JPS6312277A - 生組換えワクチンとしての帯状疱疹ウイルス - Google Patents
生組換えワクチンとしての帯状疱疹ウイルスInfo
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- JPS6312277A JPS6312277A JP62151539A JP15153987A JPS6312277A JP S6312277 A JPS6312277 A JP S6312277A JP 62151539 A JP62151539 A JP 62151539A JP 15153987 A JP15153987 A JP 15153987A JP S6312277 A JPS6312277 A JP S6312277A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
水痘は、ヘルペスウィルス属の一員である帯状庖疹ウィ
ルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ
ＶＺＶ）により起きる。該疾患は以前にｖｚｖに対する
免疫のない人に生しる。ＶＺＶ−特異抗体は疾患にかか
りた１−ぐ後に認められ、回復期に減衰するが、長年の
量検出可能であり続は該疾患に対する免疫と関連する。
ルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ
ＶＺＶ）により起きる。該疾患は以前にｖｚｖに対する
免疫のない人に生しる。ＶＺＶ−特異抗体は疾患にかか
りた１−ぐ後に認められ、回復期に減衰するが、長年の
量検出可能であり続は該疾患に対する免疫と関連する。
水痘は伝染性が高く：２０オ以而に人【］の９０％以上
がＶＺＶに曝される。大部分または全ての場合、ＶＺＶ
はおそらくを髄神経後根神経節細胞中に潜伏するように
なる。この潜伏状態から、ｖ′ｌｖはおそらく細胞性免
疫が弱くなった結果として、特異抗体の存在下において
も再活性化することができ帯状庖疹を生じる。
がＶＺＶに曝される。大部分または全ての場合、ＶＺＶ
はおそらくを髄神経後根神経節細胞中に潜伏するように
なる。この潜伏状態から、ｖ′ｌｖはおそらく細胞性免
疫が弱くなった結果として、特異抗体の存在下において
も再活性化することができ帯状庖疹を生じる。
この疾患は免疫抑制を受けたそして２０才以上の人にと
って重篤である。
って重篤である。
１９７４年にタカハシが、水痘の子供の水泡からｖｚｖ
のＯｋａ株の昨離を報告した。この株は次いで、モルモ
ット胚細胞およびヒト２倍体繊維芽細胞を経過させるこ
とにより弱められた。その弱められたＶＺＶ１０ｋａ変
株は数千の子供に臨床的に試験された。これはＶＺヴイ
リオンの表層と反応する高レベルの抗体を引き出すこと
が出来る。更にこの株は幼児および免疫能低下者におい
て水痘の予防に有効であることを示す。ＶＺＶのこの株
が、免疫能低下患者において安全に用い得る唯一の人手
可能なウィルス性ワクチンであることは注目すべきであ
り、従って、ＶＺＶがより広範な応用に向くようになっ
た。エプスタイン−パール ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓＥＢＶ）は感染性単核球症の病
原因子である。該ＥＬＩヴイリオンは３主要表層糖蛋白
を有する＝ｇｐ３５０ （３５０，０００ダルトン糖蛋
白）、ｇｐ２２０ 、およびｇｐ８５゜該ｇｐ３５０お
よびｇｐ２２０ポリペプチドは即−のウィルス遺伝子の
産物である。これら２糖蛋白は験管内においてＥＢＶ感
染性を中和することの出来る抗体の生産を誘起すること
が出来る。従って、該ｇｐ３５０遺伝子およびその産物
は、組換えＤＮＡ技術の利用により、ＥＢＶ−誘起疾患
に対するワクチンの調製に有効である。さらにＶＺＶ−
およびＥＢＶ−誘起疾患の両方、あるいはＶ７．Ｖ−誘
起疾患と他の疾患の両方にたいし人々を同時にワクチン
処理することが好ましいであろう。
のＯｋａ株の昨離を報告した。この株は次いで、モルモ
ット胚細胞およびヒト２倍体繊維芽細胞を経過させるこ
とにより弱められた。その弱められたＶＺＶ１０ｋａ変
株は数千の子供に臨床的に試験された。これはＶＺヴイ
リオンの表層と反応する高レベルの抗体を引き出すこと
が出来る。更にこの株は幼児および免疫能低下者におい
て水痘の予防に有効であることを示す。ＶＺＶのこの株
が、免疫能低下患者において安全に用い得る唯一の人手
可能なウィルス性ワクチンであることは注目すべきであ
り、従って、ＶＺＶがより広範な応用に向くようになっ
た。エプスタイン−パール ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓＥＢＶ）は感染性単核球症の病
原因子である。該ＥＬＩヴイリオンは３主要表層糖蛋白
を有する＝ｇｐ３５０ （３５０，０００ダルトン糖蛋
白）、ｇｐ２２０ 、およびｇｐ８５゜該ｇｐ３５０お
よびｇｐ２２０ポリペプチドは即−のウィルス遺伝子の
産物である。これら２糖蛋白は験管内においてＥＢＶ感
染性を中和することの出来る抗体の生産を誘起すること
が出来る。従って、該ｇｐ３５０遺伝子およびその産物
は、組換えＤＮＡ技術の利用により、ＥＢＶ−誘起疾患
に対するワクチンの調製に有効である。さらにＶＺＶ−
およびＥＢＶ−誘起疾患の両方、あるいはＶ７．Ｖ−誘
起疾患と他の疾患の両方にたいし人々を同時にワクチン
処理することが好ましいであろう。
Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕ
ｓ ＨＢＶ）は、年毎に数十万の生命を失わせる、肝硬
変および肝細胞癌を含む数種のヒト肝疾患の原因となる
感染性因子である。該１１８ヴイリオンは２群の構造蛋
白、コア蛋白および外皮または表層（”Ｓ”）蛋白から
なっている。ヴイリオンの主要表層蛋白、すなわちゾー
ン（Ｄａｎｅ）粒子であるのに加えて、′Ｓ”蛋白はオ
ーストラリア（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）抗原、または２２
ｎｍ粒子の唯一の構成物である。該”Ｓ”蛋白は血清型
により３８９−４００アミノ酸をコードしている大解放
読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ
０ＩＩＦ）の翻訳産物である。この０ＩＩＦは３ドメイ
ンに区画されており、その各々は生体内で翻訳開始部位
として機能し得るＡＴＧコドンで始まっている。これら
ドメインは遺伝子内の各々の５°−３゛の順にプレＳ−
１（１０８−１１９アミノ酸）、プレＳ−２（５５アミ
ノ酸）、モして５（２２６アミノ酸）と参照される。こ
のＯＲＦから由来する６蛋白産物は以下の組成を有する
： １） ｇｐ４２（４２，０００’ダルトン糖蛋白）＝
プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ （プレＳ−１、プレＳ
−２に隣接する、Ｓに隣接する、を意味する） ２） ｇｐ３６ （Ｐ ”蛋白）＝プレＳ−１／プレ
Ｓ−２／Ｓ３） ｇｐ３６＝プレＳ−２／Ｓ （２糖
付加部位）４） ｇｐ３：ｌ＝プレＳ−２／Ｓ （１
糖付加部位）５） ｇｐ２７＝ Ｓ （１糖付加部位
）６） ｐ２４−５（または８８表層抗原すなわちＨ
ＢｓＡｇ）ヒトの他では、ＨＢ ｓ ”、肝酵素の血清
レベル上昇その他のような定量可能な指標に反映される
ように）ＩＢＶ感染にたいし完全に感受性な種は、チン
パンジーのみである。チンパンジーが３投与量の精製Ｈ
ＢｓＡｇ粒子（ｐ２４を含む）でワクチン処理され、次
いで大投与量の感受性ＨＢＶを与えられた。偽ワクチン
処理ざわた動物は急性ＨＢ Ｖ感染の兆候を示したが、
ｌｌＢｓＡｇ−ワクチン処理された動物は感染の如何な
る兆候からも完全に保護された。従って、この実験系に
おいては、ｇｐ２７およびｐ２４ （Ｓ ドメインのみ
）からなるＨＢｓＡｇ粒子は保護免疫を誘導するのに十
分であった。これらの観察結果に励まされて、いくつか
の業者がＨＢ ｓ へｇ粒子からなるＨＢワクチンを生
産した。
ｓ ＨＢＶ）は、年毎に数十万の生命を失わせる、肝硬
変および肝細胞癌を含む数種のヒト肝疾患の原因となる
感染性因子である。該１１８ヴイリオンは２群の構造蛋
白、コア蛋白および外皮または表層（”Ｓ”）蛋白から
なっている。ヴイリオンの主要表層蛋白、すなわちゾー
ン（Ｄａｎｅ）粒子であるのに加えて、′Ｓ”蛋白はオ
ーストラリア（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）抗原、または２２
ｎｍ粒子の唯一の構成物である。該”Ｓ”蛋白は血清型
により３８９−４００アミノ酸をコードしている大解放
読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ
０ＩＩＦ）の翻訳産物である。この０ＩＩＦは３ドメイ
ンに区画されており、その各々は生体内で翻訳開始部位
として機能し得るＡＴＧコドンで始まっている。これら
ドメインは遺伝子内の各々の５°−３゛の順にプレＳ−
１（１０８−１１９アミノ酸）、プレＳ−２（５５アミ
ノ酸）、モして５（２２６アミノ酸）と参照される。こ
のＯＲＦから由来する６蛋白産物は以下の組成を有する
： １） ｇｐ４２（４２，０００’ダルトン糖蛋白）＝
プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ （プレＳ−１、プレＳ
−２に隣接する、Ｓに隣接する、を意味する） ２） ｇｐ３６ （Ｐ ”蛋白）＝プレＳ−１／プレ
Ｓ−２／Ｓ３） ｇｐ３６＝プレＳ−２／Ｓ （２糖
付加部位）４） ｇｐ３：ｌ＝プレＳ−２／Ｓ （１
糖付加部位）５） ｇｐ２７＝ Ｓ （１糖付加部位
）６） ｐ２４−５（または８８表層抗原すなわちＨ
ＢｓＡｇ）ヒトの他では、ＨＢ ｓ ”、肝酵素の血清
レベル上昇その他のような定量可能な指標に反映される
ように）ＩＢＶ感染にたいし完全に感受性な種は、チン
パンジーのみである。チンパンジーが３投与量の精製Ｈ
ＢｓＡｇ粒子（ｐ２４を含む）でワクチン処理され、次
いで大投与量の感受性ＨＢＶを与えられた。偽ワクチン
処理ざわた動物は急性ＨＢ Ｖ感染の兆候を示したが、
ｌｌＢｓＡｇ−ワクチン処理された動物は感染の如何な
る兆候からも完全に保護された。従って、この実験系に
おいては、ｇｐ２７およびｐ２４ （Ｓ ドメインのみ
）からなるＨＢｓＡｇ粒子は保護免疫を誘導するのに十
分であった。これらの観察結果に励まされて、いくつか
の業者がＨＢ ｓ へｇ粒子からなるＨＢワクチンを生
産した。
最近のデータは、ＨＢＶ感染に対する免疫においてプレ
Ｓ−１およびプレＳ−２ドメインが重要な役割を演じて
いるであろうことを示唆している。プレＳ−１に対する
抗体（プレＳ−］のアミノ酸残基１０−１２からなるペ
プチドによる免疫処理により誘導される）ならびにプレ
Ｓ−２に対する抗体（プレＳ−２のアミノ酸残基１−２
６からなるペプチドによる免疫処理により誘導される）
の両方が試験管内で１１８ ’Ｊのヒト肝癌細胞への結
合を阻止することが出来る：抗−ＨＢ５ （プレＳ−
１またはプレＳ−２を欠＜ＨＢｓＡｇでワクチン処理さ
れた患者の血清）はこの阻止現象をもたらすことか出来
ない。もしこの試験管内の現象が生体内の感染を模して
いるのなら、プレーＳ（ずなわちプレＳ−１およびプレ
Ｓ−２が全体として共に連結した）ドメインが、ＨＢＶ
の肝細胞受容器への結合部位を代表しているであろう、
そして抗−プレーＳはＨＢＶの付着および感染の開始を
阻止するであろう。加えて、抗−プレーＳのタイターが
、急性＋１ Ｂ Ｖ感染からの回復期に一ヒ昇すること
が見出されＣおり、これら抗体の回復期における役割を
示している。最後に、チンパンジーにおいて＋０８アミ
ノ酸プレーＳポリペプチドでワクチン処理すると、ＩＩ
ＢＶ投与に対しある程度の防御効果を与えることが出来
た。まとめると、これら実験的観察結果はプレーＳドメ
インが現在のＨＢワクチンにおける有用な追加例である
ことを示唆しており、従って、プレＳ−１／プレＳ−２
／Ｓをコードする大０１１Ｆを発現するのが好ましいこ
とを明らかにした。
Ｓ−１およびプレＳ−２ドメインが重要な役割を演じて
いるであろうことを示唆している。プレＳ−１に対する
抗体（プレＳ−］のアミノ酸残基１０−１２からなるペ
プチドによる免疫処理により誘導される）ならびにプレ
Ｓ−２に対する抗体（プレＳ−２のアミノ酸残基１−２
６からなるペプチドによる免疫処理により誘導される）
の両方が試験管内で１１８ ’Ｊのヒト肝癌細胞への結
合を阻止することが出来る：抗−ＨＢ５ （プレＳ−
１またはプレＳ−２を欠＜ＨＢｓＡｇでワクチン処理さ
れた患者の血清）はこの阻止現象をもたらすことか出来
ない。もしこの試験管内の現象が生体内の感染を模して
いるのなら、プレーＳ（ずなわちプレＳ−１およびプレ
Ｓ−２が全体として共に連結した）ドメインが、ＨＢＶ
の肝細胞受容器への結合部位を代表しているであろう、
そして抗−プレーＳはＨＢＶの付着および感染の開始を
阻止するであろう。加えて、抗−プレーＳのタイターが
、急性＋１ Ｂ Ｖ感染からの回復期に一ヒ昇すること
が見出されＣおり、これら抗体の回復期における役割を
示している。最後に、チンパンジーにおいて＋０８アミ
ノ酸プレーＳポリペプチドでワクチン処理すると、ＩＩ
ＢＶ投与に対しある程度の防御効果を与えることが出来
た。まとめると、これら実験的観察結果はプレーＳドメ
インが現在のＨＢワクチンにおける有用な追加例である
ことを示唆しており、従って、プレＳ−１／プレＳ−２
／Ｓをコードする大０１１Ｆを発現するのが好ましいこ
とを明らかにした。
天然に生じる■Ｚｖゲノムを異種、すなわち非ＶＺＶ−
由来の、ＤＮＡを運ぶ組換えウィルスを生産するように
変換することが本発明の目的である。他のヒト病原体の
免疫原性ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを利用す
ることが更なる目的である。しかしもう一つの目的は、
そのような異種ＤＮＡをＶＺＶゲノムの一部として発現
させるための方法を与えることである。さらにもう一つ
の目的は、新たに導入されたＤＮＡによりコードされた
異種ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するために、
ヒトをワクチン処理する方法を与えることである。本発
明のこれらおよび他の目的は以下の説明から明らかにな
ろう。
由来の、ＤＮＡを運ぶ組換えウィルスを生産するように
変換することが本発明の目的である。他のヒト病原体の
免疫原性ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを利用す
ることが更なる目的である。しかしもう一つの目的は、
そのような異種ＤＮＡをＶＺＶゲノムの一部として発現
させるための方法を与えることである。さらにもう一つ
の目的は、新たに導入されたＤＮＡによりコードされた
異種ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するために、
ヒトをワクチン処理する方法を与えることである。本発
明のこれらおよび他の目的は以下の説明から明らかにな
ろう。
ＶＺＶゲノムが、他のヒト病原体の免疫原性ポリペプチ
ドをコードする異種ＤＮＡにより改変された。この異種
ポリペプチドは、その組換えウィルスにより感染した細
胞中で発現される。該ｖｚ■ワクチン株は、臨床試験に
おいて、小児の水痘を防ぐことが出来るので、異種遺伝
物質を運ぶ組換えＶＺＶは水痘と同様に異種病原体に対
するワクチンとして有用である。
ドをコードする異種ＤＮＡにより改変された。この異種
ポリペプチドは、その組換えウィルスにより感染した細
胞中で発現される。該ｖｚ■ワクチン株は、臨床試験に
おいて、小児の水痘を防ぐことが出来るので、異種遺伝
物質を運ぶ組換えＶＺＶは水痘と同様に異種病原体に対
するワクチンとして有用である。
本発明は、水痘ならびに他のヒト病原体による疾患の両
方に対するワクチンとして機能し得る組換えｖｚｖの生
産に向けられている。健康小児の臨床試験における安全
性ならびに有効性に加えて、該ＶＺＶワクチン株は、免
疫能低下者（ｉｍｒｎｕｎｅ−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ
）における臨床試験でも安全かつ有効であった。その様
な固体において他の生きた減弱ウィルスを用いるのは好
ましくない、従って本発明において記載されたＶＺＶお
よびその組換え誘導体の利用に有意な有利さを与えるこ
とになる。
方に対するワクチンとして機能し得る組換えｖｚｖの生
産に向けられている。健康小児の臨床試験における安全
性ならびに有効性に加えて、該ＶＺＶワクチン株は、免
疫能低下者（ｉｍｒｎｕｎｅ−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ
）における臨床試験でも安全かつ有効であった。その様
な固体において他の生きた減弱ウィルスを用いるのは好
ましくない、従って本発明において記載されたＶＺＶお
よびその組換え誘導体の利用に有意な有利さを与えるこ
とになる。
３つの主要な理由により、異種免疫原性ポリペプチドを
組換え由来サブユニットワクチンとしてよりも、生絹換
えＶＺＶの形で与える方が有利である。最初に、免疫系
に複製する構造として与えられたポリペプチドは、非−
複製すなわちサブユニット構造として与えられるより、
しばしばより長期間継続する免疫を誘導することが出来
る。第２に、複製する構造としての提示は、サブユニッ
ト構造としての提示よりより存効に細胞介在免疫を誘導
することが出来る。最後に、該異種ポリペプチドがヒト
細胞で発現される限りにおいては、該ポリペプチドは、
そのポリペプチドが異種病原体による自然のヒトへの感
染において発現するときに起きるのを最も密接に模した
翻訳後修飾を受ける。それに対して、原核又は真核細胞
における組換え由来産物として発現された異種ポリペプ
チドに対する翻訳後修飾は、該ポリペプチドが自然のヒ
ト感染の間に発現される際に起きる修飾とはしばしば異
なる。さらに、異種ポリペプチドを組換えＶＺＶの一部
として発現させることは、生滅弱異種病原体の利用に伴
う如何なる潜在的な危険性をも回避する。このことは、
その様な減弱異種病原体が、より感染性の強いそして、
それ故に、病原性型に、復帰する理論的な可能性を有す
る攻に、有利である。
組換え由来サブユニットワクチンとしてよりも、生絹換
えＶＺＶの形で与える方が有利である。最初に、免疫系
に複製する構造として与えられたポリペプチドは、非−
複製すなわちサブユニット構造として与えられるより、
しばしばより長期間継続する免疫を誘導することが出来
る。第２に、複製する構造としての提示は、サブユニッ
ト構造としての提示よりより存効に細胞介在免疫を誘導
することが出来る。最後に、該異種ポリペプチドがヒト
細胞で発現される限りにおいては、該ポリペプチドは、
そのポリペプチドが異種病原体による自然のヒトへの感
染において発現するときに起きるのを最も密接に模した
翻訳後修飾を受ける。それに対して、原核又は真核細胞
における組換え由来産物として発現された異種ポリペプ
チドに対する翻訳後修飾は、該ポリペプチドが自然のヒ
ト感染の間に発現される際に起きる修飾とはしばしば異
なる。さらに、異種ポリペプチドを組換えＶＺＶの一部
として発現させることは、生滅弱異種病原体の利用に伴
う如何なる潜在的な危険性をも回避する。このことは、
その様な減弱異種病原体が、より感染性の強いそして、
それ故に、病原性型に、復帰する理論的な可能性を有す
る攻に、有利である。
生絹換え■ｚｖゲノムは以下のように得られる：
天然に産するＶＺＶプロモーター配列を、 ＥＢＶｇｐ
３５０遺伝子コード配列のすぐ５“側におく ＤＮＡク
ローンは、以下のように創製される。完全ＶＺＶ ｇｐ
ｔ遺伝子（全５゛隣接配列を含む）が山開で消化され平
滑末端化され、ＶＺＶ ｇｉｆｔプロモーターならびに
ｇｐｌ第一次転写産物の最初の３４アミノ酸を含むｏ、
９ ｋｂｐ断片を与える。
３５０遺伝子コード配列のすぐ５“側におく ＤＮＡク
ローンは、以下のように創製される。完全ＶＺＶ ｇｐ
ｔ遺伝子（全５゛隣接配列を含む）が山開で消化され平
滑末端化され、ＶＺＶ ｇｉｆｔプロモーターならびに
ｇｐｌ第一次転写産物の最初の３４アミノ酸を含むｏ、
９ ｋｂｐ断片を与える。
３ｐ３５０ ｉ伝子を含むＥＢＶプラスミドが…旧およ
びＸｈｏｌｌで消化され、最初の２１アミノ酸を除き完
全なｇｐ３５０コード配列を含む４．３ｋｂｐ断片を与
えル、ｖｚｖｇｐ１ノアミノ酸３４−３６ナラびニＥＢ
Ｖｇｐ３５０のアミノ酸２１−２２をコードするオリゴ
ヌクレオチドが合成される。該ｏ、９ ｋｂｐ ＤＮＡ
がｐｌＨ：＋９中にクローンされ、…旧で消化され・該
４．３ ｋｂｐ断片と連結される。出来たベクター（ｐ
ＡＭ２）はｓＪＬ！ｌ！１．…旧および５ｆａＮｌ テ
消化され、得られた０、９および７．０ ｋｂｐ断片は
合成オリゴヌクレオチドと連結され、 ｐＡＭ３を与え
る。
びＸｈｏｌｌで消化され、最初の２１アミノ酸を除き完
全なｇｐ３５０コード配列を含む４．３ｋｂｐ断片を与
えル、ｖｚｖｇｐ１ノアミノ酸３４−３６ナラびニＥＢ
Ｖｇｐ３５０のアミノ酸２１−２２をコードするオリゴ
ヌクレオチドが合成される。該ｏ、９ ｋｂｐ ＤＮＡ
がｐｌＨ：＋９中にクローンされ、…旧で消化され・該
４．３ ｋｂｐ断片と連結される。出来たベクター（ｐ
ＡＭ２）はｓＪＬ！ｌ！１．…旧および５ｆａＮｌ テ
消化され、得られた０、９および７．０ ｋｂｐ断片は
合成オリゴヌクレオチドと連結され、 ｐＡＭ３を与え
る。
チミヂンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含むｖｚｖプラスミ
ド（ｐＰに−１）が伐りおよび論１で消化され、完全ｔ
ｋコード領域を含む１．５ ｋｂｐ断片を与え、それは
次いでｐＵｃ１３中にクローンされる。このｔｋ ＤＮ
Ａクローン（ｐＰに−２）は１但で消化され平滑末端化
される。あるいは、ｔｋ遺伝子を含むＶＺＶプラスミド
（ｐＰに−１）がＮ５ｉｌで消化され平滑末端化される
。ｐＡＭ３が畢１およびＳｍａｌで消化され、平滑末端
化され、ｐＰＫ−２の平滑末端化された鋤１部位または
ｐＰに−１の平滑末端化されたＮ５ｉｌ部位中にクロー
ンされる。こうしてＶＺＶ ｇｐｌプロモーターおよび
ＥＢＶ ｇｐ３５０コード配列に外接する非必須ＶＺＶ
ｔｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｔｋカセット）が得ら
れる。全長ｖｚ■ゲノム性ＤＮＡおよび上述のＬｋカセ
ットが、ヒト ２培体繊維芽細胞株ＭＲＣ−５細胞に共
トランスフェクトされる。このトランスフェクションか
らのプラークが、モノクローナル抗体によりＥＢＶ ｇ
ｐ３５０の存在について検索される。ＥＢＶ ｇｐ３５
０を発現する組換えＶＺＶが見出される；この組換え体
は無細肥状で継代され、細胞共存の縫代を繰り返して安
定である。ＥＢＶ ｇｐ３５０およびＶＺＶ ｔｋ Ｄ
ＮＡプローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーション分
析が、組換えＶＺＶの構造を更に保証する。
ド（ｐＰに−１）が伐りおよび論１で消化され、完全ｔ
ｋコード領域を含む１．５ ｋｂｐ断片を与え、それは
次いでｐＵｃ１３中にクローンされる。このｔｋ ＤＮ
Ａクローン（ｐＰに−２）は１但で消化され平滑末端化
される。あるいは、ｔｋ遺伝子を含むＶＺＶプラスミド
（ｐＰに−１）がＮ５ｉｌで消化され平滑末端化される
。ｐＡＭ３が畢１およびＳｍａｌで消化され、平滑末端
化され、ｐＰＫ−２の平滑末端化された鋤１部位または
ｐＰに−１の平滑末端化されたＮ５ｉｌ部位中にクロー
ンされる。こうしてＶＺＶ ｇｐｌプロモーターおよび
ＥＢＶ ｇｐ３５０コード配列に外接する非必須ＶＺＶ
ｔｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｔｋカセット）が得ら
れる。全長ｖｚ■ゲノム性ＤＮＡおよび上述のＬｋカセ
ットが、ヒト ２培体繊維芽細胞株ＭＲＣ−５細胞に共
トランスフェクトされる。このトランスフェクションか
らのプラークが、モノクローナル抗体によりＥＢＶ ｇ
ｐ３５０の存在について検索される。ＥＢＶ ｇｐ３５
０を発現する組換えＶＺＶが見出される；この組換え体
は無細肥状で継代され、細胞共存の縫代を繰り返して安
定である。ＥＢＶ ｇｐ３５０およびＶＺＶ ｔｋ Ｄ
ＮＡプローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーション分
析が、組換えＶＺＶの構造を更に保証する。
ゾーン粒子がプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ ＯＲＦの単
離のためのＨＢＶ核酸源として利用される。ＨＢヴイリ
オン中に元来存在するニックおよびギャップの入った形
から、ＨＢＶゲノムの共役結合閉環２本鎖ＤＮＡを生成
するために、内在性のポリメラーゼ反応が用いられる。
離のためのＨＢＶ核酸源として利用される。ＨＢヴイリ
オン中に元来存在するニックおよびギャップの入った形
から、ＨＢＶゲノムの共役結合閉環２本鎖ＤＮＡを生成
するために、内在性のポリメラーゼ反応が用いられる。
修復されたＤＮＡは単離され、ＥｃｏＲｌで完全消化さ
れる。Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）クローン化用ベクター
ｐＢｎ３２２４またＥｃｏＲｌで消化され、ＨＢＶ Ｄ
ＮＡと連結されＥ、コリを形質転換するのに用いられる
。組換えプラスミドが選択される、これらは環状に入れ
替わったＨＢＶゲノムを含んでおり、その中では鏝旧部
位が完全プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓコード領域を、０
．４キロ塩基対（ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｋｂ
ｐ）の５゛ドメインと０．８ ｋｂｐの３°ドメインと
に分けている。
れる。Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）クローン化用ベクター
ｐＢｎ３２２４またＥｃｏＲｌで消化され、ＨＢＶ Ｄ
ＮＡと連結されＥ、コリを形質転換するのに用いられる
。組換えプラスミドが選択される、これらは環状に入れ
替わったＨＢＶゲノムを含んでおり、その中では鏝旧部
位が完全プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓコード領域を、０
．４キロ塩基対（ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｋｂ
ｐ）の５゛ドメインと０．８ ｋｂｐの３°ドメインと
に分けている。
これら２ドメインは全遺伝子が偶然に再会合するように
サブクローンされる。３°ドメインに関しては、ｐＵｃ
Ｉ９が−Ｒ１および…旧で消化され、次いでコード領域
の最後の５ヌクレオチド、停止コドン、Ｈｉｎｄｌ１１
部位、および…旧末端からなる合成オリゴヌクレオチド
に連結される。０．８ ｋｂｐ ＥｃｏＲｌ−Ａｃｃｌ
断片からなるプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ遺伝子の３°
部分がこのベクター中にクローンされる。Ｉ）ＵＣ；１
８がＨｉｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲｌで消化され、Ｂａ
ｍ８１部位上流から末端ＡＴＧおよび１０ ｂｐの非翻
訳レーダー配列を経て山旧ＩＩ対応末端に至る、完全Ｏ
ＲＦを再構成する７２ ｂｐの合成オリゴヌクレオチド
と連結される。該５′ドメインの０．３ ｋｂｐ…旧−
膿旧断片が、次いでこのオリゴヌクレオチド一連結クロ
ーン化ベクター中に連結される。該５°ｐｕｃｔａおよ
び３°ｐＵ（：＋９クローンはＥ、コリ中での生育によ
り増幅され、該コード領域は単離されたプラスミドから
頭重１ｌ−ＥｃｏＲ１断片として消化される。該５°お
よび３°断片は連結され、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化され、
平滑末端化され、その平滑末端を有する完全ＯＲＦは前
もって擲旧で消化され平滑末端化されたｐｕｃｔｓ中に
クローン化される。
サブクローンされる。３°ドメインに関しては、ｐＵｃ
Ｉ９が−Ｒ１および…旧で消化され、次いでコード領域
の最後の５ヌクレオチド、停止コドン、Ｈｉｎｄｌ１１
部位、および…旧末端からなる合成オリゴヌクレオチド
に連結される。０．８ ｋｂｐ ＥｃｏＲｌ−Ａｃｃｌ
断片からなるプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ遺伝子の３°
部分がこのベクター中にクローンされる。Ｉ）ＵＣ；１
８がＨｉｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲｌで消化され、Ｂａ
ｍ８１部位上流から末端ＡＴＧおよび１０ ｂｐの非翻
訳レーダー配列を経て山旧ＩＩ対応末端に至る、完全Ｏ
ＲＦを再構成する７２ ｂｐの合成オリゴヌクレオチド
と連結される。該５′ドメインの０．３ ｋｂｐ…旧−
膿旧断片が、次いでこのオリゴヌクレオチド一連結クロ
ーン化ベクター中に連結される。該５°ｐｕｃｔａおよ
び３°ｐＵ（：＋９クローンはＥ、コリ中での生育によ
り増幅され、該コード領域は単離されたプラスミドから
頭重１ｌ−ＥｃｏＲ１断片として消化される。該５°お
よび３°断片は連結され、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化され、
平滑末端化され、その平滑末端を有する完全ＯＲＦは前
もって擲旧で消化され平滑末端化されたｐｕｃｔｓ中に
クローン化される。
完全ＶＺＶ ｇｐｌ遺伝子を含む該ＶＺＶプラスミドは
Ａｖａｌで消化され、その３．７ ｋｂｐ断片は調製用
アガロースゲル電気泳動により精製される。４種のオリ
ゴヌクレオチオが合成され、ハイブリダイズされ連結さ
れて５５塩基対（ｂａｓｅ−ｐａｉｒ ｂｐ）Ａｖａｌ
−Ｘｂａｌ リンカ−を形成する。このリンカ−は該３
．７ ｋｂｐ断片に連結され、その混合物は１靜Ｖで消
化され、その０．９ ｋｂｐ断片（ｇｐｌプロモーター
を含む）が調製用アガロースゲル電気泳動により単離さ
れ、平滑末端化され、そしてプレ５−１７プレＳ−２／
Ｓを含むｐｕｃｔａベクターのＳｍａ １部位中にクロ
ーン化される。このヘクター（ｖｚＶ ｇｐｌプロモー
ターおよびプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓコード領域を含
む）は５ａｃｌおよび川１で消化され、平滑末端化され
、そしてｐｐｇ−ｔの平滑末端化されたＮ５ｉ１部位中
にクローンされる。
Ａｖａｌで消化され、その３．７ ｋｂｐ断片は調製用
アガロースゲル電気泳動により精製される。４種のオリ
ゴヌクレオチオが合成され、ハイブリダイズされ連結さ
れて５５塩基対（ｂａｓｅ−ｐａｉｒ ｂｐ）Ａｖａｌ
−Ｘｂａｌ リンカ−を形成する。このリンカ−は該３
．７ ｋｂｐ断片に連結され、その混合物は１靜Ｖで消
化され、その０．９ ｋｂｐ断片（ｇｐｌプロモーター
を含む）が調製用アガロースゲル電気泳動により単離さ
れ、平滑末端化され、そしてプレ５−１７プレＳ−２／
Ｓを含むｐｕｃｔａベクターのＳｍａ １部位中にクロ
ーン化される。このヘクター（ｖｚＶ ｇｐｌプロモー
ターおよびプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓコード領域を含
む）は５ａｃｌおよび川１で消化され、平滑末端化され
、そしてｐｐｇ−ｔの平滑末端化されたＮ５ｉ１部位中
にクローンされる。
これによりＶＺＶ ｇｐｌプロモーターおよびプレＳ−
１／プレＳ−２／Ｓコード配列に外接する非必須ＶＺＶ
ｔｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｔｋカセット）が得ら
れる。
１／プレＳ−２／Ｓコード配列に外接する非必須ＶＺＶ
ｔｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｔｋカセット）が得ら
れる。
全長ｖｚｖゲノム性ＤＮＡおよび上述のｔｋカセットが
、ＭＲＧ−５細膓に共トランスフェクトされる。このト
ランスフェクションからのプラークは、モノクローナル
抗体により０１１５″Ｓ”蛋白の存在に関して検索され
る。ＨＢＶ蛋白を発現する組換えＶＺＶか見出される；
この組換え体は無細膓状態で継代されることが出来、細
胞共存下での継代を繰り返しても安定である。適当なり
ＮＡプローブを用いてのＤＮＡハイブリダイゼーション
分析により、組換え体ＶＺＶの構造が更に確認される。
、ＭＲＧ−５細膓に共トランスフェクトされる。このト
ランスフェクションからのプラークは、モノクローナル
抗体により０１１５″Ｓ”蛋白の存在に関して検索され
る。ＨＢＶ蛋白を発現する組換えＶＺＶか見出される；
この組換え体は無細膓状態で継代されることが出来、細
胞共存下での継代を繰り返しても安定である。適当なり
ＮＡプローブを用いてのＤＮＡハイブリダイゼーション
分析により、組換え体ＶＺＶの構造が更に確認される。
該ＥＢＶ ｇｐ：１１５０遺伝子はＶＺＶゲノム中に挿
入され得る非−ＶＺＶ ＤＮＡ配列の一つの例に過ぎな
い。しばしば、常にではないが、もっとも有用なその様
な配列は、ウィルスおよび細菌を含むヒト病原体の表層
の蛋白をコードするものであろう。該ＥＢＶ ｇｐ３５
０配列はｖｚｖゲノム中に組換えるために他のＤＮＡに
比して、それを際だたせるような固有の性質を持たない
。したがって、本分野における熟練者にとっては、ＥＢ
Ｖ ｇｐ３５０遺伝子を非−ＶＺＶ ＤＮＡとしてＶＺ
Ｖゲノム中に挿入する原理が、ＨＢＶ （７）ブＬ／Ｓ
−１／プＬ／Ｓ−２／Ｓ ＯＲＦを含むがそれに限定さ
れないどのような非−Ｖ ７．ＶＤＮＡにまでも及ぶこ
とは自明である。さらに、ＶＺＶのゲノムは非常に大き
いから、大きなサイズの非−ＶＺＶ ＤＮＡを乗せるこ
とも可能である。
入され得る非−ＶＺＶ ＤＮＡ配列の一つの例に過ぎな
い。しばしば、常にではないが、もっとも有用なその様
な配列は、ウィルスおよび細菌を含むヒト病原体の表層
の蛋白をコードするものであろう。該ＥＢＶ ｇｐ３５
０配列はｖｚｖゲノム中に組換えるために他のＤＮＡに
比して、それを際だたせるような固有の性質を持たない
。したがって、本分野における熟練者にとっては、ＥＢ
Ｖ ｇｐ３５０遺伝子を非−ＶＺＶ ＤＮＡとしてＶＺ
Ｖゲノム中に挿入する原理が、ＨＢＶ （７）ブＬ／Ｓ
−１／プＬ／Ｓ−２／Ｓ ＯＲＦを含むがそれに限定さ
れないどのような非−Ｖ ７．ＶＤＮＡにまでも及ぶこ
とは自明である。さらに、ＶＺＶのゲノムは非常に大き
いから、大きなサイズの非−ＶＺＶ ＤＮＡを乗せるこ
とも可能である。
非−Ｖ″ＺＶ ＤＮＡ配列が一つの完全遺伝子、或は一
つ以上の遺伝子を有すれば、異種遺伝子の発現が起きる
であろう、或は、もし一つ以上の遺伝子が加えられたら
、いくつかの外来遺伝子の発現が起きるだろう。このよ
うに、本分野の熟練者ニ）ニー ッテハ、 ＥＢＶ ｇ
ｐ３５０（７）遺伝子を非−ＶＺＶ ＤＮＡとしてＶＺ
Ｖゲノム中に挿入する原理は、一つ以上の遺伝子にまで
及ぶ。
つ以上の遺伝子を有すれば、異種遺伝子の発現が起きる
であろう、或は、もし一つ以上の遺伝子が加えられたら
、いくつかの外来遺伝子の発現が起きるだろう。このよ
うに、本分野の熟練者ニ）ニー ッテハ、 ＥＢＶ ｇ
ｐ３５０（７）遺伝子を非−ＶＺＶ ＤＮＡとしてＶＺ
Ｖゲノム中に挿入する原理は、一つ以上の遺伝子にまで
及ぶ。
Ｖ７．Ｖｇｐｌプロモーターは、ウィルス感染の過程に
おいて生理的に非常に活性である。コート配列はたとえ
異なる遺伝子からのプロモーターにより隣接されても発
現され得ることがよく知られているから、ＶＺＶゲノム
は非−ＶＺＶ Ｊ伝子の合成を指示するために有用なプ
ロモーターにより隣接されるたくさんの遺伝子を含む。
おいて生理的に非常に活性である。コート配列はたとえ
異なる遺伝子からのプロモーターにより隣接されても発
現され得ることがよく知られているから、ＶＺＶゲノム
は非−ＶＺＶ Ｊ伝子の合成を指示するために有用なプ
ロモーターにより隣接されるたくさんの遺伝子を含む。
さらに、外来遺伝子の発現を指示する、哨乳動物細胞か
ら由来する多くのプロモーターが記載されている、その
ようなプロモーターはメタロチオネイン、レトロウィル
スの長末端繰り返し。
ら由来する多くのプロモーターが記載されている、その
ようなプロモーターはメタロチオネイン、レトロウィル
スの長末端繰り返し。
（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、およ
び類人猿ウィルス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４
０）を含むがそれに限定するものではない。該プロモー
ターはその遺伝子転写における有用性により定められる
もので、その起源によるものではない。したがって、本
分野の熟練者に取っては、発現カセットにおけるプロモ
ーターの選択が、組換えＶＺＶにより感染された細胞内
での遺伝子転写を指示することか出来る如何なる真核、
原核またはウィルス性のプロモーターにまでも及ぶのは
自明である。
び類人猿ウィルス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４
０）を含むがそれに限定するものではない。該プロモー
ターはその遺伝子転写における有用性により定められる
もので、その起源によるものではない。したがって、本
分野の熟練者に取っては、発現カセットにおけるプロモ
ーターの選択が、組換えＶＺＶにより感染された細胞内
での遺伝子転写を指示することか出来る如何なる真核、
原核またはウィルス性のプロモーターにまでも及ぶのは
自明である。
ｔｋ遺伝子がＶ″ＺＶの複製および安定性に非必須であ
ることが示されてきた。このことは生育可能なｔｋ−Ｖ
ＺＶを選択が出来ることにより示された。したがって、
ｔ、にの非−ＶＺＶ ＤＮＡのための挿入点としての利
用は、特にそれがＶＺＶ複製において非必須であるとい
う性質を有する点で有用である。完全Ｖ２Ｖゲノム性Ｄ
ＮＡ配列が入手されて、他の非必須領域が明らかにされ
利用される。それ故、本分野の熟練者にとっては、非−
Ｖ：ＺＶ ＤＮＡのための挿入点の選択は、ＶＺＶゲノ
ムのいかなる非必須領域にまでも及ぶことは自明である
。
ることが示されてきた。このことは生育可能なｔｋ−Ｖ
ＺＶを選択が出来ることにより示された。したがって、
ｔ、にの非−ＶＺＶ ＤＮＡのための挿入点としての利
用は、特にそれがＶＺＶ複製において非必須であるとい
う性質を有する点で有用である。完全Ｖ２Ｖゲノム性Ｄ
ＮＡ配列が入手されて、他の非必須領域が明らかにされ
利用される。それ故、本分野の熟練者にとっては、非−
Ｖ：ＺＶ ＤＮＡのための挿入点の選択は、ＶＺＶゲノ
ムのいかなる非必須領域にまでも及ぶことは自明である
。
ワクチニア ウィルスは外来蛋白、例えばＢ型肝炎、の
発現のためのベクターとしての利用が１２案されている
。ワクチニア ウィルスの免疫能低下者における利用は
、しばしば重篤な病的状態および死亡率をもたらすこと
が認められている。他方、免疫能低下者に対するワクチ
ンとして、減弱した帯状庖疹ウィルスを外来蛋白発現に
利用することは有用である、それにより、水痘ならびに
、その原因となる因子が該ベクターにより発現される前
出の蛋白をコードするような疾患に対して免疫する。該
ワクチンは皮Ｆおよび筋肉内を含むがそれに限定されな
い種々の経路で投与されよう。外来蛋白のいくつかの例
は、ＥＢＶにより発現されるもの、Ｂ型肝炎、ヒト免疫
不全ウィルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉ
ｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ＨＩＶ）、呼吸器感染症ウィル
ス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ５ｙｎｃｙｔｉａｌ ｖ
ｉｒｕｓ） 、単純ヘルペスウィルス１型および２型、
およびサイトメガロウィルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖ
ｉｒｕｓ）である。本発明のベクターは咄乳動物種、例
えばコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａ
ｃｃｈｕｓ）およびヒトにおいて各受容体につき＋０２
−１０’ＰＦＵの投与量で保護抗体の形成を誘導する。
発現のためのベクターとしての利用が１２案されている
。ワクチニア ウィルスの免疫能低下者における利用は
、しばしば重篤な病的状態および死亡率をもたらすこと
が認められている。他方、免疫能低下者に対するワクチ
ンとして、減弱した帯状庖疹ウィルスを外来蛋白発現に
利用することは有用である、それにより、水痘ならびに
、その原因となる因子が該ベクターにより発現される前
出の蛋白をコードするような疾患に対して免疫する。該
ワクチンは皮Ｆおよび筋肉内を含むがそれに限定されな
い種々の経路で投与されよう。外来蛋白のいくつかの例
は、ＥＢＶにより発現されるもの、Ｂ型肝炎、ヒト免疫
不全ウィルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉ
ｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ＨＩＶ）、呼吸器感染症ウィル
ス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ５ｙｎｃｙｔｉａｌ ｖ
ｉｒｕｓ） 、単純ヘルペスウィルス１型および２型、
およびサイトメガロウィルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖ
ｉｒｕｓ）である。本発明のベクターは咄乳動物種、例
えばコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａ
ｃｃｈｕｓ）およびヒトにおいて各受容体につき＋０２
−１０’ＰＦＵの投与量で保護抗体の形成を誘導する。
以下の例は本発明を説明するがしかしそれだけに限定す
るものではない。以下の実施例中に指摘されている各参
考の開示はここに参考として取り入れられている。
るものではない。以下の実施例中に指摘されている各参
考の開示はここに参考として取り入れられている。
実ＪＬｆ外−」工
ＥＢｖ３５０をコードする発 カセットを含む己亦ＶＺ
Ｖ ｔ、ｋｉ 云 の伊築 ＶＺＶ ｇｐｔ糖蛋白はＶＺＶヴイリオン中に含まれる
主要糖蛋白の一つに相当する［エリス（Ｅｌｌｉｓ）ほ
か、ジャーナル オブ ヴイロロジ−（Ｊ。
Ｖ ｔ、ｋｉ 云 の伊築 ＶＺＶ ｇｐｔ糖蛋白はＶＺＶヴイリオン中に含まれる
主要糖蛋白の一つに相当する［エリス（Ｅｌｌｉｓ）ほ
か、ジャーナル オブ ヴイロロジ−（Ｊ。
Ｖｉｒｏｌｏｇ３／） 、第５３巻：８１頁（１９８５
）］ ； ＶＺＶ ｇｐｌプロモーターにより指示され
る転写速度は比較的高い。完全なｇｐｌ遺伝子に外接す
るＶＺＶの５ａｃｌＧ断片［ダヴィソン（Ｄａｖｉｓｏ
ｎ）ほか、ジャーナル オブ ジェネラル ヴイロロジ
ー（Ｊ。
）］ ； ＶＺＶ ｇｐｌプロモーターにより指示され
る転写速度は比較的高い。完全なｇｐｌ遺伝子に外接す
るＶＺＶの５ａｃｌＧ断片［ダヴィソン（Ｄａｖｉｓｏ
ｎ）ほか、ジャーナル オブ ジェネラル ヴイロロジ
ー（Ｊ。
にｃｎ、Ｖｉｒｏｌ、）第６４巻： １１８１頁（＋９
８：１年）コが、ｐ［１Ｒ３２２の…ＩＩ＋消化、ＤＮ
Ａポリメラーゼｌのクレノフ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片によ
る平滑末端化、塗１制限部位を含むオクタマー オリゴ
ヌクレオチド（コラポレイチブ リサーチ Ｇｏ、ｌ
１ａｂｏｒｅｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）との連結、お
よび５ａｃｌによる消化により造られた修ｆ！Ｉｌｉ
ｐＢＲ３２２（ｐＲＥＳ）中にクローンされた。できた
プラスミド（ｐＶｓＧＯ−１２）が当月により消化され
、ＶＺＶ ｇｌ）ｌの上流プロモーター配列および最初
の３４アミノ酸のためのコード領域を含む０．９ ｋｂ
ｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により特製され
た（第１図）。該０．９ｋｂｐ断片はＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼにより平滑末端化され、ｐＵｃ１９の１（ｉｎ
ｃ１１部位中に部位−ンされた［ヤニシューペラン（Ｙ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒａｎ）ほか、ジー：、ｌ （Ｇ
ｅｎｅ）第３３巻：１０３頁（１９ａ５）］ 、 ＥＢ
Ｖ ｇｐ３５０およびｇｐ２２０のための構造遺伝子は
同一であり、全体がプラスミドＢ６８゛の…旧−Ｌゲノ
ム性ＤＮＡ断片中に含まれている［ハメル（Ｈｕｍｍｅ
ｌ）ほか、ジャーナル オブ ヴイロロジー 第４９９
： ４１３頁（１９８４年）］。…ＨＩＬを含む該８
６８°プラスミドが…旧により消化され、５．０ｋｂｐ
…旧−し断片が調製用アガロースゲル電気泳動により精
製された。この断片はＸｈｏｌｌにより消化され、ｇｐ
３５０のコード領域の最初の６３ｂｐを除くが転写終結
配列を含む全構造遺伝子を含む４．３ ｋｂｐ断片が、
調製用アガロースゲル電気泳動により精製された（第１
図Ｂ）。ｐＡＭｌが鉋Ｈにより消化され、該４．３ ｋ
ｂｐ断片に連結された。出来たプラスミド（ｐＡＭ２、
第１図Ｃ）は鍍ｌおよび…旧により消化され、０．９
ｋｂｐおよび７．０ ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲ
ル電気泳動により精製されたく第２図Ａ）。該０．９ｋ
ｂｐ断片は山開により消化され、もうひとつの０．９ｋ
ｂｐ断片を生じそれは調製用アガロースゲル電気泳動に
より単離された。
８：１年）コが、ｐ［１Ｒ３２２の…ＩＩ＋消化、ＤＮ
Ａポリメラーゼｌのクレノフ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片によ
る平滑末端化、塗１制限部位を含むオクタマー オリゴ
ヌクレオチド（コラポレイチブ リサーチ Ｇｏ、ｌ
１ａｂｏｒｅｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）との連結、お
よび５ａｃｌによる消化により造られた修ｆ！Ｉｌｉ
ｐＢＲ３２２（ｐＲＥＳ）中にクローンされた。できた
プラスミド（ｐＶｓＧＯ−１２）が当月により消化され
、ＶＺＶ ｇｌ）ｌの上流プロモーター配列および最初
の３４アミノ酸のためのコード領域を含む０．９ ｋｂ
ｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により特製され
た（第１図）。該０．９ｋｂｐ断片はＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼにより平滑末端化され、ｐＵｃ１９の１（ｉｎ
ｃ１１部位中に部位−ンされた［ヤニシューペラン（Ｙ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒａｎ）ほか、ジー：、ｌ （Ｇ
ｅｎｅ）第３３巻：１０３頁（１９ａ５）］ 、 ＥＢ
Ｖ ｇｐ３５０およびｇｐ２２０のための構造遺伝子は
同一であり、全体がプラスミドＢ６８゛の…旧−Ｌゲノ
ム性ＤＮＡ断片中に含まれている［ハメル（Ｈｕｍｍｅ
ｌ）ほか、ジャーナル オブ ヴイロロジー 第４９９
： ４１３頁（１９８４年）］。…ＨＩＬを含む該８
６８°プラスミドが…旧により消化され、５．０ｋｂｐ
…旧−し断片が調製用アガロースゲル電気泳動により精
製された。この断片はＸｈｏｌｌにより消化され、ｇｐ
３５０のコード領域の最初の６３ｂｐを除くが転写終結
配列を含む全構造遺伝子を含む４．３ ｋｂｐ断片が、
調製用アガロースゲル電気泳動により精製された（第１
図Ｂ）。ｐＡＭｌが鉋Ｈにより消化され、該４．３ ｋ
ｂｐ断片に連結された。出来たプラスミド（ｐＡＭ２、
第１図Ｃ）は鍍ｌおよび…旧により消化され、０．９
ｋｂｐおよび７．０ ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲ
ル電気泳動により精製されたく第２図Ａ）。該０．９ｋ
ｂｐ断片は山開により消化され、もうひとつの０．９ｋ
ｂｐ断片を生じそれは調製用アガロースゲル電気泳動に
より単離された。
以下の配列を含むオリゴヌクレオチドが合成されたく第
２図Ｂ）： ５ ’ −ＴＧＣＧＡＴＡ（：ＧＡＴＧ八ＡＴへＴＧへ
ＴＡＣＴＴＣＴＡＧ−５゜ このリンカ−は小開および…旧５°突出部を含ｔ７；）
、 ＥＢＶ ｇｐ３５０（７） ７ ミ／酸２１−２
２ （７）続イｊ：ＶＺＶｇｐｌ遺伝子のアミノ酸：］
］４−：１のためのコード配列に相当する。該リンカ−
１該０．９ ｋｂｐ断片、および該７．Ｏｋｂｐ断片が
共に連結された。出来たプラスミド（ｐＡＭ３ 、第２
図Ｃ）は■ｌおよびＳ＋＋＋ａ ｌで消化され、３．７
ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により精
製されその後Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端
化された（第３図Ａ）。完全ｔｋ遺伝子に外接するＶＺ
Ｖの５ａｃｌ Ｈ断片［デビソン（Ｄａｖ １ｓｏｎ）
ほか、ジャーナル オブ ジェネラル ヴイロロジー
第６４巻： １１８１頁（１９８３年）］がｐＲＥＳ中
にクローンされた。出来たプラスミド（ｐＰＫ−１）は
Ａｃｃｌおよびｎｌで消化され、ｔｋの全コード領域を
含む１．５ ｋｂｐの断片を与えた（第３図Ｂ）。この
断片は、調製用アガロースゲル電気泳動により精製され
、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化され、ｐ
ｔＪ（：１３のＳｍａ １部位中にクローンされた［フ
ァルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ、）、１９
８４カタログ＠ ２７−４９５４−０１］。出来たプラ
スミド（ｐＰＫ−２、第３図Ｃ）は、ｔｋコード配列内
て ２回消化する１加で消化され、Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼにより平滑末端化され、該３．７ ｋｂｐ断片と
連結された。出来たプラスミド（ｐＰＫ−３、第３図Ｄ
）は、ＶＺＶ ｔ、に遺伝子内ニＶＺＶ ｇｐｌ／ＥＢ
Ｖ ｇｐ３５０発現カセットを含む。ｐＰＫ−３は、実
施例３で記載されるように、ＥＢＶ ｇＰ３５０を発現
する組換えＶＺＶを生成するのに用いられ、以下の顕著
な特定を有する： ＢｖｚｖＤＮＡと組換えプラスミド
間の相同組換えを生成するためのＶＺＶ ｔｋ隣接配列
。２）ウィルス複製の間の、ＥＢＶ ｇｐ３５０の高レ
ベルでの発現を指示すルＶＺＶｇｐｌプロモーター。３
）ｇｐ３５０ （７）粗面小膓体への挿入および感染細
胞のプラズマ膜上での発現のためのＶＺＶ ｇｐｌ リ
ーダー配列。４）ＥＢＶ ｇｌ）３５０蛋白発現のため
のｇｐ３５０コード領域。５）ｇｐ３５０膜アンカー、
翻訳終結およびポリへ−付加配列。
２図Ｂ）： ５ ’ −ＴＧＣＧＡＴＡ（：ＧＡＴＧ八ＡＴへＴＧへ
ＴＡＣＴＴＣＴＡＧ−５゜ このリンカ−は小開および…旧５°突出部を含ｔ７；）
、 ＥＢＶ ｇｐ３５０（７） ７ ミ／酸２１−２
２ （７）続イｊ：ＶＺＶｇｐｌ遺伝子のアミノ酸：］
］４−：１のためのコード配列に相当する。該リンカ−
１該０．９ ｋｂｐ断片、および該７．Ｏｋｂｐ断片が
共に連結された。出来たプラスミド（ｐＡＭ３ 、第２
図Ｃ）は■ｌおよびＳ＋＋＋ａ ｌで消化され、３．７
ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により精
製されその後Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端
化された（第３図Ａ）。完全ｔｋ遺伝子に外接するＶＺ
Ｖの５ａｃｌ Ｈ断片［デビソン（Ｄａｖ １ｓｏｎ）
ほか、ジャーナル オブ ジェネラル ヴイロロジー
第６４巻： １１８１頁（１９８３年）］がｐＲＥＳ中
にクローンされた。出来たプラスミド（ｐＰＫ−１）は
Ａｃｃｌおよびｎｌで消化され、ｔｋの全コード領域を
含む１．５ ｋｂｐの断片を与えた（第３図Ｂ）。この
断片は、調製用アガロースゲル電気泳動により精製され
、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化され、ｐ
ｔＪ（：１３のＳｍａ １部位中にクローンされた［フ
ァルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ、）、１９
８４カタログ＠ ２７−４９５４−０１］。出来たプラ
スミド（ｐＰＫ−２、第３図Ｃ）は、ｔｋコード配列内
て ２回消化する１加で消化され、Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼにより平滑末端化され、該３．７ ｋｂｐ断片と
連結された。出来たプラスミド（ｐＰＫ−３、第３図Ｄ
）は、ＶＺＶ ｔ、に遺伝子内ニＶＺＶ ｇｐｌ／ＥＢ
Ｖ ｇｐ３５０発現カセットを含む。ｐＰＫ−３は、実
施例３で記載されるように、ＥＢＶ ｇＰ３５０を発現
する組換えＶＺＶを生成するのに用いられ、以下の顕著
な特定を有する： ＢｖｚｖＤＮＡと組換えプラスミド
間の相同組換えを生成するためのＶＺＶ ｔｋ隣接配列
。２）ウィルス複製の間の、ＥＢＶ ｇｐ３５０の高レ
ベルでの発現を指示すルＶＺＶｇｐｌプロモーター。３
）ｇｐ３５０ （７）粗面小膓体への挿入および感染細
胞のプラズマ膜上での発現のためのＶＺＶ ｇｐｌ リ
ーダー配列。４）ＥＢＶ ｇｌ）３５０蛋白発現のため
のｇｐ３５０コード領域。５）ｇｐ３５０膜アンカー、
翻訳終結およびポリへ−付加配列。
ｐＡＭ３ （実施例１）が畢１およびＳｍａ ｌで消化
され、該３．７ ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲル電
気泳動により精製され、次いでＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼにより平滑末端化された（第４図）。ｐＰＫ−１（実
施例１）かＮ５ｉｌで消化され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼにより平滑末端化され、ｐＡＭ３の３．７ｋｂｐ断
片に連結された。出来たプラスミド（ｐＰＫ−４） は
、ＭＶ ｔｋ中ニＶＺ’Ｊ ｇｐｌ／ＥＢＶ ｇｐ３５
０発現カセットを含む。ｐＰに−４は実施例３で記載さ
れるようにＥＢＶ ｇｐ３５０を発現する組換えＶＺＶ
を生成するのに用いられ、以下の例外を除きｐＰに−３
（実施例１）と同じ顕著な特定を含む：ｔｋ隣接配列が
全ＶＺＶ ５ａｃｌ ＨＦｔ片を含むまで拡張され、ｐ
ＰＫ−３に比して、５°隣隣接列を３．７ ｋｂｐそし
て３゛隣隣接列を０．６ ｋｂｐ増大させることになっ
た。
され、該３．７ ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲル電
気泳動により精製され、次いでＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼにより平滑末端化された（第４図）。ｐＰＫ−１（実
施例１）かＮ５ｉｌで消化され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼにより平滑末端化され、ｐＡＭ３の３．７ｋｂｐ断
片に連結された。出来たプラスミド（ｐＰＫ−４） は
、ＭＶ ｔｋ中ニＶＺ’Ｊ ｇｐｌ／ＥＢＶ ｇｐ３５
０発現カセットを含む。ｐＰに−４は実施例３で記載さ
れるようにＥＢＶ ｇｐ３５０を発現する組換えＶＺＶ
を生成するのに用いられ、以下の例外を除きｐＰに−３
（実施例１）と同じ顕著な特定を含む：ｔｋ隣接配列が
全ＶＺＶ ５ａｃｌ ＨＦｔ片を含むまで拡張され、ｐ
ＰＫ−３に比して、５°隣隣接列を３．７ ｋｂｐそし
て３゛隣隣接列を０．６ ｋｂｐ増大させることになっ
た。
２００μｍの２ｘ ＋ＩＢＳ（２７４＋ｎＭ Ｎａ１ｌ
、 １０ ｍＭ ＫＣＩ、１．４ ｍＭ Ｎａ２１１Ｐ
Ｏ＜、１２ ｍＭデキストロース、４２１１１Ｍ Ｈｅ
ｐｅｓ、 ｐＨ６，９）中のＶＺＶ１０ｋａゲノム性Ｄ
ＮＡ 、およびｐＰＫ−３またはｐＰに一４各１μｇ、
プラス滅菌蒸留水（最終体積３８０μｌまで）が１２Ｘ
７５ωｍ管中に加えられた。２０μＩの２Ｍ燐酸カルシ
ウム、１０ ＋＋＋Ｍ Ｈｅｐｅｓ、 ｐＨ５，５が次
いで加えられ、２３℃で３０分ＤＮＡ共沈澱の生成が成
された。
、 １０ ｍＭ ＫＣＩ、１．４ ｍＭ Ｎａ２１１Ｐ
Ｏ＜、１２ ｍＭデキストロース、４２１１１Ｍ Ｈｅ
ｐｅｓ、 ｐＨ６，９）中のＶＺＶ１０ｋａゲノム性Ｄ
ＮＡ 、およびｐＰＫ−３またはｐＰに一４各１μｇ、
プラス滅菌蒸留水（最終体積３８０μｌまで）が１２Ｘ
７５ωｍ管中に加えられた。２０μＩの２Ｍ燐酸カルシ
ウム、１０ ＋＋＋Ｍ Ｈｅｐｅｓ、 ｐＨ５，５が次
いで加えられ、２３℃で３０分ＤＮＡ共沈澱の生成が成
された。
該沈澱は、前日に３Ｘ１０５細胞／３５ＩＩＩＩＩ＋！
ｌＩＭ１培養プレートてセットアツプされたＭＲ（ニー
５細胞を覆う１．５ ｍｌの生育培地［ダルベツコの改
変イーグルの培地 （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｆ
ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ） （ＤＭＥＭ
）プラスｌＯ￥ｌ牛脂児血清］添加され、３７℃Ｃ０２
インキユベーター中で４時間インキュベートされた（第
５図）。培地が除かれ、細胞は１ｍｌの生育培地で洗浄
され、ｌｘ Ｈａｓ中１５％グリセロールが、１１′ｌ
Ｉ胞に３分間作用させられた。細胞は生育培地でもう一
度洗浄され、１．５１１＋１生育培地中で２４時間３７
℃ ＣＯ□インキュベーターでインキュベートされた。
ｌＩＭ１培養プレートてセットアツプされたＭＲ（ニー
５細胞を覆う１．５ ｍｌの生育培地［ダルベツコの改
変イーグルの培地 （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｆ
ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ） （ＤＭＥＭ
）プラスｌＯ￥ｌ牛脂児血清］添加され、３７℃Ｃ０２
インキユベーター中で４時間インキュベートされた（第
５図）。培地が除かれ、細胞は１ｍｌの生育培地で洗浄
され、ｌｘ Ｈａｓ中１５％グリセロールが、１１′ｌ
Ｉ胞に３分間作用させられた。細胞は生育培地でもう一
度洗浄され、１．５１１＋１生育培地中で２４時間３７
℃ ＣＯ□インキュベーターでインキュベートされた。
該細胞は次いでトリプシン処理され、プレート当り４
ｍｌの生育培地を含む２枚の６０ ｍＯＩプレート中
に継代され、ウィルス プラークが観察されるまで３７
℃Ｃ０２インキユベーター中でインキュベートされた。
ｍｌの生育培地を含む２枚の６０ ｍＯＩプレート中
に継代され、ウィルス プラークが観察されるまで３７
℃Ｃ０２インキユベーター中でインキュベートされた。
５ないし１０日後、細胞変性性により示される複製して
いるウィルスを含む細胞は、トリプシン処理され、細胞
ごと８Ｏ−９０ｔコンフルエントのＭＲ（ニー５細胞モ
ルヤーＬに継代された。２日後に、ウィルス プラーク
が顕著にな）た時、ＥＢＶ ｇｐ３５０に特異的なモノ
クローナル抗体（ＭｃＡｂ） ［（：１．４、ソーリー
ーローソン （Ｔｈｏｒｌｅｙ−１、ａ ｗ ｓ ｏ
ｎ ）ほか、プロシーヂングス オブ ザナショナル
アカデミ−オブ サイエンス米国 （Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、ｌＪＳ八）、第７７巻＝５３
０７頁（１９８０年）１０ μｇ／ｍｌを含む新鮮生
育培地により置換され、３７℃で１時間インキュベート
された。該細胞は次いでＤＭＥＭで３回洗浄され、以下
の方法に従ってウサギ抗−マウス免疫グロブリンの共役
されたヒト赤血球細胞を含む生育培地の存在下で３７℃
で１時間インキュベートされた：ヒト赤血球細胞（Ａｌ
ｌ陽性型）が２３℃て１５０ ｍＭ Ｎａ（：ｌ中で５
回洗浄された。２ｍｌのウサギ抗−マウスＩｇＧ （Ｉ
ｍｇ／ｍｌ）が静かに攪拌されつつ１ｍｌの洗浄されパ
ックされた赤血球細胞に加えられた。２ｍｌの０．０３
３＊（ｗ／ｖ）塩化クロム、ｐ＋＋ｓ、ｏか常に攪拌さ
れつつ該赤血球細胞に滴加された。該細胞は次いで２３
℃で７分揺すられ、生理食塩水中で４℃で５回洗浄され
、バンクの均衡塩溶液 （ｆｌａｎｋ’ｓ Ｂａ１ａｎ
ｃｃｄ ５ａｌｔ ５ｏｌｕｔｉｏｎＨＢＳＳ）中で
４℃で１回洗浄され、１：１０希釈で用いるために５０
ｍｌ ＨＢＳＳ中に懸濁された。１時間のインキュベ
ーションの後、ウィルス−感染細胞はＤＭＥＭで３回以
上洗浄され、ＶＺＶプラーク上での赤血球細胞のロゼツ
ト形成について目視で検索された；そのようなロゼツト
はｇｐ３５０を発現している細胞を示す。該（：１．４
ＭｃＡｂを用いてプラークのほぼ１０％がロゼツト陽
性であった。、２ＬｌＯおよびＢＭＡ−１７と命名され
た２つの他のｇｐ３５０−特異的ＭｃＡｂおよび抗−Ｅ
ＢＶ＋ポリクローナルヒト血清もまたロゼツト形成を誘
導したが、正常ヒト血清はしなかった。ｇｐ３５０に対
する抗体は、ＶＺＶｌｏｋａのみのトランスフェクショ
ンにより生成したプラーク上にロゼツト形成を誘導する
ことは出来なかった。Ａ型肝炎つィルスＶＰＩに対して
造られたＭｃＡｂは組換えｖＺｖプラーク上にロゼツト
形成を誘導することは出来なかりた、こうしてこの検定
がｇｐ３５０の発現を特異的に検出することを示した。
いるウィルスを含む細胞は、トリプシン処理され、細胞
ごと８Ｏ−９０ｔコンフルエントのＭＲ（ニー５細胞モ
ルヤーＬに継代された。２日後に、ウィルス プラーク
が顕著にな）た時、ＥＢＶ ｇｐ３５０に特異的なモノ
クローナル抗体（ＭｃＡｂ） ［（：１．４、ソーリー
ーローソン （Ｔｈｏｒｌｅｙ−１、ａ ｗ ｓ ｏ
ｎ ）ほか、プロシーヂングス オブ ザナショナル
アカデミ−オブ サイエンス米国 （Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、ｌＪＳ八）、第７７巻＝５３
０７頁（１９８０年）１０ μｇ／ｍｌを含む新鮮生
育培地により置換され、３７℃で１時間インキュベート
された。該細胞は次いでＤＭＥＭで３回洗浄され、以下
の方法に従ってウサギ抗−マウス免疫グロブリンの共役
されたヒト赤血球細胞を含む生育培地の存在下で３７℃
で１時間インキュベートされた：ヒト赤血球細胞（Ａｌ
ｌ陽性型）が２３℃て１５０ ｍＭ Ｎａ（：ｌ中で５
回洗浄された。２ｍｌのウサギ抗−マウスＩｇＧ （Ｉ
ｍｇ／ｍｌ）が静かに攪拌されつつ１ｍｌの洗浄されパ
ックされた赤血球細胞に加えられた。２ｍｌの０．０３
３＊（ｗ／ｖ）塩化クロム、ｐ＋＋ｓ、ｏか常に攪拌さ
れつつ該赤血球細胞に滴加された。該細胞は次いで２３
℃で７分揺すられ、生理食塩水中で４℃で５回洗浄され
、バンクの均衡塩溶液 （ｆｌａｎｋ’ｓ Ｂａ１ａｎ
ｃｃｄ ５ａｌｔ ５ｏｌｕｔｉｏｎＨＢＳＳ）中で
４℃で１回洗浄され、１：１０希釈で用いるために５０
ｍｌ ＨＢＳＳ中に懸濁された。１時間のインキュベ
ーションの後、ウィルス−感染細胞はＤＭＥＭで３回以
上洗浄され、ＶＺＶプラーク上での赤血球細胞のロゼツ
ト形成について目視で検索された；そのようなロゼツト
はｇｐ３５０を発現している細胞を示す。該（：１．４
ＭｃＡｂを用いてプラークのほぼ１０％がロゼツト陽
性であった。、２ＬｌＯおよびＢＭＡ−１７と命名され
た２つの他のｇｐ３５０−特異的ＭｃＡｂおよび抗−Ｅ
ＢＶ＋ポリクローナルヒト血清もまたロゼツト形成を誘
導したが、正常ヒト血清はしなかった。ｇｐ３５０に対
する抗体は、ＶＺＶｌｏｋａのみのトランスフェクショ
ンにより生成したプラーク上にロゼツト形成を誘導する
ことは出来なかった。Ａ型肝炎つィルスＶＰＩに対して
造られたＭｃＡｂは組換えｖＺｖプラーク上にロゼツト
形成を誘導することは出来なかりた、こうしてこの検定
がｇｐ３５０の発現を特異的に検出することを示した。
１ａ胞の含まれないウィルスは感染細胞を４℃で２分間
ＤＭＥＭ中で超音波処理し、処理上清を０．２２μｍフ
ィルターを通すことにより得られた。ＥＢＶ ｇｐ：］
５０を発現する該組換えＶ７．Ｖは、無細胞感染性ウィ
ルスとして維代可能であり、そのようなりローンは０．
０１％ （９Ｉ／ｖ）５−ブロモ−２°−デオキシウリ
ヂン存在下で継代され得る、従ってｔｋ遺遺伝円内の組
換えを示している。加うるに、該組換えＶＺＶは、細胞
共存下で、上述の抗−ｇｐ３５０ ＭｃＡｂに対する結
合により判定すると、３０ｍ、代以上ＥＢＶ ｇｐ３５
０を発現する能力を失うことなく継代された。
ＤＭＥＭ中で超音波処理し、処理上清を０．２２μｍフ
ィルターを通すことにより得られた。ＥＢＶ ｇｐ：］
５０を発現する該組換えＶ７．Ｖは、無細胞感染性ウィ
ルスとして維代可能であり、そのようなりローンは０．
０１％ （９Ｉ／ｖ）５−ブロモ−２°−デオキシウリ
ヂン存在下で継代され得る、従ってｔｋ遺遺伝円内の組
換えを示している。加うるに、該組換えＶＺＶは、細胞
共存下で、上述の抗−ｇｐ３５０ ＭｃＡｂに対する結
合により判定すると、３０ｍ、代以上ＥＢＶ ｇｐ３５
０を発現する能力を失うことなく継代された。
組換えＶＺＶまたは親ＶＺＶ１０ｋａのどわかの感染し
たＭＲＣ−５細胞から破砕物が調製され、６％ポリアク
リルアミドゲル中で電気泳動され、ニトロセルロースに
ウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）プロットされた。抗−Ｅ
ＢＶ＋ポリクローナル ヒト血清を用いて、ｇｐ３５０
およびｇｐ２２０が組換えＶＺＶ−感染細胞抽出液内に
は存在するが、親ＶＺＶ−感染細胞抽出液内にはないこ
とが見出された。これら糖蛋白は、ｇｐ３５０の真核細
胞性発現プラスミドにより安定にトランスフェクトされ
たマクスＬ細胞中に生産されるｇｐ３５０およびｇｐ２
２０と共に移動した。組換えおよび親ウィルスからのｖ
ｚｖゲノム性ＤＮＡは次いでサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
）プロット分析により特性付けざわた。精製ウィルスＤ
ＮＡ、２０μｇ、がＩＩＩ、（１）ｌ、仕損、または居
ｌ、により消化され、０．８％アガロースゲル上で電気
泳動され、ニトロセルロースに移され、ニック トラン
スレーションによりα［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識された
ｇｐ：１５０遺伝子からのＤＮＡで調べられた。組換え
ｖｚｖを含むレーンに存在するＤＮＡ断片のみがｇｐ３
５０ｐローブにパイプリダイズし、ｖｚｖゲノム内での
ｇｐ：１５０遺伝子の連関を示した。
たＭＲＣ−５細胞から破砕物が調製され、６％ポリアク
リルアミドゲル中で電気泳動され、ニトロセルロースに
ウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）プロットされた。抗−Ｅ
ＢＶ＋ポリクローナル ヒト血清を用いて、ｇｐ３５０
およびｇｐ２２０が組換えＶＺＶ−感染細胞抽出液内に
は存在するが、親ＶＺＶ−感染細胞抽出液内にはないこ
とが見出された。これら糖蛋白は、ｇｐ３５０の真核細
胞性発現プラスミドにより安定にトランスフェクトされ
たマクスＬ細胞中に生産されるｇｐ３５０およびｇｐ２
２０と共に移動した。組換えおよび親ウィルスからのｖ
ｚｖゲノム性ＤＮＡは次いでサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
）プロット分析により特性付けざわた。精製ウィルスＤ
ＮＡ、２０μｇ、がＩＩＩ、（１）ｌ、仕損、または居
ｌ、により消化され、０．８％アガロースゲル上で電気
泳動され、ニトロセルロースに移され、ニック トラン
スレーションによりα［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識された
ｇｐ：１５０遺伝子からのＤＮＡで調べられた。組換え
ｖｚｖを含むレーンに存在するＤＮＡ断片のみがｇｐ３
５０ｐローブにパイプリダイズし、ｖｚｖゲノム内での
ｇｐ：１５０遺伝子の連関を示した。
ゾーン粒子（サブタイプａｙｗ）が感染固体の血漿から
確立された方法［ランダース（Ｌａｎｄｅｒｓ ）ほか
、ジャーナル オブ ヴイロロシー 第２３巻：３６８
頁（１９７７年）コにより精製される。該ＨＯＶゲノム
性ＤＮＡは、ニックおよびギャップをもつ形としてヴイ
リオン中に存在する［ルスカ（Ｈｒｕｓｋａ）ほか、ジ
ャーナル オブ ヴイロロジー第２１巻：６６６頁（１
９７７年）］。このり、４Ａを分子クローニング用に調
製する目的で、共有結合閉環２本！ＪＩＤＮＡを生産す
るのに内在性ポリメラーゼ反応が利用されるＵランダー
ス（Ｌａｎｄｅｒｓ）ほか、ジャーナル オブ ヴイロ
ロジー 第２３巻＝３６８頁（１９７７年）］。該ＤＮ
Ａはドデシル硫酸ナトリウムおよびプロティナーゼにを
含む緩衝液中でのインキュベーションに続くフェノール
：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４
：１）抽出、およびエタノール沈澱によるｖＡ縮により
除蛋白される。この精製ＤＮＡはＥｃｏＲｌで完全に消
化される。Ｅ、コリのクローニング用ベクターであるｐ
８Ｒ３２２もまた跪旧で消化され、消化されたＨＢＶ
ＤＮＡと連結され、Ｅ、コリを形質転換するのに用いら
れる。完全なプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓコード領域を
０．４ ｋｂｐの５゛ドメインと０．８ ｋｂｐの３′
ドメインとに分ける唯一の■Ｒ１部位の回りで、環状に
入れ替わった配位でＨＢＶゲノムを含む組換えプラスミ
ドが単離される［ガリバート（Ｇａｌｉｂｅｒｔ）ほか
、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２８１巻＝６４６頁（
１９７９年）］。これら２ドメインは、完全遺伝子の偶
然の再会合のためにサブクローン化される。ｐＵｃｊ９
が畢旧および…旧で消化され、次いでコード領域の最後
の５ヌクレオチド、停止コドン、Ｈｉｎｄｌ１１部位、
および…旧末端からなる合成オリゴヌクレオチドに連結
される。このオリゴヌクレオチドの構造は： ＡＴＡＣＡＴＴＴ八ＡＡＧＣＴＴへ ＴＧＴＡＡＡＴＴＴＣＧ八八ＣＣＴＡＧへへ８ ｋｂｐ
■旧−Ａｃｃｌ断片からなるプレＳ−１／プレＳ−２／
Ｓ遺伝子の３°領域が、このベクター（ｐｔ］ＣＩ９／
ＤＳＤ）中にクローン化される。ｐＵｃＩ８ ［ヤニ
シューペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒａｎ）ほか、
ジーン（Ｇｅｎｅ）第３３巻：１０３頁（１９８５年）
］がｔｌｉｎｄｌｌｌおよび１靜１で消化さり、…旧部
位から上流端のＡＴ−まで１０ ｂｐ非非翻訳リグター
配列経てｔｌｉｎｄｌｌｌ対応末端までの完全なＯＲＦ
を再構成する、７２ ｂｐｐ成オリゴヌクレオチドに連
結される。このオリゴヌクレオチドの以下の構造を存す
る。
確立された方法［ランダース（Ｌａｎｄｅｒｓ ）ほか
、ジャーナル オブ ヴイロロシー 第２３巻：３６８
頁（１９７７年）コにより精製される。該ＨＯＶゲノム
性ＤＮＡは、ニックおよびギャップをもつ形としてヴイ
リオン中に存在する［ルスカ（Ｈｒｕｓｋａ）ほか、ジ
ャーナル オブ ヴイロロジー第２１巻：６６６頁（１
９７７年）］。このり、４Ａを分子クローニング用に調
製する目的で、共有結合閉環２本！ＪＩＤＮＡを生産す
るのに内在性ポリメラーゼ反応が利用されるＵランダー
ス（Ｌａｎｄｅｒｓ）ほか、ジャーナル オブ ヴイロ
ロジー 第２３巻＝３６８頁（１９７７年）］。該ＤＮ
Ａはドデシル硫酸ナトリウムおよびプロティナーゼにを
含む緩衝液中でのインキュベーションに続くフェノール
：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４
：１）抽出、およびエタノール沈澱によるｖＡ縮により
除蛋白される。この精製ＤＮＡはＥｃｏＲｌで完全に消
化される。Ｅ、コリのクローニング用ベクターであるｐ
８Ｒ３２２もまた跪旧で消化され、消化されたＨＢＶ
ＤＮＡと連結され、Ｅ、コリを形質転換するのに用いら
れる。完全なプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓコード領域を
０．４ ｋｂｐの５゛ドメインと０．８ ｋｂｐの３′
ドメインとに分ける唯一の■Ｒ１部位の回りで、環状に
入れ替わった配位でＨＢＶゲノムを含む組換えプラスミ
ドが単離される［ガリバート（Ｇａｌｉｂｅｒｔ）ほか
、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２８１巻＝６４６頁（
１９７９年）］。これら２ドメインは、完全遺伝子の偶
然の再会合のためにサブクローン化される。ｐＵｃｊ９
が畢旧および…旧で消化され、次いでコード領域の最後
の５ヌクレオチド、停止コドン、Ｈｉｎｄｌ１１部位、
および…旧末端からなる合成オリゴヌクレオチドに連結
される。このオリゴヌクレオチドの構造は： ＡＴＡＣＡＴＴＴ八ＡＡＧＣＴＴへ ＴＧＴＡＡＡＴＴＴＣＧ八八ＣＣＴＡＧへへ８ ｋｂｐ
■旧−Ａｃｃｌ断片からなるプレＳ−１／プレＳ−２／
Ｓ遺伝子の３°領域が、このベクター（ｐｔ］ＣＩ９／
ＤＳＤ）中にクローン化される。ｐＵｃＩ８ ［ヤニ
シューペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒａｎ）ほか、
ジーン（Ｇｅｎｅ）第３３巻：１０３頁（１９８５年）
］がｔｌｉｎｄｌｌｌおよび１靜１で消化さり、…旧部
位から上流端のＡＴ−まで１０ ｂｐ非非翻訳リグター
配列経てｔｌｉｎｄｌｌｌ対応末端までの完全なＯＲＦ
を再構成する、７２ ｂｐｐ成オリゴヌクレオチドに連
結される。このオリゴヌクレオチドの以下の構造を存す
る。
ＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＣ八ＧＡ
ＡＴＣＴＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣへＴＣＴＧＧＧ
ＡＴＴＴＴＴ Ａ ＴＧＴＴＴＴ ＧＴＴＴＴＡ ＣＣＣＬＩ： ＧＴ
ＣＴＴＡ ＧＡＡＡ ＧＧ ＴＧ ＧＴＣＧＴＴＡＧ
ＧＡ ＧＡ ＣＣｆ１：ＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＡＣ（：
ＡＣＣＡＧＴＴＧ 、八ＧＧＧにＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＡＧ（＊天然
の配列はＴではなくＣを含む；上の変換はコードされる
アミノ酸を変えることなく肛１１部位をなくす。）５°
ドメインの０．４ ｋｂｐ…Ｈ，Ｉ−ＥｃｏＲ１断片は
次いでこのオリゴヌクレオチド−結合クローニングベク
ター（ｐＵｃ１９／ＤＳＤ）中に連結される。該５°ｐ
ＵｃＩ８および３°ｐＵｃ１９クローンはＥ、コリ中で
の生育により増幅され、該コード領域は単離されたプラ
スミドから世旧１ｌ−ＥｃｏＲ１断片として消化される
。これら断片は連結され、頭重ＩＩで消化され、ＤＮＡ
ポリメラーゼｌのＰｏ１ｌ断片により平滑末端化され、
平滑末端を持つ完全０１（Ｆは、−Ｉｌｌで消化されポ
リメラーゼ１のＰｏ１ｌ断片により平滑末端化されたｐ
Ｕｃ１８中にクローン化される（ｐｕｃ１８／ＰＳＳＣ
）。
ＡＴＣＴＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣへＴＣＴＧＧＧ
ＡＴＴＴＴＴ Ａ ＴＧＴＴＴＴ ＧＴＴＴＴＡ ＣＣＣＬＩ： ＧＴ
ＣＴＴＡ ＧＡＡＡ ＧＧ ＴＧ ＧＴＣＧＴＴＡＧ
ＧＡ ＧＡ ＣＣｆ１：ＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＡＣ（：
ＡＣＣＡＧＴＴＧ 、八ＧＧＧにＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＡＧ（＊天然
の配列はＴではなくＣを含む；上の変換はコードされる
アミノ酸を変えることなく肛１１部位をなくす。）５°
ドメインの０．４ ｋｂｐ…Ｈ，Ｉ−ＥｃｏＲ１断片は
次いでこのオリゴヌクレオチド−結合クローニングベク
ター（ｐＵｃ１９／ＤＳＤ）中に連結される。該５°ｐ
ＵｃＩ８および３°ｐＵｃ１９クローンはＥ、コリ中で
の生育により増幅され、該コード領域は単離されたプラ
スミドから世旧１ｌ−ＥｃｏＲ１断片として消化される
。これら断片は連結され、頭重ＩＩで消化され、ＤＮＡ
ポリメラーゼｌのＰｏ１ｌ断片により平滑末端化され、
平滑末端を持つ完全０１（Ｆは、−Ｉｌｌで消化されポ
リメラーゼ１のＰｏ１ｌ断片により平滑末端化されたｐ
Ｕｃ１８中にクローン化される（ｐｕｃ１８／ＰＳＳＣ
）。
ＶＺＶ ｇｐｔプロモーターを含む断片をもたらすため
に、ｐＶｓＧＯ−１２が顛１テ消化され、３．７ ｋｂ
ｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により精製され
る。この断片は、Ｖ７．Ｖ ｇｐｌのＡＴＧ翻訳開始コ
トンノすぐ５′側０．０５ ｋｂｐを除キｖｚｖｇｐｔ
プロモーター配列を含む。以下の配列を持つ４種のオ
リゴヌクレオチドが合成される： ＃１ ５’−Ｔ（：ＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＣＧＴＧＧＴ
ＴＴＴＡＡＧ＃２ ＣＧＧＴＴＡＡｆｌ；Ｇ（
：ＡＣ（：ＡＡＡＡＴＴＣＡ（：ＴＧＡＴ−５’＃３５
°−ＴＧＡＣＴＡＴＡＴＴＣＣＧＡＧＧＧＴＣＧＣＧＴ
ＧＴＡＴｕ４ ＡＴＡＡＧＧ（：ＴＣＣ（：
ＡＧＣＧＧＡＣ：ＡＴＡＧＡＴ（ニー ５’オリゴンヌ
クレオチド＃ｌおよび＃２は、オリゴヌクレオチド＃３
および＃４と同じようにハイブリダイズされた。その２
組は互いに連結され、ＶＺＶｇｐｌのコード領域のすぐ
５°側のＶＺＶ ｇｐｌのプロモーター配列に相当する
。ＡｖａｌおよびＸｂａｌ ５“突出を含む５５ ｂｐ
リンカ−を生成する。この５５ｂｐ リンカ−は、ｐＶ
ｓＧＯ−１２（７） ３．７ ｋｂｐ断片に連結され、
該０．９ ｋｂｐ断片は調製用アガロースゲル電気泳動
により精製され、その後Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによ
り平滑末端化される。精製された０、９ ｋｂｐ断片は
次いでｌ）Ｕに １８／ＰＳＳにの錘１部位中にクロー
ン化される。このベクター（ＶＺＶ ｇｐｌプロモータ
ーおよびプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓコート領域を含む
）は５ａｃｌおよび履１で消化され、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼにより平滑末端化され、ｐＰに−１の平滑末端化
（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる）された類１部位中
にクローン化され、こうしてｐＰに−５を生成する。こ
のプラスミド（ｐＰＫ−５）は、以下の顕著な特定を含
む）ＩＢＶプレＳｔ／プレＳ２／Ｓを発現するベロ（ｖ
ｅｒｏ）細胞系を生成するのに利用される： １）ＶＺ
Ｖ ｇｐｌプロモーターおよびＲＮＡキＹ ’／プ部位
： ２）ＨＢＶブＬ／Ｓｔ／プレＳ２／Ｓ＜７）ための
完全な蛋白コード配列：そして３）転写終結およびポリ
Ａ付加のための配列。
に、ｐＶｓＧＯ−１２が顛１テ消化され、３．７ ｋｂ
ｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動により精製され
る。この断片は、Ｖ７．Ｖ ｇｐｌのＡＴＧ翻訳開始コ
トンノすぐ５′側０．０５ ｋｂｐを除キｖｚｖｇｐｔ
プロモーター配列を含む。以下の配列を持つ４種のオ
リゴヌクレオチドが合成される： ＃１ ５’−Ｔ（：ＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＣＧＴＧＧＴ
ＴＴＴＡＡＧ＃２ ＣＧＧＴＴＡＡｆｌ；Ｇ（
：ＡＣ（：ＡＡＡＡＴＴＣＡ（：ＴＧＡＴ−５’＃３５
°−ＴＧＡＣＴＡＴＡＴＴＣＣＧＡＧＧＧＴＣＧＣＧＴ
ＧＴＡＴｕ４ ＡＴＡＡＧＧ（：ＴＣＣ（：
ＡＧＣＧＧＡＣ：ＡＴＡＧＡＴ（ニー ５’オリゴンヌ
クレオチド＃ｌおよび＃２は、オリゴヌクレオチド＃３
および＃４と同じようにハイブリダイズされた。その２
組は互いに連結され、ＶＺＶｇｐｌのコード領域のすぐ
５°側のＶＺＶ ｇｐｌのプロモーター配列に相当する
。ＡｖａｌおよびＸｂａｌ ５“突出を含む５５ ｂｐ
リンカ−を生成する。この５５ｂｐ リンカ−は、ｐＶ
ｓＧＯ−１２（７） ３．７ ｋｂｐ断片に連結され、
該０．９ ｋｂｐ断片は調製用アガロースゲル電気泳動
により精製され、その後Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによ
り平滑末端化される。精製された０、９ ｋｂｐ断片は
次いでｌ）Ｕに １８／ＰＳＳにの錘１部位中にクロー
ン化される。このベクター（ＶＺＶ ｇｐｌプロモータ
ーおよびプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓコート領域を含む
）は５ａｃｌおよび履１で消化され、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼにより平滑末端化され、ｐＰに−１の平滑末端化
（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる）された類１部位中
にクローン化され、こうしてｐＰに−５を生成する。こ
のプラスミド（ｐＰＫ−５）は、以下の顕著な特定を含
む）ＩＢＶプレＳｔ／プレＳ２／Ｓを発現するベロ（ｖ
ｅｒｏ）細胞系を生成するのに利用される： １）ＶＺ
Ｖ ｇｐｌプロモーターおよびＲＮＡキＹ ’／プ部位
： ２）ＨＢＶブＬ／Ｓｔ／プレＳ２／Ｓ＜７）ための
完全な蛋白コード配列：そして３）転写終結およびポリ
Ａ付加のための配列。
各１μｇ＜７）ｐＰに−５およびＶＺＶ１０ｋａゲノム
性ＤＮＡが共沈され、実施例３で記載されたものと全く
同じにＭｒｔＣ−５細胞に加えられる。組換えＶＺＶの
感染した細胞は、実施例３で記載されたものと全く同じ
に、特異抗体および指示ヒト赤血球細胞により１１８ｖ
プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓの生産に関して検索され、
その結果、プラークのほぼ１０％がＨＢＳプレＳ−１／
プレＳ−２／Ｓについて陽性であることが同定される。
性ＤＮＡが共沈され、実施例３で記載されたものと全く
同じにＭｒｔＣ−５細胞に加えられる。組換えＶＺＶの
感染した細胞は、実施例３で記載されたものと全く同じ
に、特異抗体および指示ヒト赤血球細胞により１１８ｖ
プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓの生産に関して検索され、
その結果、プラークのほぼ１０％がＨＢＳプレＳ−１／
プレＳ−２／Ｓについて陽性であることが同定される。
Ｈ［Ｉ Ｖ″Ｓ”にたいする抗体はＶＺＶｌｏｋａのみ
のトランスフェクションによって生成したプラーク上に
、ロゼツト形成を誘導することは出来ない。Ａ型肝炎つ
ィルスＶＰＩに向けられたＭｃＡｂは、組換えｖｚ■プ
ラーク上にロゼツト形成を誘導することは出来ず、従っ
てこの検定がプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ発現の検出に
特異的であることを示す。無細胞ウィルスは、感染細胞
をＤＭＥＭ中４℃で２分間超音波処理し、超音波処理上
清を０．２２μｍフィルターを通過させることにより生
成される。該ＨＢＶプレ５−１７プレＳ−２／Ｓを発現
する組換えＶＺＶは、無細胞感染性ウィルスとして継代
され得る、そしてその様なりローンは０，０１％（ｗ／
ｖ） ５−ブロモ−２−デオキシウリヂンの存在下で継
代され得る、従ってｔｋ遺遺伝円内の組換えを示す。発
現はさらに培養破砕物におけるＡＵＳＴＲＩＡ■（アボ
ット（Ａｂｂｏｔｔ））による１１ ｂ ｓ 八ｇの検
出により確認される。
のトランスフェクションによって生成したプラーク上に
、ロゼツト形成を誘導することは出来ない。Ａ型肝炎つ
ィルスＶＰＩに向けられたＭｃＡｂは、組換えｖｚ■プ
ラーク上にロゼツト形成を誘導することは出来ず、従っ
てこの検定がプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ発現の検出に
特異的であることを示す。無細胞ウィルスは、感染細胞
をＤＭＥＭ中４℃で２分間超音波処理し、超音波処理上
清を０．２２μｍフィルターを通過させることにより生
成される。該ＨＢＶプレ５−１７プレＳ−２／Ｓを発現
する組換えＶＺＶは、無細胞感染性ウィルスとして継代
され得る、そしてその様なりローンは０，０１％（ｗ／
ｖ） ５−ブロモ−２−デオキシウリヂンの存在下で継
代され得る、従ってｔｋ遺遺伝円内の組換えを示す。発
現はさらに培養破砕物におけるＡＵＳＴＲＩＡ■（アボ
ット（Ａｂｂｏｔｔ））による１１ ｂ ｓ 八ｇの検
出により確認される。
組換えｖｚｖまたは親ＶＺＶ１０ｋａの何れかの感染し
たＭＲＣ−５細胞からの破砕物か調製され６％ポリアク
リルアミドゲルにより電気泳動され、ニトロセルロース
にウェスタン プロットされる。抗−１１８Ｖ″Ｓ”蛋
白血清ならびに抗−プレＳ血清の使用により、プレＳ−
１／プレＳ−２／Ｓ蛋白が、組換えＶＺＶ−感染細胞抽
出物中には存在するが、親ＶＺＶ−感染細胞抽出物中に
はないことが見出される。これら蛋白はＨＢ Ｖゾーン
粒子から由来する”Ｓ”蛋白と共に移動する。組換えお
よび親つイスルからのＶＺＶヶノム性ＤＮＡは、次いで
サザン プロット分析により特性付けされる。積装ウィ
ルスＤＮＡ、２０μｇ、か題１１、狼１、史１、または
工１により消化され、０．８％アガロースゲル上で電気
泳動され、ニトロセルロースに転移され、ニック−トラ
ンスレーションによりα［３２Ｐｌｄｌｌ：ＴＰで標識
されたｔｌ Ｂ ＶプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ遺伝子
からのＤＮＡで検索される。組換えＶＺＶを含むレーン
中に存在するＤＮＡ断片のみがｇｐ３５０プローブとハ
イブリダイズし、）ＩＢＶプＬ／Ｓ−１／ブＬ／Ｓ−２
／Ｓ 遺伝子ノｖｚｖケノム内での連関を示す。
たＭＲＣ−５細胞からの破砕物か調製され６％ポリアク
リルアミドゲルにより電気泳動され、ニトロセルロース
にウェスタン プロットされる。抗−１１８Ｖ″Ｓ”蛋
白血清ならびに抗−プレＳ血清の使用により、プレＳ−
１／プレＳ−２／Ｓ蛋白が、組換えＶＺＶ−感染細胞抽
出物中には存在するが、親ＶＺＶ−感染細胞抽出物中に
はないことが見出される。これら蛋白はＨＢ Ｖゾーン
粒子から由来する”Ｓ”蛋白と共に移動する。組換えお
よび親つイスルからのＶＺＶヶノム性ＤＮＡは、次いで
サザン プロット分析により特性付けされる。積装ウィ
ルスＤＮＡ、２０μｇ、か題１１、狼１、史１、または
工１により消化され、０．８％アガロースゲル上で電気
泳動され、ニトロセルロースに転移され、ニック−トラ
ンスレーションによりα［３２Ｐｌｄｌｌ：ＴＰで標識
されたｔｌ Ｂ ＶプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ遺伝子
からのＤＮＡで検索される。組換えＶＺＶを含むレーン
中に存在するＤＮＡ断片のみがｇｐ３５０プローブとハ
イブリダイズし、）ＩＢＶプＬ／Ｓ−１／ブＬ／Ｓ−２
／Ｓ 遺伝子ノｖｚｖケノム内での連関を示す。
支五璽−」
実施例３に従って感染細胞を超音波破砕することにより
生成された無細胞ウィルスが１０’ＰＦＵ／動物の投与
量で４匹のコモンマーモセット猿群に皮下投与される。
生成された無細胞ウィルスが１０’ＰＦＵ／動物の投与
量で４匹のコモンマーモセット猿群に皮下投与される。
生理食塩水プラセポがもう４匹のコモンマーモセット対
照猿群に皮下投与される。３０日後に両群に１０８ＰＦ
ＵのＥＢＶが投与されるウィルス投与から６力月の観察
期間の間、第１群の猿はＥＢＶ複製の如何なる兆候も示
さないが、対照の動物は全てＥＢＶ ＠製の兆候を示す
。この結果は第１群でのウィルス投与前における免疫反
応の進展を示す。
照猿群に皮下投与される。３０日後に両群に１０８ＰＦ
ＵのＥＢＶが投与されるウィルス投与から６力月の観察
期間の間、第１群の猿はＥＢＶ複製の如何なる兆候も示
さないが、対照の動物は全てＥＢＶ ＠製の兆候を示す
。この結果は第１群でのウィルス投与前における免疫反
応の進展を示す。
第１図は、ｐへＭ２の生成を示す図である。
第２図は、ｐＡＭ３の生成を示す図である。
第３図は、ｐＰＫ−３の生成を示す図である。
第４図は、ｐＰに−４の生成を示す図である。
第５図は、組換えＶＺＶの生成を示す図である。
第 １ 図
第 ２ 図
第６図
第 ４ 図
第 ５ 図
”’Ｔ Ｉ＋ＳＲ：１２２
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、そのゲノム中に非−ＶＺＶＤＮＡを存在させること
により改変されたＶＺＶ。 ２、非−ＶＺＶＤＮＡが、非−ＶＺＶＤＮＡの転写を指
示するために採用されたプロモーター配列に隣接してポ
リペプチドのためのコード配列を含んでいる、特許請求
の範囲第１項記載のＶＺＶ。 ３、非−ＶＺＶＤＮＡが、各配列が異なるポリペプチド
をコードし、各配列が隣接する非−ＶＺＶＤＮＡの転写
を指示するために採用されたプロモーター配列に隣接す
る、ひとつ以上のコード配列を含む、特許請求の範囲第
１項記載のＶＺＶ。 ４、コード配列がヒト病原体の免疫原性蛋白を特定する
、特許請求の範囲第２項記載のＶＺＶ。 ５、コード配列がエプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉ
ｎ−Ｂａｒｒ）ウィルスｇｐ３５０を特定する、特許請
求の範囲第４項記載のＶＺＶ。 ６、コード配列がＨＢＶプレＳ１／プレＳ２／Ｓを特定
する、特許請求の範囲第４項記載のＶＺＶ。 ７、プロモーター配列がＶＺＶから由来する、特許請求
の範囲第２項記載のＶＺＶ。 ８、プロモター配列がＶＺＶｇｐ１遺伝子から由来する
、特許請求の範囲第７項記載のＶＺＶ。 ９、細胞モノレヤーに、非−ＶＺＶＤＮΛがＶＺＶゲノ
ムの非必須領域中にあるＤＮＡと同一鎖上に連結されて
いるＶＺＶおよび非−ＶＺＶＤＮＡを含む培地を作用さ
せることからなる、特許請求の範囲第１項によるＶＺＶ
を生産する方法。 １０、該非−必須領域がチミジンキナーゼ遺伝子である
、特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、特許請求の範囲第１項にあるＶＺＶを含むワクチ
ン。 １２、特許請求の範囲第３項にあるＶＺＶを含むワクチ
ン。 １３、感受性種の一員に免疫反応を誘導するのに有効な
量の特許請求の範囲第２項の産物を投与することからな
る、水痘及び少なくともひとつの他の病原体にたいし免
疫する方法。 １４、感受性種の対象が免疫能低下者である、特許請求
の範囲第１３項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87695686A | 1986-06-20 | 1986-06-20 | |
| US876956 | 1986-06-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6312277A true JPS6312277A (ja) | 1988-01-19 |
| JP2523132B2 JP2523132B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=25368939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62151539A Expired - Lifetime JP2523132B2 (ja) | 1986-06-20 | 1987-06-19 | 生組換えワクチンとしての帯状疱疹ウイルス |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0251534B1 (ja) |
| JP (1) | JP2523132B2 (ja) |
| KR (1) | KR960008674B1 (ja) |
| AT (1) | ATE93543T1 (ja) |
| AU (1) | AU601747B2 (ja) |
| CA (1) | CA1337596C (ja) |
| DE (1) | DE3787131T2 (ja) |
| DK (1) | DK312687A (ja) |
| ES (1) | ES2058116T3 (ja) |
| IE (1) | IE60898B1 (ja) |
| IL (1) | IL82851A (ja) |
| NZ (1) | NZ220645A (ja) |
| PT (1) | PT85108B (ja) |
| ZA (1) | ZA874434B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06189752A (ja) * | 1991-04-26 | 1994-07-12 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 組換え水痘ウイルスとその作製法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US5324664A (en) * | 1988-08-08 | 1994-06-28 | The Upjohn Company | Herpes virus thymidien kinase-encoding DNA |
| WO1990001547A1 (en) * | 1988-08-08 | 1990-02-22 | The Upjohn Company | Methods for isolating herpes virus thymidine kinase-encoding dna |
| AU687355B2 (en) * | 1992-07-17 | 1998-02-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for preventing zoster or alleviating varicella related post-herpetic neuralgia |
| CA2177060A1 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-29 | Philip J. Provost | Thermostable varicella zoster virus |
| FR2952825B1 (fr) | 2009-11-24 | 2012-05-25 | Goaster Jacqueline Le | Utilisation d'un vaccin contre le virus vzv/hsv3 pour traiter les infections herpetiques par le virus hsv1 et/ou le virus hsv2 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5341202B2 (ja) * | 1974-03-12 | 1978-11-01 | ||
| CA1282721C (en) * | 1984-06-04 | 1991-04-09 | Bernard Roizman | Herpes simplex virus as a vector |
| IL76751A (en) * | 1984-11-01 | 1991-04-15 | American Home Prod | Method and oral vaccines against infectious organisms using live,recombinant adenovirus for the production of antibodies |
-
1987
- 1987-06-10 NZ NZ220645A patent/NZ220645A/xx unknown
- 1987-06-11 IL IL8285187A patent/IL82851A/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-12 AT AT87305202T patent/ATE93543T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-12 EP EP87305202A patent/EP0251534B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-12 ES ES87305202T patent/ES2058116T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-12 DE DE87305202T patent/DE3787131T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-16 CA CA000539785A patent/CA1337596C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-17 PT PT85108A patent/PT85108B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 KR KR1019870006210A patent/KR960008674B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-19 DK DK312687A patent/DK312687A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-06-19 JP JP62151539A patent/JP2523132B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-19 IE IE163987A patent/IE60898B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 AU AU74492/87A patent/AU601747B2/en not_active Ceased
- 1987-06-19 ZA ZA874434A patent/ZA874434B/xx unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06189752A (ja) * | 1991-04-26 | 1994-07-12 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 組換え水痘ウイルスとその作製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK312687D0 (da) | 1987-06-19 |
| ES2058116T3 (es) | 1994-11-01 |
| KR960008674B1 (ko) | 1996-06-28 |
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| PT85108B (pt) | 1990-03-08 |
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| EP0251534A1 (en) | 1988-01-07 |
| KR880000579A (ko) | 1988-03-26 |
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