JPS63107742A

JPS63107742A - 新規な機能性リポソ−ム及びその製造法

Info

Publication number: JPS63107742A
Application number: JP62123542A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Kida; 正章木田; Isako Kitahata; 北端　伊佐子; Kazuhisa Kubotsu; 窪津　和久; Yoshitsugu Sakata; 佐方　由嗣
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1986-05-20
Filing date: 1987-05-20
Publication date: 1988-05-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、臨床検査９診断、治療等、医学上の分野に於
て、特にその用途が期待される新規な機能性リポソーム
及びその製造法に関する。

〔発明の背景〕Ｂａｎｇｈａｍらが生体膜由来の界面活性剤であるリン
脂質の水懸濁物が脂質２分子膜よりなる閉鎖小胞体であ
ることを見出して以来、この小胞体はリポソームと呼ば
れ、近年、その調製法及び多方面での応用研究が精力的
になされている。また、最近では、リン脂質以外で高度
に分子設計された人工合成脂質（分子ｉ　１０００前後
の低分子両親媒性物質）が、リポソームと同様な小胞体
を形成することモ見出されている。リポソームは、その
生体適合性により単なる細胞の機能や構造特性のモデル
としてのみならず、人工赤血球として遺伝子工学におけ
るプロトシラストへの遺伝情報の導入手段として、或は
酵素を固定化するための担体として、更には、がんや難
病の治療法の開発、改良などのための薬物運搬体（Ｄｒ
ｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　）としてなど
、臨床検査９診断、医薬等の分野に於て、非常に幅広い
範囲にわたって注目されている。

従来の封入リポソームの調製法としては、最も基本的な
、脂質薄膜形成後、ボルテックスイング法、超音波法等
により処理を行なう方法をはじめとして、有機溶媒を用
いる逆相蒸発法（ＲＥＶ法）。

エタノール注入法、エーテル注入法、また、界面活性剤
を用いる方法など数多く報告されている。

これらの調製方法により種々のタイプのリポソームを４
つくることができる。リポソームのサイズは。

直径０．０２〜１０μｍにわたり、大小さまざまであり
、大きさと構造から通常多重層リポソー４ｍｕｌｔｉｌ
ａｍｅｌｌａｒｖａｓｉｅｌｅ、　ＭＬＶと略す、直径
０．３〜１０ｐｍ）、小さい一枚膜（ｓｍａｌｌ　ｕｎ
ｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ　、ＳＵＶと略す
。

直径０．０２５〜０．１　ｔｔｍ　）　、及び大きい一
枚膜（ｌａｒｇｅｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃ
ｌｅ　、　ＬＵＶと略す、直径０．２〜２．０μｍ）の
３つのタイプに大別されるが、この他に、構造的にはＬ
ＵＶに近いが、数枚膜のもの（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌ
ａｒ）などもあり、また、特にＲＥＶ法で得られたもの
を逆相蒸発法リポソーム（ｒｅｖｅｒｓｅｐｈａｓｅ　
ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎｖｅｓｉｃｌｅ　、　ＲＥＶと
略す）として別に扱うこともある。

内包効率は被封入物質がリポソーム内に保持される割合
を示すもので脂質１モルあたりの水の保持容量を意味す
るが、この値はリポソームの種類により異なり、現在の
ところＲＥＶ法で調製したリポソーム（ＲＥＶ）が最も
高い内包率を呈し、次いでＬＵＶが高く、蛋白質や核酸
を内包できるとされている。しかしながら、従来の調製
法で得られるこれらのリポソームはいずれも、酵素蛋白
質のような高分子物質を内包する上でその内包量が必ず
しも充分なものであるとは言えず、リポソーム中への高
価な薬剤の封入や高感度な診断薬組成物の調製など医療
９診断、臨床検査等の分野への応用を考えるとき、より
内包量の大きい、内包効率の高いリポソームの出現が待
ち望まれていた。

〔発明の目的〕

本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、臨
床検査１診断、治療等医学上の幅広い分野に於てその用
途が期待される内包効率の極めて高い機能性リポソーム
を提供することをその目的とする。

〔発明の構成〕

本発明は、（１）リポ多糖（ＬＰＳと略す。）又はＬＰ
Ｓ様化合物をマトリックス素材として含む機能性リポソ
ーム、及び（２）機能性リボン・−ムを製造するに際し
、ＬＰＳ又はＬＰＳ様化合物の存在下にこれを形成させ
ることを特徴とする、機能性リポソームの製造法の発明
である。

即ち、本発明は、何らかの形態でリポソームにリポ多糖
（リポポリサッカライド、　ＬＰＳ　）又はＬＰＳ様化
合物が組み込まれた機能性リポソームとその製造法に関
するものである。

本発明で用いるＬＰＳは通常Ｅ、Ｃｏ１１起原のものが
好ましく用いられるが、これに限らず、例えばＷｅｓｔ
ｐｈａｌ法で処理して得られたものなどでも充分使用し
得る。本発明に係るＬＰＳ様化合物とは、ＬＰＳそのも
のに何らかの化学修飾を施した化合物で、例えばその糖
鎖部分を酸化したもの、アセチル化。

サクシニル化、フタリル化等の化学的処理を行ったもの
などを言う。

本発明の機能性リポソームの製造法（調製法）は、従来
からよく知られているボルテ１クスイング法、超音波法
、界面活性剤法、逆相蒸発法（ＲＥＶ法）、エタノール
注入法、エーテル注入法、プレ−ベジクル（Ｐｒｅ−Ｖ
ｅｓｉｅｌｅ）法、フレンチプレスエクストルージョン
（Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ　Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）法
、　Ｃａ”融合法、アニーリング（Ａｎｎｅａｌ　ｉｎ
ｇ）法、凍結融解融合法、　Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法
等の方法や、最近、Ｓ、Ｍ、Ｇｒｕｎｅｒら（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　２４　、２８３３（１９８５）
］により報告された５ｔａｂｌ＠Ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌ
ｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ法（ＳＰＬＶ法（Ｓｔｎｂｌｅ
ＰｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒＶｅｓｉｃｉｅ法）などの
方法に全て適用が可能である。

即ち、本発明の機能性リポソームの製造法は、ＬＰＳ又
はＬＰＳ様化合物の存在下に１７　、ｄソームを形成さ
せる以外は、これら自体公知の或はその他のり２ソーム
の製造法に準じてこれを行うことで足りる。

本発明に係るリポソームの主たる構成素材としては、天
然レシチン（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）
やゾパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）
　、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ
）　、　システアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳ
ＰＣ）　、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯ
ＰＣ）　、ジミリストイルフォスファチジルエタノール
アミン（ＤＭＰＥ）　、ゾパルミトイルフォスファチジ
ルグリセロール（Ｄｐｐｃ）　、ジミリストイルフォス
ファチジン酸（ＤＭＰＡ）等のリン脂質の一種又は二種
以上、或≠はこれらとコレステロール類との混合系等、
既存のリポソームの製造法に於て通常用いられる構成素
材が全て使用可能なものとして挙げられる。

本発明の機能性リポソームは前記いずれの調製法で調製
したものでも、被封入物質の内包効率が従来のものと比
べて遥かに高く、各種低分子化合物から生化学的高分子
物質までいずれも効率よく内包する。本発明リポソーム
が内包可能な化合物としては、例えば、酵素、遺伝子、
核酸、ポリヌクレオチＰ、ホルモン、免疫グロブリン類
等から、各種薬剤や抗生物質、更には色素、螢光性物質
、発光化合物等に到るまで、既存のリポソームに封入可
能な物質は全て挙げられる。

また、本発明りＩソームは既存のリポソーム同様、各種
抗原又は抗体をその膜上に固定化させることができる。

本発明のり一ソーム上に固定化し得る抗原又は抗体とし
ては、例えば、糖脂質のような低分子抗原、例えば、α
−フェトプロティン。

ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）　、塩基性フェトプロティン
（ＲＦＰ）　、膵ガン胎児性抗原（ＰＯＡ）等の腫瘍マ
ーカー、例えばＣ−反応性蛋白（ＣＲＰ　）等の抗原蛋
白、ＩｇＡ　、　ＩｇＥ　、　ＩｇＧ　、　ｒｇＭ等の
免疫グロブリン等の抗原或はこれらの抗原に対する抗体
、更にはインシーリン、ヒト繊毛性ゴナＰトロピｙ　（
ｈＣＧ）　等のホルモンや各種薬物ハプテン抗原或はこ
れらの抗体等既存のリポソームに固定化し得る抗原又は
抗体は全て挙げられる。

固定化の方法としては架橋法、脂質活性化法等がある。

架橋法は、先ず常用されている架橋剤と所望の脂質とを
溶媒中で反応させて、リポソーム上に固定される抗原又
は抗体と結合し得る官能基を脂質分子に導入し、次いで
得られた官能性脂質とコレステロール、又は、要すれば
、これに更に他の脂質を加えて感作リポソームを調製す
る。一方、リポソームに固定すべき抗原又は抗体を緩衝
液中で架橋剤と反応させて架橋基を導入し、しかる後に
必要であれば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオ
スレイトール、　ＤＴＴ　）と更に反応させて修飾抗原
又は、抗体を得る。

最後に、感作リポソームと修飾抗原又は抗体とを緩衝液
中で反応させることにより免疫的リポソーム上−ム。

また、脂質活性化法は、先ず脂質を架橋剤或は脂質の活
性化剤を用いて抗原又は抗体と結合せしめ、得られた結
合体を界面活性剤と共に水中に加えてミセルを形成させ
、然る後に、透析或はｒルデ過等の手段を用いて界面活
性剤を除去する。

このようにして得られた、前記各種抗原又は抗体を組み
込んだ本発明のリポソームは当然のことながら、それら
の抗原又は抗体、或はそれら抗原又は抗体の抗体又は抗
原を免疫学的に測定することが可能である。

本発明の機能性リポソームの製造法に関し、界面活性剤
法を例にとり挙げて以下に詳しく説明する。

即ち、先ず前記の如きリン脂質及びコレステロール類を
有機溶媒（例えば、クロロホルム、エーテル類、アルコ
ール類等）に溶解し、減圧下で濃縮乾固後、デシケータ
−中で充分減圧乾燥する。

次いで、作製された脂質フィルムに界面活性剤水溶液（
１０ｍＭ〜５００ｒＩＩＭ）を加えて、これを均一に分
散させる。ここで使用する界面活性剤としては、例えば
、従来からよく用いられているコール酸。

トリトン、オクチルグルコシド等がｌ’られるが、望ま
しくは、オクチルグルコシドのような臨界ミセル濃度（
ＣＭＣ）の高い界面活性剤が良い。次に、本発明の手法
の鍵となるＬＰＳ或はＬＰＳ様化合物を粉末のまま、或
は溶液として加え、更に、所望する内包物（例えば酵素
等）の溶液を加えて充分に攪拌混合する。この後、直ち
に界面活性剤を除去するのが最も望ましいが、その方法
としては透析法、ｃｙｖｙｓ過法、樹脂吸着法等、自体
公知の方法が挙げられる。処理条件は時間として１時間
乃至１昼夜で、温度はリポソームの構成素材及び内包物
の性質（安定性など）等により若干異なるが、０〜７０
℃位の範囲で適宜選択して行えばよい。

更にＬＰＳ及び遊離内包物の除去については、前記した
方法を内包物の種類により低分子物質であれば、透析や
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０を用いるｒル濾過等で、
また、高分子物質であれば、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　
Ｂを用いるｊ’　ｋ　濾過や遠心分離等の操作により行
なうのが良い。かくして、得られたリポソームは限外濾
過等により所定の濃度に濃縮して使用、又は保存される
。リポソームのサイズの均一化に関しては、繁用されて
いるポリカーボネート膜を用いる方法も良いが、ｒル濾
過法（例えば５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１０００を使用
）で行うのも効果的である。

界面活性剤性以外の方法で本発明機能性リポソームを製
造する場合についても、同様に、ＬＰＳ又はＬＰＳ様化
合物を共存させる以外は、自体公知の或はその他のリポ
ソーム製造（調製）法に準じてこれを行えばよい。

このようにして酵素等を内包して得られた本発明機能性
リポソームの外観は、従来法で調製されたものがかなり
の濁度を有しているのに対し、殆ど濁りがなく透明観を
有し、しかも保存安定性に優れている。これら本発明の
方法により得られたリポソームのリン脂質の回収率は通
常６０〜７０チ位であり、従来法のそれよりも、一般に
高い。

内包量としては、例えば、アルカリフォスファターゼ（
ＡＰと略鳴）の場合、従来法に比べ約２〜２０倍程度高
い値を示す。この値は調製方法及び調製条件によっても
多少異なるが、第一に共存させるＬｐｓ　（又はＩ、Ｐ
Ｓ様化合物）の割合に大きく影響を受ける。例えば、卵
黄レシチン６、４１８９／ｒｕｇに対して、ＬＰＳ　１
〜５η／ｌｕｔの範囲内では効率はよいが、それ以下又
はそれ以上でのＬＰＳ濃度（量）では、逆に低下する傾
向が見られることもある。また、勿論、調製時のＡＰ仕
込み量にも依存し、例えば、卵黄レシチン９．５　Ｑに
対して、ＡＰ量が３００Ｕ以上で最も高い内包効率を示
す。

ＡＰを内包したＬＰＳ　−ＩＪ　ｙｔ？ソームの場合、
その保存温度（通常４〜３７℃）、リポソーム濃度等に
よっても、多少の活性の差異は認められるが、通常約４
〜５ケ月の間では全く安定である。

ＡＰを内包した本発明機能性リポソームは、また、ＬＰ
Ｓが添加されていない従来のリポソームとは異なった、
甚だ興味深い性質をも有す。即ち、これらリポソームは
一般に界面活性剤により１ｙａｉｓが起こり、そのため
内包されていた酵素の活性が回復するが、ポリミキシン
ＢのようなＬＰｓに高い親和性をもつ物質を用いた場合
には、従来のリポソームでは殆ど１ｙｓｉｓが起らず、
ＬＰＳを組み込んだ本発明リポソーム（ＬＰＳ　−リポ
ソーム）にのみ特異的に１ｙｓｆが起こることが認めら
れる。

本゛発明リポソームは、電子顕微鏡観察、光学顕微鏡観
察１粒度分布測定（光散乱）などによれば、形態的にも
従来の調製法によるす４ソームとけ明らかに異なり、サ
イズ的にもより大きなものである場合が多く、リポソー
ム間の会合もし難く、より安定なものとなっている。

以下に実施例及び参考例を挙げるが、本発明はこれら実
施例及び参考例により何ら限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１．　　ＬＰＳ−卵黄レシチン−リポソームの調
製〔界面活性剤法〕卵黄レシチンのクロロホルム溶液（１，４７ｗｔ％）０
．６５ｍｊトコレスチロールのクロロホルム溶ｍ（２０
ｍＭ）　０．２２ｔｔｔｌとをフラスコに入れ、ロータ
リーエバ２レータ−を用いて溶媒を留去して、コルベン
内壁に薄膜を形成させた。これをデシケータ−内で１〜
２時間真空乾燥させた後、オクチルグルコシド水溶液（
２００ｍＭ）１．５ｍｅを加え、ポルテックスミキサー
で均一に分散するまで攪拌した。次いで、アルカリフォ
スファターゼ（ＡＰ）水溶液（１，０ＯＯＵ／１　ｍｅ
　Ｎ２０　）　３００μｌ及びＬＰＳ　３　ｍ９を加え
、更に５分間攪拌した。これを透析チー−プに入れ、ト
リス緩衝液（５０ｍＭ　、　ｐＨ７，８’）　２１で約
−晩透析した後、リポソーム懸濁液を５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　４　Ｂカラム（１，５Ｘ２５創）に付し、グル濾過
により目的とするＬＰＳ−卵黄レシチン−リポソームの
溶液を得た。

実施例２．　　ＬＰＳ−卵黄レシチンーリ４ソームの調
製〔ボルテックスイング法〕卵黄レシチン１１．８Ｗ、ジセチルリン酸（ＤＣＰ）１
．７６μｍｏｌ　、コレステロール８μｍｏｌの混合脂
質系（溶媒：クロロホルム）にＬＰＳ　１．６　Ｉ＋１
９を加え、減圧下で濃縮乾固した後、充分乾燥した。残
渣にＡＰ溶液１６０μｌ　（１６０Ｕ　、　５０ｍＭ　
）リス緩衝＊　ｐＨ７，８）を加えて均一な懸濁液とな
るまで激しく攪拌した。

得られた懸濁液をポリカーボネート膜（１，Ｏｔｔｍ）
に通した後、超遠心分離（１５０００ｒＰｍ　、　４℃
）して上清を除き、ベレットをトリス緩衝液２　ｍｅで
分散さセｊＬＰｓ−卵黄しシチンーリポソームヲ得だ。

実施例３．　　ＬＰＳ−卵黄レシチンーリポソームの調
製（’　ＲＥＶ法〕卵黄レシチン４．７■、ジ／９ルミトイルホスファチジ
ル−グリセロール（ＤＰＰＧ）　０．６５　ｐｍｏｌ、
コレステロール６．５μｍａｌ及びジチオピリジルジノ
母ルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ
−ＤＰＰＥ）０．３２５μｍｏｌの混合脂質系（溶媒：
クロロホルム）にＬＰＳ１．５■のクロロホルム溶液を
加え、減圧下で濃縮乾固した後、充分乾燥した。残渣に
りｏｏホルム０、５　ａｇ及びエチルエーテル０．５　
ａｔを加えて溶解し、これにＡＰ溶液（１６０Ｕ、ヘイ
ス緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’
−２−エタンスルホン酸）〕を加えて充分攪拌してエマ
ルジヨンとシタ。ロータリーエバポレーターにより減圧
下。

４５℃付近で溶媒を留去した後、更にヘベス緩衝液を加
えて激しく攪拌した。得られたｉｖｉ濁液をポリカーボ
ネート膜（１，０μ、ｍ　）に通した後、超遠心分離（
３４，ＯＯｔＤＰｍ　、　４℃）して上清を除き、ベレ
ットをヘペス緩衝液２　ｍｌで分散させてＬＰＳ−卵黄
レシチン−リポソームを得た。

実施例４．　　ＬＰＳ−卵黄レシチン−リポソームの調
製［ＳＰＬＶ法（ＳｔｎｂｌｅＰｌｕｒｉｌａｍｅｌｌ
ａｒＶｅｓｉｃｉｅ法］実施例３と同様の混合脂質系の
クロロホルム−エーテル溶液に、ＡＰ溶液（１６０Ｕ、
ヘペス緩衝液）を加えてエマルジヨンとした後、バス式
の超音波洗浄器中でＮ２気流下、４５℃付近で約５分間
溶媒を留去した。次いで、ヘベス緩衝液を加えて激しく
攪拌し、得られた懸濁液を遠心分離（１２，０００（Ｐ
ｒｎ　＊　４℃）して上清を除き、ベレットをヘイス緩
衝液で再分散してＬＰＳ−卵黄レシチン−リポソームを
得た。

実Ｍ　例５．　　ｔ、ｐｓ−ジパルミトイルホスファチ
ノルコリン（ＤＰＰＣ）−リポソームの調製〔界面活性
剤法〕ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ
）のクロロホルムｉｉ（２０ｍ八１へ２ゴとコレステロ
ールのクロロホルム溶液（２０ｍＭ）　２　ｍｇとをフ
ラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒
を留去して、コルベン内壁に薄膜を形成させた。これを
デシケータ−内で１〜２時間真空乾燥させた後、ＬＰＳ
を６．６８９／ａｔ含むオクチルグルコシド水溶液ｃ２
００ｒｒＭ）０．６ｒｎｌを加え、ボルテックスミキサ
−で均一に分散するまで攪拌した。次いで、ＡＰ水溶液
（２，０００Ｕ／　１ｍｌ　Ｎ２０　）　２５０　Ｉｌ
ｌを加え、更に５分間攪拌した。これをフロータイブの
透析装置に入れ、ヘペス緩衝′ｐ２ｉ、（１０ｍＭ　、
　ｐｌ＋７．４　）を用いて、５０℃保温下で約２時間
透析した後、超遠心分離（３４，ＯＯＯｒｐｍ　、　４
℃）を３回行って上清を除き、ベレットをへ（ス緩衝液
に分散させてＬＰＳ　−ＤＰＰＣ−リポソームを得た。

実施例６．　　ＬＰＳ−ＤＰＰＣ−リポソームの調製〔
ボルテックスイング法〕ＤＰＰＣ８ｆｉｍｏｌ　、ジセチルリン酸（ＤＣＰ）　
１．７６　Ａｍｏｌ、コレステロール８μｍｏｌの混合
脂質系（溶媒：クロロホルム）にＬＰＳ　１．６　ｍｌ
を加え、減圧下で濃縮乾固した後、充分乾燥した。これ
にＡＰ溶Ｑ１６０μｌ（１６０Ｕ　、　５０　ｍＭ　）
リス緩衝液−７，８）を加えて均一な懸濁液となるまで
激しく攪拌した。得られた懸濁液をポリカーボネート膜
（１，０μｍ）に通した後、超遠心分離（１５，０ＯＯ
ｒＰｒｎ　、４℃）して上清を除き、ベレットをトリス
緩衝液２１！＃で分散させてＬＰＳ　−ＤＰＰＣ−リポ
ソームを得た。

実施例７．　　ＬＰＳ−ＤＰＰＣ−リポソームノ調製１
：　ＲＥＶ法〕ＤＰＰＣ６，５μｍｏｌ　、ジパルミトイルホスファチ
ジルグリセロール（ＤＰＰＧ）　０．６５１１ｍｏｌ　
、コレステロール６．５μｍｏｌ及びジチオピリジルジ
パルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ
−ＤＰＰＥ）　０．３２５μｍｏｌの混合脂質系（溶媒
：クロロホルム）にＬＰＳｌ、５りのクロロホルム溶液
を加え、減圧下で濃縮乾固した後、充分乾燥した。残渣
にクロロホルム０．５コ及びエチルエーテル０．５　ｍ
ｌを加えて溶解し、これにＡＰ溶液（１６０Ｕ、ヘベス
緩衝液）を加えて充分攪拌してエマルジョンとした。ロ
ータリーエバポレーターにより減圧下、４５℃付近で溶
媒を留去した後、更にヘイス緩衝液を加えて激しく攪拌
した。得られた懸濁液をポリカーボネート膜（１，０μ
ｍ）に通した後、超遠心分離（３４，０００ｒＰｌ’ｎ
　。

４℃）して上清を除き、ベレットをヘイス緩衝液２　ｔ
ｕｇで分散させてり、ＰＳ　−ＤＰＰＣ−リポソームを
得た。

実施例８．　　ＬＰＳ−ＤＰＰＣ−リポソームノ調製［
ＳＰＬＶ法（ＳｔｎｂｌｅＰｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ
Ｖｅｓｉｃｉｅ法〕実施例７と同様の混合脂質系のクロ
ロホルム−エーテル溶液に、ＡＰ溶液（１６０Ｕ、ヘベ
ス緩衝液）を加えてエマルジヨンとした後、バス式の超
音波洗浄器中でＮ２気流下、４５℃付近で約５分間溶媒
を留去した。次いで、ヘペス緩衝液を加えて激しく攪拌
し、得られた懸濁液を遠心分離（１２，０００ｒａｒｎ
。

４℃）して上清を除き、ベレットをヘベス緩衝液で再分
散してＬＰＳ　−ＤＰＰＣ−リポソームを得た。

実施例９．界面活性剤（Ｂｒ１ｊｉ　５８　）によるＩ
ｙｓｉｓからのリポソーム内包量（ＡＰ活性）の測定各
種調製法により得られた本発明のリポソーム溶液各１０
　ｔｌｌにＢｒ１ｊｉ　５８　（１％溶液）を加え、３
７℃で３０分間インキュベートした後％ｐ−ニトロフェ
ニルリン酸溶液（２ｍＭ　）　２　ｒｒｔを加え、更に
３０分間インキエペートし、然る後、０．５Ｎ　ＮａＯ
Ｈ（１＃！ｌ）を加え、４１０　ｎｍでの吸光度を測定
しＡＰ内包量を求めた。

結果を表１及び２に示す。尚、比較の為、同じ調製法で
ＬＰＳを添加しない場合（即ち、従来法）の結果も併せ
て表１及び２に示す。

表１．　　卵黄レシチン−リポソームのＡＰ内包量（Ｂ
ｒｉｊｉ　５８１ｙｓｉｓ　ａｓｓａｙによる）表２．
　　ＤＰＰＣ−リポソームのＡＰ内包量（Ｂｒｉｊｌ　
５８１ｙｓｉｓ　ａｓｓａｙによる）表中の数値は、リ
ン脂質１　ｍｏｌ当りのＡＰの活性値を従来法の界面活
性剤法の場合を１００とじた相対値で示しておる。

表１及び２より明らかな如く、ＬＰＳ法により得られた
本発明のリポソームは従来法のそれと比べていずれもＡ
Ｐ内包量が著しく大である。

実施例１０．２リミキシンＢによるＬＰＳ−卵黄レシチ
ン−リポソームの１ｙｓｉｓ挙動実施例１の界面活性剤法で得た本発明のリポソーム溶液
１０μｌにポリミキシンＢの所定の濃度の溶液を１００
μｅ加え、更にｐ−ニトロフェニ／Ｌ／　ＩＪ　７酸（
２ｍＭ）３ｔｎｌを加えて、３７℃で３０分間インキエ
ベートした後、４１０　ｎｍの吸光度を測定して１ｙｓ
ｉｓ挙動を調べた。

結果を第１図に示す（−０−で表示）。また、比較の為
、従来法で得られたリポソームについて同様に測定した
結果も第１図に併せて示す（−×−で表示）。尚、第１
図に於ける縦軸は各ポリミキシン濃度に於ける１ｙｓｉ
ｓの大きさを、Ｂｒ１ｊｉ　５８による１ｙｓｉｓの値
（吸光度）を１００としたときの相対値で示しである。

第１図より明らかな如く、ポリミキシンＢによる１ｙｓ
ｉａはＬＰＳを組み込んだ本発明のＩＪ　、ｄンームに
のみ特異的に起ることがわかる。

実施例１１．　　ＩｇＧを結合したＬＰＳ−卵黄レシチ
ン−リポソームの製造卵黄レシチン（クロロホルム溶液）、コレステロール（
クロロホルム溶液）及びＤＴＰ　’−ＤＩ）ＰＥ（クロ
ロホルム溶液）を１３：４．４：０．１０モル比で混和
し、溶媒を留去して薄膜を作製した。この脂質フィルム
を減圧乾燥し、２００ｍＭのオクチルグルコシド水溶液
１．５　ｒｔｔｔ、ＬＰＳ　３ダ、ＡＰ水溶液（１，０
ＯＯＵ／１ｗｌ　Ｈ２Ｏ）　１８０μｌを加えて、脂質
フィルムを溶かし、５０　ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（
０，１５Ｍ　ＮａＣｔを含む１、ｏ　７．８　）に対し
て一夜透析した。得られた懸濁液を５ｅｐｈａｒｏｓｅ
　４　Ｂにて精製してＡＰを内包し、且つ膜表面に抗原
（ＩｇＧ）結合官能基であるＤＴＰ基をもつリポソーム
を得た。

別途に５ηのヒ）　ＩｇＧを２ｍｅの０．ＯＩＭへ一？
スｆｆｌ衝液（０，８５％ＮａＣ４を含む、ｐＨ７，４
）に溶かし、１０綱のＮ−サクシンイミジル−３−（２
−ピリジルジチオ）プロピネー）　（ＳＰＤＰ）　１０
μｌを加えて反応させた。次いで、反応液を５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ　−２５（０，Ｉ　Ｍ酢酸緩衝液、　０．１
５Ｍ　ＮａＣ１を含む、ｐ）４４．５）によるグルヂ過
にかけ、得られた蛋白分画２　ｒｔｔｅにノチオスレイ
トール３０　＃　（ＤＴＴ）を加えて反応を行なった。

反応液を０．ＯＩＭヘペス緩衝液で平衡化した５ｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−２５に展開し、５ＰＤＰにより修飾された
ＩｇＧ分画を得た。

かくして得られた５ＰＤＰ修飾ＩｇＧと、先に得たリポ
ソームとを等量混合し、室温で一夜反応させた。

反応後、　５ｅｐｈａｄｓｘ　４Ｂにてリポソーム分画
を分取し、ＩｇＧ結合ＬＰＳ−卵黄レシチン−リポソー
ム溶液を得た。

参考例１．　　ＩｇＧ結合ＬＰＳ−卵黄レシチンーリ、
ｌソームを用いるＩｇＧの定量実施例１１で得られたＩｇＧ結合ＬＰＳ−卵黄レシチン
−リポソームを用いて、ヒトＩｇＧの定量を行った。Ｉ
ｇＧ結合ＬＰＳ−卵黄レシチンーリポソーム２０μ！、
抗ＩｇＧ血清２００μｌ、各穏濃度のヒトＩｇＧ溶液２
０μｌ、モルモット血清補体（ＩＣＨ５ｏ）２００μｌ
を試験管に入れ、３７℃で３０分間反応させた。

次にｐ−ニトロフェニルリン酸（２０ｍＭ　）４００　
ｆｉｌを加え、３７℃で３０分間反応させた後、０．１
　ＮＮａＯＨ１，５ａｇを加えて反応を停止し、４１０
　ｎｍでの吸光度を測定した。ＩｇＧｆｉ度（μ９Ａｌ
　）と相対吸光度（ＩｇＧ無含有試料により得られる吸
光度を１００とした時の値）（％）との関係（検量線）
を第２図に示す。

実施例１２．Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）を結合したＬＰＳ
　−ＤＰＰＣ−リポソームの製造実施例７で得たＬＰＳ　−ＤＰＰＣ−ＩＪボソーム溶液
のｈ量を、実施例１１の５ＰＤＰ修飾ＩｇＧと同様にし
て得た５ＰＤＰ修飾ＣＲＰ３ｍ！９と混合し、室温で一
夜反応させた。反応後、超遠心分離（３４，０００ｒｌ
）ｒｒｌ　）により上清を除き、ペレットをヘペス緩衝
液で再分散してＣＲＰ結合ＬＰＳ　−ＤＰＰＣ−リポソ
ーム分画を得た。

参考例２．　　ＣＲＰ結合ＬＰＳ　−ＤＰＰＣ−リポソ
ームを用いるＣＲＰの定量実施例１２で得られたＣＲＰ結合ＬＰＳ　−ＤＰＰＣ−
リポソームを用いて、参考例１と同様にしてＣＲＰの定
量を行った。

ＣＲＰ濃度（ｐｌ／ｎｔ　）と相対吸光度＊＃＃（ＣＲ
Ｐ無〔発明の効果〕本発明は、臨床検査１診断、医療等の分野に於て、特に
その用途が期待される新規な機能性リポソームとその製
造法を提供するものであり、被封入物質の内包効率が極
めて高い機能性リポソームを提供するものである点に甚
だ顕著な効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はポリミキシンＢによる本発明リポソームの１ｙ
ｓｊｓ挙動を調べた実施例１ｏの測定結果（÷で表示）
と、比較の為の従来法のそれ（−Ｘ−で表示）を表わし
、横軸はポリミキシン濃度（ＩＲ９／ｒＩｌ）を、また
、縦軸はＢｒ１Ｊｌ　５８による１ｙｓｉｓの値（吸光
度）を１００としたときの相対吸光度（％）を夫々示す
。第２図は参考例１で得られた検量線を表わし、横軸はＩ
ｇＧ濃度（μｇ／１１ｇ）を、また、縦軸はＩｇＧ無含
有試料により得られる吸光度を１００とした時の相対吸
光度（％）を夫々示す。第３図は参考例２で得られた検量線を表わし、横軸はＣ
ＲＰ濃度（μ１Ａｌ）を、また、縦軸はＣＲＰ無含有試
料により得られる吸光度を１００とした時の相対吸光度
（チ）を夫々示す。特許出願人　　和光純薬工業株式会社第１図；ｒ：　’）　ミ＊　シンＢ　：ｊｖＬ（，３／ｍ！ｌ
　）奨裟イ皐壇（ネ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）リポ多糖（ＬＰＳと略す。）又はＬＰＳ様化合物
をマトリックス素材として含む機能性リポソーム。
（２）ＬＰＳ様化合物が、ＬＰＳの糖鎖部分を酸化した
もの、或はアセチル化、サクシニル化、フタリル化等の
化学的処理を行ったものである、特許請求の範囲第１項
記載の機能性リポソーム。
（３）酵素又は遺伝子等の生化学的高分子物質を内包し
た、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の機能性リポ
ソーム。
（４）色素、発光化合物又は螢光性物質等の低分子化合
物を内包した、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
機能性リポソーム。
（５）蛋白質抗原、低分子ハプテン抗原又はそれらの抗
体を結合させた、特許請求の範囲第１項〜第４項のいず
れかに記載の機能性リポソーム。
（６）機能性リポソームを製造するに際し、リポ多糖（
ＬＰＳと略す。）又はＬＰＳ様化合物の存在下にこれを
形成させることを特徴とする、機能性リポソームの製造
法。
（７）ＬＰＳ様化合物が、ＬＰＳの糖鎖部分を酸化した
もの、或はアセチル化、サクシニル化、フタリル化等の
化学的処理を行ったものである、特許請求の範囲第６項
記載の製造法。
（８）ＬＰＳ又はＬＰＳ様化合物の存在下、ボルテック
スイング法、超音波法、界面活性剤法、逆相蒸発法（Ｒ
ＥＶ法）、エタノール注入法、エーテル注入法、プレ−
ベジクル（Ｐｒｅ−Ｖｅｓｉｃｌｅ）法、フレンチプレ
スエクストルージョン（Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ　Ｅ
ｘｔｒｕｓｉｏｎ）法、Ｃａ＾２＾＋融合法、アニーリ
ング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）法、凍結融解融合法、Ｗ／
Ｏ／Ｗエマルジョン法又はＳＰＬＶ法（Ｓｔｎｂｌｅ　
Ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｉｅ法）によ
りリポソームを形成させる、特許請求の範囲第６項又は
第７項記載の製造法。
（９）酵素又は遺伝子等の生化学的高分子物質を内包し
た機能性リポソームを製造する、特許請求の範囲第６項
〜第８項のいずれかに記載の製造法。
（１０）色素、発光化合物又は螢光性物質等の低分子化
合物を内包した機能性リポソームを製造する、特許請求
の範囲第６項〜第８項のいずれかに記載の製造法。
（１１）蛋白質抗原、ハプテン抗原又はそれらの抗体を
結合させた機能性リポソームを製造する、特許請求の範
囲第６項〜第１０項のいずれかに記載の製造法。