ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７） ；２
５００ ＰＲＩＮＴ ＃に、°“ＬＩＳＴ”、“ＩＩＩ
“１＋＋Ｉ３＋“２５１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ
”２５２０ ＦＯＲＹ＝１丁０１２ ２５３０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２５
４０１任ＸＴ Ｙ ２５５０ Ｐ［Ｎ丁 ＃に、Ｅ１ ２５６０ ＰＲＩＮＴ ＩＩＫ、ＣＨＲ＄（２７）；
２６００ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＬＩＳＴ゛１“′
■“ＺＩＩＣ”２６１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ” ２６２０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１２ ２６３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２６４０
８ＥＸＴ Ｙ ２６５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２６６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｃｌ１Ｒ＄（２７）；２
７００ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＬＩＳＴ“Ｚｌｌｉ“
ＺＩＩＱＩ＋２７１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ν°“２
７２０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１２ ２７３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２７４０
ＮＥＸＴ Ｙ ２７５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２７６０ Ｐｆ？ＩＮ丁 ＃に、ＣＨＲ＄（２７）；
２８００ ＲＥＴＵＲＮ ３０００ ＰＲＩＮＴ ＃に、“’ＬＩＳ丁′°１
“Ａ−１“Ａ”３０１−ＯＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ” ３０２０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ３ ３０３０Ｐ［Ｎ丁 ＃に、ＣＨＲ＄（９）；３０４０
ＮＥＸＴ Ｙ ３０５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、し ３０６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）；３１
００ ＰＲＩＮＴ ＃恥”ＬＩＳＩＩＩ 、 ＩＩ
Ａ ｌ”１“ｌ Ｂ ｌ“３１１０ ＰＲＩＮＴ ＃
に、’“Ｖ１１３１２０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ３ ３１３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）。
ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、”ＲＵＮ 丁Ｉ）ＩＥ”；Ｅ
１７１０ ＩＮＰＵＴ ”ＤＯＹＯＵ ＷＡＮＴ
ＴＯ５ＴＡＲＴ？”Ｙ＄７２０ ＩＦ Ｙ＄＝”
Ｎ” 丁ｔ（ＥＮ ＧＯ丁０ γ１０７３０ ＣＨ
ＡＩＮ”−“ ２０００ ＰＲＩＮＴ ＃に、’“ＬＩＳＴｏｏ；
“Ａ１１ 、ＩＴ“２０１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”
Ｖ’“２０２０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ５ ２０３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２０４
０８ＥＸＴ Ｙ ２Ｏ５０ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２０６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）；２１
００ ＰＲＩＮＴ ＃に、“ＬＩＳＴ“°；′″Ａ“
１：１１３１“２１１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ” ２１２０ ＦＯＲＹ＝打０５ ２１３０ ＰＲＩＮＴ １１に、ＣＨＲ＄（９）；２
１４０ ＮＥＸＴ Ｙ ２１５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２１６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）１２２
００ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＬＩＳＴ−”Ａ”、“Ｃ“
２２１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ”２２２０ Ｆ
ＯＲＹ＝ＩＴＯ５ ２２３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２２４０
ＮＥＸＴ Ｙ ２２５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２２６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）；２３
００ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＬＩＳＴ’“；“Ａｌｌ
、ＨＤ１＋２３１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”Ｖ” ２３２０ ＦＯＲＹ＝１丁０５ ２３３０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；２３４
０ ＮＥＸＴ Ｙ ２３５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｅ１ ２３６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７） ；２
４００ ＰＲＩＮＴ ＃に、”１１８丁”、”Ｉ”
、”Ａ”２４１０ ＰＲＩＮＴ ＃逢＋Ｖｌ＋２４２
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００ ＰＲＩＮＴ ＃恥”ＬＩＳＩＩＩ 、 ＩＩ
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に、’“Ｖ１１３１２０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ３ ３１３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）。
３１４０ ＮＥＸＴ Ｙ
３１５０ Ｐ［ＮＴ ＃に、Ｌ
３１６０ ＰＲＩＮＴ 濡に、ＣＨＲ＄（２７）：
３２００ ＰＲＩＮＴ ｔｆＫ、”ＬＩＳＴ”；”Ａ”
；”Ｃ”３２１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、“Ｖｏ“３２２
０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ３ ３２３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；３２４０
ＮＥＸＴ ｙ ３２５０ ＰＲＩＮＴ ＃連［ ３２６０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）；３３０
０ ＰＲＩＮＴ ＃にＩＩＬＩｓＴＩＩ ：ｌＩＡ＋ｌ
；ｎｏｎ３３１０ ＰＲＩＮＴ ＃にｌＴｌ ３３２０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ３ ３３３０ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（９）；３３４０
ＮＥＸＴ Ｙ ３３５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、Ｌ ３３６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（２７）；３
４００ ＲＥＴＵＲＮ ＲＡＳＩＣ：Ｗ Ｉ Ｃ０ＰＹＲＩＧＨＴ １９８５ ＤＲ，ＲＯＢＥＲ
Ｔ Ｊ、）ＩＥＬＡＨＥＤＥ５ ＣＬＥＡＲ １０ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｗ１２ Ａ＄＝”
５ＥＱｔＪＥＮＣＥ” １３０ＰＥＮ ＃０５．Ａ＄ １４ ＰＲＩＮＴ ＃Ｄ５．”５ＴＡＲ丁゛１５
ＣＬＯ３Ｅ ＃Ｄ５ ４０ ＣＩＡＩＮ ’“［Ａ丁“ ８ＡＳＩＣ５［Ａ丁 １ ｆ？Ｅ）ｆ Ｃ０ＰＹＲＩＧＨＴ １９８５
ＤＲ，ＲＯＢＥＲＴ Ｊ、ＨＥＬＡＭＥＤＥ“２
ＰＲＩＮＴ ＃に、’丁ＬＯＷ”Ｌ３ ＦＯＲＹ
＝ＩＴＯ５００ ４８ＥＸＴ Ｙ ５ ＲＥ）ｌ ＲＥＳＥＴ ＩＮＪＥＣＴＯＲＴ
ｏ ＬＯＡＤ６ ＸＣ０Ｍ ３ＯＦＦ、４ＯＮ ７ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ８ＮＥＸＴ Ｙ １１ ■［丁＄゛Ｙ”ＩＮＰＵＴ”ＥＮＴＥＲ８ＡＳＥ
ＩＤＥＮ丁ＩＦＩＣＡ丁ｌ０ＮＷＨＥＮ ＬＯＡＤ
ＥＤ”Ｂ＄ １３ ＩＦ Ｔ＄“Ｙ” ＧＯＴＯ１２０１５ＦＯＲＹ
＝ＩＴＯ１００ ２０ＮＥＸＴ Ｙ ２５ １？ＥＨＳＥＴ ＲＯＴＯＲＹ ＶＡＬＶＥ
Ｔｏ ＬＯＡＤ ＤＡＴＰ３０ ＸＣＯ３１
ＯＦＦ、２ＯＮ ４０ ＦＯＲＹ＝１１０１００ ５０ ＮＥＸＴ Ｙ ６０ ＸＣＯ３２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ １００ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００００１１０ＮＥＸＴ
Ｙ １１９ ＲＥＭ ＳＥＴ ＬＯＡＤ ＦＬＯＷ
ＲＡＴＥ１２０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯΔ゛Ｌ
１２５ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ １３０ＮＥＸＴ Ｙ １４０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、Ｂ＄ １５０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ２００ １５５ＮＥＸＴ Ｙ １９５ ＲＥＨＣＡＬＬ ＵＰ ＣＣＭ ５Ｕ
ＢＲＯＵＴＩＮＥ ＦＯＲ八ＮＡＬＹＳＩＳｔＪＮ ２００ Ｐ［ＮＴ ＃に、”ＡＮ八い’ＳＥ”；”
Ａ“２０４ ＲＥＭ ＵＳＥ ＲＥＬＡＹ Ｔ
ＯＰＵＳＨ５ＴＡＲＴ ＢｔＪＴＴＯＮ２０５ Ｐ
ＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（７）２１０ ＦＯＲＹ＝Ｉ
ＴＯ１００ ２１１ＮＥＸＴ Ｙ ２１２ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜、Ｉ ＴＨＥＮ
２１２２１４ Ｉ？Ｅ）Ｉ ＩＮＪＥＣＴ Ｄ
ＡＴＰ２１５ ＸＣ０Ｍ ４ＯＦＦ、３ＯＮ ２１６ ＲＥＩ（ＳＥＴ ＲＥＡＣＴＩＯＮ Ｔ
ＩＭＥ ＡＮＤ ＦＬＯＩＪＲＡＴＥ２１７ Ｉ
Ｆ ＥＬＴ（０）＜丁 丁ＨＥＮ ２１γ２１８
ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｒ２２０” ＩＦ
ＥＬＴ（０）＜１ １ＨＥＮ ２２０２２１ Ｉ
Ｆ Ｔ＄＝’“Ｙ“” ＧＯＴＯ２４０２２２ＦＯＲＸ
＝ＩＴＯ５ ２２３ＸＣ０）ｆ ｌ０ＦＦ、２ＯＮ ２２４ ＦＯＲＸ＝を丁０１００ ２２５ ＮＥＸＴ Ｙ ２２６ ＸＣＯＨ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ ２２７ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２２８ＮＥＸＴ Ｙ ２２９ ＮＥＸＴ Ｘ ２３０ ８Ｅ）ｌ ＬＩＮＥ３ ２２２ Ｔｏ
２２９ ＲＥＳＥＴ ＲＯＴＯＲＹ Ｖ八ＬＶＥ
Ｔｏ ＷＡＳＨ ２４０ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｉ ＴＨＥＮ ２４
０２４５ ＲＥＭ ＷＡＳＨＲＥＡＣＴＯＲＦＯＲ
ＥＶＡＬＵ八Ｔｌ０へ ＯＦ ＲＵＮ２５０ ＰＲ
ＩＮＴ ＃に、“’ＦＬＯＷ”讐２６０ ＩＦ Ｅ
ＬＴ（０）＜ＥＩ ＴＨＥＮ ２６０２６２ ＦＯ
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。
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ＤＲ，ＲＯＢＥＲＴ Ｊ、ＨＥＬＡＭＥＤＥ“２
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＝ＩＴＯ５００ ４８ＥＸＴ Ｙ ５ ＲＥ）ｌ ＲＥＳＥＴ ＩＮＪＥＣＴＯＲＴ
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ＩＤＥＮ丁ＩＦＩＣＡ丁ｌ０ＮＷＨＥＮ ＬＯＡＤ
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ＲＡＴＥ１２０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯΔ゛Ｌ
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２２９ ＲＥＳＥＴ ＲＯＴＯＲＹ Ｖ八ＬＶＥ
Ｔｏ ＷＡＳＨ ２４０ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｉ ＴＨＥＮ ２４
０２４５ ＲＥＭ ＷＡＳＨＲＥＡＣＴＯＲＦＯＲ
ＥＶＡＬＵ八Ｔｌ０へ ＯＦ ＲＵＮ２５０ ＰＲ
ＩＮＴ ＃に、“’ＦＬＯＷ”讐２６０ ＩＦ Ｅ
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ＲＹ＝ＩＴＯ５００ ２６３ＮＥＸＴ Ｙ ２６５ ＩＦ 丁＄−“’Ｙ”ＣＨＡＩＮ’“Ｗ“
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２６９ ＲＥ）Ｉ ＲＥ八へ ＤＡＴＡ ＦＩ
ＬＥ ＦＲＯＭ ＲＵＮ２７０ Ａ＄＝“ＡＰ’“ ２７９ Ｃ１＝０ ２８００ＰＥＮ ＃［）１．Ａ＄ ２９０ ＩＮＰＵＴ ＃Ｄ１，２９５．に、Ｂ、Ｃ２９
２Ｃ１＝Ｃ＋Ｃｌ ２９４ ＧＯＴＯ２９０ ２９５ＣＬＯ３Ｅ ＄０１ ２９７ ＲＥＩ４ ＤＩＳＰＬＡＹ ＲＥＳＵＬＴＳ
ＯＮ ５ＲＥＥＮ２９８ ＩＦ Ｚ＝ＯＴＨＥＮ Ｚ＝
１３００ ＰＲＩＮＴ ｚ； ３０１ Ｚ＝Ｚ＋１ ３０２ ＰＲＩＮＴ Ｃ１゜ ３０３ ＰＲＩＮＴ ”Ａ“： ３０４ ＰＲＩＮＴ ’“／゛°１ ３１０ ＩＦ Ｃ１＞Ａ（１） 丁ＨＥＮ ３
９５３１１ ＲＥ）ｌ ５ＡＶＥＳ ＬＡＳ丁
ＲＥＳＵＬＴ 八ｓ Ｑ＄３１２ Ｑ＄＝Ｐ＄ ３１４ ＲＥ）ｌ ＲＥＤＥＦＩＮＥＳ Ｐ＄Ｗ
ＩＴＨＬＡＴＥＳＴ ＲＥＳＵＬＴＳ３１５ Ｐ＄＝
“°Ａ′′ ３１９ ＲＥ）ｌ ５ＡＶＥＳ ５ＵＣＣＥＳＳＦＵＬ
ＲＵＮＳ ＩＮ ５ＥＱＵＥＮＣＥＤＡＴＡ
ＦＩＬＥ ３２０ Ｓ＄＝”５ＥＱＵＥＮＣＥ” ３３００ＰＥＮ １１０５．Ｓ＄ ３４０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｄ５．”Ａ“ ３５０ ＣＬＯ３Ｅ ＃０５ ３５４ ８Ｅ）ｌ Ｃ０ＵＮＴＥＲＦＯＲＮ０ＩＳＥ
ＥＬＩＭＩＮＡ丁ＩＮＧ ＲＯＵＴＩＮ３５５
Ｚ１＝２１＋１ ３９０ ＣＨＡＩＮ ”ＬＡＴ” ３９４ ＲＥ）ｆ ＲＥＳＥＴＳ Ｎ０ＩＳＥ
Ｃ０ＵＮＴＥＲＡＮＤ ＥＬＩＨＩＮ八ＴＥＳＣへ
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４０２４０１ ＧＯＴＯ４１０ ４０２，０＄＝０ ４０３ ＣＨＡＩＮ ”ＬＢＴ” ４１０ １Ｆ Ｑ＄＝”Ｇ” ＴＨＥＮ ４１２
４１１ ＧＯＴＯ４２０ ４１２Ｑ＄＝０ ４１３ ＣＨＡＴＮ ”ＬＣ丁゛。
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４２０ ＩＦ Ｑ＄＝“１°’ ＴＨＥＮ ４２２４２
１ ＧＯＴＯ４３０ ４２２Ｑ＄・０ ４２３ ＣＨＡＩＮ ”ＬＯＴ” ４３０ １Ｆ Ｑ＄＝”Ｏ” ＴＨＥＮ ４３１４３１
ＣＩ−ＩＡＩＮ ”ＬＢＴ”ＲＡＳＩＣ： Ｌ
ＢＴ Ｉ ＲＥＭ Ｃ０ＰＹＲＩＧ）ＩＴ １９８５ Ｄ
Ｒ，ＲＯＢＥＩ？Ｔ Ｊ、ＭＥＬＡＭＥＤＥ５ ＰＲＩ
ＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｗｌｏ ＸＣＯ３３ＯＦＦ、
４ＯＮ １５ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ １６８ＥＸＴ Ｙ １９ ＲＥＭ ５ＥＴＳ ＲＯＴＯＲＹ ＶＡ
ＬＶＥ 丁ｏ ＬＯＡＤ ＤＣＴＰ２０ ＦＯＲ
Ｘ＝ＩＴＯ２ ３０ＸＣＯＨｌ０ＦＦ、２ＯＮ ４０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ５０ＮＥＸＴ Ｙ ６０−ＸＣＯ）ｉ ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ ７０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ８０ＮＥＸＴ Ｙ ９０ ＮＥＸＴ Ｘ １００ ＦＯＲＹ＝１１０１００００１１０ ＮＥ
ＸＴ Ｙ ２Ｏ０ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＡＮＡＬＹＳＥ’“；′８
′２０５ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（７）２１０
ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２１１ＮＥＸＴ Ｙ ２１２ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜、Ｉ ＴＨＥＮ
２１２２１５ ＸＣ０）Ｉ ４ＯＦＦ、３ＯＮ２１７
ＩＦ ＥＬＴ（０）＜丁 Ｔ’ＨＥＮ ２１７
２１８ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｒ２２２Ｆ
ＯＲＸ＝ＩＴＯ４ ２２３ＸＣ０Ｍ ｌ０ＦＦ、２ＯＮ ２２４ ＦＯＲＸ＝ＩＴＯ１００ ２２５ＮＥＸＴ Ｙ ２２６ ＸＣ０Ｄ ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ ２２７ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２２８ＮＥＸＴ Ｙ ２２９ ＮＥＸＴ Ｘ ２４０ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｉ ＴＨＥＮ
２４０２５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ’“−
２６０ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｅｌ ＴＨＥＮ ２６
０２７０１３＄＝”ＢＰ′ ２７９ Ｃ２＝０ ２８００ＰＥＮ ＃０２．Ｂ＄ ２９０ ＩＮＰＵＴ ＩＤ２，２９５．に、Ｂ、Ｃ２９
２Ｃ２＝Ｃ＋Ｃ２ ２９３ＧＯＴＯ２９０ ２９５ＣＬＯ３Ｅ ＩＤ２ ２９８ ＩＦ Ｚ＝ＯｒＩＩＥＮ １＝１３００ Ｐ
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１ ＧＯＴＯ４３０ ４２２Ｑ＄・０ ４２３ ＣＨＡＩＮ ”ＬＯＴ” ４３０ １Ｆ Ｑ＄＝”Ｏ” ＴＨＥＮ ４３１４３１
ＣＩ−ＩＡＩＮ ”ＬＢＴ”ＲＡＳＩＣ： Ｌ
ＢＴ Ｉ ＲＥＭ Ｃ０ＰＹＲＩＧ）ＩＴ １９８５ Ｄ
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３１０ ＩＦ Ｃ２＞Ａ（２） 丁ＨＥＮ ３
９５３１２ Ｑ＄−Ｐ＄ ３１５ Ｐ＄−“Ｃ′ ３２ＯＳ＄＝”５ＥＱＵＥＮＣＥ” ３３００ＰＥＮ ＃Ｄ５．Ｓ＄ ３４０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｄ５．”Ｃ” ３５０ ＣＬＯ３Ｅ ｌＩＤ５ ３５５ Ｚ１＝２１＋１ ３９０ ＣＨへＩＮ ”ＬＢ丁゛′３９５ １Ｆ
Ｚｌ＜旧 ６０丁０ ４００３９６ Ｚ１＝０ ３９７０＄＝Ｐ＄ ４００ ＩＦ Ｑ＄＝”Ａ” 丁ＨＥＮ ４０
２４０１ ＧＯＴＯ、ｉｌ。
９５３１２ Ｑ＄−Ｐ＄ ３１５ Ｐ＄−“Ｃ′ ３２ＯＳ＄＝”５ＥＱＵＥＮＣＥ” ３３００ＰＥＮ ＃Ｄ５．Ｓ＄ ３４０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｄ５．”Ｃ” ３５０ ＣＬＯ３Ｅ ｌＩＤ５ ３５５ Ｚ１＝２１＋１ ３９０ ＣＨへＩＮ ”ＬＢ丁゛′３９５ １Ｆ
Ｚｌ＜旧 ６０丁０ ４００３９６ Ｚ１＝０ ３９７０＄＝Ｐ＄ ４００ ＩＦ Ｑ＄＝”Ａ” 丁ＨＥＮ ４０
２４０１ ＧＯＴＯ、ｉｌ。
４０２ Ｑ＄＝０
４０３ ＣＩＡＩＮ ”Ｌへ丁゛
４１０ １Ｆ Ｑ＄＝”Ｇ” １旺Ｎ ４１２４１
１ ＧＯＴＯ４２０ ４１２Ｑ＄＝０ ４１３ ＣＨＡＩＮ ’“ＬＣＴ” ４２０ ＩＦ Ｑ＄＝’ゴ’ ＴＨＥＮ ４２２４２１
ＧＯＴＯ４３０ ４２２Ｑ＄＝０ ４２３ ＣＨＡＩＮ ’“ＬＯＴ” ４３０ ＩＦ Ｑ＄＝”Ｏ” ＴＨＥＮ ４３１４３
１ ＣＨＡＩＮ “’ＬＣＴ”ＲＡＳＩＣ： Ｌ
ＣＴ Ｉ ＲＥ）Ｉ Ｃ０ＰＹＲＩＧＨＴ １９８５
ＤＲ，ＲＯＢＥＲＴ Ｊ、ＭＥ’Ｌ八ＨＥへＥ５
Ｐ）ｔｌＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ’“Δ１０ ＸＣ０Ｍ
３ＯＦＦ、４ＯＮ １５ ＦＯＲＹ＝１１０１００ １６ ＮＥＸＴ Ｙ １９ ＲＥ）Ｉ ＳＥＴ ＲＯＴＯＲＹ ＶＡ
ＬＶＥ Ｔｏ ＬＯＡＤ ＤＧ丁Ｐ２０ ＦＯ
ＲＹ＝ＩＴＯ３ ３０ＸＣ０Ｍ ｌ０ＦＦ、２ＯＮ ４０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ５０ＮＥＸＴ Ｙ ６０ ＸＣＯＨ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ ７０ ＦＯＲＹ＝１１０１００ ８０ ＮＥＸＴ Ｙ ９０ ＮＥＸＴ Ｘ １００ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００００１１０ＮＥＸＴ
Ｙ ２Ｏ０ＰＲＩＮＴ ＃に、”’ＡＮＡＬＹＳＥ” 、”
Ｃ”２０５ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（７）２１０
ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２１１８ＥＸＴ Ｙ ２１２ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜、Ｉ ＴＨＥＮ
２１２２１５ ＸＣ０Ｍ ４ＯＦＦ、３ＯＮ ２１７ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｔ ＴＨＥＮ
２１７２１８ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｒ２２
０ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｉ ＴＨＥＮ ２２０２
２２ ＦＯＲＸ＝ＩＴＯ３ ２２３ＸＣＯＨｌ０ＦＦ、２ＯＮ ２２４ ＦＯＲＸ＝１１０１００ ２２５ ＮＥＸＴ Ｙ ２２６ ＸＣ０）ｌ ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ２２７ ＦＯ
ＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２２８ＮＥＸＴ Ｙ ２２９ ＮＥＸＴ Ｘ ２４０ １Ｆ ＥＬＴ（０）＜ｒ 丁ＨＥＮ ２
４０２５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”慶２６０
ＩＦ ＥＬＴ（ｏ３＜ＥＩ ＴＨＥＮ ２６
０２７０ Ｃ＄−’“ＣＰ“ ２７９ Ｃ３＝０ ２８００ＰＥＮ ＃Ｄ３．Ｃ＄ ２９０ ＩＮＰＵＴ ＃Ｄ３，２９５．に、Ｂ、Ｃ２９
２Ｃ３＝Ｃ＋Ｃ３ ２９３ＧＯＴＯ２９０ ２９５ＣＬＯ３Ｅ ＃Ｄ３ ２９８ 汀 Ｚ＝０ 丁ＨＥＮ Ｚ・１３００ Ｐ
ＲＩＮＴ Ｚ： ３０１ Ｚ＝Ｚ＋１ ３０２ ＰＩ？ＩＮＴ Ｃ３； ３０３ ＰＲＩＮＴ “Ｇ− ３０４ＰＲＩＮＴ ’“／″１ ３１０ ＩＦ Ｃ３＞Ａ（３） ＴＩＩＥＮ ３９５
３１２ Ｑ＄−Ｐ＄ ３１５ Ｐ＄＝’“Ｇ′“ ３２ＯＳ＄−’”５ＥＱｔｌＥＮＣＥ“３３００ＰＥＮ
＃Ｄ５．Ｓ＄ ３４０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｄ５．”Ｇ’“３５０ ＣＬＯ
３Ｅ Ｒ０５ ３５５Ｚ１＝２１＋１ ３９０ ＣＨＡＩＮ ”ＬＤＴ“ ３９５ ＩＦ １１＜ＮＩ ＧＯＴＯ４００３９
６Ｚ１＝０ ３９７ Ｑ＄＝Ｐ＄ ４００ ＩＦ Ｑ＄＝”Ａ’“ ＴＨＥＮ ４０２
４０１ ＧＯＴＯ４１０ ４０２Ｑ＄＝０ ４０３ ＣＨＡＩＮ “’ＬＡＴ” ４１０ ＩＦ Ｑ＄＝”Ｃ” 丁ＨＥＮ ４１
２４１１ ＧＯＴＯ４２０ ４１２Ｑ＄−０ ４１３ＣＨＡＩＮ ’“［８丁“ ４２０ ＩＦ Ｑ＄−”Ｔ” 丁ＨＥＮ ４２
１４２１ Ｑ＄−〇 ４２２ ＣＨＡＩＮ “’ＬＤＴ“４３０ ＩＦ
Ｑ＄＝“’Ｏ” ＴＨＥＮ ４３１４３１ Ｃ
ＨＡＩＮ ’“ＬＤＴ“８ＡＳＩＣ； ＬＯＴ Ｉ ＲＥＭ Ｃ０ＰＹＲＩＧＩＩＴ １９８５ ＤＲ，
ＲＯＢＥＲＴ Ｊ、ＨＥＬＡＩ＋ＥＤＥ５ ＰＲＩＮＴ
＃に、’“ＦＬＯＷ”Ｗｌｏ ＸＣＯＨ３ＯＦＦ、
４ＯＮ １２ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ １３ＮＥＸＴ Ｙ １９ Ｉ？Ｅ）ｌ ＳＥＴ ＲＯＴＯｌ”ｔＹ
ＶＡＬＶＥ 王ｏ ＬＯＡＤ ＤＴＴＰ２０
ＦＯＲＹ＝１丁０４ ３０ ＸＣ０Ｍ １ＯＦＦ、２ＯＮ ４０ ＦＯＲＹ＝１ＴＯ１００ ５０ＮＥＸＴ Ｙ ６０ ＸＣ０Ｉ−１２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ ７０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ８０ＮＥＸＴ Ｙ ９０ ＮＥＸＴ Ｘ １００ ＦＯＲＹ＝１丁０１００００１１０ ＮＥ
ＸＴ Ｙ ２Ｏ０ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＡＮＡＬＹＳＥ’“、”Ｄ
”２０５ ＰＲＩＮＴ Ｈに、ＣＨＲ＄（７）２１０
ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２１１ＮＥＸＴ ｙ ２１２ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜、Ｉ ＴＨＥＮ
２１２２１５ ＸＣＯト１ ｄＯＦＦ、３ＯＮ２
１７ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｔ 丁ＨＥＮ ２
１７２１８ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ’“Ｒ２２
０ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｉ ＴＨＥＮ ２２０２
２２ ＦＯＲＸ＝ＩＴＯ２ ２２３ＸＣ０）Ｉ １ＯＦＦ、２ＯＮ２２４ ＦＯ
ＲＸ＝ＩＴＯ１００ ２２５ＮＥＸＴ Ｙ ２２６ ＸＣＯＨ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ ２２７ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２２８ＮＥＸＴ Ｙ ２２９ ＮＥＸＴ Ｘ ２４０ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｉ ＴＨＥＮ
２４０２５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、’“［［四′°
臀２６０ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｅｌ 丁ＨＥＮ
２００２７０ Ｄ＄＝“’ＯＰ” ２７９ Ｃ４＝０ ２８００ＰＥＮ ＃０４．Ｄ＄− ２９０ ＩＮＰＵＴ ＃Ｄ４，２９５．に、Ｂ、Ｃ２９
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ＲＩＮＴ ｚ； ３０１ ｚ＝ｚ＋１ ３０２ ＰＲＩＮＴ Ｃ４゜ ３０３ ＰＲＩＮＴゴ′： ３０４ ＰＲＩＮＴ ”／”； ３１０ ＩＦ Ｃｄ＞Ａ（４） ＴＨＥＮ ３９５３
１２ Ｑ＄＝Ｐ＄ ３１５ Ｐ＄＝”Ｔ” ３２ＯＳ＄＝’“５ＥＯＵＥＮＣＥ’″３３００ＰＥＮ
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１ ＧＯＴＯ４２０ ４１２Ｑ＄＝０ ４１３ ＣＨＡＩＮ ’“ＬＣＴ” ４２０ ＩＦ Ｑ＄＝’ゴ’ ＴＨＥＮ ４２２４２１
ＧＯＴＯ４３０ ４２２Ｑ＄＝０ ４２３ ＣＨＡＩＮ ’“ＬＯＴ” ４３０ ＩＦ Ｑ＄＝”Ｏ” ＴＨＥＮ ４３１４３
１ ＣＨＡＩＮ “’ＬＣＴ”ＲＡＳＩＣ： Ｌ
ＣＴ Ｉ ＲＥ）Ｉ Ｃ０ＰＹＲＩＧＨＴ １９８５
ＤＲ，ＲＯＢＥＲＴ Ｊ、ＭＥ’Ｌ八ＨＥへＥ５
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Ｃ”２０５ ＰＲＩＮＴ ＃に、ＣＨＲ＄（７）２１０
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２１７２１８ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｒ２２
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２２ ＦＯＲＸ＝ＩＴＯ３ ２２３ＸＣＯＨｌ０ＦＦ、２ＯＮ ２２４ ＦＯＲＸ＝１１０１００ ２２５ ＮＥＸＴ Ｙ ２２６ ＸＣ０）ｌ ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ２２７ ＦＯ
ＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２２８ＮＥＸＴ Ｙ ２２９ ＮＥＸＴ Ｘ ２４０ １Ｆ ＥＬＴ（０）＜ｒ 丁ＨＥＮ ２
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２Ｃ３＝Ｃ＋Ｃ３ ２９３ＧＯＴＯ２９０ ２９５ＣＬＯ３Ｅ ＃Ｄ３ ２９８ 汀 Ｚ＝０ 丁ＨＥＮ Ｚ・１３００ Ｐ
ＲＩＮＴ Ｚ： ３０１ Ｚ＝Ｚ＋１ ３０２ ＰＩ？ＩＮＴ Ｃ３； ３０３ ＰＲＩＮＴ “Ｇ− ３０４ＰＲＩＮＴ ’“／″１ ３１０ ＩＦ Ｃ３＞Ａ（３） ＴＩＩＥＮ ３９５
３１２ Ｑ＄−Ｐ＄ ３１５ Ｐ＄＝’“Ｇ′“ ３２ＯＳ＄−’”５ＥＱｔｌＥＮＣＥ“３３００ＰＥＮ
＃Ｄ５．Ｓ＄ ３４０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｄ５．”Ｇ’“３５０ ＣＬＯ
３Ｅ Ｒ０５ ３５５Ｚ１＝２１＋１ ３９０ ＣＨＡＩＮ ”ＬＤＴ“ ３９５ ＩＦ １１＜ＮＩ ＧＯＴＯ４００３９
６Ｚ１＝０ ３９７ Ｑ＄＝Ｐ＄ ４００ ＩＦ Ｑ＄＝”Ａ’“ ＴＨＥＮ ４０２
４０１ ＧＯＴＯ４１０ ４０２Ｑ＄＝０ ４０３ ＣＨＡＩＮ “’ＬＡＴ” ４１０ ＩＦ Ｑ＄＝”Ｃ” 丁ＨＥＮ ４１
２４１１ ＧＯＴＯ４２０ ４１２Ｑ＄−０ ４１３ＣＨＡＩＮ ’“［８丁“ ４２０ ＩＦ Ｑ＄−”Ｔ” 丁ＨＥＮ ４２
１４２１ Ｑ＄−〇 ４２２ ＣＨＡＩＮ “’ＬＤＴ“４３０ ＩＦ
Ｑ＄＝“’Ｏ” ＴＨＥＮ ４３１４３１ Ｃ
ＨＡＩＮ ’“ＬＤＴ“８ＡＳＩＣ； ＬＯＴ Ｉ ＲＥＭ Ｃ０ＰＹＲＩＧＩＩＴ １９８５ ＤＲ，
ＲＯＢＥＲＴ Ｊ、ＨＥＬＡＩ＋ＥＤＥ５ ＰＲＩＮＴ
＃に、’“ＦＬＯＷ”Ｗｌｏ ＸＣＯＨ３ＯＦＦ、
４ＯＮ １２ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ １３ＮＥＸＴ Ｙ １９ Ｉ？Ｅ）ｌ ＳＥＴ ＲＯＴＯｌ”ｔＹ
ＶＡＬＶＥ 王ｏ ＬＯＡＤ ＤＴＴＰ２０
ＦＯＲＹ＝１丁０４ ３０ ＸＣ０Ｍ １ＯＦＦ、２ＯＮ ４０ ＦＯＲＹ＝１ＴＯ１００ ５０ＮＥＸＴ Ｙ ６０ ＸＣ０Ｉ−１２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ ７０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ８０ＮＥＸＴ Ｙ ９０ ＮＥＸＴ Ｘ １００ ＦＯＲＹ＝１丁０１００００１１０ ＮＥ
ＸＴ Ｙ ２Ｏ０ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＡＮＡＬＹＳＥ’“、”Ｄ
”２０５ ＰＲＩＮＴ Ｈに、ＣＨＲ＄（７）２１０
ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２１１ＮＥＸＴ ｙ ２１２ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜、Ｉ ＴＨＥＮ
２１２２１５ ＸＣＯト１ ｄＯＦＦ、３ＯＮ２
１７ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｔ 丁ＨＥＮ ２
１７２１８ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ’“Ｒ２２
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２２ ＦＯＲＸ＝ＩＴＯ２ ２２３ＸＣ０）Ｉ １ＯＦＦ、２ＯＮ２２４ ＦＯ
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２４０２５０ ＰＲＩＮＴ ＃に、’“［［四′°
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１４３１ ＣＨＡＩＮ ”ＬＡＴｏ”ＢＡＳＩＣ：
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５ＰＥＣＩＦＩＣ）ＪＵＴ八ＧへＮＩＳＩＳ ＰＲＯ
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ＢＡＳＥＳ ＴＩＬＬ ＴＩＩＥ ＭｔＪＴＡＴ
ＩＯＮ’”Ｎ１１８ ＰＲＩＮＴ”ＥＮＴＥＲ５ＥＱ
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ＥＮ ＰＲＩＮＴ”Ｇ ’“１２６０ 汀 Ａ
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３１０ ＮＥＸＴ Ｙ ３１５ ＰＲＩＮ丁 ３２０ ＩＮＰＵＴ “’ＥＮＴＥＲＹ ＦＯＬ
ＬＯΔＥＤ ＢＹ ＲＥＴＵＲＮ 丁０３ＴＡＲ
Ｔ“Ｙ＄ ３３０ ＩＦ Ｙ＄−”Ｙ“ＴＩＩＥＮ ３４０
３４０ ＰＲＩＮＴ ３６０ ＦＯＲＩ＝ＩＴＯＮ ３７０ ＩＦ Ａ（Ｉ）−１ｎ１ＥＮ ３９０３８０
ＧＯＴＯ７００ ３９０ＸＣＯ＋１３０Ｆ「、４ＯＮ ４００ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ５００ ４１０ＮＥＸＴ Ｙ ４１５ ＸＣ０ＨＩＯＦＦ、２ＯＮ ４２０ ＦＯＲＹ＝１１０１００ ４３０ ＮＥＸＴ Ｙ ４４０ ＸＣ０Ｉ−１２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ４５０ ＦＯ
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ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｔ ＴＨＥＮ ６２０６
３０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”０６４０ 汀
ＥＬＴ（０）（ＲＴＨＥＮ ６４０６５０ ＰＲＩ
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Ｉ。
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６６６ ＰＲＩＮＴ “′Ａ “１
６６７ ＩＦ Ｉ＝Ｎ 丁ＨＥＮ ２０００６
７０ ＮＥＸＴ ｌ ６８０ ＧＯＴＯ３７０ ７００ＩＦ Ａ（Ｉ）−２ＴＨＥＮ ＧＯＴｏ
７２０７１０ ＧＯＴＯ１１００ ７２０ＸＣＯＨ３ＯＦＦ、４ＯＮ ７３０ ＦＯＲＹ＝１１０５００ ７４０ ＮＥＸＴ ’ｌ’ ７５０ ＦＯＲＸ＝ＩＴＯ２ ７６０ＸＣＯＨｌ０ＦＦ、２ＯＮ ７７０ ＦＯＲＹ＝１１０１００ ７８０ ＮＥＸＴ Ｙ ７９０ ＸＣ０Ｍ ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ８００ Ｆ
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ＰＲＩＮＴ ＃に、“Ｆｌ−ＯＷ”０９７０
ＩＦ ＥＬＴ（０）＜ＲＴＨＥＮ ９７０９８０
ＰＲＩＮＴ ＃に、“’ＦＬＯＷ“Ｆｅ１２ Ｉ
Ｆ ＥＬＴ（０）＜聾 Ｔ、ＨＥＮ ９９０９９５
ＰＲＩＮ丁 ■。
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ＰＲＩＮ丁 ■。
９９６ ＰＲＩＮｌ “°Ｃ“′６
９９７ ＩＦ Ｉ＝Ｎ ＴＨＥＮ ２０００１
０００ ＮＥＸＴ １ １０１０ ＧＯＴＯ３７０ １１００ＩＦ Ａ（１）−３ＴＨＥＮＧＯＴＯ１１２０
１１２０ＸＣ０Ｍ ３ＯＦＦ、４ＯＮ １１２５ ＦＯＲＹ＝１１０５００ １１３０ ＮＥＸＴ Ｙ １１４０ ＦＯＲＸ＝１丁０３ １１５０ ＸＣ０Ｍ １ＯＦＦ、２ＯＮ１１６０ Ｆ
ＯＲＹ＝１丁０１００ １１７０ ＮＥＸＴ Ｙ １１８０ ＸＣ０Ｉ−！ ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ１１９０
ＦＯＲＹ＝１丁０１００ １２００ ＮＥＸＴ ｙ １２１０ ＮＥＸＴ Ｘ １２２０ ＸＣＯＨ４ＯＦＦ、３ＯＮ １２３０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ５００ １２４０ＮＥＸＴ ｙ １２５０ ＦＯＲＹ＝１１０３ １２６０ ＸＣ０）Ｉ ｌ０ＦＦ、２ＯＮ１２７０ Ｆ
ＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ １２８０ＮＥＸＴ Ｙ １２９０ ＸＣ０）！ ２ＯＦＦ、ｌ０Ｎ１３００ Ｆ
ＯＲＹ＝１１’０１００ １３１０ ＮＥＸＴ Ｙ １３２０ ＮＥＸＴ Ｘ １３３０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｆ１３４０
１Ｆ ＥＬＴ（０）く丁 Ｔ１任Ｎ １３４０１
３５０ ＰＲＩｌ’ｌＴ ＃に、 ”ＦＬＯＷ”０１３
６０ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜ＲＴＨＥＮ １３６
０１３７０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｆ１
３８０ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｗ ＴＨＥＮ
１３８０１３８５ ＰＲＩＮＴ Ｉ。
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１３８６ ＰＲＩＮ丁 ”Ｇ “；１３８７
ＩＦ Ｉ＝Ｎ 丁ＨＥＮ ２０００１３９０ Ｎ
ＥＸＴ １ １４００ ＧＯＴＯ３７０ １５００ＩＦ Ａ（Ｉ）＝４ １ＨＥＮ ＧＯＴｏ
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ＲＹ＝ＩＴＯ１００ １７２０ＮＥＸＴ Ｙ １７３０ ＮＥＸＴ Ｘ １７４０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｆ１７５０
ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｔ ＴＨＥＮ １７５
０１７６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、“’ＦＬＯＷ”０１７
７０ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜ＲＴＨＥＮ １７７
０１７８０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｆ１７９
０ ＩＦ Ｅｌ汀（０）＜Ｗ ＴＨＥＮ １７
９０１７９５ ＰＲＩＮＴ Ｉｊ １７９６ ＰＲＩＮ丁 “°丁 °゛１１７９７
ＩＦ Ｉ＝Ｎ 丁ＨＥＮ ２０００１８００
ＮＥＸＴ １ １８１０ ＧＯＴｏ ３７０ ２０００ ＰＲＩＮＴ ’“５ＹＮＴＩＩＥＳＩＳ
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ＩＦ Ｉ＝Ｎ 丁ＨＥＮ ２０００１３９０ Ｎ
ＥＸＴ １ １４００ ＧＯＴＯ３７０ １５００ＩＦ Ａ（Ｉ）＝４ １ＨＥＮ ＧＯＴｏ
１５２０１５１０ ＧＯＴＯ３７０ １５２０ＸＣ０Ｍ ３ＯＦＦ、４ＯＮ １５３０ ＦＯＲＹ＝１１０５００ １５４０ ＮＥＸＴ Ｙ １５５０ ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ４ １５６０ＸＣ０Ｍ ｌ０ＦＦ、２ＯＮ １５７０ ＦＯＲＹ＝１１０１００ １５８０ ＮＥＸＴ Ｙ １５９０ ＸＣ０）！ ２ＯＦＦ、１ＯＮ１６００
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７０ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜ＲＴＨＥＮ １７７
０１７８０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ＦＬＯＷ”Ｆ１７９
０ ＩＦ Ｅｌ汀（０）＜Ｗ ＴＨＥＮ １７
９０１７９５ ＰＲＩＮＴ Ｉｊ １７９６ ＰＲＩＮ丁 “°丁 °゛１１７９７
ＩＦ Ｉ＝Ｎ 丁ＨＥＮ ２０００１８００
ＮＥＸＴ １ １８１０ ＧＯＴｏ ３７０ ２０００ ＰＲＩＮＴ ’“５ＹＮＴＩＩＥＳＩＳ
Ｉｓ Ｎｏ冒ＳＴＯ，ＰＰＥＤ ＪＵＳＴＢＥＦＯＲＥ
ＢＡＳＥ ＴＯＢＥ’“２０１０ ＰＲＩＮＴ
“’ １（ＵＴ
ＡＴ［Ｄ”２０２０ ｐ＋ｕ＋ｌＩｒ ２０３０ ＰＲＩＮＴ ”ＩＮＰＵＴ ６ Ｏ
Ｎ ＴＨＥ ＲＯ丁ＡＲＹ ＶＡＬＶＥ ＭＵ
ＳＴＣＯＮＴ八ＩＮ−丁Ｈへ“ ２０４０ ＰＲＩＮＴ ”ＡＬＴＥＲ［Ｄ ＢＡ
ＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥ ＢＡＳＥ ＴＨＡＴｒ
ＯＬＬＯＷｓ ＩＴ ＩＮ” ２０５０ ＰＲＴＮＴ ” ＴＩＩＥ
ＳＥ［）ＵＥＮＣＥ’“２０６０ ＰＲＩＮＴ ”
ＡＦＴＥＲＴＨＩＳ ＲＥＡＣＴＩＯＮ Ｉｓ
Ｃｏ トＩＰＬＥＩＥＤＩＮＰＵＴ Ｇ ＭＵＳＴ” ２０７０ ＰＲＩＮＴ ” Ｃ０
ＮＴ八ＩＮ ＴＨＥ ＣＯＭＰＬＥｒＥ ５ＥＴ
ＯＦ ＢへＳＥＳ” ２１００ ＩＮＰＵＴ ”ＥＮＴＥＲＹ ｒＯＬＬＷＥ
Ｄ ＢＹ ＲＥＴＵＲＮ ＷＨＥＮＲＥＡＤＹ”Ｙ＄ ２１１０ ＩＦ Ｙ＄＝”Ｙ” ＴＨＥＮ ２１２
０２１２０ ＸＣ０Ｍ ３ＯＦＦ、４ＯＮ２１３０
ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ５００ ２１４０ＮＥＸＴ Ｙ ２１５０ ＦＯＲＸ＝１１０５ ２１６０ ＸＣ０ＨＩＯＦＦ、２ＯＮ ２１７０ ＦＯＲＹ＝１１’０１００２１８０ Ｎ
ＥＸＴ Ｙ ２１９０ ＸＣ０Ｉ−１２ＯＦＦ、 ｌ０Ｎ２２００
ＦＯＲＹ＝１丁ｏｉｏ。
２２１０ ＮＥＸＴ Ｙ
２２２０ ＮＥＸＴ ×
２２３０ ＸＣＯ３４ＯＦＦ、３ＯＮ
２２．１１０ ＦＯＲＹ＝１１０５００２２５０
ＮＥＸＴ Ｙ ２２６０ ＸＣ０Ｉ（ｌ０ＦＦ、２ＯＮ２２７０ Ｆ
ＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２２８０ＮＥＸＴ Ｙ ２２９０ ＰＲＩＮＴ ＃に、’“ＦＬＯＷ”Ｆ２３０
０ ＩＦ ＥＬＴ（０）＜Ｔ 丁ＨＥＮ ２３
００２３１０ ＰＲＩＮＴ ＃に、”ｒＬｏ臀゛°
０２３２０ 汀 Ｅ［丁（Ｏ）く門 丁ＨＥＮ ２３
２０２３３０ ＰＲＩＮＴ ＃に、’“ＦＬＯＷ”Ｆ２
３４０ ＩＦ ＥＬＴ（０）く韓 丁ＨＥＮ ２
３４０２３９０ ＰＲＩＮ丁 ２４００ ＰＲＩＮＴ “’ＨＵＴＡＴＩＯＮ 八
Ｌ １ＮｓＥＲＴＩＯＮ Ｉｓ ＣＯＭＰＬＥ
丁ＥＩＮＰＵＴ ６ ）ＩＵＳＴ” ２４１０ ＰＲＩＮＴ °’ ＨＡＶ
Ｅ ＴＨＥ Ｃ０ＨＰＬ［丁Ｅ ＳＥＴ ０Ｆ
ＢＡＳＥＳ” ２４２０ ＩＮＰＵＴ ”ＥＮＴＥＲＹ ＷＨＥ
Ｎ ＲＥＡＤＹ Ｔｏ ＲＥＳＵＨＥＳＹＮＴＨ
ＥＳＩＳ”Ｙ＄ ２４３０ ＩＦ Ｙ＄−”Ｙ” ＴＨＥＮ ２４４
０２４４０ ＸＣ０Ｍ ３ＯＦＦ、４ＯＮ２４５０
ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ５００ ２／１６０ ＮＥＸＴ Ｙ ２４７０ ＦＯＲＹ＝１１０５ ２４８０ ＸＣ０Ｍ ｌ０ＦＦ、２ＯＮ２４９０ Ｆ
ＯＲＹ＝１１０１００ ２５００ ＮＥＸＴ Ｙ ２５１０ ＸＣ０Ｍ ２ＯＦＦ、１ＯＮ２５２０
ＦＯＲＹ＝１丁ｏｉｏ。
ＮＥＸＴ Ｙ ２２６０ ＸＣ０Ｉ（ｌ０ＦＦ、２ＯＮ２２７０ Ｆ
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ＯＲＹ＝１１０１００ ２５００ ＮＥＸＴ Ｙ ２５１０ ＸＣ０Ｍ ２ＯＦＦ、１ＯＮ２５２０
ＦＯＲＹ＝１丁ｏｉｏ。
２５３０ ＮＥＸＴ Ｙ
２５４０ ＮＥＸＴ Ｘ
２５５０ ＸＣ０１（４ＯＦＦ、３ＯＮ２５６０ Ｆ
ＯＲＹ＝１１０５００ ２５７０ ＮＥＸＴ Ｙ ２．５８０ ＸＣ０Ｍ ｌ０ＦＦ、２ＯＮ２５９０
ＦＯＲＹ＝ＩＴＯ１００ ２６００ＮＥＸＴ Ｙ ２６１０ ＸＣ０Ｉ（２ＯＦＦ、 １ＯＮ２６２０
ＦＯＲＹ＝１１’０１００２６３０ ＮＥＸＴ Ｙ ２６４０ ＰＲＩＮ丁 ＃に、“’ＦＩＯＷ”Ｆ２６
５０ １Ｆ ＥＬＴ（０）＜Ｔ ＴＨＥＮ ２６
５０２６６０ ＰＲＩＮＴ ＃に、“’ＦＬＯＷ”０２
６７０ １Ｆ ＥＬＴ（０）＜Ｆ ｒｌｌＥＮ
２６７０２６８０ ＰＲＩＮＴ ＃に、’“ＦＬＯＷ”
Ｆ２６９０ ＰＲＩＮ丁 ” Ｆ
ｒｌ・ｌｌ５ＨＥＤ“２７００ ＥＮＤ ５０００ ＰＲＩＮ丁 ”ＢＥＬＯＷ ＡＲＥ
ＴＨＥ ＶＡＲＩＯＵＳ ０ＰＥＲＡＴＩＯＮＡＬ
ＰＡＲＡ）ＩＥ丁ＥＲ３” ５００１ ＰＲＩＮ丁 “’ＦＬＯＷＲＡＴＥ＝２”
５００２ ＰＲＩＮＴ ’ゴＲＡＶＥＬ 丁Ｉ）
ＩＥ＝、１”５００３ ＰＲＩＮ丁 “ＲＥＡＣＴＩ
ＯＮ 丁ＩＭＥ＝２“５００４ ＰＲＩＮ丁 “Ｗ
ＡＳＨＴｌ１（Ｅ＝１”５００５ ＰＲＩＮＴ ”）Ｉ
ＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＴＩＭＥ＝２
’“５００６ ＰＲＩＮ丁 ”Ｃｏｔ−ＩＰＬＥＴＩ
ＯＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ＝１０”５０１０ ＩＮＰ
ＩＪＴ ”ＩＦ ＹＯＵ ＷＡＮＴ Ｔｏ
ＣＨＡＮＧＥ 八ＮＹ ０ＦＴＨＥ）Ｉ ＥＮＴ
ＥＲＹ”Ｙ＄ ５０２０ ＩＦ Ｙ＄−”Ｙ“ ＴＨＥＮ ５０３
５５０３０ ＧＯＴＯ９ ５０３５ＣＬＥＡＲ ５０４０ＰＲＩＮ丁 ”ＴＯＣＨＡＮＧＥ ＤＥＦＡ
ＵＬＴ ＶＡＬＵＥＳ ＥＮＴＥＲＹ＆ ＲＥＴＵ
ＲＮ” ５０５０ ＩＮＰＵＴ ”Ｄｏ Ｙｏｕ ＷＡ
ＮＴ 丁ＯＣＨＡＮＧＥ Ｔ１１Ｅ ＦＬＯＷＲ
Ａ王Ｅ （２）“Ｙ＄ ５０５５ Ｆ−２ ５０５６丁−５１ ５０［３０ＩＦ Ｙ＄−’“Ｙ“ 丁ＨＥＮ ５０
８０５０７０ ＧＯＴＯ５１４０ ５０８０ＩＮＰＵＴ ’”ＥＮＴＥＲＮＥ臀ＦＬＯＷＲ
ＡＴＥ“Ｆ５０９０ ＰＲＩＮＴ ”ＴＨＥ Ｐ
ＲＯＤＵＣＴ ＯＦ ＦＬＯＷＲ八丁Ｅ−へＲＡＶ
［ＬＴＩ）ＩＥ ＨＵＳＴ ＥＱＵＡビ５１００
ＰＲＩＮＴ ’ゴＨＥ ＲＥＱＵＩＲＥＤ ＬＯＡＤ
ＩＮＧ ＶＯＬＵ）ＩＥ Ｉ’ＨＩＳΔＩＬＬ Ａ
ＵＴＯＭＡＴＩＣＡＬＬＹ“５１１０ ＰＲＩＮＴ
’“ 八［丁ＥＲＥ
Ｄ”５１２０ Ｔ＝、２／Ｆ ５１２１ ＰＲＩＮＴ “’ＴＨＥ ＮＥＷ Ｔ
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２６７０２６８０ ＰＲＩＮＴ ＃に、’“ＦＬＯＷ”
Ｆ２６９０ ＰＲＩＮ丁 ” Ｆ
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ＰＲＩＮＴ Ｔ
５１４０ ＩＮＰＵＴ ’“Ｄｏ ＹＯＵ し
１八ＮＴ Ｔｏ ＣＨＡＮＧＥ ＲＥ八へＴＩＯ
ＮＴＩＭＥ （２）”Ｙ＄ ５１４５ Ｒ＝２ ５１５０ ＩＦ Ｙ＄−“Ｙｏ“ＴＨＥＮ ５１７０５
１６０ ＧＯＴｏ ５１８０ ５１７０ ＩＮＰＵＴ ”ＥＮＴＥＲＴＨＥ Ｎ
ＥＷ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＴＩＭＥＶＡＬＵＥ”Ｒ ５１８０ＩＮＰＵＴ “’Ｄｏ ＹＯＵ ＷＡＮＴ
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Ｅ （１）”Ｙ＄ ５１９０ Ｗ＝２ ５２００ ＩＦ Ｙ＄−“Ｙ“′ 丁１１［Ｎ
５２２０５２１０ ００丁０ ５２３０ ５２２０ ＩＮＰＵＴ “ＥＮＴＥＲ丁ＨＥ Ｎ
ＥＷ 臀ＡＳＨ丁ＩＭＥ ＶへＬＩＪＥ”シ（５２３
０ＰＲＩＮＴ ”ＤＯＹＯｔｌ ＷＡＮＴ 丁ＯＣ
ＨＡＮＧＥ ＴＨＥ ト＋ｔＪＴへＴ１０ＮＡＬ
ＲＥＡＣＴｒＯＮ ＴＩＩ（Ｅ”５２４０ ＩＮ
ＰＵＴ ” （２）
”Ｙ＄５２５０１−１＝２ ５２６０ ＩＦ Ｙ＄−”Ｙ” 丁１任Ｎ ５
２８０５２７０ ＧＯＴＯ５２９０ ５２８０ＩＮＰＵＴ ”ＥＮＴＥＲＮＥＷ ＭＵ丁
ＡＴＩＯＮ八へＲＥ八へ丁ＩＣＩＮ王ＩＭビＨ ５２９０ＰＲＩＮＴ “’Ｄｏ Ｙｏｕ ＷＡＮ
Ｔ Ｔｏ ＣＨＡＮＧＥ 丁＋１Ｅ Ｃ０ＨＰ
ＬＥＴＩＯＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ” ５３００ ＩＮＰＩＪ王 ”
ＴｒＭＥ（１０）“’ＹＳ５３１０
Ｆ＝１０ ５３２０ ＩＦ Ｙ＄＝”Ｙ” ＴＨＥＮ ５３４
０５３３０ ＧＯＴＯ５４００ ５３４０１ＮＰＵ丁 ”ＥＮＴＥＩＩ ＮＥＷ Ｒ
ＥＡＣＴＩＯＮ Ｃ０ＨＰＬＥＴＩＯＮ丁丁ト任”Ｆ ５４００ ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、’丁ＬＯＷ”、Ｆ５４
１０ ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、”ＴＲＡＶＥＬ 丁Ｔ）
ＩＥ”、丁５４２０ ＰＲＩＮＴ ＨＰ、”ＲＥＡ
ＣＴＩＯＮ ＴＩＭＥ”、Ｒ５４３０ＰＲＩＮＴ
＃Ｐ、”ＷＡＳＨ丁１１４Ｅ“、−５４４０ＰＲＩＮＴ
＃Ｐ、”ＭＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＡＣＴＴＯＮ
丁１１（Ｅ“Ｈ５４５０ＰＲＩＮＴ ＃Ｐ、“’Ｃ
ＯＭＰＬＥ丁ＩＯＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＴＩ）Ｉ
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第１図は、本発明の一実施態様の実施において用いられ
得る異なる構成要素の概略図でおり、第２図は、本発明
による配列決定に用いられ得る反応および配列段階の概
略表示で必り、第３図は、本発明による部位特異的変異
生成に用いられ得る反応および配列段階の概略表示であ
ゆ、第４図は、本発明により用いられ得るコンピュータ
ープログラムのフローチャートて必り、また第５図は、
本発明の一実施例において用いられた反応至の図である
。
得る異なる構成要素の概略図でおり、第２図は、本発明
による配列決定に用いられ得る反応および配列段階の概
略表示で必り、第３図は、本発明による部位特異的変異
生成に用いられ得る反応および配列段階の概略表示であ
ゆ、第４図は、本発明により用いられ得るコンピュータ
ープログラムのフローチャートて必り、また第５図は、
本発明の一実施例において用いられた反応至の図である
。
Claims (12)
- （１）（ａ）既知の窒素含有塩基を有する活性化ヌクレ
オシド５′−三リン酸を、鋳型依存性ＤＮＡポリメラー
ゼと、プライマーがプライマーの３′末端で鋳型よりも
少なくとも１ヌクレオチド残基短いものであるように相
補性オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリットされ
た一重鎖ポリヌクレオチド鋳型とからなる反応混合物へ
、該活性化ヌクレオシド５′−三リン酸が鋳型の非対合
ヌクレオチド残基に相補性である場合にプライマーの３
′末端でのプライマー上への活性化ヌクレオシド５′−
三リン酸前駆体の取込みをもたらす条件下で添加し、そ
して （ｂ）該ヌクレオシド５′−三リン酸前駆体がプライマ
ー鎖中に取込まれたか否かを検知する ことでなるヌクレオチドの塩基配列を決定するための方
法。 - （２）活性化前駆体の取込みの検知が、 （ａ）反応混合物から、取込まれなかったヌクレオシド
５′−三リン酸前駆体を分離し、そして（ｂ）分離され
た成分中における取込まれなかつたヌクレオシド５′−
三リン酸前駆体の存在または不存を検知する ことにより行なわれるものである特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 - （３）分離された取込まれなかつたヌクレオシド５′−
三リン酸前駆体の存在または不在が吸収分光学によつて
検知されるものである特許請求の範囲第２項に記載の方
法。 - （４）吸収波長が紫外域にあるものである特許請求の範
囲第３項に記載の方法。 - （５）分離された取込まれなかったヌクレオシド５′−
三リン酸前駆体の存在または不在が螢光分光学によつて
検知されるものである特許請求の範囲第２項に記載の方
法。 - （６）前駆体の取込みの検知が、 （ａ）反応混合物から、取込まれなかったヌクレオシド
５′−三リン酸前駆体を分離し、そして（ｂ）分離され
た取込まれなかつたヌクレオシド５′−三リン酸前駆体
の存在または不在を電気化学的に検知する ことにより行なわれるものである特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 - （７）活性化ヌクレオシド５′−三リン酸が放射標識さ
れ、そして分離された取込まれなかった放射標識ヌクレ
オシド５′−三リン酸の存在または不在を放射能計数に
より検知するものである特許請求の範囲第２項に記載の
方法。 - （８）鋳型がＤＮＡからなり、ヌクレオチドポリメラー
ゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼからなり、また活
性化ヌクレオシド５′−三リン酸前駆体がデオキシリボ
ヌクレオシド５′−三リン酸前駆体からなるものである
特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 - （９）鋳型がＤＮＡからなり、ヌクレオチドポリメラー
ゼがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなり、また活
性化ヌクレオシド５′−三リン酸前駆体がリボヌクレオ
シド５′−三リン酸前駆体からなるものである特許請求
の範囲第１項または第２項に記載の方法。 - （１０）鋳型がＲＮＡからなり、ヌクレオチドポリメラ
ーゼがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼからなり、また
活性化ヌクレオシド５′−三リン酸前駆体がデオキシリ
ボヌクレオシド５′−三リン酸前駆体からなるものであ
る特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 - （１１）（ａ）既知の窒素含有塩基を有する活性化ヌク
レオシド５′−三リン酸を、鋳型依存性ヌクレオチドポ
リメラーゼと、プライマーの３′末端で鋳型よりも少な
くとも１ヌクレオチ ド残基短いものであるプライマーにハイブ リッドされた既知配列を有する一重鎖ポリ ヌクレオチド鋳型とからなる反応混合物へ、該活性化ヌ
クレオシド５′−リン酸前駆体が鋳型の非対合ヌクレオ
チド残基に相補性で ある場合にプライマーの３′末端でのプライマー上への
活性化ヌクレオシド５′−三リン酸の取込みをもたらす
条件下で添加しそし て、 （ｂ）反応混合物から取込まれなかった前駆体を分離し
、そしてこの分離された成分中の 取込まれなかったヌクレオチドの相対量を 検知することにより５′−三リン酸の取込みを検知し、 （ｃ）変異生成されるべき残基の前に位置する鋳型上の
ヌクレオチド残基まで、プライ マーが伸長するまで上記（ａ）および（ｂ）段階を繰返
し、 （ｄ）鋳型と誤対合するであろう所望の変異を構成する
塩基を有するヌクレオシド５′− 三リン酸の類似体を、該類似体のプライ マー鎖中への取込みをもたらす条件下で添 加し、 （ｅ）反応混合物から取込まれなかった類似体を分離し
、そしてこの分離された成分中の 取込まれなかった類似体の相対量を検知す ることによって類似体の取込みを検知し、 さらに （ｆ）変異生成されたヌクレオチドの合成が完了するよ
うに、４つの塩基のすべての混合 物からなる活性化ヌクレオシド５′−三リン酸前駆体群
を反応混合物に添加する ことでなるヌクレオチドの部位特異的変異生成のための
方法。 - （１２）ヌクレオシド５′−三リン酸の類似体がヌクレ
オシド（１−チオ）−三リン酸からなるものである特許
請求の範囲第１１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US756129 | 1985-07-18 | ||
| US06/756,129 US4863849A (en) | 1985-07-18 | 1985-07-18 | Automatable process for sequencing nucleotide |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6285863A true JPS6285863A (ja) | 1987-04-20 |
Family
ID=25042161
Family Applications (1)
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