JPS6296087A - リゾビウム・ジヤポニカム １９１の ｎｏｄＤ関連遺伝子 - Google Patents
リゾビウム・ジヤポニカム １９１の ｎｏｄＤ関連遺伝子Info
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- C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ＵＳＤ八１へ１の囲り関連遺伝子は、 ［ｌ５ＤＡ １
９１由来のゲノムＯＮへのＥｃｏＲＩ消化物をリゾビウ
ム・メリロテ４ （Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ） のｎｏｄ Ａ 、 ｎｏｄ Ｂのすべ
ておよびｎｏｄ Ｄとｎｏｄ Ｃの一部を含むｐＲＭＳ
Ｌ４２とハイブリダイズさせて吟味することにより分離
された（Ｅｇｅｌｈｏｆｆ （１９８５））。２つの強
くハイブリダイズした断片が見出され、１つは約６Ｋｂ
ｐ。
９１由来のゲノムＯＮへのＥｃｏＲＩ消化物をリゾビウ
ム・メリロテ４ （Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ） のｎｏｄ Ａ 、 ｎｏｄ Ｂのすべ
ておよびｎｏｄ Ｄとｎｏｄ Ｃの一部を含むｐＲＭＳ
Ｌ４２とハイブリダイズさせて吟味することにより分離
された（Ｅｇｅｌｈｏｆｆ （１９８５））。２つの強
くハイブリダイズした断片が見出され、１つは約６Ｋｂ
ｐ。
もう一方は約３ ＫｂｐでそれぞれＥＡ１４−１７およ
びＥＡ４−１９と名付けられた。断片ＥＡ１４−１７は
ゴＤ −ｒｌを含み、また断片ＥＡ４−１９はｎｏｄＤ
ｒ２を含む。６Ｋｂｐ 、 ３Ｋｂｐのいずれの
断片も囲Ａ、 ｎ剋Ｂまたはｎｏｄ Ｃに相同な配列
を含んでいなかった。ｎｏｄＡおよび／またはｎｏｄ
Ｂに関連する配列およびｎｏｄ Ｃに関連する配列は、
９．６Ｋｂｐの別個のＥｃｏＲｒ断片上において識別
された。したがって、 ＵＳＤＡ １９１の囲遺伝子の
遺伝的な構成は、以前に報告された菌株のそれとは、
ｎｏｄＤ関連配列がｎｏｄ Ａ 、 ｎｏｄ Ｂ
。
びＥＡ４−１９と名付けられた。断片ＥＡ１４−１７は
ゴＤ −ｒｌを含み、また断片ＥＡ４−１９はｎｏｄＤ
ｒ２を含む。６Ｋｂｐ 、 ３Ｋｂｐのいずれの
断片も囲Ａ、 ｎ剋Ｂまたはｎｏｄ Ｃに相同な配列
を含んでいなかった。ｎｏｄＡおよび／またはｎｏｄ
Ｂに関連する配列およびｎｏｄ Ｃに関連する配列は、
９．６Ｋｂｐの別個のＥｃｏＲｒ断片上において識別
された。したがって、 ＵＳＤＡ １９１の囲遺伝子の
遺伝的な構成は、以前に報告された菌株のそれとは、
ｎｏｄＤ関連配列がｎｏｄ Ａ 、 ｎｏｄ Ｂ
。
ｎｏｄ Ｃ位置から少なくとも数キロベースにより分離
されまた互いの間でも分離していることにおいて相違す
る。
されまた互いの間でも分離していることにおいて相違す
る。
（以下余白）
第１図は２つのＥｃｏ Ｒ１断片の部分的制限地図を示
す。各々の大部分はｎｏｄ Ｄに関連するコード領域の
すべてを含め配列決定された。３ｋｂＥｃｏ Ｒ１の断
片においては２８８６塩基対がほとんど全断片に対応し
て配列決定された。斜線の入った領域は、 ３６，３９
３の分子量を持つ３２１アミノ酸の蛋白をコードするｎ
ｏｄ Ｄ−ｒ２オーブンリーディングフレームの位置を
図形的に示す。矢印は３ｋｂ断片の制限地図に関してｎ
ｏｄＤ−ｒ２の転写方向を示している。６ｋｂ断片では
２５４３塩基対の配列が決定された。これはオープンリ
ーディングフレームおよびＥＡ１４−１７のコード領域
にわたり１分子量が３５，３００の３１２アミノ酸の蛍
白をコードするものである。矢印は制限地図に関して転
写方向を示す。表１は、コード配列。
す。各々の大部分はｎｏｄ Ｄに関連するコード領域の
すべてを含め配列決定された。３ｋｂＥｃｏ Ｒ１の断
片においては２８８６塩基対がほとんど全断片に対応し
て配列決定された。斜線の入った領域は、 ３６，３９
３の分子量を持つ３２１アミノ酸の蛋白をコードするｎ
ｏｄ Ｄ−ｒ２オーブンリーディングフレームの位置を
図形的に示す。矢印は３ｋｂ断片の制限地図に関してｎ
ｏｄＤ−ｒ２の転写方向を示している。６ｋｂ断片では
２５４３塩基対の配列が決定された。これはオープンリ
ーディングフレームおよびＥＡ１４−１７のコード領域
にわたり１分子量が３５，３００の３１２アミノ酸の蛍
白をコードするものである。矢印は制限地図に関して転
写方向を示す。表１は、コード配列。
プロモーターを含む３５６塩基の５゛側非翻訳配列。
および８２塩基の３゛側非翻訳配列を含むｎｏｄＤ −
ｒ２のＤＮＡ配列を示している。表２には、コード配列
プロモーターを含む３３７塩基対の５゛側非翻訳配列。
ｒ２のＤＮＡ配列を示している。表２には、コード配列
プロモーターを含む３３７塩基対の５゛側非翻訳配列。
および１２８塩基対の３°側非翻訳領域を含むｎｏｄ
Ｄ−ｒｌのヌクレオチド配列が含まれている。表３には
ｎｏｄ Ｄ−ｒ２およびｎｏｄ Ｄ−ｒｌにより各々コ
ードされたアミノ酸配列を示す。ｎｏｄＤ −ｒ２およ
びｎｏｄＤ−ｒｌの推定上のアミノ酸配列は約７０％の
相同性を示し、かつこれらの各々はりゾビウム・メリロ
ティ （Ｂエ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｎｏｄ Ｄ遺伝子
の配列から推定されたアミノ酸配列に対し約７０％の相
同性を示した。以下に記載された機能上の差からみて。
Ｄ−ｒｌのヌクレオチド配列が含まれている。表３には
ｎｏｄ Ｄ−ｒ２およびｎｏｄ Ｄ−ｒｌにより各々コ
ードされたアミノ酸配列を示す。ｎｏｄＤ −ｒ２およ
びｎｏｄＤ−ｒｌの推定上のアミノ酸配列は約７０％の
相同性を示し、かつこれらの各々はりゾビウム・メリロ
ティ （Ｂエ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｎｏｄ Ｄ遺伝子
の配列から推定されたアミノ酸配列に対し約７０％の相
同性を示した。以下に記載された機能上の差からみて。
非相同性の程度は有意な機能上の非類似性を生せしめる
のに充分であるように思われる。
のに充分であるように思われる。
ｔｌｓＤ＾１９１のｎｏｄ Ｄ関連遺伝子の機能上の特
質は下記の如く一覧化される。ｎｏｄ Ｄ −ｒｌにお
ける突然変異体は大豆根瘤を迅速かつ効果的に形成する
ことが出来ない；大豆の根瘤の形成は遅れ、かつ形成さ
れた根瘤は窒素を固定する能力に乏しく。
質は下記の如く一覧化される。ｎｏｄ Ｄ −ｒｌにお
ける突然変異体は大豆根瘤を迅速かつ効果的に形成する
ことが出来ない；大豆の根瘤の形成は遅れ、かつ形成さ
れた根瘤は窒素を固定する能力に乏しく。
通常の成熟根瘤の能力の約１７４である。ベクターｐＲ
Ｋ２９０上にある虻Ｄ−ｒｌの過剰コピーを含むＵＳＤ
Ａ １９１の構造が形成するエキソポリサッカライドの
量は、幾種かの研究学課地上での野性型のＵＳＤＡ１９
１のそれよりも実質的に少ない。ｎｏｄＤ −ｒｌは遊
離生活する菌体中で発現される。広宿主域プラスミド上
のｎｏｄＤ−ｒｌは１元来クローバーに根瘤を形成する
ことの出来ないりゾビウム・トリフオリ （Ｒ，ｔｒｉ
ｆｏｌｉｉ） ｎｏｄ Ｄ−突然変異体に対しクローバ
−への根瘤形成能力を回復せしめることは出来ない。
Ｋ２９０上にある虻Ｄ−ｒｌの過剰コピーを含むＵＳＤ
Ａ １９１の構造が形成するエキソポリサッカライドの
量は、幾種かの研究学課地上での野性型のＵＳＤＡ１９
１のそれよりも実質的に少ない。ｎｏｄＤ −ｒｌは遊
離生活する菌体中で発現される。広宿主域プラスミド上
のｎｏｄＤ−ｒｌは１元来クローバーに根瘤を形成する
ことの出来ないりゾビウム・トリフオリ （Ｒ，ｔｒｉ
ｆｏｌｉｉ） ｎｏｄ Ｄ−突然変異体に対しクローバ
−への根瘤形成能力を回復せしめることは出来ない。
ＵＳＤＡ １９１ｎｏｄ Ｄ−ｒ２の突然変異体は、野
性型およびｎｏｄ Ｄ−ｒｌの突然変異体に比較して、
熱帯性のレグメシラトロ（ｌｅｇｕｍｅ ５ｉｒａｔｒ
ｏ）に根瘤を形成することは出来ない。ベクターｐＲＫ
２９０上に存在するｎｏｄＤ−ｒ２の過剰コピーを含む
ｔｌｓＤＡ １９１の構造ハ、コロニーの形態により判
断して、エキソポリサッカライド産生に関して認め得る
変化を生ぜしめない。ｎｏｄＤ−ｒｌに比較して、広宿
主域プラスミド上のｎｏｄＤ−ｒ２は、リゾビウム・ト
リフオリ （Ｒ，ｔｒｉｆｏｌｉｉ） ｎｏｄ Ｄ−突
然変異体に移された時これを相補し、クローバ−に根瘤
を形成することの能力を回復することが出来る。
性型およびｎｏｄ Ｄ−ｒｌの突然変異体に比較して、
熱帯性のレグメシラトロ（ｌｅｇｕｍｅ ５ｉｒａｔｒ
ｏ）に根瘤を形成することは出来ない。ベクターｐＲＫ
２９０上に存在するｎｏｄＤ−ｒ２の過剰コピーを含む
ｔｌｓＤＡ １９１の構造ハ、コロニーの形態により判
断して、エキソポリサッカライド産生に関して認め得る
変化を生ぜしめない。ｎｏｄＤ−ｒｌに比較して、広宿
主域プラスミド上のｎｏｄＤ−ｒ２は、リゾビウム・ト
リフオリ （Ｒ，ｔｒｉｆｏｌｉｉ） ｎｏｄ Ｄ−突
然変異体に移された時これを相補し、クローバ−に根瘤
を形成することの能力を回復することが出来る。
ＵＳＤＡ １９１のｎｏｄ Ｄ関連遺伝子の両者をリゾ
ビウム・メリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）またはり
ゾビウム・レグミノサラム（Ｒユ 圏■畦匹且ユ畦ニ移
スことにより （ＵＳＤＡ １９１ Ｓパブラスミドに
含まれる他の遺伝子と共に）、かかる菌体が正常な大豆
根瘤を形成せしめることにはならない。上記の代わりに
生じる根瘤は欠陥を持ち、窒素固定能力を欠き、レグヘ
モグロビン、ノジュリン３５またはノジュリン２９を含
まず、かつかかる欠陥根瘤からは生育し得るバクテリア
を取り出すことは不可能である。リゾビウム・メリロテ
ィ （Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）宿主はそれ自身の共生遺
伝子に関して野性型株であったのに対し、リゾビウム・
レグミノサラム（Ｌ圏且ｍ１ｎｏ且聾畦株は自身の共生
遺伝子を欠失していた。上記に反し１両ｎｏｄ Ｄ関連
遺伝子を含むＵＳＤＡ１９１」ＬプラスミドのＡＮＵ２
６５（広宿主域の生育の迅速な菌株ＮＧＲ２３４ｐ箪除
去誘導体）への移動により、 ＡＮＵ ２６５／ｐＳｙ
ｍ １９１の移転結合体は大豆に正常な窒素固定根瘤を
形成することが可能となる。
ビウム・メリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）またはり
ゾビウム・レグミノサラム（Ｒユ 圏■畦匹且ユ畦ニ移
スことにより （ＵＳＤＡ １９１ Ｓパブラスミドに
含まれる他の遺伝子と共に）、かかる菌体が正常な大豆
根瘤を形成せしめることにはならない。上記の代わりに
生じる根瘤は欠陥を持ち、窒素固定能力を欠き、レグヘ
モグロビン、ノジュリン３５またはノジュリン２９を含
まず、かつかかる欠陥根瘤からは生育し得るバクテリア
を取り出すことは不可能である。リゾビウム・メリロテ
ィ （Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）宿主はそれ自身の共生遺
伝子に関して野性型株であったのに対し、リゾビウム・
レグミノサラム（Ｌ圏且ｍ１ｎｏ且聾畦株は自身の共生
遺伝子を欠失していた。上記に反し１両ｎｏｄ Ｄ関連
遺伝子を含むＵＳＤＡ１９１」ＬプラスミドのＡＮＵ２
６５（広宿主域の生育の迅速な菌株ＮＧＲ２３４ｐ箪除
去誘導体）への移動により、 ＡＮＵ ２６５／ｐＳｙ
ｍ １９１の移転結合体は大豆に正常な窒素固定根瘤を
形成することが可能となる。
２ ツ（７） ＬＩＳＤＡ １９１ｎｏｄ Ｄ関連遺伝
子にコードされるアミノ酸配列と、蛋白配列データベー
スにおけるアミノ酸配列との比較により、これらの遺伝
子とＥ、 ｃｏ旦のｎ辷Ｒ遺伝子との間の予期せざる
相同性が判明した。ｈＬＲの機能は、アミノ酸リジン生
合成過程の遺伝子の転写に関するレギュレーターの機能
である。更に、 ｈＬＲは自己の発現にろいてのフィー
ドバック制御を行う（Ｐ、 Ｓｔｒａｇｉｅｒｅｔ
ａ１、 （１９８３） Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ１、
１６８：３３３）。更に。
子にコードされるアミノ酸配列と、蛋白配列データベー
スにおけるアミノ酸配列との比較により、これらの遺伝
子とＥ、 ｃｏ旦のｎ辷Ｒ遺伝子との間の予期せざる
相同性が判明した。ｈＬＲの機能は、アミノ酸リジン生
合成過程の遺伝子の転写に関するレギュレーターの機能
である。更に、 ｈＬＲは自己の発現にろいてのフィー
ドバック制御を行う（Ｐ、 Ｓｔｒａｇｉｅｒｅｔ
ａ１、 （１９８３） Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ１、
１６８：３３３）。更に。
ｂ！Ｒはバクテリアの細胞壁成分であるジアミノピメリ
ン酸に反応して展Ａを制御するから、μｐｄ−り関連遺
伝子は細胞壁成分、またはりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ）大豆相互作用中にリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ）あるいは大豆のいづれかにより放出される他の物質
に反応して他のｎｏｄ遺伝子の発現をも仲介することが
出来る。上記の観察はＵＳＤＡ １９１のｎｏｄ Ｄ関
連遺伝子の制′４′ｎ機能を示唆するが１本発明は虻り
関連遺伝子が有効に働くためのその機能上の理論に依存
しない。
ン酸に反応して展Ａを制御するから、μｐｄ−り関連遺
伝子は細胞壁成分、またはりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ）大豆相互作用中にリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ）あるいは大豆のいづれかにより放出される他の物質
に反応して他のｎｏｄ遺伝子の発現をも仲介することが
出来る。上記の観察はＵＳＤＡ １９１のｎｏｄ Ｄ関
連遺伝子の制′４′ｎ機能を示唆するが１本発明は虻り
関連遺伝子が有効に働くためのその機能上の理論に依存
しない。
クローン化されたｔｌｓＤＡ １９１のｎｏｄ Ｄ関連
遺伝子であるｎｏｄＤｒｌおよびｎｏｄＤ −ｒ２はＵ
ＳＤＡ １９１および他の大豆根瘤バクテリアを遺伝操
作して、大豆根瘤形成の速度、効率、比肩性および栽培
上の特殊性の如きパラメーターを変更するのに有用であ
る。更に、 ｎｏｄ Ｄ−ｒｌは栽培により増殖するり
ゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株によるエキソポリサ
ッカライド産生を調節するのに役立ち、しかもこの菌株
の性質は、エキソポリサッカライドの合成が商用リゾビ
ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）生産法の生産性を制限しか
つ栽培用媒地からの菌体の濃縮および精製化のための分
離技術に対して阻害因子となるために。
遺伝子であるｎｏｄＤｒｌおよびｎｏｄＤ −ｒ２はＵ
ＳＤＡ １９１および他の大豆根瘤バクテリアを遺伝操
作して、大豆根瘤形成の速度、効率、比肩性および栽培
上の特殊性の如きパラメーターを変更するのに有用であ
る。更に、 ｎｏｄ Ｄ−ｒｌは栽培により増殖するり
ゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株によるエキソポリサ
ッカライド産生を調節するのに役立ち、しかもこの菌株
の性質は、エキソポリサッカライドの合成が商用リゾビ
ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）生産法の生産性を制限しか
つ栽培用媒地からの菌体の濃縮および精製化のための分
離技術に対して阻害因子となるために。
重要な存在である。当分野で公知の多数の遺伝操作が、
遺伝子の量、遺伝子発現の速度およびタイミングを変更
するために、または環境因子による遺伝子発現の調節に
使用される。これらの技法の中には、下記に限られるこ
とはないが、他のプロモーターのコントロール下での遺
伝子の一つまたは両者の発現、宿主細胞中の遺伝子の量
の変更。
遺伝子の量、遺伝子発現の速度およびタイミングを変更
するために、または環境因子による遺伝子発現の調節に
使用される。これらの技法の中には、下記に限られるこ
とはないが、他のプロモーターのコントロール下での遺
伝子の一つまたは両者の発現、宿主細胞中の遺伝子の量
の変更。
一つ以上の遺伝子コピーの誘導性あるいは構成性の発現
を可能にすることおよび匹虹り関連遺伝子の機能を互い
にまたは他の遺伝子と組み合わせる翻訳時の融合の形成
が含まれる。発現の速度とタイミング、およびｕｐ−”
５４節やｄｏｗｎ ｓｍ節の行われる条件をもたらす
遺伝子操作の他の技法は、当業者に理解されるごとく使
用される。開示されたヌクレオチド配列のデータは、公
知のＤＮＡ配列改変技術２例えば、下記に限定すること
はないが、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、エクソ
ヌクレアーゼの使用および部位支配性突然変異生成およ
び化学的ＤＮＡ合成のプロセスを含む技法を用いて。
を可能にすることおよび匹虹り関連遺伝子の機能を互い
にまたは他の遺伝子と組み合わせる翻訳時の融合の形成
が含まれる。発現の速度とタイミング、およびｕｐ−”
５４節やｄｏｗｎ ｓｍ節の行われる条件をもたらす
遺伝子操作の他の技法は、当業者に理解されるごとく使
用される。開示されたヌクレオチド配列のデータは、公
知のＤＮＡ配列改変技術２例えば、下記に限定すること
はないが、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、エクソ
ヌクレアーゼの使用および部位支配性突然変異生成およ
び化学的ＤＮＡ合成のプロセスを含む技法を用いて。
記載された遺伝子の構造を形成するための手段を提供す
る。
る。
ｎｏｄＤ−ｒｌおよびｎｏｄＤ−ｒ２のプロモーターは
。
。
それに通常付随するｎｏｄＤ−ｒｌおよびｎｏｄＤ −
ｒ２の構造遺伝子以外のコード配列の発現に有用である
。かかるコード配列（ここでは、外因性のコード配列と
呼ばれる）は同じまたは異なった生物の他の遺伝子９合
成りＮＡまたはキメラ性のコード配列を形成する供給源
の組合せに由来し得、しかも構造的制限はｌｆｌ訳可能
なコード配列に対しては当分野において公知であるもの
のみである。外因性コード配列およびｎｏｄＤ−ｒｌま
たはｎｏｄＤ −ｒ２のプロモーターを有する複合遺伝
子の形成は、壁回−Ｄ−ｒｌまたはｎｏｄＤ −ｒ２発
現に特徴的な環境下でのこの複合遺伝子の発現に到らし
める。例えば。
ｒ２の構造遺伝子以外のコード配列の発現に有用である
。かかるコード配列（ここでは、外因性のコード配列と
呼ばれる）は同じまたは異なった生物の他の遺伝子９合
成りＮＡまたはキメラ性のコード配列を形成する供給源
の組合せに由来し得、しかも構造的制限はｌｆｌ訳可能
なコード配列に対しては当分野において公知であるもの
のみである。外因性コード配列およびｎｏｄＤ−ｒｌま
たはｎｏｄＤ −ｒ２のプロモーターを有する複合遺伝
子の形成は、壁回−Ｄ−ｒｌまたはｎｏｄＤ −ｒ２発
現に特徴的な環境下でのこの複合遺伝子の発現に到らし
める。例えば。
ｎｏｄ Ｄ−ｒｌプロモーターは遊離生活するバクテリ
アおよび大豆相席の両者において発現を作動させるＵ！
ＩＤ−ｒ２プロモーターは大豆相席での発現を作動させ
かつ遊離生活するリゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）におい
ても発現させる。
アおよび大豆相席の両者において発現を作動させるＵ！
ＩＤ−ｒ２プロモーターは大豆相席での発現を作動させ
かつ遊離生活するリゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）におい
ても発現させる。
ここではプロモーターは、転写に必要なすべての制御領
域を含む転写開始部位上流のヌクレオチド配列として定
義される。プロモーター領域は一部は、転写開始部位を
識別するＳ１ヌクレアーゼマ・ノピングの技法により特
定され得る。プロモーターのさらなる特定は機能に基づ
くものである。転写開始部位近位の配列の部分はプロモ
ーターの機能に対してしばしば不可欠であるのに対し、
より遠位側の上流小片は調節物質に対する“微調整”応
答の機能を発揮することがある。ある共通配列は原核性
のプロモーターの特性的なものであることが証明されて
いる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｕｒｔ（１９
７９））。
域を含む転写開始部位上流のヌクレオチド配列として定
義される。プロモーター領域は一部は、転写開始部位を
識別するＳ１ヌクレアーゼマ・ノピングの技法により特
定され得る。プロモーターのさらなる特定は機能に基づ
くものである。転写開始部位近位の配列の部分はプロモ
ーターの機能に対してしばしば不可欠であるのに対し、
より遠位側の上流小片は調節物質に対する“微調整”応
答の機能を発揮することがある。ある共通配列は原核性
のプロモーターの特性的なものであることが証明されて
いる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｕｒｔ（１９
７９））。
上記の基準は、ｎｏｄＤｒｌまたはｎｏｄＤ −ｒ２の
コード領域の開始から上流の５゛非翻訳領域内にかなり
の確実性をもってリゾビウム・ジャポニカム（Ｒ，Ｄ且
狙兵μＬ） ＵＳＤＡ １９１のｎｏｄＤ −ｒｌおよ
びｎｏｄＤ−ｒ２のプロモーターを識別するために使用
され得る。ｎｏｄＤ−ｒｌプロモーターは大体１９７０
位置（表２）から転写開始部位（位置１６６３の翻訳開
始の上流の点）に延びる配列中に位置する。ｎｏｄＤ−
ｒ２プロモーターは大体９５１位置（表１）から転写部
位に延びる配列に位置する。
コード領域の開始から上流の５゛非翻訳領域内にかなり
の確実性をもってリゾビウム・ジャポニカム（Ｒ，Ｄ且
狙兵μＬ） ＵＳＤＡ １９１のｎｏｄＤ −ｒｌおよ
びｎｏｄＤ−ｒ２のプロモーターを識別するために使用
され得る。ｎｏｄＤ−ｒｌプロモーターは大体１９７０
位置（表２）から転写開始部位（位置１６６３の翻訳開
始の上流の点）に延びる配列中に位置する。ｎｏｄＤ−
ｒ２プロモーターは大体９５１位置（表１）から転写部
位に延びる配列に位置する。
ここで提供される配列のデータは、当分野において公知
の方法に組合わされた時、当業者がその発現がル回より
−ｒｌまたは止：＋ｄＤ−ｒ２により調節される所望の
複合遺伝子を構成するために充分なものである。このよ
うな方法には、下記のものに限定されることはないが、
配列中の所望の部位での制限エンドヌクレアーゼ切断、
所望断片の他の所望ＤＮＡ断片への連結、オリゴヌクレ
オチドの化学合成および部位支配性の突然変異生成が含
まれる。
の方法に組合わされた時、当業者がその発現がル回より
−ｒｌまたは止：＋ｄＤ−ｒ２により調節される所望の
複合遺伝子を構成するために充分なものである。このよ
うな方法には、下記のものに限定されることはないが、
配列中の所望の部位での制限エンドヌクレアーゼ切断、
所望断片の他の所望ＤＮＡ断片への連結、オリゴヌクレ
オチドの化学合成および部位支配性の突然変異生成が含
まれる。
プロモーターおよびコード配列の配列に関する変異体は
１機能に実質的に影響を及ぼすことなく実現可能である
ことが知られている。対立遺伝子変異体として知られて
いるある種のかかる変異体の出現は自然界ではその頻度
が限定されている。
１機能に実質的に影響を及ぼすことなく実現可能である
ことが知られている。対立遺伝子変異体として知られて
いるある種のかかる変異体の出現は自然界ではその頻度
が限定されている。
コード配列に対しては、同じアミノ酸配列をコードする
異なったヌクレオチド配列を持つ相同体は遺伝コードの
性質から可能であることが知られている。アミノ酸配列
に影響を及ぼす他の変異体もまた可能であるが、それに
も拘わらず、これは機能的な性質が実質的に変化するこ
とはない。プロモーターに対しては、配列のある部分は
不可欠であることがあるのに対し、他の部分においては
プロモーターの定量的および定性的な機能的性質に影響
を及ぼすことな（変異が許されることがある。
異なったヌクレオチド配列を持つ相同体は遺伝コードの
性質から可能であることが知られている。アミノ酸配列
に影響を及ぼす他の変異体もまた可能であるが、それに
も拘わらず、これは機能的な性質が実質的に変化するこ
とはない。プロモーターに対しては、配列のある部分は
不可欠であることがあるのに対し、他の部分においては
プロモーターの定量的および定性的な機能的性質に影響
を及ぼすことな（変異が許されることがある。
プロモーターと類似の機能との比較に基づけば。
全体の相同性が９０％または以上である時には、プロモ
ーターの機能に実質的に影響を及ぼすことのない変異が
許されかつ識別することが可能である。
ーターの機能に実質的に影響を及ぼすことのない変異が
許されかつ識別することが可能である。
従って、互換性を持つ等個物の範囲には、コード配列の
場合は機能的に等価な蛋白をコードする相同物、またプ
ロモーターの場合は少なくとも９０％の配列相同性を持
つ機能的に等価な相同物が含まれる。
場合は機能的に等価な蛋白をコードする相同物、またプ
ロモーターの場合は少なくとも９０％の配列相同性を持
つ機能的に等価な相同物が含まれる。
下記の例は単に発明を詳述する。下に注記されている場
合を除き、クローニング、 ＤＮＡ分離、増幅および精
製、 ＤＮＡ リガーゼ、 ＤＮＡポリメラーゼ。
合を除き、クローニング、 ＤＮＡ分離、増幅および精
製、 ＤＮＡ リガーゼ、 ＤＮＡポリメラーゼ。
制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素的反応および各種
の分離技術に対する標準技法は当業者には公知であり一
般に用いられるものである（例えば。
の分離技術に対する標準技法は当業者には公知であり一
般に用いられるものである（例えば。
Ｒ，Ｗｕ ＋ ｅｄ、 （１９７９） Ｍｅｔｈ、 Ｅ
ｎｚｙｍｏ１、 ６８：Ｒ，Ｗｕ 。
ｎｚｙｍｏ１、 ６８：Ｒ，Ｗｕ 。
ｅｔ ａ１、、 ｅｄｓ、 （１９８３） Ｍｅｔｈ
、 Ｅｎｚｙｍｏ１、 １００ 、匪；Ｌ、 Ｇｒｏｓ
ｓｍａｎ ａｎｄ Ｋ、 Ｍｏ１ｄａｖｅ、 ｅｄｓ、
（１９８０） Ｍｅｔｈ。
、 Ｅｎｚｙｍｏ１、 １００ 、匪；Ｌ、 Ｇｒｏｓ
ｓｍａｎ ａｎｄ Ｋ、 Ｍｏ１ｄａｖｅ、 ｅｄｓ、
（１９８０） Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏ１、 ６５；Ｊ、 Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ （
１９７２） Ｅｘ ｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ； Ｒ，Ｄａｖｉｓ
ｅｔ 旦、（１９８０） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂ
ａｃｔｅｒｊａｌ ＧｅｎｅｔｉｃｓＨＲ，Ｆ。
１９７２） Ｅｘ ｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ； Ｒ，Ｄａｖｉｓ
ｅｔ 旦、（１９８０） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂ
ａｃｔｅｒｊａｌ ＧｅｎｅｔｉｃｓＨＲ，Ｆ。
５ｃｈｌｅｉｆ ａｎｄ Ｐ、Ｃ，Ｗｅｎｓｉｎｋ （
１９８２） ＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 紅虹■Ｌ；ａｎｄ Ｔ。
１９８２） ＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 紅虹■Ｌ；ａｎｄ Ｔ。
Ｍａｎｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ 、 （１９８２）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 且並江Ｌ）。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 且並江Ｌ）。
略号が用いられている時には、この分野において標準と
考えられ、かつこの中に引用されたごとき広（頭布され
ている専門誌に一般に用いられているものである。ＤＮ
Ａ配列に関して用いられている用語“ｃｌｏｎｅｄ”は
、汚染ＤＮＡを実質的に含まない分離されかつ精製され
た特定のＤＮＡ配列を意味する。ただし、クローン化Ｄ
ＮＡは、それからクローン化ＤＮＡが制限酵素消化およ
び電気泳動を含む従来の技法により分離され得るベクタ
ーまたは他の複製可能な存在物の一部として保持される
ことが出来る。
考えられ、かつこの中に引用されたごとき広（頭布され
ている専門誌に一般に用いられているものである。ＤＮ
Ａ配列に関して用いられている用語“ｃｌｏｎｅｄ”は
、汚染ＤＮＡを実質的に含まない分離されかつ精製され
た特定のＤＮＡ配列を意味する。ただし、クローン化Ｄ
ＮＡは、それからクローン化ＤＮＡが制限酵素消化およ
び電気泳動を含む従来の技法により分離され得るベクタ
ーまたは他の複製可能な存在物の一部として保持される
ことが出来る。
［ｌ５ＤＡ １９１の全ゲノムＤＮＡが匡乞ＲＩで消化
され。
され。
アガロースゲル電気泳動により分画された。Ｓ、Ｌ。
Ｌｏｎｇから得られたプラスミドｐＲＭＳＬ４２がハイ
ブリダイゼーションプローグとして、サザンハイプリダ
イゼーションの条件下に使用され、プローブの配列と相
同な配列を識別した。プローブはりゾビウム・メリロテ
４ （Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｎｏｄ Ａおよびｎ
ｏｄ Ｂの全て、並びにｎｏｄ Ｄとｎｏｄ Ｃの一部
を含んでいた。それぞれ９．６ ｋｂ、 ６．０ ｋｂ
および３．Ｏｋｂの３つの強ハイブリダイズするＥｃｏ
Ｒ１断片がＩＪＳＤ八１９へに存在していたが、 ｔ
ｌｓＤＡ １９１」ｕプラスミドを欠（誘導体にはなか
った。９．６ ｋｂ断片はｎｏｄ Ｃおよびｎｏｄ Ａ
および／もしくはｎｃ＋ｄ Ｂと相同な配列を有するこ
とが見出されたが、 ｎｏｄ Ｄとの相同性はなかった
。しかし、 ３．０ｋｂと６．０ｋｂの断片はいづれ
もリゾビウム・メリロテイ （Ｂユ ｍｅｌ １ｌｏｔ
ｉ）ｎｏｄＤ領域と相同性を有していた。
ブリダイゼーションプローグとして、サザンハイプリダ
イゼーションの条件下に使用され、プローブの配列と相
同な配列を識別した。プローブはりゾビウム・メリロテ
４ （Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｎｏｄ Ａおよびｎ
ｏｄ Ｂの全て、並びにｎｏｄ Ｄとｎｏｄ Ｃの一部
を含んでいた。それぞれ９．６ ｋｂ、 ６．０ ｋｂ
および３．Ｏｋｂの３つの強ハイブリダイズするＥｃｏ
Ｒ１断片がＩＪＳＤ八１９へに存在していたが、 ｔ
ｌｓＤＡ １９１」ｕプラスミドを欠（誘導体にはなか
った。９．６ ｋｂ断片はｎｏｄ Ｃおよびｎｏｄ Ａ
および／もしくはｎｃ＋ｄ Ｂと相同な配列を有するこ
とが見出されたが、 ｎｏｄ Ｄとの相同性はなかった
。しかし、 ３．０ｋｂと６．０ｋｂの断片はいづれ
もリゾビウム・メリロテイ （Ｂユ ｍｅｌ １ｌｏｔ
ｉ）ｎｏｄＤ領域と相同性を有していた。
コスミッド・クローン・バンクは部分的にＥｃ。
Ｒ１で消化されたゲノムＵＳＤＡ １９１ＤＮＡをベク
ターｐｓＵＰ ２０５ （Ｓｉｍｏｎ Ｒ，ｅｔ ａ
１、（１９８３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１ニア
８４）でパッケージングすることにより作られた。この
バンクをｐＲＭＳＬ４２のｎｏｄ特異断片でスクリーニ
ングを行うと、 ＵＳＤＡ １９１ｎｏｄ関連遺伝子を
含む数個のクローンがあることがわかった。３．０ｋｂ
断片とその隣接断片とを含むコスミッドは６．０ｋｂま
たは９．６ｋｂの断片は含有していなかった。また６、
０ｋｂ断片およびその隣接断片とを含むコスミッドは３
．０ｋｂまたは９．６ｋｂの領域を含んでいなかった。
ターｐｓＵＰ ２０５ （Ｓｉｍｏｎ Ｒ，ｅｔ ａ
１、（１９８３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１ニア
８４）でパッケージングすることにより作られた。この
バンクをｐＲＭＳＬ４２のｎｏｄ特異断片でスクリーニ
ングを行うと、 ＵＳＤＡ １９１ｎｏｄ関連遺伝子を
含む数個のクローンがあることがわかった。３．０ｋｂ
断片とその隣接断片とを含むコスミッドは６．０ｋｂま
たは９．６ｋｂの断片は含有していなかった。また６、
０ｋｂ断片およびその隣接断片とを含むコスミッドは３
．０ｋｂまたは９．６ｋｂの領域を含んでいなかった。
それ故に、この二つの部位でのｎｏｄ Ｄ関連配列は相
互に分離し、また匹ｄ Ａ、 ｎｏｄ Ｂ、皿ＬＣ座位
からとも少なくとも数キロベース離れている。なお１皿
ｄＡ、匹ｄ Ｂ、匹虹Ｃに隣接する匹ＬＤ関連配列は検
出されなかった。
互に分離し、また匹ｄ Ａ、 ｎｏｄ Ｂ、皿ＬＣ座位
からとも少なくとも数キロベース離れている。なお１皿
ｄＡ、匹ｄ Ｂ、匹虹Ｃに隣接する匹ＬＤ関連配列は検
出されなかった。
さらにハイブリダイゼーションの実験を続けた結果、リ
ゾビウム・メリロティ （Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のと
ｒｄ Ｄ領域はＵＳＤＡ １９１の３．０ｋｂと６．Ｏ
ｋｂの断片中央部とだけハイブリダイズすることがわか
った。
ゾビウム・メリロティ （Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のと
ｒｄ Ｄ領域はＵＳＤＡ １９１の３．０ｋｂと６．Ｏ
ｋｂの断片中央部とだけハイブリダイズすることがわか
った。
このＵＳＤＡ １９１の２断片は相互にもハイブリダイ
ズするが、中央部のみが相同性を有していた。中央部の
ハイブリダイズする領域はＭａｘａｍ、 Ａ ａｎｄＧ
ｉｌｂｅｒｊ、 Ｗ、 （１９７７） Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ１、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、７４．５６０の技術を使
って配列決定された。３．０ｋｂ断片に付随しているｎ
ｏｄ Ｄ関連配列をｎｏｄＤ −ｒ２と称し。
ズするが、中央部のみが相同性を有していた。中央部の
ハイブリダイズする領域はＭａｘａｍ、 Ａ ａｎｄＧ
ｉｌｂｅｒｊ、 Ｗ、 （１９７７） Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ１、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、７４．５６０の技術を使
って配列決定された。３．０ｋｂ断片に付随しているｎ
ｏｄ Ｄ関連配列をｎｏｄＤ −ｒ２と称し。
また６、０ｋｂ断片に付随する匹ｄＤ関連配列をｎｏｄ
Ｄ−ｒｌと称した。３．０ｋｂ断片の２８８６塩基対が
配列決定され、また６、０ｋｂ断片の中央ｎｏｄ Ｄ関
連部分の２５４３塩基対も配列決定された。各々のケー
スについてｎｏｄＤ−ｒｌの場合には約９３６塩基対の
長さの大きなオープンリーディングフレームがあり。
Ｄ−ｒｌと称した。３．０ｋｂ断片の２８８６塩基対が
配列決定され、また６、０ｋｂ断片の中央ｎｏｄ Ｄ関
連部分の２５４３塩基対も配列決定された。各々のケー
スについてｎｏｄＤ−ｒｌの場合には約９３６塩基対の
長さの大きなオープンリーディングフレームがあり。
またｎｏｄＤ−ｒ２の場合には９６３塩基対の長さのフ
レームがあることが、配列から判明した。オープンリー
ディングフレームおよび５゛および３′の非翻訳領域を
含むＥＡ１４−１７およびＨＡ４−１９の配列が表１お
よび表２に示されている。オープンリーディングフレー
ムに先立つ（５゛側の）３００塩基対領域は。
レームがあることが、配列から判明した。オープンリー
ディングフレームおよび５゛および３′の非翻訳領域を
含むＥＡ１４−１７およびＨＡ４−１９の配列が表１お
よび表２に示されている。オープンリーディングフレー
ムに先立つ（５゛側の）３００塩基対領域は。
リゾビウム・メリロティ （Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）中
のｎｏｄＤに先立つ領域と相同な数個の領域を含んでお
り。
のｎｏｄＤに先立つ領域と相同な数個の領域を含んでお
り。
かつこれらの領域はＵＳＤＡ １９１の２個のｎｏｄ
Ｄ関連遺伝子のプロモーターとして同定されている。
Ｄ関連遺伝子のプロモーターとして同定されている。
ｎｏｄ Ｄ関連遺伝子の各々で突然変異を含むＵＳＤＡ
１９１の誘導体が作られた。挿入突然変異は、カナマイ
シン耐性遺伝子を各ｎｏｄ Ｄ関連遺伝子のオープンリ
ーディングフレーム内にある特異的なりａｍＨＩ部位に
挿入することにより１発生せしめた。ｎｏｄ Ｄ−ｒｌ
のＢａｍ−旧部位はアミノ酸１３５をコードするヌクレ
オチド配列に位置し、またｎｏｄＤｒ２のＢａｍ ｔ（
１部位はアミノ酸８８をコードするヌクレオチド配列に
位置する。第１図にＢａｍ ）ＩＩ部位の場所を図式的
に示しである。挿入されたカナマイシン耐性遺伝子はＢ
ａｍ １１１部位を含む配列により側面を変えられる。
１９１の誘導体が作られた。挿入突然変異は、カナマイ
シン耐性遺伝子を各ｎｏｄ Ｄ関連遺伝子のオープンリ
ーディングフレーム内にある特異的なりａｍＨＩ部位に
挿入することにより１発生せしめた。ｎｏｄ Ｄ−ｒｌ
のＢａｍ−旧部位はアミノ酸１３５をコードするヌクレ
オチド配列に位置し、またｎｏｄＤｒ２のＢａｍ ｔ（
１部位はアミノ酸８８をコードするヌクレオチド配列に
位置する。第１図にＢａｍ ）ＩＩ部位の場所を図式的
に示しである。挿入されたカナマイシン耐性遺伝子はＢ
ａｍ １１１部位を含む配列により側面を変えられる。
ｎｏｄＤｒｌの場合には、第２の突然変異は。
Ｂａｎ ｔ１１部位から上流のＣ１ａ １部位の間に
ある１、９キロベースのＤＮＡを欠失させ、かつ欠失さ
れた小片をカナマイシン耐性遺伝子で置きかえることに
より作られた。クローンにおける突然変異は、二重相同
Ｍｉ換えにより野性型のＵＳＤＡ １９１に戻り交雑さ
せ、カナマイシン耐性で選ばれた突然変異したＵＳＤＡ
１９１ゲノムにおける挿入および欠失突然変異の構造
はプロットハイブリダイゼーション分析で確認された。
ある１、９キロベースのＤＮＡを欠失させ、かつ欠失さ
れた小片をカナマイシン耐性遺伝子で置きかえることに
より作られた。クローンにおける突然変異は、二重相同
Ｍｉ換えにより野性型のＵＳＤＡ １９１に戻り交雑さ
せ、カナマイシン耐性で選ばれた突然変異したＵＳＤＡ
１９１ゲノムにおける挿入および欠失突然変異の構造
はプロットハイブリダイゼーション分析で確認された。
ｎｏｄＤｒｌにおける挿入突然変異と欠失突然変異は、
栽培変種Ｗｉｌｌｉａｍｓとム■皿に漏出性ｆｉｘ−表
現型全現型せしめた。４週間目の植物はややうす緑色で
、その色調は正常のｆｉｘ＋接種植物の緑色と非接種植
物の黄色との中間であった。アセチレン還元活性は、ニ
トロゲナーゼ活性尺度であるが。
栽培変種Ｗｉｌｌｉａｍｓとム■皿に漏出性ｆｉｘ−表
現型全現型せしめた。４週間目の植物はややうす緑色で
、その色調は正常のｆｉｘ＋接種植物の緑色と非接種植
物の黄色との中間であった。アセチレン還元活性は、ニ
トロゲナーゼ活性尺度であるが。
野性型のレベルの約１７４であった。また相席数は野性
型レベルの約１７２であった。タイムコースの研究の結
果では、根瘤とニトロゲナーゼ活性は。
型レベルの約１７２であった。タイムコースの研究の結
果では、根瘤とニトロゲナーゼ活性は。
野性型に比べ突然変異体の方がやや遅いように思われた
。ｎｏｄ Ｄ−ｒｌ突然変異体の場合では、根瘤の発達
が１〜２日後れるようで、根瘤は４〜６週間後でも充分
には発達しなかった。競合的な接種の場合には、ある菌
株の適用のわずかの遅れがある場合も形成される根瘤で
はその菌株が著しい抑圧をうけるに至る場合がある。ｎ
ｏｄＤ −ｒｌの相席形成遅延突然変異体は、野性型と
突然変異体バクテリアの混合物中に同時に存在していた
場合も類似の挙動を示す。本実験では各菌株の定常期培
養物が突然変異体対野性型生育細胞が１０：１の比にな
るように混合され、大豆の栽培変種す社用に接種された
。大豆植物はレオナルトビン中のバーミキュライトで生
長した。４週間後に、根瘤を根の表面から採取し、根瘤
表面を殺菌し、砕き９種々の選択培地に置いた。突然変
異体のバクテリアは根瘤中の１２．５％中にしか検出さ
れず、かつ、かかる根瘤の全ては野性型の菌体が繁殖し
ていた。
。ｎｏｄ Ｄ−ｒｌ突然変異体の場合では、根瘤の発達
が１〜２日後れるようで、根瘤は４〜６週間後でも充分
には発達しなかった。競合的な接種の場合には、ある菌
株の適用のわずかの遅れがある場合も形成される根瘤で
はその菌株が著しい抑圧をうけるに至る場合がある。ｎ
ｏｄＤ −ｒｌの相席形成遅延突然変異体は、野性型と
突然変異体バクテリアの混合物中に同時に存在していた
場合も類似の挙動を示す。本実験では各菌株の定常期培
養物が突然変異体対野性型生育細胞が１０：１の比にな
るように混合され、大豆の栽培変種す社用に接種された
。大豆植物はレオナルトビン中のバーミキュライトで生
長した。４週間後に、根瘤を根の表面から採取し、根瘤
表面を殺菌し、砕き９種々の選択培地に置いた。突然変
異体のバクテリアは根瘤中の１２．５％中にしか検出さ
れず、かつ、かかる根瘤の全ては野性型の菌体が繁殖し
ていた。
ｎｏｄＤ−ｒｌを含む６．０ｋｂ断片が広宿主域ベクタ
−ｐＲＫ２９０クローニングされ２次いで［ｌ５ＤＡ
１９１に戻され形質転換された。ｎｏｄ Ｄ関連遺伝子
の過剰コピーを含むコロニーは形態学的に変化を見て、
野性型ＵＳＤＡ １９１と比べ外観が小さく、かつゴム
性状が著しく低い。この効果は数種の異なった研究室培
地で見られた。例えば酵母−マントール寒天。
−ｐＲＫ２９０クローニングされ２次いで［ｌ５ＤＡ
１９１に戻され形質転換された。ｎｏｄ Ｄ関連遺伝子
の過剰コピーを含むコロニーは形態学的に変化を見て、
野性型ＵＳＤＡ １９１と比べ外観が小さく、かつゴム
性状が著しく低い。この効果は数種の異なった研究室培
地で見られた。例えば酵母−マントール寒天。
トリプトン−酵母抽出物（Ｂｅｒｇｅｒｓｏｎ、 Ｆ、
Ｊ、（ｅｄ）（１９８０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
ｈ虹■二組肛１■旦社出見伍Ｆｉｘａｔｏｎ 、
Ｊ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） 、さらには
グリセロールを炭素源としグルタミン酸ソーダを窒素源
とする最小培地（Ｂｉｓｈｏｐ、旦 社、（１９７６）
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１、 ５７：５４２）等
である。コロニーの形態学的な変化は、ベクターｐＲＫ
２９０のみまたは以前に述べたｎｏｄＤ −ｒｌ中の挿
入突然変異を含むクローンも一緒に含むＵＳＤＡ １９
１の対照菌株には見られなかった。コロニーの形態学的
な変化はｐＲＫ２９０中の６．Ｏｋｂ断片の方向性に関
係なく発生した。この結果は、コロニー形態に対する効
果はｎｏｄＤ関連遺伝子の存在によるものであり、かつ
その遺伝子はそれ自体のプロモーターで発現されるとい
う結論を支持するものである。また、この結果はさらに
ｎｏｄＤｒｌが遊離生存する菌体中で発現されることを
示している。コロニー外観変化はエキソポリサッカライ
ド合成の減少として解釈される。
Ｊ、（ｅｄ）（１９８０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
ｈ虹■二組肛１■旦社出見伍Ｆｉｘａｔｏｎ 、
Ｊ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） 、さらには
グリセロールを炭素源としグルタミン酸ソーダを窒素源
とする最小培地（Ｂｉｓｈｏｐ、旦 社、（１９７６）
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１、 ５７：５４２）等
である。コロニーの形態学的な変化は、ベクターｐＲＫ
２９０のみまたは以前に述べたｎｏｄＤ −ｒｌ中の挿
入突然変異を含むクローンも一緒に含むＵＳＤＡ １９
１の対照菌株には見られなかった。コロニーの形態学的
な変化はｐＲＫ２９０中の６．Ｏｋｂ断片の方向性に関
係なく発生した。この結果は、コロニー形態に対する効
果はｎｏｄＤ関連遺伝子の存在によるものであり、かつ
その遺伝子はそれ自体のプロモーターで発現されるとい
う結論を支持するものである。また、この結果はさらに
ｎｏｄＤｒｌが遊離生存する菌体中で発現されることを
示している。コロニー外観変化はエキソポリサッカライ
ド合成の減少として解釈される。
ｎｏｄＤｒ２中の突然変異の効果はｎｏｄ Ｄ −ｒｌ
中の突然変異の効果よりもさらに微妙であった。最も著
しい点は、ｎｏｄＤｒ２の突然変異体は、熱帯の豆科で
あるシラトロ（ｓ ｉｒａ ｔｒｏ）に根瘤を作る能力
に欠けていた事である。非突然変異のｎｏｄ Ｄ−ｒ２
の過剰コピーは根瘤またはコロニー形態に効果を生じな
かった。ｎｏｄＤｒｌを含む６．０ｋｂ断片と異なり、
非突然変異ｎｏｄＤ−ｒ２を含む３．０ｋｂ断片はりゾ
ビウム・トリフオリ （Ｒ，ｔｒｉｆｏｌｉｉ）のｎｏ
ｄＤ−突然変異体を相補することが出来た（根瘤形成能
力の回復）。それ故に、リゾビウム・トリフオリ （Ｒ
，ｔｒｉｆｏｌｉｉ）の根瘤形成能力はｎｏｄ Ｄ−ｒ
２により回復することがあっても、リゾビウム・トリフ
オリ （Ｌｔｒｉｆｏｌｉｉ） はシラトロ（ｓｉｒａ
ｔｒｏ）に根瘤形成することは出来ない。一方、シラト
ロ（ｓ ｉｒａ ｔｒｏ）に根瘤形成する能力は、 Ｕ
ＳＤ八１へ１のｎｏｄＤ関連遺伝子の一つ、特にｎｏｄ
Ｄ ｒ２遺伝子の機能と関係している。この結果は
、他の遺伝子がこれらの現象中である役割を果している
可能性を否定するものではないが、 ＥＡ４−１９の機
能はりゾビウム・トリフオリ （Ｒエ ｔｒｉｆｏｌｉ
ｉ）の肌虹り遺伝子とは異なっていることを示している
。ｎｏｄＤｒｌを含む６．０ｋｂクローンではりゾビウ
ム・トリフオリ （Ｒ，ｔｒｉｆｏｌｉｉ） ｎｏｄ
Ｄ−突然変異体の相補は見られなかった。
中の突然変異の効果よりもさらに微妙であった。最も著
しい点は、ｎｏｄＤｒ２の突然変異体は、熱帯の豆科で
あるシラトロ（ｓ ｉｒａ ｔｒｏ）に根瘤を作る能力
に欠けていた事である。非突然変異のｎｏｄ Ｄ−ｒ２
の過剰コピーは根瘤またはコロニー形態に効果を生じな
かった。ｎｏｄＤｒｌを含む６．０ｋｂ断片と異なり、
非突然変異ｎｏｄＤ−ｒ２を含む３．０ｋｂ断片はりゾ
ビウム・トリフオリ （Ｒ，ｔｒｉｆｏｌｉｉ）のｎｏ
ｄＤ−突然変異体を相補することが出来た（根瘤形成能
力の回復）。それ故に、リゾビウム・トリフオリ （Ｒ
，ｔｒｉｆｏｌｉｉ）の根瘤形成能力はｎｏｄ Ｄ−ｒ
２により回復することがあっても、リゾビウム・トリフ
オリ （Ｌｔｒｉｆｏｌｉｉ） はシラトロ（ｓｉｒａ
ｔｒｏ）に根瘤形成することは出来ない。一方、シラト
ロ（ｓ ｉｒａ ｔｒｏ）に根瘤形成する能力は、 Ｕ
ＳＤ八１へ１のｎｏｄＤ関連遺伝子の一つ、特にｎｏｄ
Ｄ ｒ２遺伝子の機能と関係している。この結果は
、他の遺伝子がこれらの現象中である役割を果している
可能性を否定するものではないが、 ＥＡ４−１９の機
能はりゾビウム・トリフオリ （Ｒエ ｔｒｉｆｏｌｉ
ｉ）の肌虹り遺伝子とは異なっていることを示している
。ｎｏｄＤｒｌを含む６．０ｋｂクローンではりゾビウ
ム・トリフオリ （Ｒ，ｔｒｉｆｏｌｉｉ） ｎｏｄ
Ｄ−突然変異体の相補は見られなかった。
（一般的な結論点）
上記の開示どおり、独特なまた明確な機能属性を有する
ＵＳＤＡ １９１のｎｏｄ Ｄ関連遺伝子をコードする
ＤＮＡクローンが供される。これは大豆板層形成バクテ
リアを改変して、根瘤形成過程におけるバクテリアのタ
イミング、効率および競合性を改良するために有用なも
のである。当分野では良く知られている様に、コード配
列の修飾は、その際にコードされた蛋白の基礎機能を変
えることな〈実施出来るものである。かかる修飾は機能
属性の変化に結びついているかも知れない。また、かか
る修飾はアミノ酸配列、翻訳または転写の効率には影響
を及ぼさないと思われる。またかかる修飾はここで定義
されたり開示されたりした遺伝子の機能属性には影響は
ないと考えられる。この修飾は当業者にとっては明らか
な修飾範囲内にあり、かつ添付した請求の範囲内にある
もので、異なるわずかな変化であり、また価値では変わ
らないものと思われる。
ＵＳＤＡ １９１のｎｏｄ Ｄ関連遺伝子をコードする
ＤＮＡクローンが供される。これは大豆板層形成バクテ
リアを改変して、根瘤形成過程におけるバクテリアのタ
イミング、効率および競合性を改良するために有用なも
のである。当分野では良く知られている様に、コード配
列の修飾は、その際にコードされた蛋白の基礎機能を変
えることな〈実施出来るものである。かかる修飾は機能
属性の変化に結びついているかも知れない。また、かか
る修飾はアミノ酸配列、翻訳または転写の効率には影響
を及ぼさないと思われる。またかかる修飾はここで定義
されたり開示されたりした遺伝子の機能属性には影響は
ないと考えられる。この修飾は当業者にとっては明らか
な修飾範囲内にあり、かつ添付した請求の範囲内にある
もので、異なるわずかな変化であり、また価値では変わ
らないものと思われる。
以下の見本が１９８５年７月２９日にイリノイ州ペオリ
ャのアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレ
クション（ＮＲＲＬ）に寄託された。
ャのアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレ
クション（ＮＲＲＬ）に寄託された。
クローン ＥＡ４−１９を運ぶＥ、ｃｏｌｉ ； ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１５９８５クローン ＥＡ１４−１７を運ぶ
Ｅ、ｃｏｌｉ ； ＮＲＲＬ Ｂ−１５９８６（以下余
白） 表 １ ９０１ ＴＴＴＴＴＡＣＣＧＡ ＣＡＧＡＴＣＡ
ＧＣＴ ＴＴＧＣＧＣＴＴＧＡ ＡＧＣＧＣＣＧＣ
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る。
ＲＬ Ｂ−１５９８５クローン ＥＡ１４−１７を運ぶ
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白） 表 １ ９０１ ＴＴＴＴＴＡＣＣＧＡ ＣＡＧＡＴＣＡ
ＧＣＴ ＴＴＧＣＧＣＴＴＧＡ ＡＧＣＧＣＣＧＣ
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了ズｎ”５キ゛” （Ａｓｐａｒａ５ｒｈｃ冫ｐ
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ｌ．ａ＋ａｒｒｎｈｅ ）Ｒ ＝ Ａｒｇ ” ’ｉ
’ｔレキ−ン（Ａｒｔ３１ｖｓｊｓｅ ）Ｓ ”
Ｓ”’ ” ｕ’ｌン （Ｓｅｒ’＋ｎｅ ）Ｔ ”
Ｔｈｒ ” ７レＴｚ７ （％ｒｅｏＭｎｅ）Ｖ
＝ Ｖａｔ ” １）”り７ （１／ａｌｉ
ｎａ ）Ｗ ＝Ｔｒｙ ・ トソアト万ン （ Ｔｒぴ
ｆｏ叶馳フＹ ＝ Ｔｙｒ ＝ ４口冫冫ζ７ｙｒｏｓ
ｉ ｎ ｅ．フ４、 ′ の ′ なＵ 第１図は２つのＥｃｏ ＲＩ断片の部分的制限地図であ
る。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、リゾビウム・ジャポニカム（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
￥ ￥ｊａｐｏｎｉｃｕｍ￥）ＵＳＤＡ１９１の￥ｎｏ
ｄ￥Ｄ関連遺伝子あるいはこれと機能的に等価な相同物
を含有するクローン化ＤＮＡ。 ２、前記￥ｎｏｄ￥Ｄ関連遺伝子が￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ１
、￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ２あるいはこれと機能的に等価な相
同物である特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 ３、前記￥ｎｏｄ￥Ｄ関連遺伝子が￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ１
あるいは￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ２である特許請求の範囲第１
項に記載のＤＮＡ。 ４、前記ＤＮＡがプラスミドである特許請求の範囲第１
項に記載のＤＮＡ。 ５、前記ＤＮＡがリゾビウム（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ￥
）宿主内で多コピー複製可能なプラスミドである特許請
求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 ６、リゾビウム・ジャポニカム（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
￥ ￥ｊａｐｏｎｉｃｕｍ￥）ＵＳＤＡ１９１の￥ｎｏ
ｄ￥Ｄ関連蛋白あるいは該蛋白と機能的に等価な相同物
のアミノ酸配列をコードする構造遺伝子を含有するクロ
ーン化ＤＮＡ。 ７、前記構造遺伝子が￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ１、￥ｎｏｄ￥
Ｄ−ｒ２あるいはこれと機能的に等価な相同物である特
許請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ。 ８、前記構造遺伝子が￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ１あるいは￥ｎ
ｏｄ￥Ｄ−ｒ２である特許請求の範囲第６項に記載のク
ローン化ＤＮＡ。 ９、前記ＤＮＡがプラスミドである特許請求の範囲第６
項に記載のクローン化ＤＮＡ。 １０、前記ＤＮＡがリゾビウム（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
￥）宿主内で多コピー複製可能なプラスミドである特許
請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ。 １１、￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ１、￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ２あるい
はこれと少なくとも９０％配列が相同である機能的に等
価な相同物のプロモーターであって、外因性のコード配
列と組み合わせられ該組合せがリゾビウム（￥Ｒｈｉｚ
ｏ−ｂｉｕｍ￥）宿主内で発現可能であるプロモーター
。 １２、￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ１あるいは￥ｎｏｄ￥Ｄ−ｒ２
のプロモーターを含有する特許請求の範囲第１１項に記
載のプロモーター。 １３、プラスミド内に含有される特許請求の範囲第１１
項に記載のプロモーター。 １４、リゾビウム（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ￥）宿主内で
多コピー複製可能なプラスミド内に含有される特許請求
の範囲第１１項に記載のプロモーター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76393485A | 1985-08-07 | 1985-08-07 | |
| US763934 | 1996-12-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6296087A true JPS6296087A (ja) | 1987-05-02 |
Family
ID=25069229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61186713A Pending JPS6296087A (ja) | 1985-08-07 | 1986-08-07 | リゾビウム・ジヤポニカム １９１の ｎｏｄＤ関連遺伝子 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0211662A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6296087A (ja) |
| AU (1) | AU587631B2 (ja) |
| NZ (1) | NZ217146A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0818465A1 (en) * | 1996-07-12 | 1998-01-14 | Institute of Molecular Biotechnology (IMB) Department of Genome Analysis | Genomic sequence of Rhizobium sp. NGR234 symbiotic plasmid |
| US6475793B1 (en) | 1996-07-12 | 2002-11-05 | Andre Rosenthal | Genomic sequence of Rhizobium sp. NGR 234 symbiotic plasmid |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ208557A (en) * | 1983-06-22 | 1988-11-29 | Lubrizol Genetics Inc | Recombinant nif (nitrogen fixation) promoters - foreign structural gene combinations, plasmids, transformants and method of expressing the structural gene in plants |
-
1986
- 1986-08-07 AU AU60955/86A patent/AU587631B2/en not_active Ceased
- 1986-08-07 JP JP61186713A patent/JPS6296087A/ja active Pending
- 1986-08-07 EP EP86306106A patent/EP0211662A3/en not_active Ceased
- 1986-08-08 NZ NZ21714686A patent/NZ217146A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6095586A (en) | 1987-02-12 |
| NZ217146A (en) | 1992-07-28 |
| EP0211662A3 (en) | 1987-08-12 |
| AU587631B2 (en) | 1989-08-24 |
| EP0211662A2 (en) | 1987-02-25 |
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