JPS6288962A - クロマトグラフイ−によるアルブミンの短時間分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、クロマトグラフィーを用いて、アルブミンを
メルカプトアルブミンとノンメルカプトアルブミンとに
迅速に分離する方法に関する。

アルブミンは生体細胞や体液中に広く含まれる蛋白質で
、血漿の膠實浸透圧の採得や生体内における物′瓜の移
送等の侵能を有し、Ｉ￥１ＩＩＩ　Ｉ包の生活にきわめ
て密接な関連をもつ。アルブミンは構造の異なる複数の
成分からなることが知られているが、蛋白質の分離、分
析に用いられる】１０常の電気泳動や液体クロマトグラ
フィーでは単一のピークとしてしか検出されない。アル
ブミンを迅速かつ簡便に複数の成分に分離することは、
生化学や医学の分野において極めて有用であり、例えば
、アルブミン中の特に有用な成分の分離株１８．４が可
能になるばかりでなく、複数の成分の分離情報を臨床症
状の指標として、臨床検査へ応用することも町：ｉ目と
なる、 通常、人の体液中のアルブミンは、メルカプトアルブミ
ンとノンメルカプトアルブミンよりなるが、メルカプト
アルブミンの全アルブミンに対する比率は腎疾患、肝疾
廖で、その病、態とよく対応して低下するため、診断督
よび病１．１！！管理の新しい指標として最近注目され
ている。ＣＳｏｇａｍｉ　Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　、　（ｉ
ｎ　ｐｒｅｓｓ　）］（従来の技術および発明が解決し
ようとする問題点） アルブミンをメルカプトアルブミンとノンメルカプトア
ルブミンとに分離した報告は、従来多くはないが、例え
ば、スルホエチルセファデックス（商品名、ファルマシ
ア社、スウェーデン）１に固定相とし、移動相に酢酸−
酢酸す）　ＩＪウム緩衝液を用い、塩化ナトリウムの濃
度勾配をかけるイオ７９：　換りＣ１？　トゲラフイー
法（Ｒ，Ｄ、Ｈａｇｅｎｍａｉｅｒ＆　Ｊ、Ｆ、　Ｆｏ
ｓｔｅｒ　（＋　９７１　）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　１０゜６３７〕、２−ピリンルサルファイド基を
リガンドとしたセファローズを固定相とし、アルブミン
を通液すると、アルブミン中のメルカプトアルブミンの
みがリガンドと共有結合を生ずる。その後、システィン
または僅元型グルタチオン等で溶出せしめる、いわゆる
コバレフトクロマトグラフィー法（Ｊ、Ｃａｒｌｓｓｏ
ｎ　＆　Ａ、５ｖｅｎｓｏｎ　（１９７４）　ＦＥＲ８
Ｌｅｔｔ、、　４２．１８４　］等カアル。

しかしながら、いずれの方法も試料の前処理として、血
清または血漿中からアルブミンのみを単離して用いる必
要があるし、また、ゲルの強度上の理由から低流速で行
なわなければならず、分離分析に極めて長時間を要し、
かつ、移動相を途中で変える操作を伴なうので、迅速、
簡便なアルブミンの分離方法とは言えない。

また、最近、硬質の全多孔質ゲルを固定相とし、】１へ
常の緩衝用基剤を含む水溶液を移動相とするアルブミン
の分離方法（特開昭５９−６７４５６号）が開発され、
かなり簡便に分離分析が行なえるようになったが、それ
でもなお、分析終了まで約１００分を要していた。

（問題点を解決するための手段） 木発明者らは、前記の問題点を克服するため鋭意研究の
結果、迅速かつ簡便な操作でアルブミンを複数の成分に
分離する方法を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、主鎖に直接結合したアルコール性
水酸基とイオン交閾基とを有する全多孔性粒状架橋共重
合体を固定相とし、埠動相のｐＨが５．０〜６．５で、
かつ、移動相の少なくとも一部がアンチカオトロピック
イオンを含む水溶液であるクロマトグラフィーによって
、アルブミン中の少なくともメルカプトアルブミンとノ
ンメルカプトアルブミンを、従来法と比較してはるかに
短時間のうちに分離する方法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で言うメルカプトアルブミンとは、アルブミン分
子鎖のＮ宋端から５４番目のアミノ酸が一８ＨＥを有す
るシスティン残基であるアルブミンであり、ノンメルカ
プトアルブミンとは、このシスティン残基とシスチン、
酸化型グルタチオン、またはその他の−８−８−結合を
有する低分子化合物が、分子１ｆｉ’ｌ　−Ｓ　Ｈ、−
８−８−交換反応により結合したもので、−８Ｈ基が存
在しないアルブミンを言う、 本発明で固定相として用いられる硬質の全多硬性粒状架
橋共１合体（以下、単にゲルと表わす）は、少なくとも
主鎖に結合したアルコール性水酸基を有する。主鎖に直
接結合したアルコール注水酸基とは、例えば、酢酸ビニ
ルや炭酸ビニレンの重合体をケン化して得られる水酸基
のことである。

水酸基の量は、ゲル乾燥重量当り３〜９　ｍｅｑ／ｆの
範囲にあるのがよい。ここで、水酸基の量は、例えば、
水酸基を無水酢酸と反応させて、消費した無水酢酸の量
またはゲルの重量変化を測定することで求めることがで
きる。

また、本発明のゲルは、水酸基の他にイオン交換基を有
する。例えば、アミノ基、ジエチルアミノ基等の弱塩基
性アニオン交換基、４級アンモニウム基等の強塩基性ア
ニオン交換基、あるいはカルボキシル基、リン酸基等の
弱酸性カチオン交換基、スルホン酸基のような強酸性カ
チオン交換基が好ましい。中でも塩基性アニオン交換基
が好ましく、特に１ジエチルアミノ基等の弱塩基性アニ
オン交換基が好ましい。また、イオン交換基の量は、０
．１〜３．０　ｍｅｑ／ｆの範囲にあるのが好ましい。

イオン交換基の諺は、通常のイオン交換樹脂の交換容量
の６１１１定方法で求めることができる。

上記の水酸基およびイオン交換基は、ゲル全体に分布し
ても、また、ボア形成部分すなわちボア表面のみに分布
してもよい。

本発明の架橋共重合体の架橋構造は特に限定されないが
、例えば、トリアリルイソシアヌレート、ジアリルイソ
シアヌレートやトリアリルシアヌレート等のトリシアヌ
レートａやトリアジン環を有する架橋性単量体単位によ
って架橋された構造等を挙げることができる。なかでも
トリアリルイソシアヌレートによって架橋された構造が
好ましい。

本発明で用いる硬質のゲルとは、機械的強度が大で、し
かも、内部までボアが分布した構造を有するゲルのこと
である。このようなゲルは、前述したセファデックスの
ような軟質のゲルと異なり、乾燥状態でも膨潤時のボア
構造を実質的に維持するため、乾燥状態での比表面積が
大である。本発明のゲルは、通常、乾燥ゲル重量当り２
ｒｎ”７９以上、好ましくは５〜１０００ｍ”／ｆの比
表面積を仔する。一方、軟質ゲルの乾燥時の比表面積ｊ
　ｍ２／７以下の小さい値を示す。比表面積が本発明の
範囲にあるゲルは、機械的強度が大きいので、クロマト
グラフィー用の担体として用いたときに、溶離溶媒を高
流速で通液することができ、迅速な分離・分析が可能と
なる。ゲル中のボアの大きさは、少なくともアルブミン
が浸透できる程度の大きさであればよい。ボアの大きさ
は、デキストラン、ポリエチンングリコール等の分子皆
既Ｗの標準サンプルヲ用いてゲルパーミェーションクロ
マトグラフィーを行ない、得られた検址線から公知の方
法で推定することができる。

本発明のゲルの粒径は、通常は１〜２０００７＋ｍの範
囲にあるのがよい。高速液体クロマトグラフィー用充填
剤として用いる場合は、平均粒径が２〜１５μｍの範囲
にあるのが好ましい。大寸サンプルの分離を目的とする
場合は、より大きい粒径でよい。

本発明の硬頁ゲルの一例は、特開昭５９−８２６１号公
報に示されている。

アルブミンの分離は、前記ゲルを通常ステンレスやガラ
スのカラムに充填し、いわゆる液体クロマトグラフィー
によって行なわれるが、薄層クロマトグラフィーとして
行なってもよい。

本発明で用いる移動相のｐＨは３．０〜６．５である。

さらに好ましくは４．５〜６．０である。、また、移動
相の少なくとも１１類は、アンチカオトロピックイオン
を含む水溶液である。ここで言う少なくとも１種類とい
う意味を以下に説明する。クロマトグラフィーにおいて
移動相の組成は、場合によっては、段階的または連続的
に変化させる必要があるが、その段階的または連続的な
組成変化は、２種類以上の移動相を用意し、それを逐次
所定の比率で混合することによって形成する。この２種
類以上の移動相のうち、少なくとも１種類は、アンチカ
オトロピックイオンを含む水浴液であり、また、りａマ
ドグラフィーを行なう間、移動相の組成′ｆｃ変化させ
ない場合は勿、倫、その単一の移動相がアンチカオトロ
ピックイオンを含む水＠液であるという意味である。

また、ここで言うアンチカオトロピックイオンとは、Ｓ
α−のような多価のイオン、Ｆ−のようなイオン半径の
小さいもので、水の規則構造を安定化し、結果として水
溶液中の蛋白ｐｉ　ｃｒ）疎水結合を強めるようなイオ
ン、言い堕えると、塩析効果の強いイオンを表わす。具
体的には、クエン酸イオン、酒石酸イオン、ｓｏ七、Ｆ
−１ＣＨ，Ｃｏｏ−１ＣＺ−１（ＣＨ，１４Ｎ　、　Ｎ
Ｈ４等である。〔堀尾武−９山下仁平（１９８１）、　
　”蛋白斑・酵素の基礎実恢法“。

南江堂・今堀和友、山用民夫（１９８４）。

”生化学辞典”、東京化学同人〕 アンチカオトロピックイオンの中でも、硫酸、クエン酸
、酒石酸の各基の少なくとも一つを０．０１〜１．ＯＭ
、好ましくは０．１〜０．７　Ｍ（７）範囲で含む水容
液は、本発明の移動相として時に好ましい。

移動相のｐＨ，移動相に加える塩の種＠または濃度が、
前記１囲にあることにより、メルカプトアルブミンとノ
ンメルカプトアルブミンの分離、あるいはそれらと他の
成分との分離を、より短時間に、かつ良好に行なうこと
が可能となる。

また、上記塩の他ｌこ、１ｍ常のクロマトグラフィーの
移動相に用いるｐＨ緩衝用基斉１φ：含まれてぃてもよ
いことはａうまでもない。

さらに、エタノール、メタノール、アセトニトリル、エ
チレングリコール等の水浴性の有機溶媒を少量加えるこ
とにより、クロマトグラムの形状をシャープにすること
ができる。

クロマトグラフィーを行なう間、移動相の組成は変化さ
せることなく一定組成のままでもよいし、必要により、
段階的または連続的に変化させてもよい。

被分離成分がメルカプトアルブミンまたはノンメルカプ
トアルブミンを含むことの確認は、メルカプトアルブミ
ンがシスチンまたハ酸化型グルタチオンによって１ぼ化
され、ノンメルカプトアルブミンに変化し、ノンメルカ
プトアルブミンが還元型グルタチオンによって還元され
、メルカプトアルブミンに変化する性質を利用して行な
うことができる。すなわち、前もってシスチン、酸化型
グルタチオンまたは還元型グルタチオンを加え反応せし
めた試料のクロマトグラムと、未処理の試料のタロマド
グラムの各成分の才的変化によって碌認することができ
る。あるいは、もつと直接的に被分離成分の官能基（Ｓ
Ｈ基）の分析で行なうことができる。

（実施例） 以下に本発明の実施例を示すが、本発明の節回は、これ
らの実施例により限定されるものではない。

実施例１ アルブミンの分離は、以下に示すような条件の液体クロ
マトグラフィーで行なった。なお、カラム（Ａｓａｈｉ
ｐａｋ　ＥＳ　−５０２Ｎ　）は、主ｍ　Ｋ　ｒｔＬ　
ｔｌｊ　結合したアルコール性水酸基とイオン交換基Ｃ
ジエチルアミノ基）とを有する硬質の全多孔性粒状架橋
重合体を固定相とした高速液体クロマトグラフィー用充
填カラムである。

カラム：旭化成工業（＋’ｉ　）商品名Ａｓａｈｉｐａ
ｋ　Ｅ　Ｓ　−５０２Ｎ内径７．６龍、畏さ１０− 移動相：　５０ｒｒＬＭ　Ｎ−メチルピペラジン−ＨＣ
ｌ−４−４００１７１Ｍ　Ｍｅ酸ナナトリウム＋１％エ
タノールｐＨ４，８） （・シ移動相全体積の１４エタノールを含むの童　） ポンプ二日本分光工業（株）商品名 ＴＲＩ　　ＲＯＴＡＲ−■（流＠：　１　、Ｏｙｄ７ｒ
ｍ’ｉ　）検出器：日本分光工業（株］　商品名 ＦＰ−２１０（励起光波長：　２８０　ｎｍけい光波長
：３４０ｎｍ） 温　　度＝　５５Ｃ （結　果） 血ｒＩＩ（オーツ・ダイアグノスティック・システムズ
ｃ株）製のノーマルコントロール血清）の分析例を第１
図に示した。クロマトグラムかられかるように、グロブ
リン、メルカプトアルブミン、ノンメルカプトアルブミ
ンの順に浴出し、約２０分で分析は終了した。各成分の
分離は良好であった。

実施例２ 移動相のエタノール濃度に勾配をかけて、実施例１と同
様に血清中のアルブミンを分析した。

詳細は以下に示す。

カラム：実施例１と同様 移動相：Ａ液：　５０　ｍＭ　Ｎ−メチルビペラジン−
ＨＣｌ。

−１−４００１ｎＭ硫酸ナトリウム（ｐ）１４．８）Ｂ
液：５０ｍＭＮ−メチルピペラジｙ−ＨＣ４−ｌ−４０
０ｒ！′ＬＭ硫酸ナトリウム＋１（１エタノール（ｐＨ
４，８１ 送液ポンプの吸入側にＡ液とＢ液を濃度勾配形成装置を
介して接続し、Ａ／Ｂ（体積比）が９０７１０になるよ
うに設定し、カラムを平衡化した。

その後は、第２図に示すように、Ｂ液の比率を徐々に上
げて行く５段階の直線的勾配溶離を行なった。

なお、試料の注入は濃度勾配形成を開始してから５分後
に行なった。

ポンプ二日本分光工業（株）商品名 ＴＲＩ　ＲＯＴＡＲ−Ｖ　（流量：　１　、Ｏｍｌ／ｒ
ｔｉｎ　）１き度勾配形成装置二日木分光工業ｃ株）商
品名グラジェントプログラマＧＰ−Ａ４０ 検出器二日本分光工業（株）商品名 ＵＶＩＤＥＣ−１００−■　（波９：２８０ｎｍ）温　
　度　＝　６０　Ｃ （賠　果） 実施例１と同一血清の分析例を第６図に示した。

クロマトグラムを見るとわかるように、グロブ１ノン、
尿酸、メルカプトアルブミン、ノンメルカプトアルブミ
ンの順に溶出し、分析は約１５分で終了した。各成分の
分離は極めて良好であった。

実施例５ 実施例２と同様の装置、同様の移動相（Ａ液、Ｂ液）を
用い、第４図に示すような５段階の直線的勾配溶離を行
なって、ヒト血清アルブミンを分離した。（試料注入は
１度勾配形成開始と同時に行なった。） 試　　料：　　ＭＩＴ、ＥＳ　製 人血清アルブミｙ　（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ＞検出濡：
日本分光工業Ｃ株）　商品名 ）；’ｐ−２１０（励起光ｅ艮：　２８０ｎｍけい光ｅ
長：　３４０ｎｍ　１ 温　度＝３５Ｃ （結　果） 人＋（ｌＩ消アルブミンを分離した例を第５図に示した
。微廿のグロブリン、メルカプトアルブミン（ＨＭＡ＞
、ノンメルカプトアルブミン（ＨＮＡ）、ＨＭ　Ａ　ｄ
ｉｍｅｒの順に溶出し、各成分の分離は啄めて良好であ
った。しかも、この条件ではＨＮＡをさらに２成分に分
離することができる。すなわち、５４番目のシスティン
残基にさらにもう−イ固システィンが結合したＨＮＡ（
ＣＹＳ）とグルタチオンが結合したＨＮＡ（ＧＬＵＴ）
である。

比叔例 特開昭５９−６７４５６号に基づき、Ａｉｒ述の便實の
全多孔質ゲルを固定相とした昼速液体クロマトグラフィ
ー用充填カラムを用い、以下に示す条件の液体クロマト
グラフィーによって、血ｆａ中のアルブミンの分析を行
なった。

カラムニ旭化成工業ｃ株）　商品名 Ａｓａｈｉｐａｋ　Ｇ　Ｓ　−５２０ （内径７．６ｍｙａ、長さ５０　ｔ’ｔｎ　）　ｘ　４
本移−相：３０′ｒｒＬＭリン酸ナトリウム−１−１５
０ｍＭ　ｊｍＥ酸ナトリウム（ｐＨ７，０）ポンプ二日
本分光工業（株）　商品名 ＴＲＩ　　ＲＯＴＡＲ−Ｖ　　（流量：　１　、Ｏｄ　
／ｖｍ　）検出器：日本分光工業（株）　商品名 ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＶＩ　　（波、ｉ　　二　２８
０ｎｍ）温　度＝５０Ｃ （結　果） 血清（オーフ・ダイアグノスティック・システムズ（株
）製のノーマルコントロール血清）の分析例を第６図に
示した。クロマトグラムを見るとわかるように、分析に
は１００分以上を要し、メルカプトアルブミンとノンメ
ルカプトアルブミンの分離は不充分であった。

本発明のクロマトグラフィーによるアルブミンの分離に
おいては、硬質の全多孔性粒状架橋共重合体にアルコー
ル性水酸基の他にイオン交換基を導入し、しかも、移動
相のｐＨが３．０〜６．５で、かつ、移動相の少なくと
も１棟類にアンチカオトロピックイオンを含む水＠液を
用いることによって、メルカプトアルブミンとノンメル
カプトアルブミンのゲルへの親和性の差を大きくするこ
とができるようになった。このため分離度が飛躍的Ｖこ
向上し、従来、カラム長２ｍで約＋００分を要していた
メルカプトアルブミンとノンメルカプトアルブミンの分
離が（特開昭５９−６７４５６号）、本発明におけるり
ａマドグラフィーによって、カラム侵１０閤、所要時間
約１５分で可能となった。

このように、本発明における方法は、再現性、迅速性あ
るいは簡便性等あらゆる点にも−いて、従来のいかなる
方法よりもけるかにテ優れている。肝疾恣の早期診ホＪ
［、重症度刊定もさることながら、本発明の分離法の迅
速性から、緊色を要する体液浄化療法施行の時期決定や
予ｉ　７）３４祭にも有用であろう。また、体液および
生物製剤中のアルブミンとグロブリンを分１にを分析、
または分離採取するのにも有効であることは訂うまでも
ない。

【図面の簡単な説明】

、窮１図は実施例１によって健常人（血清を分離した結
果を示すクロマトグラム、第２図は央廁例２の直憚的勾
配浴離を示す図表、第３しＩは実施例２によって健常人
＋ｍ嘴を分離した結果を示すクロマトグラム、第４図は
実施例３の直線的勾配溶離を示す図表、第５図は実施例
５によって人血清アルブミンを分離した結果を示すクロ
マトグラム、：ｕ６図は比較例によって健常人血清を分
離した結果を示すクロマトグラムである、

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 主鎖に直接結合したアルコール性水酸基とイオン交換基
   とを有する硬質の全多孔性粒状架橋共重合体を固定相と
   し、移動相のｐＨが３．０〜６．５で、かつ、移動相の
   少なくとも一部がアンチカオトロピツクイオンを含む水
   溶液であるクロマトグラフィーによつて、アルブミン中
   の少なくともメルカプトアルブミンとノンメルカプトア
   ルブミンを分離することを特徴とするアルブミンの分離
   方法。