JPS629342B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS629342B2 JPS629342B2 JP9918685A JP9918685A JPS629342B2 JP S629342 B2 JPS629342 B2 JP S629342B2 JP 9918685 A JP9918685 A JP 9918685A JP 9918685 A JP9918685 A JP 9918685A JP S629342 B2 JPS629342 B2 JP S629342B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- embryos
- ice
- silver iodide
- preservation solution
- embryo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、胚（受精卵）の凍結保存において、
その保存液の植氷方法に関するものである。
その保存液の植氷方法に関するものである。
現在、一般に普及している胚（受精卵）の凍結
保存の一連の技術の中で、胚を含む保存液（胚に
とつては細胞外液にあたる）に、その保存液の凍
結点よりも通常１〜２℃低い温度で「氷晶形成を
誘起する」（「植氷」とも呼ばれる）ことは不可欠
の技術とされている。融解後に生存性を維持して
いる胚を高率に、しかも安定して得るためには、
冷却過程においては、胚を含む保存液が過度の過
冷却状態になるのを避ける工夫、あるいは過冷却
による潜熱発生後の冷却速度の上昇を防ぐ工夫が
必要である。植氷は、このうち前者に対する解決
法として考案されたものである。従来は、主とし
て手動操作によつて冷媒や冷体を胚を含む保存液
が入つた容器の外壁に接触させる方法が用いられ
ている。近年、胚の凍結保存用として冷却速度な
どを自由に設定できる装置が相次いで開発された
が、それらには同時に、植氷操作を自動化するた
めに特別の複雑な装置が設けられている。
保存の一連の技術の中で、胚を含む保存液（胚に
とつては細胞外液にあたる）に、その保存液の凍
結点よりも通常１〜２℃低い温度で「氷晶形成を
誘起する」（「植氷」とも呼ばれる）ことは不可欠
の技術とされている。融解後に生存性を維持して
いる胚を高率に、しかも安定して得るためには、
冷却過程においては、胚を含む保存液が過度の過
冷却状態になるのを避ける工夫、あるいは過冷却
による潜熱発生後の冷却速度の上昇を防ぐ工夫が
必要である。植氷は、このうち前者に対する解決
法として考案されたものである。従来は、主とし
て手動操作によつて冷媒や冷体を胚を含む保存液
が入つた容器の外壁に接触させる方法が用いられ
ている。近年、胚の凍結保存用として冷却速度な
どを自由に設定できる装置が相次いで開発された
が、それらには同時に、植氷操作を自動化するた
めに特別の複雑な装置が設けられている。
しかしながら、上記の植氷では、サンプルのセ
ツテイングに配慮が必要であるばかりでなく、従
来の手動による植氷方法と同様に、 多本数のサンプルの同時植氷が不可能であ
る。 植氷操作に伴いサンプルの温度が上昇する危
険性がある。 胚の至近距離の部位には植氷できない。 気泡を隔てた場合の氷晶形成は不確実であ
る。 などの問題点がそれぞれ存在し、これらの問題点
の全てを解決できる方法は、現在のところまだ開
発されていない。
ツテイングに配慮が必要であるばかりでなく、従
来の手動による植氷方法と同様に、 多本数のサンプルの同時植氷が不可能であ
る。 植氷操作に伴いサンプルの温度が上昇する危
険性がある。 胚の至近距離の部位には植氷できない。 気泡を隔てた場合の氷晶形成は不確実であ
る。 などの問題点がそれぞれ存在し、これらの問題点
の全てを解決できる方法は、現在のところまだ開
発されていない。
本発明は、上記の各問題点を解決するための方
策の一環としてなされたもので、人工降雨の氷晶
核として応用されているヨウ化銀（Ag）を用
いて保存液に氷晶形成を誘起する（植氷）方法を
提供しようとするものである。 まず、実際にヨウ化銀が氷晶形成の誘起剤とな
り得るかどうかを試験した。この試験の状況を第
１図ないし第６図を参照して説明する。 凍結容器には、現在、胚の凍結保存に広く用い
られているプラスチツクストロー１を用い、この
プラスチツクストロー１内に胚２および保存液３
（1.5Mジメチルスルホオキサイド・修正PBS溶
液）を充填し、気泡４を隔ててヨウ化銀（Ag
）・蒸留水懸濁液５（以下、ヨウ化銀という）
を充填して封栓６し、保存液３側のプラスチツク
ストロー１端から、第１図に示すように銅・コン
スタンタン熱電対７の一端を保存液３内に挿入
し、その他端に温度記録計８を接続して、保存液
３の凍結点温度より約２℃低い−７℃で15分間保
持中の潜熱発生の有無を、温度記録計８にモニタ
ーした。なお、符号９は綿栓である。 その結果、保存液３とヨウ化銀５を気泡４を隔
てて吸引し封栓６した第２図ａ，ｂの場合には、
雰囲気温度を−７℃に保存中に潜熱が発生した。
一方、第３図ｃに示す保存液３のみの場合と、第
４図ｄに示す気泡４を隔てて蒸留水１０を吸引し
た場合と、第５図ｅに示す気泡４を隔てて保存液
３を吸引しただけの場合では、−７℃の保存中に
潜熱の発生は見られず、過冷却の後に潜熱の発生
が見られた。第６図ｆに示す冷媒の自動接触方式
による植氷を行つた場合は、過冷却が起こる前に
潜熱が発生した。なお、第２図ないし第６図に示
すグラフは、それぞれの場合に温度記録計８にモ
ニターされた潜熱発生状況を示すものである。
策の一環としてなされたもので、人工降雨の氷晶
核として応用されているヨウ化銀（Ag）を用
いて保存液に氷晶形成を誘起する（植氷）方法を
提供しようとするものである。 まず、実際にヨウ化銀が氷晶形成の誘起剤とな
り得るかどうかを試験した。この試験の状況を第
１図ないし第６図を参照して説明する。 凍結容器には、現在、胚の凍結保存に広く用い
られているプラスチツクストロー１を用い、この
プラスチツクストロー１内に胚２および保存液３
（1.5Mジメチルスルホオキサイド・修正PBS溶
液）を充填し、気泡４を隔ててヨウ化銀（Ag
）・蒸留水懸濁液５（以下、ヨウ化銀という）
を充填して封栓６し、保存液３側のプラスチツク
ストロー１端から、第１図に示すように銅・コン
スタンタン熱電対７の一端を保存液３内に挿入
し、その他端に温度記録計８を接続して、保存液
３の凍結点温度より約２℃低い−７℃で15分間保
持中の潜熱発生の有無を、温度記録計８にモニタ
ーした。なお、符号９は綿栓である。 その結果、保存液３とヨウ化銀５を気泡４を隔
てて吸引し封栓６した第２図ａ，ｂの場合には、
雰囲気温度を−７℃に保存中に潜熱が発生した。
一方、第３図ｃに示す保存液３のみの場合と、第
４図ｄに示す気泡４を隔てて蒸留水１０を吸引し
た場合と、第５図ｅに示す気泡４を隔てて保存液
３を吸引しただけの場合では、−７℃の保存中に
潜熱の発生は見られず、過冷却の後に潜熱の発生
が見られた。第６図ｆに示す冷媒の自動接触方式
による植氷を行つた場合は、過冷却が起こる前に
潜熱が発生した。なお、第２図ないし第６図に示
すグラフは、それぞれの場合に温度記録計８にモ
ニターされた潜熱発生状況を示すものである。
次いで、ヨウ化銀が氷晶形成の誘起剤として胚
の凍結保存に有効であるかどうかを家兎の胚を用
いた実施例について、第７図ないし第１０図およ
び別表（第１表および第２表）を参照して説明す
る。 第７図において、プラスチツクストロー１内へ
の胚２と保存液３およびヨウ化銀５の充填様式
は、前記第２図ないし第６図のａ〜ｆと同様に行
つた。即ち、ａは、胚２・保存液３、気泡４、ヨ
ウ化銀５の順に吸引した。ｂは、胚２・保存液
３、気泡４、保存液３、気泡４、ヨウ化銀５の順
に吸引した。ｃは、胚２・保存液３のみを吸引し
た。ｄは、胚２・保存液３、気泡４、蒸留水１０
の順に吸引した。ｅは、胚２・保存液３、気泡
４、保存液３の順に吸引した。ｆは、胚２・保存
液３のみを吸引した。そして、冷媒をプラスチツ
クストロー１の外壁に接触させる従来の方法で植
氷を行つた。前記ａ〜ｅについては、雰囲気温度
を−７℃で15分間保持するだけで、外部からの植
氷操作は行わなかつた。用いた胚のステージは、
桑実期胚であつた。サンプルを第８図に示す所定
のプログラムに従つて冷却し、最終的に液体窒素
中に浸漬した。融解後の胚の正常性は、形態学的
検査によつて、また、その生存性は、体外培養試
験によつて検討した。 その結果は、第９図および第１０図に示す通り
であつた。即ち、ヨウ化銀を吸引したａおよびｂ
（図中ではａとｂを合計した）では、凍結・融解
後、細胞質および透明帯がともに正常な胚（可移
植胚）の割合は、90％に達した。これに対して、
ｃ（図中では「対照」と表示）、ｄおよびｅで
は、可移植胚の得られる割合は極端に低く、逆に
変性胚の得られる割合が高かつた。外部から植氷
を行つたｆでは、可移植胚の割合が高く、その胚
の形態学的分布は、ヨウ化銀を吸引したものと似
通つていた。凍結・融解後、培養によつて拡張胚
盤胞に発育した胚数の割合は、ａ＋ｂおよびｆで
は89％および85％と高率を示したのに対し、ｃ，
ｄおよびｅでは20％前後の低率であつた。 以上の結果から、ヨウ化銀は、胚の凍結保存に
応用した場合、氷晶形成の誘起剤として有効であ
り、従来の植氷方法を行つた場合と同等の成績が
得られることが実証された。 融解後に、気泡が移動してヨウ化銀と胚を含む
保存液が混つた場合のヨウ化銀の胚に及ぼす影響
を調べ、その結果を第１表および第２表に示し
た。第１表で明らかなように、胚の洗浄の有無に
拘わらず可移植胚数および発育胚数の割合は高率
を示した。このことから、ヨウ化銀が融解後に保
存液と混つた場合でも、第２表で明らかなように
胚の生存性に悪影響を及ぼさないことが実証され
た。さらに、保存液とヨウ化銀を混合した後に冷
却を開始したサンプルでも、その融解後の可移植
胚数および発育胚数の割合から、氷晶形成が誘起
されることが明らかであつた。
の凍結保存に有効であるかどうかを家兎の胚を用
いた実施例について、第７図ないし第１０図およ
び別表（第１表および第２表）を参照して説明す
る。 第７図において、プラスチツクストロー１内へ
の胚２と保存液３およびヨウ化銀５の充填様式
は、前記第２図ないし第６図のａ〜ｆと同様に行
つた。即ち、ａは、胚２・保存液３、気泡４、ヨ
ウ化銀５の順に吸引した。ｂは、胚２・保存液
３、気泡４、保存液３、気泡４、ヨウ化銀５の順
に吸引した。ｃは、胚２・保存液３のみを吸引し
た。ｄは、胚２・保存液３、気泡４、蒸留水１０
の順に吸引した。ｅは、胚２・保存液３、気泡
４、保存液３の順に吸引した。ｆは、胚２・保存
液３のみを吸引した。そして、冷媒をプラスチツ
クストロー１の外壁に接触させる従来の方法で植
氷を行つた。前記ａ〜ｅについては、雰囲気温度
を−７℃で15分間保持するだけで、外部からの植
氷操作は行わなかつた。用いた胚のステージは、
桑実期胚であつた。サンプルを第８図に示す所定
のプログラムに従つて冷却し、最終的に液体窒素
中に浸漬した。融解後の胚の正常性は、形態学的
検査によつて、また、その生存性は、体外培養試
験によつて検討した。 その結果は、第９図および第１０図に示す通り
であつた。即ち、ヨウ化銀を吸引したａおよびｂ
（図中ではａとｂを合計した）では、凍結・融解
後、細胞質および透明帯がともに正常な胚（可移
植胚）の割合は、90％に達した。これに対して、
ｃ（図中では「対照」と表示）、ｄおよびｅで
は、可移植胚の得られる割合は極端に低く、逆に
変性胚の得られる割合が高かつた。外部から植氷
を行つたｆでは、可移植胚の割合が高く、その胚
の形態学的分布は、ヨウ化銀を吸引したものと似
通つていた。凍結・融解後、培養によつて拡張胚
盤胞に発育した胚数の割合は、ａ＋ｂおよびｆで
は89％および85％と高率を示したのに対し、ｃ，
ｄおよびｅでは20％前後の低率であつた。 以上の結果から、ヨウ化銀は、胚の凍結保存に
応用した場合、氷晶形成の誘起剤として有効であ
り、従来の植氷方法を行つた場合と同等の成績が
得られることが実証された。 融解後に、気泡が移動してヨウ化銀と胚を含む
保存液が混つた場合のヨウ化銀の胚に及ぼす影響
を調べ、その結果を第１表および第２表に示し
た。第１表で明らかなように、胚の洗浄の有無に
拘わらず可移植胚数および発育胚数の割合は高率
を示した。このことから、ヨウ化銀が融解後に保
存液と混つた場合でも、第２表で明らかなように
胚の生存性に悪影響を及ぼさないことが実証され
た。さらに、保存液とヨウ化銀を混合した後に冷
却を開始したサンプルでも、その融解後の可移植
胚数および発育胚数の割合から、氷晶形成が誘起
されることが明らかであつた。
以上説明したように、本発明による胚の凍結保
存における植氷の方法によれば、保存液に、ヨウ
化銀によつて氷晶形成を誘起するようにしたか
ら、特別の装置は必要ではなく、ただ雰囲気温度
の冷却を制御するだけでよい。また、多本数のサ
ンプルの同時植氷、気泡を隔てての氷晶形成が可
能であり、植氷に伴いサンプルの温度が上昇する
おそれは全くなく、また胚が凍結容器のどの部分
に存在しても問題のないことが予測される。さら
に、予め保存液とヨウ化銀を混合しても氷晶形成
が誘起されることから、プラスチツクストロー以
外の凍結容器を用いた場合にもこの植氷方法は応
用可能である。
存における植氷の方法によれば、保存液に、ヨウ
化銀によつて氷晶形成を誘起するようにしたか
ら、特別の装置は必要ではなく、ただ雰囲気温度
の冷却を制御するだけでよい。また、多本数のサ
ンプルの同時植氷、気泡を隔てての氷晶形成が可
能であり、植氷に伴いサンプルの温度が上昇する
おそれは全くなく、また胚が凍結容器のどの部分
に存在しても問題のないことが予測される。さら
に、予め保存液とヨウ化銀を混合しても氷晶形成
が誘起されることから、プラスチツクストロー以
外の凍結容器を用いた場合にもこの植氷方法は応
用可能である。
第１図は、本発明の試験装置を示す側断面図、
第２図ないし第６図は、第１図の試験装置により
試験されたサンプルａ〜ｆおよびそれぞれのサン
プルの潜熱発生状況を示すグラブで、第２図ａ，
ｂは植氷にヨウ化銀を用いた場合、第３図ｃは保
存液のみの場合、第４図ｄは蒸留水を用いた場
合、第５図ｅは保存液を用いた場合、第６図ｅは
保存液のみで冷媒を自動接触させる場合の側断面
図、第７図ａ〜ｆは、本発明の実施例を示し、第
２図ないし第６図のａ〜ｆと同様のサンプルを示
す側断面図、第８図はサンプルの冷却・融解曲線
を示す模式図、第９図は凍結・融解後の胚の形態
評価による分類のグラフ、第１０図は凍結・融解
後、48時間培養により拡張胚盤胞に発育した胚数
が回収胚数に占める割合を示すグラフである。 １…プラスチツクストロー（凍結容器）、２…
胚、３…保存液、４…気泡、５…ヨウ化銀、６…
封栓、７…銅・コンスタンタン熱電対、８…温度
記録計、９…綿栓、１０…蒸留水。
第２図ないし第６図は、第１図の試験装置により
試験されたサンプルａ〜ｆおよびそれぞれのサン
プルの潜熱発生状況を示すグラブで、第２図ａ，
ｂは植氷にヨウ化銀を用いた場合、第３図ｃは保
存液のみの場合、第４図ｄは蒸留水を用いた場
合、第５図ｅは保存液を用いた場合、第６図ｅは
保存液のみで冷媒を自動接触させる場合の側断面
図、第７図ａ〜ｆは、本発明の実施例を示し、第
２図ないし第６図のａ〜ｆと同様のサンプルを示
す側断面図、第８図はサンプルの冷却・融解曲線
を示す模式図、第９図は凍結・融解後の胚の形態
評価による分類のグラフ、第１０図は凍結・融解
後、48時間培養により拡張胚盤胞に発育した胚数
が回収胚数に占める割合を示すグラフである。 １…プラスチツクストロー（凍結容器）、２…
胚、３…保存液、４…気泡、５…ヨウ化銀、６…
封栓、７…銅・コンスタンタン熱電対、８…温度
記録計、９…綿栓、１０…蒸留水。
【表】
Claims (1)
- １ 胚の凍結保存に用いる保存液に、ヨウ化銀に
よつて氷晶形成を誘起するようにしたことを特徴
とする胚の凍結保存におけるヨウ化銀による植氷
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9918685A JPS61255655A (ja) | 1985-05-09 | 1985-05-09 | 胚の凍結保存におけるヨウ化銀による植氷の方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9918685A JPS61255655A (ja) | 1985-05-09 | 1985-05-09 | 胚の凍結保存におけるヨウ化銀による植氷の方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61255655A JPS61255655A (ja) | 1986-11-13 |
| JPS629342B2 true JPS629342B2 (ja) | 1987-02-27 |
Family
ID=14240616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9918685A Granted JPS61255655A (ja) | 1985-05-09 | 1985-05-09 | 胚の凍結保存におけるヨウ化銀による植氷の方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61255655A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015537047A (ja) * | 2012-12-11 | 2015-12-24 | ユニバーシティ オブ リーズ | 鉱物成核剤を利用した凍結方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5689961A (en) * | 1996-01-30 | 1997-11-25 | Organogenesis Inc. | Ice seeding apparatus for cryopreservation systems |
-
1985
- 1985-05-09 JP JP9918685A patent/JPS61255655A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015537047A (ja) * | 2012-12-11 | 2015-12-24 | ユニバーシティ オブ リーズ | 鉱物成核剤を利用した凍結方法 |
| US10015958B2 (en) | 2012-12-11 | 2018-07-10 | University Of Leeds | Method of freezing making use of a mineral nucleator |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61255655A (ja) | 1986-11-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |