JPS6311861A - 結合反応を電子的に測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、一対の化学的な物質、特に、抗原や抗体のよ
うな生物活動に必要な物質間で行なわれる結合反応を電
子的に検出する新規な方法に関する。更に１本発明は、
電子的な免疫分析のための新規な方法に関する。

従来の技術 生物は、バクテリアやビールスのような外から浸入して
くる異物質や微生物に対してその身体を保護するために
抗体と称する微細な物質を形成することが免疫学的な原
理として良く知られている。抗体は、典型的に、微細な
浸入物質に結合してこれを破壊するか又は無害なものと
することによりこれら物質を中性化するように働く、抗
体は、結漿゛のグロブリンプロティンであり、ガンマグ
ロブリンとしばしば称される。

バクテリアやビールスのような異物質が外部から人間や
動物に浸入すると、感染と戦うための抗体の形成が１つ
以上の抗原の存在によって促進される。浸入する微生物
に関連した抗原は、そこから得られる異物質１例えば、
バクテリアやビールスの一部分で構成される。より一般
的には、抗原は、免疫反応を開始させることのできる物
質である。人体内の幾つかの特殊な細胞は、抗原を含ん
でおり、その抗原に対して特に構成された抗体を形成す
る。このような抗体は、人体内に放されると、その抗原
を識別してこれと結合し、感染と戦う、抗体は、非常に
特殊なもので、一般には。

その形成を促進する抗原としか結合しない。

成る人が成る疾病に感染すると、その人の血液は、その
疾病に特有の測定可能なレベルの抗原を含むことがしば
しばある。このような感染が存在するかどうかを判断す
るために、患者の血液サンプルを用いて免疫診断テスト
が行なわれる。このサンプルは、成る疾病又は症状に特
有の抗体を含むと分かっている溶液と混合される。抗原
−抗体反応が生じた場合には、テスト結果が肯定であり
、抗原が検出される。このようなテストは典型的ｉこ可
逆であり、即ち、成る抗原を含むと分かつている溶液又
は試薬を用いてそれに対応する抗体がサンプル中に存在
するかどうかを判断することができる。しかしながら、
抗原−抗体反応は微細なレベルで生じるだけで、容易に
ｗ４察することができない。従って、公知の全ての免疫
診断テストは、抗原−抗体反応が生じたことを指示する
ための成る種の手段をもたらすに過ぎない。

発明が解決しようとする問題点 抗原−抗体反応を検出するために色々な技術が利用され
ている。現在利用されている主たる技術は、酵素免疫分
析、免疫蛍光性分析及び放射線免疫分析である。典型的
な酵素免疫分析の手順においては、酵素によって無色の
物質から着色した生成物を形成することにより抗原−抗
体反応が検出される。免疫蛍光性技術では、一般的に顕
微鏡でｌｉ３！　察しなければならないような少量の光
が放射されることによって反応が生じたことが指示され
る。放射線免疫分析では、放射性標識物質を使用し、少
量の放射能の有無によって抗原−抗体反応の発生が測定
される。これらの公知の方法は信頼性の高いものではあ
るが、時間がかＮる上に非常にやっかいである。

最近では、種々の形式の電気的な免疫分析技術が開発さ
れている。このような方法では、免疫反応を測定するた
めに電子的なエンドポイントが使用される。ここで使用
する［電子的なエンドポイント」という用語は、結合反
応が生じたことを指示する電気的特性の変化、例えば、
抗原−抗体反応による電流、電圧又は抵抗の変化を意味
している。

このような１つの技術は、電界効果トランジスタのゲー
ト領域に抗体の層を被覆したものを用いている。抗原−
抗体反応が生じた場合には、トランジスタの電荷密度が
変化する。この形式のシステムが、例えば、１９８０年
１２月９日付けのシェンク（Ｓｃｈｅｎｃｋ）氏の米国
特許第４，２３８゜７５７号、１９８１年１２月２５日
付けのグツケル（Ｇｕｃｋｅｌ）氏の米国特許第４，１
８０，７７１号及び１９８２年６月１５日付けのマルモ
ロス（Ｍａｌ＋５ｒｏｓ）氏の米国特許第４，３３４，
８８０号に開示されている。

免疫学的な反応を電気的に測定するための多数の他の方
法が提案されている。１つの免疫試薬に電気的に活性な
物質で標識を付けることにより電気測定式の免疫分析を
行なうことができる。１９８０年１１月１１日付けのペ
ース（Ｐａｃｅ）氏の米国特許第４，２３３，１４４号
には、１つのこのような技術が開示されている。その別
の方法としては、２つの導電層の間に抗原−抗体層をサ
ンドイッチしそしてそれにより生じる積層体の電気的な
キャパシタンスを測定することが含まれる。１９７７年
１０月１８日付けのギアエバー（Ｇｉａｅｖｅｒ）氏の
米国特許第４，０５４，６４６号には、このような方法
が開示されている。更に別の方法においては、変化の作
用を表わす信号の検出と、酵素免疫分析技術とが組み合
わされる。このような方法は、１９８１年９月１日付け
のギボン（Ｇｉｂｂｏｉｉ）氏の米国特許第４，２８７
，３００号に開示されている。然し乍ら、以上の電気的
な方法は、医療に携わる者や研究室にいる者に対して、
免疫診断テストを実行するための簡単で、迅速で、感度
が高く、安価で且つ使い易い手段をもたらすものではな
い。

本発明の１つの特徴は、抗原又は抗体で標識付けされた
コロイド状の金の粒子を使用するものである。一般に、
「コロイド状の金」とは、微細な金の粒子が水もしくは
水溶液中に懸濁したものを指し、これらの金の粒子の外
面には特定の抗体が結合されている。このような粒子の
形成については、１９８４年５月１日付けのデメイ（Ｄ
ｅＭｅｙ）氏等の一米国特許第４．４４．６，２３８号
及び１９８３年１２月１３０付けのデメイ氏等の米国特
許第４．４２．０．５５８号に開示されている。これら
デメイ氏等の全内容を参考としてここに取り上げる。こ
のようなコロイド状の金の粒子は、これまでにも免疫診
断テストに使用されており、抗原−抗体反応の結果とし
て反射される少量の光を観察することによりその結果を
光学的に判断することができる。上記のデメイ氏等の特
許には、前記形式の高駕度フィールド光線方法が開示さ
れている。本発明は、電子的なエンドポイントを用いた
新規な免疫診断方法にコロイド状の金を効果的に利用す
るものである。

問題点を解決するための手段 本発明は、一対の第１及び第２の物質、特に、生物活動
に必要な物質間で行なわれる結合反応であって、化学的
な錯体を形成するよう互いに結合する反応を検出するた
めの効果的な方法を提供する。本発明の方法は、これら
の物体を互いに近づけてそれらの間での結合反応により
開放電気回路を開成（閉じ）させることを含む。これに
より生じる回路の電気状態の変化が結合反応を指示する
。

本発明の更に別の特徴によれば、結合反応の検出に用い
られる診断素子は、一対の離間された電気導体、特に、
非導電性の基板上に横に並んで配置された導電性の層を
具備しているにれら導体間のスペースで狭いチャンネル
を画成することができる。互いに結合する一対の物質の
一方は、導体間に位置する非導電性基板の表面１例えば
、チャンネルの底面に付着され、固定される。電気回路
を形成する手段は、チャンネルが回路の切断点を構成す
るように各々の導電層に接続することができる。ここで
使用する「診断素子」という用語は、基板、導体及び１
つの結合物質の層を指すものであって、電気回路を形成
する手段は含まない。このような診断素子及び電気回路
形成手段は。

一対の物質間の結合反応によって回路の切断点を橋絡す
る適当な手段と関連して容易に使用することができる。

このような手段の１つは、以下で詳細に述べるように一
方の物質を導電性粒子の表面に接着することを含む。

本発明の別の特徴によれば、錯体形成物質間の反応を検
出する前記の方法は、抗原−抗体反応の検出に特に用い
られる。凝集物の形成程度及びそれにより生じる電荷の
程度を使用して、以下で詳細に述べるように、患者から
のサンプルが所与の抗体又は抗原を含むかどうかを判断
することができる。

実施例 以下、添付図面を参照し、本発明の好ましい実施例を詳
細に説明する。

本発明の方法は、生物身体内の抗原を検出するのに特に
有用である。このような抗原は、薬品、毒素、ホルモン
、アレルゲン、腫瘍マーカ、ファクタ、酵素、ステロイ
ド、ヌクレオチド及び参考としてここに取り上げる１９
８２年４月２７日付けのハング（Ｈｕａｎｇ）氏の米国
特許第４，３２７゜０７３号にリストされた他の物質を
含む、前記の物質は、抗原と反応してこれに結合する反
応物質（抗体）の生成を促進する。従って１本発明の方
法は、人間や下等動物の身体内に存在する種々様々な物
質を検出するのに有用である。

特に、本発明の方法は、患者がどの薬品を飲んだかを素
早く判断することが所望される薬過量処理に特に有用で
ある。又１本発明の方法は、特定の疾病又は症状に関連
した患者の血液流内の抗原の存在を検出するのにも非常
に有用である。

第１Ａ図ないし第１Ｅ図は、本発明によって抗原を検出
する方法を概略的に説明するものである。第１八図ない
し第１Ｃ図を参照すれば、特定の抗ＪｆＸ　１２　Ａを
含む全血、血清又は尿といった患者からのサンプル１１
Ａ（第１Ａ図）は、抗体１５Ａが外面に付着された金の
粒子１４Ａを所定量含んでいるコロイダル状の金の標本
１３Ａ（第１Ｂ図）と混合される。抗体１５Ａは、特に
、抗原１２Ａに結合される（第１Ｃ図）。それにより得
られる混合物１６Ａにおいては、抗原１２Ａが抗体１５
Ａに結合し、抗！１２Ａ及び抗体１５Ａが粒子１４Ａに
結合したものより成る遊離錯体１８Ａが形成される。抗
体１５Ａの方が抗原１２Ａよりも多いので、幾つかの抗
体１５Ａは遊離したま−となり、即ち、抗原１２Ａに結
合しない。

第２Ａ図ないし第２Ｃ図に示されたように、抗［１２Ａ
を含まない制御用のサンプルＩＩＢ（第２Ａ図）と、患
者サンプル１１Ａに用いた標本１３Ａと組成が実質的に
同じである第２のコロイダル状の金の標本１３Ｂ（第２
Ｂ図）とを用いて上記の手順を実行した。このようにし
て形成された第２の混合物１６Ｂ（第２Ｃ図）は、第１
Ｃ図に示す錯体１８Ａを含んでおらず、従って、抗原が
表面に結合されない粒子１４Ｂを非常に多数有している
。患者サンプルに対応する第１の混合物１６Ａ（第１Ｃ
図）及び制御用に対応する第２の混合物１６Ｂ（第２Ｃ
図）は、本発明による反応検出器２０（第１Ｄ図及び第
２Ｄ図）に使用する用意ができる。

第３図を説明すれば、反応検出器２０は、非導電性の基
板２２と、この基板２２上に横に並んで配置された一対
の薄い離間された導電性の層２３．２４　（それらの間
にチャンネル３２が形成されている）と、電気回路を形
成する手段、例えば。

図示されたようにワイヤ２８によって層２３．２４に機
能的に接続されたオームメータ２６とを備えている。基
板２２は、典型的に、ポリスチレン。

ガラス又は結晶シリコンのような非導電性材料で形成さ
れる。層２３．２４は、導電性材料、特に、導電性の金
属、例えば、金、銀、銅、クロム又はアルミニウムで形
成される。

再び、第１図及び第２図を説明すれば、同一の第１及び
第２の反応検出器２０Ａ（第１Ｄ図）及び２０Ｂ（第２
Ｄ図）が、各々、混合物１６Ａ及び１６Ｂと共に使用す
るために前景て形成される。キャリア液体（例えば、水
や塩水溶液）内の抗原のサンプルは、層２３Ａ、２３Ｂ
と２４Ａ、２４Ｂとの間に形成された浅いチャンネル即
ちグループ３２Ａ、３２Ｂに注入され、これらチャンネ
ルの底面３３Ａ、３３Ｂの表面に抗原を結合させて、抗
原層３０Ａ、３０Ｂを形成させる（第１Ｄ図及び第２Ｄ
図）。これらの抗原層３０Ａ、３０Ｂは、検出されるべ
き抗原１２Ａと同じ形式の抗原で形成される。

第１Ｅ図を説明すれば、患者のサンプル１１Ａ（第１Ａ
図）に対応する第１の混合物１６Ａ（第１Ｃ図）は、第
１の検出器２０Ａのチャンネル３２Ａに注入され、抗原
層３０Ａと抗体１５Ａとが結合される。制御用の混合物
１６Ｂ（錯体１８Ａのない）及び第２の検出器２０Ｂ　
（第２Ｅ図）を用いて前記の手順を実行した。

遊離した抗体１５　Ａを有する導電性の粒子１４Ａは、
抗原−抗体結合反応により抗原層３０Ａを介して底面３
３Ａに効果的に結合される。抗原−抗体反応を行なうの
に用いる反応条件は良く知られている。サンプルＩＩＡ
からの抗原１２Ａを含む錯体１８Ａは、底面３３Ａに結
合する傾向がない。抗原−抗体反応を行なうことのでき
る適当な時間の後に、チャンネル３２Ａは、もし所望な
らば、適当な液体１例えば、水や塩溶液でフラッシュさ
れ、結合しなかった粒子１４Ａが洗浄され、反応検出器
を加熱するか又は空気に対して開放させるような適当な
手段によって乾燥される。

第４Ａ図及び第４Ｂ図を説明すれば、第４Ａ図は、第１
Ｅ図と同じ状態に対応しそして第４Ｂ図は、第２Ｅ図と
同じ状態に対応する。第４Ａ図及び第４Ｂ図は、第１Ｅ
図及び第２Ｅ図では明らかでない結合反応の程度の差を
示している。オームメータ２６Ａ及び２６Ｂは、検出器
２ＯＡ及び２０Ｂの各々に対するチャンネル３２Ａ及び
３２Ｂ間の抵抗値を登録する。制御については（第４Ｂ
図）、遊離した抗体１５Ｂが付着した全ての粒子１４Ｂ
を用いて、底面３３１３に結合した抗原層３０Ｂと結合
することができる。その結果、底面３３Ｂに錯体３５Ｂ
が形成され、固定される。第４Ｂ図に示すように、錯体
３５Ｂは、互いに接触して１かたまりとなる傾向があり
、チャンネル３２Ｂを効果的に橋絡する凝集体即ちチェ
ーン３９Ｂを形成する。粒子１４Ｂは導電性であるから
、凝集体３９Ｂは１層２３Ｂと２４Ｂとの間に電気的な
接続を効果的に与え、オームメータ２６Ｂ、ワイヤ２８
Ｂ、層２３Ｂ、２４Ｂ及び凝集体３９Ｂによって画成さ
れた電気回路を完成する。これは、オームメータ２６Ｂ
により与えられる抵抗値の読みによって表わされる。凝
集体３９Ｂの橋絡により抵抗値が急激に減少する。

患者サンプルに対応する混合物１６Ａのための反応は同
様に行なわれるが、この混合物１６Ａは、抗原１２Ａと
抗体１５Ａとの反応により形成された錯体１８Ａを既に
含んでいる。これら錯体１８Ａの抗体は、少なくとも若
干の抗原１２Ａと既に結合されているので、これらの錯
体１８Ａは。

底面３３Ａにある抗Ｍ３０Ａの層に結合しない。

混合物１６Ａにおいては１粒子１４Ａに付着したｆ１ｉ
！ＩＩｉシた抗体１５Ａの数が混合物１６Ｂの場合より
少ない。というのは、これら抗体１５Ａの幾つかが錯体
１８Ａの形成に使用されたからである。

第４Ａ図に示されたように、凝集体３９Ａは形成される
が、このような凝集体は少数であり、従って、チャンネ
ル３２Ａの橋絡の程度も僅かである。

その結果、オームメータ２６Ａに登録された抵抗値の低
下は、オームメータ２６Ｂに登録された抵抗値の低下よ
りも小さくなる。この読みの差は、患者からのサンプル
ＩＩＡにおける抗Ｍ１２Ａの存在を示している。患者か
らのサンプル１１Ａが抗ＭＬ　２　Ａを含んでいない場
合には、反応検出器２ＯＡについての抵抗値の低下が検
出器２０Ｂについての抵抗値の低下と同じになる。

サンプルの特定の抗原レベルに対応する抵抗値が特定の
テストに対して分かっている場合には、第２Ａ図ないし
第２Ｅ図及び第４Ｂ図に示した制御を行なわずに上記の
手順を実行することができる。然し乍ら、制御によって
形成される対応する抵抗値の読みにより正確な結果が得
ら九るので、制御を用いることが好ましい。

第１図ないし第４図に示す手順は、説明のためにかなり
簡単化されている。導電性の粒子１４Ａ、１４Ｂは、抗
原１２Ａ及び抗体１５Ａ、１５Ｂより大きなものである
。多数の抗体１５Ａ、１５Ｂが１つの導電性粒子１４Ａ
又は１４Ｂに結合し、同様に、多数の抗Ｊ！Ｘ１２　Ａ
が１つの粒子１４Ａ又は１４Ｂの表面上の抗体１５Ａと
結合することができる。第５図は、抗体１５Ｂが表面に
付着した導電性粒子１４Ｂが抗原Ｒｊ３０Ｂを経て底面
３３Ｂにいかに結合されるかを概略的に示している。

上記した錯体１８Ａは、実際には、その表面に付着した
幾つかの遊離した抗体１５Ａと、抗原１２Ａに結合した
幾つかの抗体１５Ａとを有する粒子１４Ａを備えている
。然し乍ら、これらの錯体１８Ａにおいては、遊にした
抗体（混合物１６Ａの抗原１２Ａに結合しない）比率が
充分に低くて、錯体１８Ａはチャンネル３２Ａの底面３
３Ａに実質的に結合されない。

上記の手順に使用した反応検出器２０は、次ぎのように
設計される。チャンネル３２の巾は。

特に、チャンネル３２を橋絡するチェーンを形成する導
電性粒子の単純な数値的な平均直径に対し変化する。次
ぎの表は５本発明による寸法の好ましい範囲を示してい
る。

平均導電　　チャン　　　　チャンネル粒子直径　　ネ
ル巾　　　　巾対粒子直（μ　　　　　（径の比率 ０．０１−５００　　０．１−２０，０００　５：１−
４０：１０．０１−１０　　０．１−１００　　　１０
：１−３０：１０．０１−１　　　１−２５　　　　１
５：１−２５：１チャンネル巾対平均粒子直径の比は、
２０：１であるのが典型的であり、例えば、チャンネル
の巾が１０μでありそして導電性粒子の平均直径が０゜
５μである。

良く知られているように、抗原は、ポリスチレンに対し
て親和力を有し、成る条件のもとでこれに結合される。

これに対し、抗体は、以下に述べる手順を用いて金の粒
子のような微細な金属粒子の表面に容易に結合する。従
って、抗原−抗体の結合を伴う本発明の実施例では、抗
原をチャンネルの底面に結合しそして抗体を導電性粒子
に結合するのが好ましい。然し乍ら、逆の構成（抗原−
粒子、抗体−チャンネル）も使用可能である。

Ｊ３２３，２４は、機能的であると分かっている寸法で
あればいかなる所望の寸法でもよい。これらのＦｊＪ２
３．２４は、できるだけ薄いのが好ましく、その厚みは
約０．５μ以下であり、特に、０．００１−０．００５
μの範囲であるのが好ましい。従来のスパッタ付着を容
易に使用して層２３．２４を形成することができる。層
２３．２４は、非導電性の基板上に丸い「ドツト」を定
めるように長方形（第２図）又は半円形のような所望の
形状をもつことができる。一般に、基板２２は、プラス
チック、好ましくは、メチルセルローズ、ナイロン又は
ポリスチレンで形成される。基板２２は、顕微鏡スライ
ドを形成するのに使用される形式のポリスチレンで形成
されるのが最も好ましい。

というのは、抗原分子の極性によりこれら分子を基板に
結合させて実質的に完全な均質な抗原被膜を形成させる
からである。

ガラスそれ自体は、基板２２として一般的に使用されな
い。というのは、抗原は、ガラス面に対して親和力が弱
く、抗原の層をガラススライドに付着することが困難で
あると分かっているからである。然し乍ら、本発明の更
に別の特徴によれば、ガラススライドを表面処理して、
ガラススライド上の被膜に対する抗原の親和力を、ポリ
スチレンスライドに対する抗原の親和力とはゾ同程度に
することができると分かっている。この表面処理は、ガ
ラススライドにチタニウム・オキシニトライド（Ｔ　ｉ
　Ｏｘ　Ｎ　ｙ）の薄い層を被覆することを含む。この
技術の一例を以下に示す。

第８図は、多数の層２３．２４が１枚の非導電性基板２
２の上に配置された本発明の診断素子の更に別の実施例
を示している。この実施例のための導電性手段２８は、
一連の個々の電気導体６１を備えており、これら電気導
体の各々は共通の導体６２に接続され、そしてこの導体
は、基板２２の縁に取り付けられた端子プレート６３に
接続される。層２３．２４の対は、基板２２上で行列に
配置される。

第８図の実施例では、プレート６３の行が長方形の基板
２２の隣接する側縁に配置される。層２３に接続された
導体６２の第１の組６６と、層２４に接続された導体６
２の第２の組６７との重畳を防止するために、第２の組
６７の１つの導体を除く全ての導体６２が基板２２の反
対側に配置される。これらの導体６２は、第８図に破線
で示されている。外側の導体６２Ａは、第１組６６のど
の導体６２にも交差せず、従って、基板２２の他側に存
在する必要はないが、もし所望ならば、このように配置
することもできる。基板２２の反対側で第２組６７の共
通の導体６２に接続された個々の導体６１は、基板２２
の厚みを貫通して延びて導体６２と接続する（第７図に
破線で示す）部分６９を含んでいる。

オームメータ２６は１層２３．２４の各々の対の抵抗値
を測定するために端子プレート６３の種々の組合体に接
続することができる。このような測定を行なうために、
オームメータ２６は、基板２２の別々の縁上で２つのプ
レート６３に接続される。第８図の実施例では、オーム
メータをプレート６３Ｇ、６３Ｄに接続し、層２３Ｃ，
２４Ｄの指示された対のテストを行なう。

上記の実施例では、各対の層２３．２４間に別々の物質
を結合することもできるし、上記したように制御機能を
果たすためにそれらの間に物質を結合しなくてもよいの
で、本発明による１つの診断素子で、抗原のような多数
の種々の物質に対し、１つの患者サンプルをテストする
ことができる。

例 以下の手順を使用し１本発明により抗体で標識付けした
金粒子の懸濁物を形成した。塩化金の１％ｗ／ｖ（重！
＆／体積）水溶液を約１ｍＱ使用し、これを、約０　、
１　ｍ　ＱのＫｏｄａｋ　Ｄ−１９゛写真現像液と混合
し、塩化金を還元して金粒子を生成した。

これにより得られた混合物を、約１５０００ｇの遠心力
により希釈水で洗浄し、水中の純粋な金の粒子の懸濁物
を得た。

ボート・アンチ−ラビット１ｇＧの抗体を、ＰＨ９，６
の炭酸塩緩衝液に添加し、１：５０００（ｗ／ｖ）の抗
体水溶液を生成した。この水溶液１．０ｍＱを金の粒子
に添加し、それにより得られた混合物を室温で一晩凝固
させる。この混合物からの金の粒子をボート・アンチー
ラビットエｇＧと結合させ、約１５０００ｇの遠心力に
より燐酸塩緩衛の塩水で洗浄し、余計な抗体を除去した
。

第６図及び第７図を説明すれば、顕微鏡用のガラススラ
イド４０にチタニウム・オキシニトライド（ＴｉＯｘＮ
ｙ）の薄い層４５を被覆した。

高周波（ｒｆ）マグネトロンスパッタ付着により色々な
組成のチタニウム・オキシニトライドフィルムをガラス
スライド上に付着した。このチタニウム・オキシニトラ
イド被膜を付着するのに用いた装置は、マテリアルズ・
リサーチ・コーポレージョン（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｉｉ）のモデル
８２２スパツタスフエアであった。このシステムの基本
的な圧力は、　３　Ｘ　１０−７Ｔｏｒｒであった。

このシステムには、窒素及び酸素の混合物を後方充填し
た。８　Ｘ　１０””Ｔｏｒｒの全圧力でスパッタリン
グを行なった。順方向電力は１５００Ｗであり、ターゲ
ット電圧は３１４■であり、反射電力はＯＷであり、カ
ソードとアノードの距離は２．５インチであり、スパッ
タリング時間は３０分であった。

オキシニトライド物質は、酸素／窒素プラズマ中で反応
性の付着を行なうことにより形成された。フィルムの組
成を変えるために酸素と窒素の比率を変えた。フィルム
の組成は、オージェの電子分光器で測定した。窒素と酸
素の分子比が０゜３０ないし０．４０の場合に、優れた
抗原付着性を有するフィルムが形成された。Ｔｉ０ｘＮ
ｙフイルムにおける抗原付着の量は、プラスチックスラ
イド上の場合と同等であり、同様の条件のもとでの被膜
のないガラスに対する抗原付着性よりも大きなものであ
る。

次いで、金−パラジウム合金（６０：４０）を各スライ
ド４０の上面に蒸着して、厚み１０００人の均一に分布
した金−パラジウム層４１を各スライド４０上に形成し
た。次いで、各々の金−パラジウムＮ４１の表面におい
て点４６と４７との間に鋭い針を用いて罫書き（、ＩＡ
）４２が形成された。

次いで、先の丸い器具を使用し、領域４８．４９におい
て層４１をこすり落した。これにより。

非導電性の線４２によって分離された一対の１０００人
厚みの導電層５１．５２が残された。領域５１．５２に
おける（線４２を横切る）オームメータの読みは、２百
万オ一ム以上の読みであった。

水性のラビットＩＧＧ溶液を線４２の全長にわたって塗
り、１８時間（−晩）放置して抗原層５３を形成した。

次いで、ＩＧＧ溶液を取り除き、燐酸塩緩衝の塩溶液で
スライド４０を洗浄した。

次いで、予め形成した金の標識のアンチ−ラビット−Ｉ
ＧＧ　（金粒子直径０．１−０．５ｍｍ）を線４２に塗
布した。

次いで、金の凝集体の形成を顕微鏡でｉｌｌ祭した。約
２０ミクロン長さの凝集体が観察され、隣接する凝集体
のグループにも注目した。一般に、凝集体のサイズは、
その長さが約１ミクロンから２０ミクロンまで変化した
。第９図は、巾が約５ミクロンの罫書き（線４２）をま
たぐ大きな凝集体の形成を示している。巾が２０ミクロ
ン延びたスライド４０上の線４２については完全な橋絡
が観察されなかった。然し乍ら、他の実験条件をそれに
応じて調整した場合、例えば、大きな直径の金の粒子を
使用した場合には、このような太い線１］も有用である
とされる。成る場合には、罫書きによって線４２を形成
する針の先端が不完全であるために多数の平行な線４２
が形成されるが、このようなことは避けねばならない。

というのは、オームメータを層５１．５２に接続した時
に抵抗値を実質的に変化させるには、全ての平行線を凝
集体で橋絡することが必要になるからである。

第１０図は、ラビットＩＧＧ溶液で処理されなかったこ
と以外はスライド４０と同様に処理された制御スライド
に対する結果を示している。この顕微鏡写真に示された
ように、燐酸塩緩衝の塩溶液で洗浄した後にはこのスラ
イドセグメント上に少数の小さな凝集体が残されるだけ
である。

種々のテストスライドに対し層５１．５２にわたってオ
ームメータを接続した。１つのスライド４０については
、抵抗値の読みが２百万オ一ム以上から約６４０００オ
ームまで減少した。線４２が非常に広いか或いは針の先
端の不完全さによって多数の線４２が形成された殆どの
スライド４０に対し、抵抗値の変化は殆ど又は全くなか
った。

以上の説明は、本発明の好ましい実施例に関するもので
あり、本発明は、ここに示した実施例に限定されるもの
でないことを理解されたい。本発明の範囲から逸脱せず
に、上記実施例において種々の変更がなされ得ることを
理解されたい。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図、第１Ｂ図、第１Ｃ図、第１Ｄ図及び第１Ｅ図
そして第２Δ図、第２Ｂ図、第２Ｃ図、第２Ｄ図及び第
２Ｅ図は１本発明による免疫診断方法を説明する概略図
、 第３図は、本発明の１つの実施例による反応検出器を示
す回路図、 第４Ａ図及び第４Ｂ図は、各々、第１Ａ図ないし第１Ｅ
図及び第２Ａ図ないし第２Ｅ図の方法による凝集体の形
成を示す概略図、 第５図は、本発明の一実施例による導電性粒子と非導電
性基板との結合を示す概略図。 第６図は、本発明の一実施例による診断素子の概略図、 第７図は、第６図の診断素子の断面図。 第８図は１本発明による多診断素子の概略図、第９図は
、サンプルスライドを倍率５０００で示す顕微鏡写真で
、本発明の一例による凝集体の形成を示す図、そして 第１０図は、凝集体のない制御スライドを倍率８００で
示す顕微鏡写真である。 更に、第１図ないし第８図は正しいスケールではないが
、第９図及び第１０図は正しいスケールである。 １１Ａ・・・患者サンプル １１Ｂ・・・制御用サンプル １２Ａ・・・特定の抗原 １３Ａ、１３Ｂ・・・コロイド状の金の標本１４Ａ、１
４Ｂ・・・金粒子 １５Ａ・・・抗体 １６Ａ、１６Ｂ・・・混合物 １８Ａ・・・錯体 ２０・・・反応検出器 ２２・・・基板 ２３．２４・・・導電層 ２６・・・オームメータ ３２・・・チャンネル 昭和　　　年　　　月　　　日 １．事件の表示　　　昭和６２年特許願第７１３１９号
２、発明の名称　　　結合反応を電子的１之測定する方
法３、補正をする者 事件との関係　　出願人 氏名　　　スーザン　ジェイ　ムロッコースーｔ−−外
２名 ４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭和６２年６月３０日６、補正
の対象　　　　明細書の図面の簡単な説明の欄明細書第
３５頁第１４行から第３６頁第１行の“第９図は・・・
・・である。′を下記のとおり訂正する。 「　第９図は、サンプルスライドに形成された凝集体の
結晶構造を倍率５，０００で示す顕微鏡写真、そして 第１０図は、制御スライドに形成された少数の小さな凝
集体の結晶構造を倍率８００で示す顕′ｆｒ１．鏡写真
である。」

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）互いに接触した際に結合するような一対の物質間
   の結合反応を検出する方法であって、上記の結合反応を
   生じさせる状態のもとで上記物質を互いに結合させそし
   て結合反応の進行を指示する手段を用意するという段階
   を具備する方法において、更に、 不完全な電気回路を画成する手段の存在中で上記一対の
   物質の混合物を形成して、上記の結合反応によって上記
   電気回路を完成させ、そして上記結合反応の発生を指示
   する上記回路の電気特性の変化を測定する段階を具備し
   たことを特徴とする方法。
2. （２）錯体を形成するように互いに結合する一対の第１
   及び第２の物質間の結合反応を検出する方法において、 上記第１の物質が表面に結合された導電性の粒子を、非
   導電性基板上に配設した一対の離間した導体間に画成さ
   れたチャンネルの底面に結合した上記第２物質の層と接
   触させるように配置し、上記第１物質と第２物質との結
   合反応により上記粒子を上記底面に結合させて凝集体を
   形成し、電気回路を完成するように上記チャンネルを横
   切る上記凝集体の橋絡により生じる電気的特性の変化を
   測定し、この電気的な変化が上記第１物質と第２物質と
   の間の結合反応を指示することを特徴とする方法。
3. （３）上記導電性粒子は、本質的に、銀及び金より成る
   グループから選択された少なくとも１つの金属で構成さ
   れる特許請求の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）上記粒子の平均直径は、０．０１ないし１．０ミ
   クロンの範囲である特許請求の範囲第３項に記載の方法
   。
5. （５）上記一対の物質は、抗体と、微生物又はその一部
   分、薬品、ホルモン、アレルゲン、腫瘍マーカ、ファク
   タ、酵素、ステロイド及びヌクレオチドより成るグルー
   プから選択された１つの部材とを備えている特許請求の
   範囲第２項に記載の方法。
6. （６）電気的変化を測定する上記の段階は、更に、上記
   電気回路の電気抵抗の変化を測定することを含む特許請
   求の範囲第２項に記載の方法。
7. （７）上記第１の物質は上記抗体を備え、更に、上記抗
   体を含むサンプルをコロイド状の金と混合して、上記第
   １物質が表面に結合された上記導電性粒子を作成する段
   階を具備した特許請求の範囲第５項に記載の方法。
8. （８）上記チャンネルの巾は、０．１ないし１００ミク
   ロンの範囲である特許請求の範囲第２項に記載の方法。
9. （９）オームメータを上記導体に作動的に接続して上記
   電気回路を形成する段階を更に具備した特許請求の範囲
   第６項に記載の方法。
10. （１０）テストサンプル中の抗原を検出する方法におい
    て、 ｉ）抗体が表面に結合された所定量の導電性粒子を上記
    テストサンプルに導入し、上記テストサンプル中の抗原
    を上記粒子の表面上の抗体の一部分に効果的に結合させ
    、 ｉｉ）非導電性の表面に結合された上記抗原の層に上記
    粒子を付着し、上記抗原の層は、上記非導電性表面上の
    一対の導体間に介在するものであり、 ｉｉｉ）上記導体間の上記層に結合された上記粒子の凝
    集体を形成し、そして ｉｖ）上記凝集体で上記導体間を橋絡することによって
    生じた電気的特性の変化を測定し、この電気的特性の変
    化が上記テストサンプル内の上記抗原を指示するように
    したことを特徴とする方法。
11. （１１）特許請求の範囲第１０項に記載の方法において
    、更に、 ｖ）上記テストサンプルに代わって上記抗原を含まない
    制御用サンプルと、上記抗体が表面に結合された第２の
    所定量の上記導電性粒子と、第２対の各導体間で第２の
    非導電性表面に結合された上記抗原の第２の層とを用い
    て前記の段階ｉ）ないしｉｖ）を繰返し、そして ｖｉ）上記テストサンプル及び上記制御サンプルに関連
    した電気的特性の変化を比較して、上記テストサンプル
    中に存在する上記抗原の量を測定するという段階を具備
    する方法。
12. （１２）前記の段階ｉｉ）は、更に、 Ａ）上記抗原の層をフラッシュして、結合しなかった粒
    子を除去し、そして Ｂ）上記抗原の層を乾燥させるという段階を含んでいる
    特許請求の範囲第１０項に記載の方法。
13. （１３）上記導体は、一対の横に離間された導電性の層
    である特許請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. （１４）上記段階ｉ）において、抗体が表面に結合され
    た上記導電性粒子をキャリア液体に懸濁させる特許請求
    の範囲第１２項に記載の方法。
15. （１５）上記段階ｉ）は、更に、上記サンプルを、上記
    抗体が表面に結合されたコロイド状の導電性金属粒子の
    標本と混合させる段階を含む特許請求の範囲第１４項に
    記載の方法。
16. （１６）一対の物質間の化学的な結合反応を検出するの
    に用いる診断素子において、 非導電性の基板と、 上記基板上に配置された一対の離間された電気導体と、 上記導体間で上記基板上に配置された一方の上記物質の
    層とを具備することを特徴とする診断素子。
17. （１７）上記導体は、上記基板上に横に並んで配置され
    た一対の離間された導電性の層より成り、これらの層は
    、その間にチャンネルを画成し、一方の上記物質の層は
    、上記チャンネルの底面に結合される特許請求の範囲第
    １６項に記載の診断素子。
18. （１８）上記導電性の層は、本質的に、導電性の金属で
    構成され、上記導電性の層の厚みは、０．５ミクロン以
    下である特許請求の範囲第１７項に記載の診断素子。
19. （１９）上記チャンネルの巾は、０．１ないし１００ミ
    クロンである特許請求の範囲第１８項に記載の診断素子
    。
20. （２０）上記一対の物質は、抗体と、微生物又はその一
    部分、薬品、ホルモン、アレルゲン、腫瘍マーカ、ファ
    クタ、酵素、ステロイド及びヌクレオチドより成るグル
    ープから選択された１つの部材とを備えている特許請求
    の範囲第１７項に記載の診断素子。
21. （２１）上記素子は、更に、 上記基板上の離間された位置に配置された複数の上記対
    の電気導体と、 別の物質との結合反応を受ける種々の物質の複数の層で
    あって、それに関連した対の導体間で上記基板上に配置
    されているような層と、 上記基板の縁付近に配置された複数の導電性端子と、 上記導体の対の各々からそれに対応する対の上記端子へ
    電流を導通する電気接続手段とを具備し、上記端子の一
    方は、それに関連した導体対の一方の導体に電気的に接
    続され、上記端子の他方は、上記導体対の他方の導体に
    電気的に接続される特許請求の範囲第１６項に記載の診
    断素子。
22. （２２）上記基板は、実質的に長方形であり、上記端子
    は、上記基板の２つの隣接縁に沿って一対の行として配
    置され、上記導体対の各々は、別々の対の上記端子に組
    み合わされていて、１つの対の２つの導体が上記電気接
    続手段によって他の対の導体と同じ２つの端子に接続さ
    れないようにした特許請求の範囲第２１項に記載の診断
    素子。