JPS63118638A - 多螢光分析を用いた細胞・粒子等の特性を決定するための方法および装置 - Google Patents

多螢光分析を用いた細胞・粒子等の特性を決定するための方法および装置

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JPS63118638A
JPS63118638A JP62208036A JP20803687A JPS63118638A JP S63118638 A JPS63118638 A JP S63118638A JP 62208036 A JP62208036 A JP 62208036A JP 20803687 A JP20803687 A JP 20803687A JP S63118638 A JPS63118638 A JP S63118638A
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light
fluorescence
cell
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ディーザー・ジェイ・レックテンワルド
チア・ヒュエイ・チェン
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Becton Dickinson and Co
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は多螢光分析を用いて粒子の１又はそれ以上の特
性を決定するための方法およびその装置に関し、より詳
細には、１つの光源からの単一の波長励起によって達成
される多色螢光分析を行う九めの方法およびその装置に
関する。
（従来技術およびその問題点） 粒子、細胞あるいはこれらと同様な物の螢光特性を検知
しこれら粒子等に関する価値のおる情報を提供する種々
の装置がある。螢光顕微鏡、フローサイトメトリおよび
イメージ顕微鏡がこのような装置の例の１つであり、こ
れらの装置では螢光を検知することにより観察者すなわ
ち使用者に分析されるべき粒子あるいは細胞に関するデ
ータを提供する。
フローサイトメトリ装置においては、細胞あるいは他の
粒子が液体流の中を流され特定の性状の観察を容易にし
ている。一般的に、フローサイトメトリ装置は対象とす
るある粒子あるいは細胞の存在を確認し九シ、ま九はこ
れら細胞あるいは粒子の数を数え九り、あるいはある場
合においては。
対象とする粒子ま九は細胞を集めるために粒子あるいは
細胞を分類するために有用である。代表的なフローサイ
トメトリ装置においては、細胞を含有する流体サンプル
を装置を通じて急速に流動する液体流の中に導入し、各
々の細胞が一時に一個づつ列をなして順番に検知領域を
通過するようになされている。細胞の体積は各々の細胞
が検知領域を通過するときの電気的なインピーダンス変
化によって決定す−ることかできる。同様にして、もし
光の入射ビームを検知領域に当てれば通過する細胞はそ
の光を散乱させる。この散乱された光は細胞の形状およ
びサイズ、反射率、透明度、細粒度、表面粗度等の関数
として働く。ま友、入射光ビームの励起エネルギを通過
することによって励起された標識細胞あるいはオートフ
ローレッセンス細胞によって発せられる螢光は螢光特性
を有する細胞を同定する九めに検知可能である。フロー
サイトメトリ装置によって細胞の分析を行っ穴径に、所
定の特性を有するとされ九細胞は、もし装置が分類性能
を有していれば、分類収集される。
フローサイトメトリ装置のような機器は免疫系の種々の
応答１反応あるいは関係を研究者あるいは実験者にとっ
て特に有用である。免疫螢光分析学および螢光免疫検定
法は、実験者が対象とする選定細胞を同定あるいはター
ゲットを行い、これによって病状等を的確に把握するこ
とを補助する。
免疫体系の観察に加えて、螢光分析はま九細胞状物質の
構造研究を含む細胞生物学および細胞形態学的観察にき
わめて有用である。
細胞についてのデータおよび情報を得るために螢光を用
いようとすれば、得られる結果と同様に。
螢光的な応答に対するテストを達成する機構を装置の設
計に卦いて考慮することが肝要でおる。特に、螢光標識
はこの標識が螢光染料であるか螢光試薬であるかにかか
わらず代表的には光エネルギによって励起される。通常
は、使用される螢光標識に対して最も大きな励起レベル
を示す最適の波長が存在する。−旦励起されると一般的
には励起波長とは異っ九波長において螢光放射が生ずる
。
螢光顕微鏡、イメージ・アナライザあるいはフローサイ
トメトリを問わず、螢光分析装置は一般に螢光信号が最
も強くなる最大放射波長における螢光放射を検知するよ
うに設計される。
複数の螢光放射が同時に検知される細胞又は粒子の螢光
分析は、細胞等に関するより多くの情報を得ることがで
きるために、多くの観察者によって好んで望にられる。
励起光源としてアークランプを用いた場合には螢光標識
を励起させるために役立つ光スペクトルが豊富であシ、
シたがって単一の光源により多くの螢光を広範囲の波長
にわ几って励起することができる。しかしながら、励起
の目的のために役立つ光エネルギのエネルギレベルは一
般的に弱く、シ九がって螢光標識から放射される信号を
検知し又処理するのは困難である。
ランプの中の光を放射するエレメントの大きさの如き他
の要因も螢光標識からの信号に影響を与える。反対に、
螢光励起のためにレーザを用い九場合には十分に高い強
度の信号を得ることができるが、レーザによって生ずる
光は単色光すなわち単一の波長になってしまう。このこ
とは、１つのレーザおよびこれに関連する光学系あるい
は電気的回路が各螢光標識が細胞又は粒子上で検知され
なければならないという実用上の要求を有する定めに、
螢光分析観察に１つの限定を設けていた。少くとも１つ
の報告例、すなわち１９７７年の組織化学および細胞化
学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　）ｖｏ
ｌ、２５．＆７第８９９乃至９０７頁に掲載のＬｏｋｅ
ｎ他の６螢光活性細胞ンータを用いた２色免疫螢光学”
、では単一のアルゴンイオンレーザがフルオレスセイン
およびローダミンの同時励起の九めの励起エネルギをも
九らしている。このように、　Ｌｏｋｅｎ　他は１つの
レーザ励起源を用いて２つの異っ側壁光試薬を伴っ念細
胞に関する情報を得るという有益性を獲得している。
多くの異っ穴壁光標識から螢光放射データを得′る′こ
とを可能にするとともに螢光装置の価格および複雑さを
最小にする九めには、単一の励起波長を示す（非較的大
きな強さで）光源を用いて多くの螢光標識を励起し、そ
れぞれ別個に検知することのできる螢光をスペクトル的
に離れた波長で放射することが望ましい。ＤＮＡの研究
および細胞表面のマーキングに対して多くのスティンお
よび染料が役立つものでありなか、単一の波長で励起可
能でかつ別個に検知可能なようにスペクトル的に十分に
離れ側壁光放射を生ぜしめる３または４以上の螢光標識
は知られていなかっ九。上述した如く、Ｌｏｋｅｎ他は
２つの染料を励起させる九めの単一の波長をもたらすア
ルゴンイオンレーザを用いた。ある種の新しい螢光抱合
体が米国特許第４．５２４，１０４号および４，５２０
，１１０号明細書に記載されている。したがって本発明
は単一波長の励起が別個に検知可能な少くとも３つの螢
光標識を励起するという上述の如き目的を有している。
（発明の構成） 多螢光分析を用いて粒子の１あるいはそれ以上の特性を
決定する次めの方法は、入射光ビームを分析すべき粒子
に導（段階を包含している。粒子は各々が異なっ念放射
スペクトルを有する少なくとも３つの螢光マーカー即ち
標本を有している。
入射光ビームは光の単波長においてマーカーの励起を生
ぜしめ、これによって螢光の異なり念波長が粒子から放
射される。この方法は１分析すべき粒子に関連する異な
った螢光放射を同時に検知し。
検知した螢光を１又はそれ以上の粒子の特性に関連付け
る段階を含む。
本発明の好ましい実施例においては、多螢光分析を用い
て細胞等の１あるいはそれ以上の免疫螢光学的特性を決
定するための方法は、液体流中に一時にほぼ１つづつ細
胞を流動させる段階を含む。
細胞は少なくとも３つの免疫螢光分析に適した表面螢光
マーカーを有している。各々のマーカーは異った放射ス
ペクトルを有し、これらスペクトルにおいて放射最大値
はスペクトル的に十分に分離可能であってスペクトル的
な重なυ合いは実質的にない。したがって放射最大値の
間には十分なスペクトル的差異がある。単一の波長にお
ける光ビームはレーザから流動流中の細胞に導かれて全
ての螢光マーカーが励起され細胞から異った波長の螢光
が放射される。流動流中で動く細胞に関連する異った螢
光放射が同時に検知される。この検知され穴壁光は細胞
の１又はそれ以上の特性を決定する九めに用いられる。
本発明の他の観点において、螢光分析を用いる粒子の１
又はそれ以上の特性の分析のための装置は光の単一の波
長によって細胞上の多くの螢光マーカーを励起する友め
に分析すべき粒子に光ビームを導くための手段を備えて
いる。少くとも３つの螢光検知手段が設けられて粒子か
ら放射される螢光を検知する。この検知手段は光フイル
タ手段の選定され次組合せを有し、この光フイルタ手段
は少くとも３つのスペクトル的に分離された波長の螢光
放射を同時に集めることを許容する。検知された螢光放
射を粒子の１又はそれ以上の特性と関連付けるための手
段も設けられる。
本発明の、原理によれば、螢光分析は単一の励起波長の
光エネルギを提供する１つの光源を用いスペクトル線を
考慮することによって連取される。
染料、着色斉（スティン）等の螢光マーカーの選定され
た組合せを用いることによって、好ましくはレーザー等
の光源からの単一の励起波長によシ３又はそれ以上の螢
光放射を刺激（励起〕することができる。光学フィルタ
の選定した組合せは、フローサイトメトリ装置等の検知
装置が異った励起螢光マーカのスペクトル的に分別され
た放射物を検知することを許容する。異っ穴壁光マーカ
ーの最大放射値（ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｍａｘｉｍａ　）
　　の間には適度なスペクトル間隔が存在し、これら同
一のマーカーが選定され光波長において、励起される限
り。
本発明によって多値光検知を連取することができる。励
起のために単一の光波長を用いることによって、従来は
２又はそれ以上の励起光源によって行なわれている装置
に対して大幅な節約を行うことができる。これらの節約
は費用の面のみならず。
装置あるいはオペレータ・インターフェースの複雑さを
低減することである。ま九本発明は、異った螢光放射が
同時に検知され、し九がって分析すべきサンプルが単一
の光検査メカニズムによって長壁光情報を提供するとい
う、利益を有する。本発明の他の利点は以下の実施例の
記載からより明らかとなろう。
（実　施　例） 以下に述べるように１１本発明の応用例をフロー・サイ
トメトリに対するものとして説明するが、本発明が螢光
免疫分析、螢光顕微鏡、イメージ（像）解析等を含む種
々の分野に応用可能であることは理解されよう。第１図
を参照すると、フロー・サイトメトリ装置１０の光学的
粒子流動エレメントが示されている。第１図の光学的流
動エレメントは１粒子等の特性を評価する交めに一時に
ほぼ１つづつ液体流の中に粒子あるいは細胞等を流動さ
せるための、フロー・サイトメトリ装置の主要な要素を
示している。例えば、第１図の装置のエレメントは、カ
リフォルニア、マウンドヴコーにある、ペクトン・デッ
キンンン・イムノサイトメトリ・システムズによって販
売されている、ＦＡＣ８螢光活性セルレータの中に組み
込むことが出来る。
ＦＡＣＳ　　セルフ・−夕は、広い範囲の種々の研究実
験応用分野において、螢光を含む異なった光パラメータ
に基づき細胞数を分析するとともにこれらを選別する。
以下に詳細に説明しかつＦＡＣＳ　　セルソータなどの
装置として具体化される光学的流動エレメントに加えて
１本発明の使用において有用な螢光検知装置の他の詳細
が米国特許第３．８２６，３６４号明細書に記載されて
いる。
第１図に示すように、本発明のフローサイトメトリ装置
にたいして光源１１によシ光エネルギがもたらされる。
この光源は単一波長の平行光ビームを発生するレーザが
好ましい。本発明の目的のｔめには他の光源を用いるこ
とができ、またフィルタ等の手段を用いて無関係な波長
を除去しこれによって以下に説明するように流動細胞の
流れに対して単一の波長のみを導くことができる。この
ようにフローサイトメトリ装置においては、励起エネル
ギは光源１１により生じる光ビームによってもたらされ
る。光ビーム１２は光ビームの光学的経路に位置する焦
点レンズ１４を通過する。レンズ１４は観察すべき粒子
あるいは細胞を保有している液体流に光ビームを合わせ
る助けをする。
第１図はまた、本発明のフローサイトメトリ装置の中に
組み込まれたノズル１８を示している。
液体流１６の中の細胞あるいは粒子はノズルを通って流
れるようにされる。この型式でのノズルの利用は周知で
あり、例えば上述の米国特許第３．８２６，３６４号明
細書に記載されている。このノズルはシース液体の中に
流体力学的に焦点付けられた粒子の流れを提供し、この
シース液体は細胞流とともに液体流１６を包含している
。光ビーム１２が液体流１６と交差する調整された焦点
光を各粒子あるいは細胞が通過すると、光ビームの光エ
ネルギがこれら細胞上の螢光マーカーを刺激する。螢光
マーカーは自動螢光であるか又は光源１１によってもた
らされる波長において刺激エネルギに感応性を有するマ
ーカー、染料あるいは着色剤によって着色され念もので
ある。
光源からの照射によって活性化され几細胞から放射され
友螢光は検知することができ、観察すべき細胞に関する
情報が収集される。レーザ励起型のフローサイトメトリ
装置においては、螢光は。
その視軸がレーザからの入射光ビームの励起軸線に対し
てほぼ９０°　である角度において収集されるのが一般
的である。第１図において、軸２４は螢光の収集のため
の９０°の視軸を示している。
入射光ビームからの約９０°角度において細胞によって
放射され次異なっ九波長における螢光を集めるために、
螢光信号は代表的には分離すなわちスプリットを受ける
。この分離は２色ミラーあるいはビームスプリッタ２５
等の多くの異なっｔ技法により行うことができる。ここ
で説明する実施例においては、螢光は軸２４に沿って２
色ミラー２５の前縁面に当九るまで移行する。ある色領
域における螢光は２色ミラー２５によって反射され、こ
の反射された信号は軸３１に沿って移行してフォトディ
テクタ６２の中に集められる。他の色領域の螢光は２色
ミラーを通って伝達され軸３０に沿って移行する。軸３
０に沿うこの螢光の移行は、他の２色ミラー即ちビーム
スプリッタ３４を設けることによって精選すなわち分離
される。このミラーは伝達された螢光信号の異なった色
波長を分離するために用いることができる。このように
１例えば最初に伝達され次色領域における螢光は２色ミ
ラー３４によって軸３５に沿って反射され適宜なフォト
ディテクタ３６の中に集められる。
異なった色領域における螢光は軸３８に沿って２色ミラ
ー３４を通って伝達され、適宜なフォトディテクタ３９
の中に集められる。第１図には示していないが、出来得
る限り純粋な信号を得る几めに各々のフォトディテクタ
について種々のレンズあるいはバリア等を用いることが
できることは。
当業者には理解されよう。特に第１図に示すように、フ
ィルタ４０．４１．４２はフォトディテクタ３２．３６
．３９をそれぞれ伴っている。これらの光フィルタはそ
れぞれの７オトデイテクタの中に集められる前に螢光信
号をろ波する帯域フィルタであることが好ましい。純粋
な帯域フィルタの代わりに、これら各々のフィルタを帯
域フィルタと同様な機能を果比す短および長通過フィル
タの組み合わせとすることができることは理解されよう
。
螢光信号をスペクトル的に分離する次めに２色ミラーお
よびフィルタを含む適宜な光学的エレメントを選定する
ことによって、多くの異った螢光信号が異り九波長にお
いて同時に収集される。し九がって、第１図には３つの
フォトディテクタが示されているが、ミラーおよびフィ
ルタ等の光学的ろ波エレメントをより多く用いてスペク
トル的に豊富な螢光放射信号を精選して個々の集合に対
する成分をスペクトル的に分離することも本発明の範囲
内である。しかしながら、細胞等からの複数の螢光放射
を同時に収集することができることは本発明のユニーク
な特徴であるが、螢光を励起するための励起エネルギは
単一の波長において光ビームを提供する単一の光源によ
っても九らされる。この点に関して、本発明は３又はそ
れ以上の螢光放射信号を同時に検知することができ、こ
の信号の螢光活動度は光エネルギの単一波長において励
起される。この望ましい結果を得るためには。
光フイルタ手段の組合せの選定のみならず、流動する細
胞又は粒子上の螢光マーカーの組合せを装置の能力と適
合するように選定しなければならない。
本発明のユニークな結果を得るための螢光マーカーおよ
び光学フィルタの組合せを説明する前に。
液体流１６中の粒子又は細胞を適宜な容器４５の中に収
集すべきであって、おそらく、もしフローサイトメ）　
ＩＪ装置が分類能力を備えるのであれば粒子等を別々の
容器に分類して集めなければならないことを指摘する。
上述のフォトディテクタが一旦螢光信号を受は次ならば
、これによって得られ元情報を更に利用することができ
る。種々のフォトディテクタは周知のフォトマルチプラ
イヤ・チコープあるいは同様の装置を用いることができ
、これらの装置等は光信号を電気的パルスに変換し。
し念がってこれにより検知され次光を装置を通って流れ
る細胞に伴わせる。フォトディテクタからの電気的信号
は代表的にはディスプレイあるいは記憶又は更に処理す
る目的のために装置の電子回路（図示せず）に供給され
、し九がって分析すべき細胞の１又はそれ以上の特性を
決定することができる。
分析される細胞に対する螢光マーカーの組合せを選定す
る際に、光学フィルタあるいは異った螢光信号をスペク
トル的に分別および収集する之めの関連するエレメント
と共に、考慮すべき多くの要素がある。例えば、螢光マ
ーカーはこれら全てが単一の波長における光エネルギに
よって励起されるが、螢光放射は実質的なスペクトル的
重なりがなく個々に検知可能なようにスペクトル的に十
分に分離されなければならない。この念めに、螢光スペ
クトルに沿う隣接する螢光マーカーの最大放射値の間の
スペクトル的間隔は少くとも１５ｎｍでなければならな
い。また勿論染料すなわち螢光マーカーは、分析装置の
一部である光源からのエネルギの励起線と適合するよう
に選定されなければならない。例えば、アルゴン・イオ
ン・レーザは螢光励起の目的のために４８８　ｎｍの代
表的なエネルギ出力線を有している。この単一の波長に
おいて、多くの使用可能な染料、細胞表面着色剤あるい
は着色剤の組合せが存在し、これらの染料等は励起可能
でかつ異った光の波長において放射物を生じし九がって
個々に検知可能である。
次に示す例は説明の目的の九めであり本発明の原理ある
いは特徴を限定するものではない。
例　　　１ ６つの異った免疫螢光着色剤を有する細胞サンプルが準
備された。異ったタイプの細胞、これら細胞の部分集合
およびこれら部分集合の下部構造はこれらと関連する異
っ交着色剤を有しているため、これら多数の螢光信号の
検知は分析すべき細胞の性質に関して重要な情報を提供
する。このテストにおける免疫螢光着色剤は次の通シで
ある。
すなわち、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩ
ＴＣ）、ピコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッドタン
デム、ピコシアニンタンデム（ＰＣ）。
アロ・ピコシアニンタンデム（ａｐｃ）ｂよびペリシニ
ン・クロロフィル・プロティン（ＰＣＰ）である。これ
らの螢光マーカーによって着色された細胞を含む細胞が
上述のものと同様のフローサイトメ）　ＩＪ装置を通過
させられ友。光源は、励起の目的の几めに４８８　ｎｍ
のエネルギ出力線を有するアルゴンイオン・レーザであ
った。レーザからの励起エネルギによって励起された６
つの異つ穴壁光放射を検知する九めに、６つの異つ危フ
ォトディテクタを装置に用いた。光学的エレメントおよ
びフィルタの組合せは個々の収集に対して螢光放射をス
ペクトル的に分離するように選定され次。次の特性をも
ったバイパスフィルタが各フォトディテクタに用いられ
た。すなわち、ＦＩＴＣの収集に対しては５２５ｎｍ、
ＰＥの収集に対しては５７５　ｎｍ、テキサスレッドの
収集に対しては６１０ｎｍ、ＰＣの収集に対しては６４
　Ｃ１ｎｍ。
蟲ＰＣの収集に対しては６６０ｎｍ、ＰＣＰの収集に対
しては６８０　ｎｍである。フローサイトメトリ装置は
ヒストグラムを表示するようにプログラムされ、このヒ
ストグラムにおいては各螢光着色剤に対して多くの事象
が波長の関数として示される。第２図は６つの螢光マー
カーの放射特性を示し、これらのマーカーは全て４８８
　ｎｍで励起され、ま九、全ての放射特性はこの多くの
パラメータを処理する能力を備えた装置によって同時に
検知された。第２図から、放射最大値の間には十分なス
ペクトル的間隔があり、したがって実質的にスペクトル
的重なシ合いが生ぜず、また異った螢光マーカーの容易
な同定が行えることが１判明しよう。
例　　２ 次の着色剤を用いて例１と同様にして細胞サンプルを準
備した。すなわち着色剤は、ＰＥ、テキサスレッド、Ｐ
Ｃ，−ＰＣｌおよびＰＣＰである。
ヘリウム・ネオンレーザを用いた５　４３　ｎｍ、ＹＡ
Ｇレーザを用いた５　３０　ｎｍ又は水銀アークランプ
を用いた５　４６　ｎｍにおける励起エネルギに当てる
と、これら全ての着色剤は励起され、実質的なスペクト
ル的重なり合いのない螢光放射が検知された。同様の結
果が同じ光源および同じ染料を用いて得られ、ここにお
いて光源からの励起エネルギ線は５２９および５５０　
ｎｍの間であった。
例　　　３ 次の５つの着色剤を用いて例１におけると同様の細胞サ
ンプルが準備され九。すなわち、ＰＥ。
ＰＥテキサスレッドタンデム、ＰＥ−ＰＣタンデム、Ｐ
Ｅ−−ＰＣタンデムおよびＰＣＰである。
ヘリウムネオン・レーザによる５　４３　ｎｍ、　ＹＡ
Ｇレーザによる５　３０　ｎｍ、　　又は水銀アークラ
ンプによる５　４６　ｎｍにおいて励起エネルギに当て
ると、全ての染料が励起されこれらの螢光放射がスペク
トル的重複なしにスペクトル的に検知され次。
例　　４ 例１と同様の細胞サンプルが、クーマリン（ＣＯＵ）、
Ｃ０Ｕ−ＰＫ、Ｃ０Ｕ−ＰＥ　　テキサスレッド、Ｃ０
Ｕ−ＰＥ−ＣＰＣ，Ｃ０Ｕ−ＰＥ−−ＰＣ。
およびＰＣＰの着色剤の組合せを用いて、準備された。
ヘリウム・カドミウム・レーザによる４　４２　ｎｍ　
　において光励起線に当てると、これら全ての着色剤が
励起され、これらの螢光放射がスペクトル的重複なしに
同時に検知される。
例　　５ 例４の細胞サンプルを次のＤＮＡ染料を最初の２つの着
色剤に代えて用い繰り返され友。すなわち、アミノーア
クチノミシンーＤおよびＬＤＳ染料である。このテスト
の結果は例４で得たものと同様であった。
このように１本発明は螢光反応を行う几めのエネルギ源
として単一の波長励起を用いて多色螢光分析を行うため
の方法および装置が提供される。
レーザ等の高強度単一光源により励起され友多くの螢光
信号の同時収集は分析すべき細胞又は粒子に関する情報
の収集を高め、特に免疫学、免疫螢光分析学、およびイ
メージマイクロスコービーに有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の実施例であるフローサイトメトリの光
学エレメントおよび光路を示す斜視図。 第２図は単一波長によって励起され九６つの異っ元値光
マーカーに対するスペクトルのグラフディスプレイであ
り螢光放射強度に対する波長Ｃナノメータ）を示してい
る。 １１：光　源、　　　　　１２：光ビーム１４：焦点レ
ンズ、　　　　１６：液体流１８：ノズル、　　　　　
　２４：軸 ２５：ビームスプリッタ ４０．４１，４２　　：フィルタ。 鎌　凌　　（ｎｍ）

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）多螢光分析を用いて細胞あるいはこれと同等の物
    の１またはそれ以上の特性を決定するための方法であっ
    て、 （ａ）各々異った発光スペクトルをもった少くとも３つ
    の螢光標識を有する細胞を液体流中にほぼ１時に１つづ
    つ流動させる段階と、 （ｂ）前記液体流中の細胞に入射光線をあてて単一の光
    の波長において全ての螢光標識を励起させこれによって
    細胞から異った螢光波長を発せしめる段階と、 （ｃ）同時に液体流中で流動する細胞に関連する異った
    螢光放射物を検知する段階と、 （ｄ）前記検知した螢光を用いて細胞の１またはそれ以
    上の特性を決定する段階と、から成ることを特徴とする
    方法。
  2. （２）細胞の前記螢光標識が免疫螢光分析法に適した細
    胞表面標識であることを特徴とする特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  3. （３）細胞に伴う螢光標識が少くとも４つあり、これら
    の中の少くとも１つが細胞の内部組織の螢光分析を行う
    染料であることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載
    の方法。
  4. （４）前記染料がＤＮＡダイであることを特徴とする特
    許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. （５）前記標識は励起された時にスペクトル的に分別す
    ることができるに十分な最大放射を示しこれによってス
    ペクトル重複なしに検知することを可能とするようにな
    されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の方法。
  6. （６）隣接する螢光標識の放射最大値間の螢光スペクト
    ルに沿ったスペクトル間隔が少くとも１５ｎｍであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方法。
  7. （７）前記光線がレーザによってもたらされこのレーザ
    が４８８ｎｍの励起光線の波長を生ずることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
  8. （８）前記螢光標識が、フルオレスセイン、フィコエリ
    トリン、テキサスレッド、フィコシアニン、アロ−フィ
    コシアニン、ペリジニン−クロロフィルプロティンある
    いはこれらの組み合せから成る染料の群から選択される
    ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。
  9. （９）前記群から選択された螢光標識が少くとも４つあ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法。
  10. （１０）前記群から選択された螢光標識が少くとも５つ
    あることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法
    。
  11. （１１）前記群から選択された螢光標識が少くとも６つ
    あることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法
    。
  12. （１２）多螢光分析を用いて粒子の１またはそれ以上の
    特性を決定するための方法であって、 （ａ）各々異った放射スペクトルを有しかつ同一の波長
    の光によって励起可能な少くとも３つの螢光標識を有す
    る粒子に入射光線をあて、この入射光線が前記標識の励
    起を生ぜしめ、これによって異った螢光波長が前記粒子
    から放射されるようにする段階と、 （ｂ）分析される粒子に伴う異った螢光放射を同時に検
    知する段階と、 （ｃ）前記検知した螢光を粒子の１またはそれ以上の特
    性に関連付ける段階と、を備えたことを特徴とする方法
    。
  13. （１３）液流中の細胞またはこれと同等なものの１つ又
    はそれ以上の免疫螢光分析的な特性を多螢光分析を用い
    て決定する方法であって、 （ａ）少くとも３つの免疫螢光分析に適した細胞表面螢
    光標識を有する細胞をほぼ１時に１つづつ液流中に流動
    させ、各標識には放射極値がスペクトル的に分別される
    異った放射スペクトルをもたせることによって実質的な
    スペクトル的な重なりが生じないようにする段階と、 （ｂ）前記液流中の細胞に単一波長の光線をあてて全て
    の螢光標識を励起しこれによって細胞から異った波長の
    螢光を放射させる段階と、 （ｃ）前記液流中で流動する細胞に伴う異った螢光放射
    を同時に検知する段階と、 （ｄ）前記検知した螢光を用いて細胞の１またはそれ以
    上の特性を決定する段階と、を備えたことを特徴とする
    方法。
  14. （１４）前記螢光標識が光の単一の波長で励起可能な細
    胞表面螢光標識の選択された組合せから選ばれることを
    特徴とする特許請求の範囲第１３項に記載の方法。
  15. （１５）液流中を流動する細胞又はこれと同等なものの
    １またはそれ以上の特性を多螢光分析を用いて決定する
    ための装置であって次の（ａ）〜（ｄ）の構成要素を備
    えたことを特徴とする装置： （ａ）流動手段；この手段は液流中に細胞を１時にほぼ
    １つづつ流動させる。 （ｂ）光線導入手段；この手段は光の単一波長によって
    前記細胞上の複数の螢光標識を励起させるために前記液
    流中の細胞に光線をあてる。 （ｃ）少くとも３つの螢光検知手段；この手段は液流中
    を流動する細胞によって放射される螢光を検知するため
    のものであり、少くとも３つのスペクトル的波長の螢光
    放射物を同時に集めることのできる光フィルタ手段の選
    定された組合せを有している。 （ｄ）決定手段；この手段は前記検知された螢光を用い
    て細胞の１またはそれ以上の特性を決定する。
  16. （１６）前記光線導入手段がレーザを備えていることを
    特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の装置。
  17. （１７）前記選択されたフィルタ手段の組合せがスペク
    トル的に少くとも互に１５ｎｍ離れた波長において光線
    を通過させるフィルタの群から選ばれたフィルタを備え
    たことを特徴とする特許請求の範囲第１６項記載の装置
    。
  18. （１８）前記レーザが４８０ｎｍの波長の励起光線をも
    たらすことを特徴とする特許請求の範囲第１６項記載の
    装置。
  19. （１９）前記選択された光フィルタ手段の組合せが５２
    ５ｎｍ、５７５ｎｍ、６１０ｎｍ、６３０ｎｍ、６６０
    ｎｍおよび６８０ｎｍの波長の光線を通過させてそれぞ
    れの検知手段に集めるようにするフィルタの群から選ば
    れたフィルタを備えたことを特徴とする特許請求の範囲
    第１８項記載の装置。
  20. （２０）多螢光分析を用いて粒子の１またはそれ以上の
    特性を決定するための装置であって次の（ａ）〜（ｃ）
    の構成要素を備えたことを特徴とする装置： （ａ）光線導入手段；この手段は単一の波長の光線によ
    って粒子上の複数の螢光標識を励起するために分析すべ
    き粒子に光線をあてる。 （ｂ）少くとも３つの螢光検知手段；この手段は粒子に
    よって放射された螢光を検知するためのものであって、
    少くとも３つのスペクトル的に分別された波長の螢光放
    射物を同時に集める選択された光フィルタ手段の組合せ
    を備えている。 （ｃ）関連付ける手段；この手段は前記検知された螢光
    を粒子の１または２以上の特性と関連付ける。
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