JPS6289629A

JPS6289629A - 組織親和性コラ−ゲンとその製法

Info

Publication number: JPS6289629A
Application number: JP61145680A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Hizuka; 正博肥塚; Kunio Takaoka; 邦夫高岡; Kaneo Suzuki; 鈴木　銀男; Shigeo Yasugi; 八杉　重雄
Original assignee: Nitta Gelatin Inc
Current assignee: Nitta Gelatin Inc
Priority date: 1985-06-21
Filing date: 1986-06-21
Publication date: 1987-04-24
Anticipated expiration: 2009-08-17
Also published as: EP0206801A3; JPH0662679B2; EP0206801A2; US4975527A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕この発明は、骨形成因子の担体などに用いられる組織親
和性コラーゲンとその製法に関する。

〔背景技術〕

従来、生体における骨欠損部を補填する場合、主に、患
者自身の骨から自家骨を取って自家骨移植していた。こ
れは、同種骨移植や異種骨移植より取り込みの進行が早
く、確実だからである。しかし、自家骨移植の使用は、
以下のような欠点がある。■自家骨の採取量は自ずと限
られる。■自家骨の採取は、同じ患者に付加的な外科処
置が必要で、感染の危険が増し、手術時間が長くなり、
患者に苦痛を与える。それゆえ、骨欠損部が大きいと、
セラミックや金属などの人工生体材料が、骨移植の代用
に用いられてきた。しかしながら、このような人工生体
材料は、たやすく周囲の骨組織に取り込まれない。なぜ
なら、充分な量の骨が生体材料の周囲に形成されないか
らである。

この問題を解決するためにコラーゲンに骨形成因子を複
合させた骨誘導性生体材料や、さらに所要の形状のセラ
ミックなどの組織親和性を持った材料に上記複合体を付
着させた生体材料を骨欠損部の補填および固定に用いる
ことが、発明者らにより考えられた（特開昭６０−２５
３４５５．アメリカ特許出願第７３７３８６号）。

コラーゲンおよび骨形成因子（ＢＭＰ）は、この分野や
関連文献においても知られている。コラーゲンは、化学
１分子構造、生化学的特質および免疫学の面では評価が
確立している。酵素可溶化コラーゲンは、その比較的低
い抗原性のため、生体材料としてよく用いられる（たと
えば、アメリカ特許４３１４３８０号）。ＢＭＰは、タ
カ才力らによってＤｕｎｎ骨肉腫より分離され（Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　２：　４６６４７１
．１９８１）、Ｕｒｉｓｔによって骨組織より分離され
た（アメリカ特許４２９４７５３号）。Ｊｅｆｆｅｒｉ
ｅｓは、骨移植物を移植することにより骨形成を誘導す
る方法を開示した（アメリカ特許４４７２８４０号）。

骨移植物は、コラーゲンと脱塩した骨粉子および／また
は骨から取った骨形成因子より得たものであった。

発明者らは、タカ才力らが開示したように、Ｄｕｎｎ骨
肉腫より分離し、精製したＢ　Ｍ　Ｐ、および、従来の
方法により得られた酵素可溶化コラーゲンを用いた骨誘
導性生体材料を作った。マウスの背部訪問にその生体材
料を移植して、骨形成能を調べたところ、つぎのような
ことがわかった。ＢＭＰだけを移植する場合は、異所骨
形成を誘導するには、多量のＢ　Ｍ　Ｐが必要であった
。一方、コラーゲンと組み合わせて移植した場合は、ず
っと少ないＢＭＰで異所骨形成がみられた。

しかしながら、従来の方法で得られた酵素可溶化コラー
ゲンを用いると、異所骨形成がいつもスムースに起こる
わけではなかった。その達成は、用いられたコラーゲン
のテロペブタイドの量に明らかに左右される。テロペプ
タイドの量は、コラーゲンの抗原性に密接に関連してい
る。このようにテロベプタイドをあまり含まないコラー
ゲンが用いられたときは、移植された一定量のＢＭＰに
対して誘導される骨の量は増えた。異所骨形成を誘導す
るために必要なり　Ｍ　Ｐを最低限の量は減った。この
実験では高い再現性が得られた。すなわち、ＢＭＰを用
いる異所骨形成の満足できる誘導を得るためには、より
低い抗原性を有するコラーゲンが必要とされる。精製さ
れたＢＭＰはわずかじか得られないため、コラーゲンを
ＢＭＰの担体として用いることも実際上、重要である。

コラーゲンの抗原部位はコラーゲン分子の末端非ヘリッ
クス部分（テロペプタイド）に主に存在するため、抗原
性を除去する方法はコラーゲン分子のテロペプタイドの
除去を通じて行われる。それはペプシンなどの蛋白分解
酵素をコラーゲンに作用させることによる（たとえば、
Ｉｎｔ、　Ｒｅｖ、　Ｃ。

ｎｎ、　Ｔｉ５ｓ、　Ｒｅｓ、　　７．　６１〜９９　
（１９７６））。

〔発明の目的〕

この発明の目的は、組織親和性の良い、そして抗原性の
ないコラーゲンおよびその製法を提供することにある。

〔発明の開示〕

コラ−ゲナーゼ以外の蛋白分解酵素は、コラーゲン分子
の末端非ヘリックス部分（テロベプタイド）を選択的に
消化して不溶性コラーゲンを溶解すること、および、コ
ラーゲンの抗原決定基の大部分は、テロペプタイドに存
在することがよく知られている。それゆえ、可溶性であ
ろうと不溶性であろうと、コラーゲンは酵素で処理され
て、未処理のままのコラーゲンより抗原性の少ないテロ
ペプタイドのないコラーゲンを産出することも知られて
いる。酵素で処理して不溶性コラーゲンの源からコラー
ゲンを得るためによ（使われる方法としては次のような
ものがある。精製し毛を抜いた動物の皮あるいは皮膚を
小さく切り、用いられる酵素にふされしいｐＨに調整し
た水に分散する。

そしてペプシンなどの蛋白分解酵素で処理する。

酵素を失活させたのち、可溶性コラーゲンが、消化され
たものから回収され、そしてさらに精製される。

しかしながら、このような方法で得られたコラーゲンを
Ｄｕｎｎ骨肉腫から得られたＢＭＰの担体として用いた
場合、置所骨形成はスムーズに起こらなかった。われわ
れ発明者は、このような従来の方法で得られたコラーゲ
ンを用いては置所骨形成がうまく行かなかったことは、
次のような事実によると考えた。用いられたコラーゲン
のテロペプタイドの消化が十分でなく、置所骨形成を得
るに十分に低い抗原性が示されなかったこと、消化の間
にコラーゲンポリマ会合体の存在のために、消化が十分
でなかったこと、そのために、酵素がコラーゲンに十分
働かなかったこと、そして、抗原性が置所骨形成にふさ
れしい低いレベルに達しなかったことである。

われわれ発明者は上記のような考えを確認するために、
次のような実験をおこなった。われわれの発見によれば
、次のような酵素処理によって、置所骨形成に必要な低
いレベルの抗原性を有するコラーゲンを得るために、コ
ラーゲンポリマ会合体を除去することは、たとえば、メ
ンブランフィルタを用いた可溶化コラーゲンの濾過によ
って行われる。そこで３種類のコラーゲンを用意した。

ペプシンで溶解され、メンブランフィルタで濾過されて
いないコラーゲン（Ａ）、ペプシンで可溶化し、ペプシ
ンを失活させる前に０．４５１！ｍのメンブランフィル
タで濾過したコラーゲン（Ｂ）、ペプシンで可溶化させ
たのち、それを失活させてから０．４５μｍのメンブラ
ンフィルタで濾過を行ったコラーゲン（Ｃ）。それぞれ
について分子量分布およびアミノ酸組成を調べた。コラ
ーゲン（Ａ）の抗原性をコラーゲン（Ｂ）のそれに比較
し、また、置所骨形成において、ＢＭＰの担体として用
いられたコラーゲン（Ｂ）の効果は、コラーゲン（Ｃ）
のそれに比較された。すなわち、コラーゲン（Ａ）は、
会合体を除去しないまま可溶化されたものであり、コラ
ーゲン（Ｂ）は、会合体除去後もペプシンがまだ活性化
しているものであり、コラーゲン（Ｃ）は、会合体が除
かれているが、１）３過ののち、ペプシンはコラーゲン
に作用していないものであった。

前記各コラーゲンをそれぞれ５０°Ｃで３０分間加熱す
ることにより変性させたのち、分子量分布が、ＴＳＫゲ
ル（Ｇ−４０００ＰＷ＋Ｇ−３０００ＰＷ：東洋曹達工
業（（零製）を用いて、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグ
ラフィー）によって測定された。結果を第５図に示す。

図において、縦軸は吸光度Ａ　２３゜、横軸は保持時間
（分）である。保持時間が長いほど分子量が小さい。吸
光度は２３０ｎｍの紫外部吸収で測定した。アミノ酸分
析はアミノ酸自動分析機（Ｋ−２０２ＳＮ協和精密（掬
製）を用いて行われた。上記コラーゲンはそれぞれ１）
０℃で２４時間加水分解したのち、測定が行われた。結
果は第１表に示す。なお、チロシンはコラーゲン分子の
テロペプタイドにのみ存在すると考えられるので、千ロ
ジン含量をテロペプタイドの除去の目安とした。すなわ
ち、チロシンはテロペプタイドにのみあるとして１００
０残基あたりチロシン５残基あるのをテロペブタイド１
００％あり（全く除去されていないこと）として、テロ
ベブタイドの量を百分率であられし、結果を第１表に示
した。

第５図の分子量分布にみるように、コラーゲン（Ａ）は
、分子量の大きい方でピークを示している。コラーゲン
（Ｂ）は、分子量の小さい方でピークを示している、こ
れは、会合体の除去を示している。濾過を行ったコラー
ゲン（Ｃ）も同様に分子量が小さい方にピークを示して
いる。しかしながら、アミノ酸分析の結果は、コラーゲ
ン（Ｂ）のチロシン含量つまり、失活を行わなかったの
でペプシンが濾過後も引き続き作用したコラーゲン（Ｂ
）におけるチロシン含量の方がコラーゲン（Ｃ）におけ
るそれよりもずっと低かった（半分以下）。コラーゲン
（Ｃ）は、濾過後ペプシンが作用していない。なお、第
１表にみるように、コラーゲン（Ａ）のチロシン含量は
もちろん高い。

一方、コラーゲン（Ａ）およびコラーゲン（Ｂ）とコラ
ーゲン抗体との交叉反応を次のようにして調べた。すな
わち、Ｉ型コラーゲンに対するポリクロナル抗体（１０
２〜１０’倍の間の希釈系列）をコラーゲン（Ａ）およ
びコラーゲン（Ｂ）をそれぞれコートしたマイクロタイ
ターウェルに作用させた。二次抗体としては、ウサギＩ
ｇＧペロキシダーゼに対するヤギ抗体を用いた。発色は
０−−フェニレンジアミンによった。コラーゲンがＩ型
コラーゲン抗体に反応する（抗原抗体反応）と、０−−
フェニレンジアミンは発色する。そこで、その吸光度を
４９０ｎｍで測定した。吸光度の値が抗原抗体反応の強
さを意味する。結果は、第８図に示した。グラフでは横
軸は■型コラーゲン抗体の希釈倍数の常用対数を等間隔
目盛りであられし、縦軸は４９０ｎｍの吸光度を等間隔
目盛りであられしている。図中、ムと（Ａ）で示された
折線はコラーゲン（Ａ）を示し、■と（Ｂ）で示された
折線はコラーゲン（Ｂ）を示す。図にみるように、１０
”倍の希釈倍数の■型コラーゲン抗体が用いられたとき
、コラーゲン（Ａ）の吸光度（ＯＤ値）は２．１８であ
った。しかし、コラーゲン（Ｂ）のそれは、０．２１で
あった。したがって、コラーゲン（Ａ）においては、抗
原抗体反応が活発に行われているが、コラーゲン（Ｂ）
ではそのような反応はほとんど見られない。これは、コ
ラーゲン（Ａ）には抗原決定基が存在するが、コラーゲ
ン（Ｂ）にはそれがないからである。

次に置所骨形成においてＢＭＰの担体として用いられた
コラーゲン（Ｂ）およびコラーゲン（Ｃ）の効果につい
て次のようにして調べた。Ｄｕｎｎ骨肉腫より得られた
精製されたＢＭＰをそれぞれコラーゲン（Ｂ）およびコ
ラーゲン（Ｃ）の溶液と混ぜた。そして、凍結乾燥し、
殺菌して二つの骨誘導性生体材料を得た。各々の生体材
料をマウスの背部部間に移植した。３週間ののち、置所
骨形成の誘導が観察された。コラーゲン（Ｂ）を用いた
生体材料は、コラーゲン（Ｃ）を用いたそれよりも一層
効果的であった。

チロシン含量、抗原性、そして、骨形成に関する上記の
結果から、１０００残基あたり２残基未満のチロシン含
量が、コラーゲン分子よりテロペプタイドを十分に除去
したことの適当な目安であることが観察された。

この発明は、上記のような知見をもとにして完成された
。

それゆえ、この発明は、チロシン含量が１０００残基あ
たり２残基未満である組織親和性コラーゲンを第１の発
明とし、組織親和性コラーゲンを得る方法であって、会
合体が除かれたコラーゲンを原材料として用い、蛋白分
解酵素をこのコラーゲンに作用させることを特徴とする
組織親和性コラーゲンの製法を第２の発明とする。

この発明を以下に詳しく説明する。

コラーゲンは水に不溶で、一般に哺乳類、鳥類などの結
合組織、骨、歯、靭帯、鍵、真皮、筋膜などに存在して
いる。このような不溶性コラーゲンは、たとえば、酵素
処理やアルカリ処理によって可溶化される。そして可溶
化されたコラーゲンは酵素を不活性にしたのち、精製さ
れ、殺菌して用いられる。この殺菌方法としては、コラ
ーゲン（Ｃ）の場合のように、酵素を不活性にしたのち
、濾過を行って殺菌する方法がとられる。しかし、濾過
による殺菌はバクテリアを除去するために用いられるの
であって、第２の発明によるように、コラーゲンの会合
体を除去するためのものではない。すなわち、可溶化さ
れたコラーゲンの濾過は、コラーゲンの抗原性の除去と
関連して行われるのではなかった。

第２の発明において、会合体が除去されたコラーゲンは
、会合体の量が必ずしもＯでないものも含まれる。たと
えば、上記のように、コラーゲンを可溶化したのちに、
濾過してコラーゲン会合体を除く方法による場合はそう
である（必ずしも完全に除かれなくてもよい）。この濾
過のフィルタとしては、たとえば、メンブランフィルタ
が用いられる。しかし、フィルタは、上記のものに限定
されるものではない。フィルタのポアサイズは、発明者
の確かめたところによると３Ｉｒｍ以下、より好ましく
は、０．４５−以下がよい。しかし、この範囲に限定さ
れるわけではない。会合体の除かれたコラーゲンを得る
には、可溶化したコラーゲンを濾過する方法以外に、可
溶化したコラーゲンを超遠心分離する方法など、他の方
法によることも可能である。また、市販のコラーゲンを
濾過滅菌するためには、ポアサイズ０．４５μｍ以下の
フィルタが用いられるので、これを会合体の除かれたコ
ラーゲンとしてそのまま蛋白分解酵素に作用させること
ができる。

ところで、その濾過滅菌の程度など、製造条件によって
市販のコラーゲンでも会合体が除かれていることが時々
ある。そこで、このようなコラーゲンを会合体の除かれ
たコラーゲンとして用いることができるかどうか確がめ
るため、発明者らは、上記と同様の実験を行った。すな
わち、市販のコラーゲンＶｉｔｒｏｇｅｎ　−１００（
コラーゲン社製。

アメリカ）をコラーゲン（Ｄ）とし、また、このコラー
ゲンをペプシンで処理して得られたものをコラーゲン（
Ｅ）としてそれぞれ用い、上記の実験と同様にして分子
量分布を測定し、アミノ酸分析を行った。さらに、テロ
ペプタイドの量も同様にして調べた。

分子量分布の測定結果は、第６図に示した。第６図にお
いて、縦軸は吸光度Ａ、。、横軸は保持時間（分）であ
り、保持時間が長いほど分子量が小さい。吸光度は２３
０ｎｍで紫外部吸収で測定した。アミノ酸分析の結果、
および、テロペプタイドの量は、第２表に示す。

第６図にみるように、市販のコラーゲン（Ｄ）の分子量
分布は、第５図のコラーゲン（Ｃ）のそれと同様であっ
た。コラーゲン（Ｄ）にペプシンを作用させたちのコラ
ーゲン（Ｅ）の分子量分布は、第５図のコラーゲン（Ｂ
）のそれと同様であった。また、第２表にみるように、
コラーゲン（Ｅ）のチロシン含量は、もとのコラーゲン
（Ｄ）のそれよりもずっと小さかった。それゆえ、抗原
性の原因となるテロペブタイドの量は少なく、テロペプ
タイドはコラーゲン（Ｅ）ではほぼ完璧に除かれたこと
がわかる。

上記の結果にみるように、市販のコラーゲンには会合体
の除かれたコラーゲンとしてそのまま用い、蛋白分解酵
素をこの発明の方法に従って作用させることにより、組
織親和性コラーゲンを得ることができるものもある。会
合体が除かれたコラーゲンは、他の市販のコラーゲンか
ら、’ａ過および超遠心分離などによって得ることもで
きる。

この発明において、チロシン量をコラーゲン分子よりテ
ロペプタイドが除かれた目安として用いる。それは、前
述したようにチロシンがコラーゲン分子のテロペプタイ
ドにのみ存在すると考えられるからである。チロシン含
量が１０００残基あたり２残基未満であるときは、テロ
ペプタイドは十分にコラーゲンから除かれている。その
結果得られたコラーゲンは、抗原性をほとんど示さない
。チロシン含量が１０００残基あたり１．５残基以下で
あれば、抗原性の除去という観点からすれば、さらに好
ましい。

さらに、第１の発明のＭｉ機織親和コラーゲンは、第２
の発明に定義される方法以外の製法によっても得ること
ができる。たとえば、アルカリ可）容性コラーゲンが知
られている。これは、Ｎａ２５ｏ４の飽和した約５％の
ＮａＯＨ溶液でコラーゲンを処理することによって得ら
れる。これはかなり低いテロベプタイドの含量を示して
いる。

第２の発明によるように、会合体が除去されたコラーゲ
ンを原材料として用いると、コラーゲン分子のテロベプ
タイドに蛋白分解酵素をより簡単に作用させることがで
きる。

蛋白分解酵素を会合体が除かれたコラーゲンに反応させ
るためには、蛋白分解酵素を、会合体が除かれたコラー
ゲンに加える。あるいは、また、上記のように溶解され
たコラーゲンを濾過するときに、蛋白分解酵素を失活さ
せなければ、蛋白分解酵素をそのままで濾液中でコラー
ゲンに作用させる。蛋白分解酵素で処理されたコラーゲ
ンにおいては、テロペブタイドは容易に除去され（必ず
しも完全に除去されるわけではない）、抗原性はとても
低い。それゆえ異物反応も全く起こらないし、組織親和
性はとても良い。

この発明の組織親和性コラーゲンは、ＢＭＰと随意に混
ぜることができ、骨形成までのしばらくの間（たとえば
、約２週間）生体内に不溶状態のまま残っており、骨誘
導をスムースに起こさせるさらに、この発明にかかる組
織親和性コラーゲンの等電点は７以上が好ましい。これ
は、コラーゲンに生理的条件下で、すなわち、移植され
たときに、しばらくの間（たとえば、骨形成までの期間
）不溶な状態でいるための特質を与えるためである。さ
らに、この発明にかかる組織親和性コラーゲンがアルカ
リ処理によって得られたとき、等電点は７以下であるこ
とがあり、成形性は、酵素処理によって得られたコラー
ゲンよりも悪いことがある。それゆえ、この発明の組織
親和性コラーゲンは、酵素処理によって得るのが好まし
い。

第３表は、第１の発明による組織親和性コラーゲンの使
用形態および使用の例を要約している。

しかし、これらの事項に限られない。

なお、ここで、骨形成因子とは、未分化な開票系細胞に
細胞外から作用して、その遺伝形質を軟骨細胞や骨芽細
胞へと誘導（軟骨誘導、骨誘導）する物質である。次に
その製法の例を示すが、これに限るものではない。

（骨形成因子の製法の一例）Ｄｕｎｎ骨肉腫をホモジナイズし、アセトン、メチルエ
ーテルで脱脂する。得られたものを乾燥し、骨肉腫の脱
脂乾燥粉末を得る。次に、脱脂乾燥粉末を４Ｍ塩酸グア
ニジンで抽出し、５％酢酸を含むエタノールによってエ
タノール分画を行い、分画した上澄みを１０ｍＭ燐酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に対して透析する。透析
を十分に行うと、チューブ内に沈澱が見られ、これを遠
沈（１００００Ｇ、１５分間）で回収し、上澄みは捨て
る。回収した沈澱分画は、塩酸グアニジンで再び溶解す
る。次に、ゲル濾過などによってクロマトグラフィを行
う。第７図は５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２００ゲル（
ファルマシア・ファイン・ケミカルズ）によってクロマ
トグラフィを行った場合の溶出曲線である。図において
縦軸は吸光度ＡＺ１）゜、横軸は溶出液ｆｆｉ　（＋７
）である。吸光度は２８０ｎｍの紫外部吸収で測定した
。第７図に示す分画すを回収し、１０ｍＭ燐酸ナトリウ
ム緩衝液に対して透析を行い、析出物を遠沈（１００Ｏ
Ｇ、１５分間）で回収し、精製し、凍結乾燥してＢＭＰ
が得られる。

次に、第１の発明にかかる組織親和性コラーゲンを上記
ＢＭＰとともに用いた生体材料の例を示す。しかし、こ
のコラーゲンの応用は、これらの例に限らない。

（実施例１）新鮮な子牛の皮の毛を取り、洗浄し、小さく切った。そ
して、ＮａＣ１溶液と水で洗い、さらに、メタノールと
クロロホルムの混合液で脱脂を行った。精製された皮は
、ＨＣＩ溶液に加えられた。そして、混合物は、ＨＣＩ
でｐＨ３，０に調節され、ペプシンが加えられた（コラ
ーゲンに対するペプシンの割合はおよそ４／１００）。

混合液は時折掻き回され、２０℃で２４時間保持された
のちグラスフィルタで濾過された。それから、ポアサイ
ズ０．４５鎖のニトロセルロース類のメンブランフィル
タで濾過された。濾液は、さらに２０°Ｃで２４時間保
持された。得られた溶液は、ＮａＯＨでｐＨ１０，０に
調整され、ペプシンを失活させ、さらにＨＣＩでｐＨ７
，４に再び調節される。コラーゲン沈澱物は遠心分離に
より回収され、ＨＣＩ溶液ｐＨ３，０に溶解される。次
に、その液量の１）５の３０％ＮａＣ１溶液が加えられ
、得られた沈澱物は回収され、ｐＨ３゜０のＨＣＩ溶液
に溶解される。

分散液はｐ）１３．０の塩酸溶液に対して透析が行われ
、溶液はＮａＯＨでｐＨ７，４に調整される。コラーゲ
ン沈澱物は回収され、そして、ｐＨ３，０のＨＣＩ溶液
に溶解される。そして、濃度３　ｍｇ　／　ｍｌのコラ
ーゲン溶液を得た。このコラーゲンのチロシン含量は１
０００残基あたり１．２残基で、等電点は、７以上であ
った。

上記の方法によって得られた精製されたＢＭＰは、ｐｏ
３．ｏのＨＣＩ溶液に溶解された。濃度は、３．０ｍｇ
／ｒａｔであった。この溶液１００μβをコラーゲン溶
液１．０−とよく混ぜ、その混合液はＮａＯＨでｐＨ７
，４に調整された。その後凍結乾燥され、さらに、エチ
レンオキサイドガスで滅菌され、骨誘導性生体材料を得
た。

この生体材料をマウスの背部訪問内に移植し、移植物（
第４図で矢印で示す）を３週間後に取り出し、これを軟
質Ｘ線写真に撮り、第１図Ａに示した。第１図Ａで白い
部分が骨基質（骨梁）である。第１図Ａの写真でみるよ
うに、この発明にかかる組織親和性コラーゲンを用いた
生体材料は、１２検体の全てに骨組織が非常によく誘導
されていた。検体間のばらつきも小さかった。第２図は
取り出した移植物の組織の一部の拡大写真である第２図
の写真において、その上方で左右に伸びる灰色の帯は骨
基質（骨梁）で、この骨基質中の黒い点は骨細胞、骨基
質の上の縞は筋肉、筋肉の下の部分が移植物である。移
植物において白い大きな斑点状の部分が脂肪細胞、大き
な灰色の部分が骨基質（骨梁）であり、骨基質問の沢山
の黒い点が骨ＶＢ細胞（造血細胞）である。この骨基質
中の黒い点は骨細胞、骨基質の辺縁の黒い部分が骨芽細
胞である。

第２図にみるように、前記の生体材料をマウスの背部訪
問内に移植すると、骨組織が３週間後に形成された。

発明者らの観察したところによると、骨組織の形成の過
程は次のようであった。

上記生体材料をマウスの背部訪問内に移植すると、４日
後に、移植物の辺縁部分の筋肉との接触面に筋肉内から
遊走したと思われる未分化細胞がコラーゲン線維の周辺
にあられれる。移植して１週間後、移植物の辺縁部と筋
肉との接触面に軟骨の形成が行われた。移植して２週間
後、形成された軟骨に血管が進入した。軟骨基質の吸収
と基質への新生骨添加がみられた。その結果、軟質のコ
アを有する骨梁（１次骨梁）が形成された。この骨梁間
の空間には骨髄組織が出現し、この過程は移植物の辺縁
から中心に向かって進行した。移植後３週間でこの過程
が移植物の中心まで進行し、第２図にみられる骨組織が
形成された。

他方、定量的な骨形成能は、１）５３ｒ取り込み量で次
のようにして調べた。上記生体材料をマウスの背部訪問
内に移植したのち、１）００００ｃｐのｆｌｓ３ｒをそ
のマウスの腹腔内に注射した。３週間後、その移植物を
取り出して、その移植物の８５３ｒ取り込み量をγカウ
ンターによって調べた。その量は２１）６±７９０ｃｐ
ｍであった。このことから、前記Ｘ線写真（軟Ｘ写真）
および骨Ｍｉ織影形成結果ともに非常によく骨形成が起
こったことが示唆された。

（実施例２）ポアサイズ０．４５μｍのフィルタのかわりにポアサイ
ズ３距のメンブランフィルタを用いること以外は実施例
１と同様の方法によってコラーゲン溶液を得た。このコ
ラーゲンのチロシン含量は１０００残基あたり２６０残
基で、等電点は、７以上であった。次に、実施例１と同
様にして、このコラーゲン溶液を用いて骨誘導生体材料
を得、移植した。結果は、実施例１とほぼ同様であった
。

（比較例１）新鮮な子牛の皮の毛を除き、洗浄し小さく切った。Ｎａ
Ｃ１溶液と水で洗浄し、そののちメタノール−クロロホ
ルムの混合液で脱脂した。精製された皮はＨＣＩ溶液に
加えられた。そして、その混合物はＭＣＩでｐＨ３，０
に調整され、ペプシンが加えられた（ペプシンのコラー
ゲンに対する割合はおよそ４／１００）。混合物は２０
℃で４８時間保持され、グラフフィルタで濾過され、さ
らにｐＨ１０，０に調整して、ペプシンを不活性にした
。

その後、ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ
で濾過した。この濾液を実施例１と同様に処理し、コラ
ーゲン溶液を得た。このコラーゲンのチロシン含量は１
０００残基あたり２．５残基であり、等電点は７以上で
あった。

次に、実施例１と同様にして、骨誘導性生体材料をこの
コラーゲン溶液を用いて得、さらに移植した。移植物は
３週間後に取り出され、結果を第１図Ｂに示した。第１
図Ｂにみるように、骨誘導は白い部分で起こっている。

第１図Ｂの写真にみるように、このようにして得られた
生体材料は、１２検体のうちの５検体においてわずかに
骨組’（ｌｆＩｉの８Ａ　ｉが見られたが、はとんど誘
導されないものもある。検体間によって骨組織の誘導の
ばらつきが大きかった。第３図は取り出した移植物の組
織の一部拡大写真である。

第３図において上部左右には白いベルトが拡がっている
。ベルトの上の部分は筋肉で、ベルトの下の部分は移植
物である。移植物の灰色の繊維はコラーゲン線維である
。この写真にみるように、骨組織は誘導されていない。

さらに、１）５３ｒ取り込み量を実施例１と同様にして
調べた。その計は９６３±３７１　ｃｐｍである。この
ことから、前記Ｘ線写真（軟Ｘ写真）および骨組織形成
結果と同様あまり骨形成が行われてないことが示唆され
る。

次に会合体の除去が確認された市販のコラーゲンを用い
た実施例および比較例について述べる。

（実施例３）前述したような、分子量分布およびアミノ酸組成をもっ
た市販のコラーゲン溶液（ｐＨ２，５、ｆｍ度３、０　
ｍｇ／　ｍｌ）　、νｉｔｒｏｇｅｎ　−１００（コラ
ーゲン社、アメリカ）を用いた。この？容液にペプシン
を加えて（ペプシンのコラーゲンに対する量は２／１０
０）、この溶液を２０℃２４時間で保持し、ＮａＯＨで
ｐＨ１０，０に調整し、ペプシンを不活性にしたのち、
実施例１と同様に処理してコラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍ
／）を得た。このコラーゲンのチロシン含量は、１００
０残基あたり１．１残基で、等電点は７以上であった。

実施例１と同様にして、骨誘導性生体材料がそのコラー
ゲン溶液を用いて調製され、移植された。３週間後、骨
組織の良好な誘導が観察された。

（比較例２）実施例３で用いられた市販のコラーゲン（チロシン含量
１０００残基あたり２．３残基１等電点７以上）溶液を
、実施例１と同様にして、ＢＭＰと混ぜて骨誘導性生体
材料を得、マウスに移植した。３週間後、骨組織は移植
物にほとんど誘導されなかった。

次に、この発明にかかる組識親和性コラーゲンを用いる
と、骨誘導がスムーズに起こったことを示す例とその比
較例を述べる。

（実施例４および比較例３）実施例１で得られたコラーゲン溶液と上述したＢ　Ｍ　
Ｐを用いた骨誘導性生体材料４種類を準備した。それぞ
れニＢ　Ｍ　Ｐを０．７５．　０．３０．　０．１９．
０．０９４ｍｇを混ぜた。それぞれに実施例１の方法に
従って、３ｍｇのコラーゲンを混ぜた。これら４つの生
体材料それぞれをマウスに移植した。そして、骨形成お
よび［１ＳＳｒ取り込み量が実施例１に従って調べられ
た。同時にＢＭＰのみを移植したものも調べられた。結
果を第４表に示す。

第４表にみるように、ＢＭＰ単独で用いられた場合、Ｂ
ＭＰｌ、２０ｍｇでは骨形成が見られながった。そして
、６．０ｍｇと大量にＢＭＰを用いても、８　Ｓ　３　
ｒの取り込み量は８０６ｃｐｍと小さく、骨誘導が不十
分であることを示した。これに対し、ＢＭＰをこの発明
にかかる組織親和性コラーゲンと混合して用いると、骨
形成は、ＢＭＰの量がｏ、０９４ｍｇとごく少量であっ
ても認められた。このように、この組織親和性コラーゲ
ンと混ぜると、骨はよく形成され、Ｂ　Ｍ　Ｐの量がこ
れを単独に用いた場合に骨形成が認められなかった場合
の量よりもかなり少なくても非常によく骨が形成される
ことがわかった。すなわち、ごの発明にががる組織親和
性コラーゲンを混合して用いると、骨誘導がスムースに
起こることがわかった。

（実施例５）実施例１に従って得られた精製した子牛の皮（５００ｇ
）をＮａｚ　ＳＯ４を１６％含有する５％のＮａＯＨ？
容ン夜１）で２０　’Ｃで５日間、時折ン昆ぜながら処
理した。得られた皮は、ＨＣＩで約ｐＨ７に調整された
。そして、水で十分洗われたのち、ｐｏ３．ｏのＨＣｌ
ｉ容？夜に？容解された。さらに、グラスフィルタで濾
過して不溶物を取り除いた。濾過液に塩化ナトリウムを
加え、最終的な濃度を７％とし、コラーゲンを沈澱させ
た。沈澱物は遠心分離によって回収され、ｐＨ３，０の
ＨＣＨ各法に溶解され、十分な量のｐＨ３，０のＨＣＩ
溶液で透析した。透析したコラーゲン濃度はＨＣＩ溶液
で調整され、濃度３ｍｇ／ｍＩのアルカリ可溶コラーゲ
ン溶液を得た。このコラーゲンのチロシン含量は１００
０残基あたり０．９残基で、等電点は６以下であった。

実施例１で述べられたのと同様にして、コラーゲン溶液
と精製されたＢＭＰを用いて生体材料が調製され、マウ
スの背部動量に移植された。その結果、骨形成は実施例
１と同様であったが、誘導された骨組織は広がり、移植
された生体材料の形を保持していなかった。

上記のような結果から、第１の発明にかかる組織親和性
コラーゲンは抗原性を示さず、従来のコラーゲンに比べ
て良い！Ｉｎ　８Ｎ親和性を有している。

それゆえ、この組織親和性コラーゲンは優秀な医用材料
および生体材料となることがわかった。この発明にかか
る組織親和性コラーゲンの等電点は、７以上が好ましい
こともわかった。

なお、この発明の組織親和性コラーゲンは、精製、滅菌
されたのち、種々の使用状態で種々の医用材料、生体材
料などに利用され、すくれた組織親和性を示す。たとえ
ば、上記したようにＢ　Ｍ　Ｐと任意に混合して骨形成
用生体材料となるほか、第５表に示すような使用状態お
よび用途があるが、これらに限定するものではない。

第５表；発明の効果］第１の発明にかかる組織親和性コラーゲンは、上記のご
とく、チロシン含量が１０００残基あたり２残基未満で
あるので、抗原性に関与するテロベプタイドは充分除か
れた。この発明にかかる組織親和性コラーゲンは、従来
のコラーゲンに比べて抗原性のない良好な組′ｉ＠親和
性を有する。そのため、このコラーゲンをＢＭＰの担体
として用いれば、骨形成が順調に起こる。さらに、骨形
成の再現性が良く、骨形成が少量のＢＭＰで順調に誘導
される。

第２の発明にかかる組織親和性コラーゲンの製法は、上
記のごとく、会合体の除かれたコラーゲンを原材料とし
て用い、蛋白分解酵素をそのコラーゲンに作用させて、
組織親和性コラーゲンを得るので、第１の発明にかかる
組織親和性コラーゲンを速やかに得ることができる。さ
らに、この製法により得られた組織親和性コラーゲンは
、生理的状況下で、溶けにくくなっている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、マウスに移植した生体材料の骨誘導状態をあ
られすＸ線写真で、Ａは実施例１のコラーゲンを用いた
もの、Ｂは比較例１のコラーゲンを用いたもの、第２図
〜第４図は生物の形態をあられす写真で、第２図は実施
例１のコラーゲンを用いて骨形成を行ったときの組織の
一部を拡大したもの、第３図は比較例１のコラーゲンを
用いて骨形成を行ったときの組織の一部を拡大したもの
、第４図はマウスから移植物を採り出した状態であり、
第５図は会合体の有無を調べるため３種のコラーゲンに
ついてＨＰＬＣによる分子量分布をあられすグラフ、第
６図は、会合体の有無を調べるため市販のコラーゲンに
ついてＨＰＬＣによる分子量分布をあられすグラフ、第
７図は骨形成因子を得るためのクマトグラフィーによる
溶出曲線、第８図は抗原決定基の有無を調べるため２種
のコラーゲンについて抗原抗体反応の強さをあられした
グラフである。代理人　弁理士　　松　本　武　彦第１）・）第５図俣才舎庄１間　（ｍｉｎ　）第６図保符吟間（ｍｉｎ）第７区名土地蓋　（ｍｆ！、）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）チロシン含量が１０００残基あたり２残基未満で
ある組織親和性コラーゲン。
（２）等電点が７以上である特許請求の範囲第１項記載
の組織親和性コラーゲン。
（３）骨形成用生体材料である特許請求の範囲第１項ま
たは第２項記載の組織親和性コラーゲン。
（４）組織親和性コラーゲンを得る方法であって、会合
体が除かれたコラーゲンを原材料として用い、蛋白分解
酵素をこのコラーゲンに作用させることを特徴とする組
織親和性コラーゲンの製法。
（５）会合体の除かれたコラーゲンが、不溶性コラーゲ
ンに対し蛋白分解酵素を加えて可溶化した後、ろ過して
得られたものである特許請求の範囲第４項記載の組織親
和性コラーゲンの製法。
（６）組織親和性コラーゲンが、チロシン含量１０００
残基あたり２残基未満のものである特許請求の範囲第４
項または第５項記載の組織親和性コラーゲンの製法。
（７）組織親和性コラーゲンが、骨形成用生体材料であ
る特許請求の範囲第４項ないし第６項のいずれかに記載
の組織親和性コラーゲンの製法。