JPS63141579A - 高効率培養制御方法 - Google Patents
高効率培養制御方法Info
- Publication number
- JPS63141579A JPS63141579A JP28682186A JP28682186A JPS63141579A JP S63141579 A JPS63141579 A JP S63141579A JP 28682186 A JP28682186 A JP 28682186A JP 28682186 A JP28682186 A JP 28682186A JP S63141579 A JPS63141579 A JP S63141579A
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- JP
- Japan
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- culture
- substrate
- acid
- cells
- inducer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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Classifications
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01R—ELECTRICALLY-CONDUCTIVE CONNECTIONS; STRUCTURAL ASSOCIATIONS OF A PLURALITY OF MUTUALLY-INSULATED ELECTRICAL CONNECTING ELEMENTS; COUPLING DEVICES; CURRENT COLLECTORS
- H01R13/00—Details of coupling devices of the kinds covered by groups H01R12/70 or H01R24/00 - H01R33/00
- H01R13/62—Means for facilitating engagement or disengagement of coupling parts or for holding them in engagement
- H01R13/629—Additional means for facilitating engagement or disengagement of coupling parts, e.g. aligning or guiding means, levers, gas pressure electrical locking indicators, manufacturing tolerances
- H01R13/631—Additional means for facilitating engagement or disengagement of coupling parts, e.g. aligning or guiding means, levers, gas pressure electrical locking indicators, manufacturing tolerances for engagement only
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は微生物や動植物細胞などに抗生物質、アミノ酸
、酵素または生理活性物質などを生産させるに際し、目
的とする物質を効率よく生産させるための高効率培養制
御方法に関するものである。
、酵素または生理活性物質などを生産させるに際し、目
的とする物質を効率よく生産させるための高効率培養制
御方法に関するものである。
微生物や動植物の細胞を培養することにより、その代謝
物である抗生物質、アミノ酸、酵素またはホルモンなど
の生理活性物質などを生産することが行われている。こ
の培養方法は大部分が培養槽に培地と種細胞を入れて培
養するだけの回分培養であり生産性は低い。
物である抗生物質、アミノ酸、酵素またはホルモンなど
の生理活性物質などを生産することが行われている。こ
の培養方法は大部分が培養槽に培地と種細胞を入れて培
養するだけの回分培養であり生産性は低い。
そこで、生産性を高めるために培養途中で基質または誘
導物質を添加する培養方法が行われるが、培養のどの時
点で添加するかが問題になっており、その明確な指標は
知られていない。一方、パン酵母培養の場合はエタノー
ルの生成を呼吸商により検知して基質を流加して酵母濃
度を高くする方法（特開昭５７−３６９８３号、特開昭
５８−７８５８４号）が述べられているが、これは菌体
を得るための培養であり、代謝物生産とは全く異なる。
導物質を添加する培養方法が行われるが、培養のどの時
点で添加するかが問題になっており、その明確な指標は
知られていない。一方、パン酵母培養の場合はエタノー
ルの生成を呼吸商により検知して基質を流加して酵母濃
度を高くする方法（特開昭５７−３６９８３号、特開昭
５８−７８５８４号）が述べられているが、これは菌体
を得るための培養であり、代謝物生産とは全く異なる。
また、基質の添加にもかかわらず培養中に細胞の増殖速
度が低下する現象があり、これは増殖阻害物質の培養液
中への蓄積が原因であるといわれている。しかし、増殖
阻害物質についての知見は少なく、この点からも効率的
な培養を達成することが困難になっている。この増殖阻
害物質を特定せずに、これを除去するために培養液を断
続的又は連続的に抜き出し遠心分離により菌体を回収し
て再び培養槽に仕込む方法（特開昭５３−２９９８５号
）が提供されている。これは酵母を対象としたもので、
細胞を大量に生産させるためのプロセスであり、細胞に
目的物質を生産させるためのプロセスではない。
度が低下する現象があり、これは増殖阻害物質の培養液
中への蓄積が原因であるといわれている。しかし、増殖
阻害物質についての知見は少なく、この点からも効率的
な培養を達成することが困難になっている。この増殖阻
害物質を特定せずに、これを除去するために培養液を断
続的又は連続的に抜き出し遠心分離により菌体を回収し
て再び培養槽に仕込む方法（特開昭５３−２９９８５号
）が提供されている。これは酵母を対象としたもので、
細胞を大量に生産させるためのプロセスであり、細胞に
目的物質を生産させるためのプロセスではない。
上記従来技術は基質などの添加や増殖阻害物質の検知の
点について配慮がなされておらず、効率的な細胞増殖や
代謝物質の生産が難しいという問題があった。
点について配慮がなされておらず、効率的な細胞増殖や
代謝物質の生産が難しいという問題があった。
本発明の目的は微生物や動植物の細胞を培養し、その代
謝物質を生産させるブスセスにおいて、上記従来技術の
欠点を解消した高効率培養制御方法を提供することにあ
る。
謝物質を生産させるブスセスにおいて、上記従来技術の
欠点を解消した高効率培養制御方法を提供することにあ
る。
本発明の高効率培養制御方法は、上記目的を達成するた
め、微生物または動植物の細胞を培地中で好気的に培養
し、その代謝物を生産させるプロセスにおいて、培養中
の細胞が前記培地中に分泌する有機酸の濃度を検知し、
前記検知結果を指標として、つぎのいずれかの工程、 （１）有機酸を除去した後または除去しながら、前記培
地中に基質または誘導物質と基質を同時に添加して前記
代謝物の生産を誘導する工程、（２）有機酸を除去する
ことなく、前記培地中に基質または誘導物質と基質を同
時に添加して前記代謝物の生産を誘導する工程、 または、 （３）有機酸を除去して細胞を増殖させる工程、をとる
ことを特徴とする。
め、微生物または動植物の細胞を培地中で好気的に培養
し、その代謝物を生産させるプロセスにおいて、培養中
の細胞が前記培地中に分泌する有機酸の濃度を検知し、
前記検知結果を指標として、つぎのいずれかの工程、 （１）有機酸を除去した後または除去しながら、前記培
地中に基質または誘導物質と基質を同時に添加して前記
代謝物の生産を誘導する工程、（２）有機酸を除去する
ことなく、前記培地中に基質または誘導物質と基質を同
時に添加して前記代謝物の生産を誘導する工程、 または、 （３）有機酸を除去して細胞を増殖させる工程、をとる
ことを特徴とする。
以下、本発明の前記構成をさらに具体的に説明する。
微生物または動植物の細胞による代謝物質の生産には遺
伝子組換え大腸菌によるインターフェロンやインスリン
の生産、ヒト・リンパ芽球細胞による誘導物質としてセ
ンダイウィルスを用いたインターフェロンの生産、遺伝
子組換え動物細胞による誘導物質としてグルココルチコ
イドホルモンを用いた物質生産及び植物細胞による赤色
色素シコニンの生産など多数の生産例がある。
伝子組換え大腸菌によるインターフェロンやインスリン
の生産、ヒト・リンパ芽球細胞による誘導物質としてセ
ンダイウィルスを用いたインターフェロンの生産、遺伝
子組換え動物細胞による誘導物質としてグルココルチコ
イドホルモンを用いた物質生産及び植物細胞による赤色
色素シコニンの生産など多数の生産例がある。
本発明では以上述べた誘導物質を添加する代謝物質生産
例の中から高効率培養制御方法を示す具体例として、プ
ロモータにｔｒｐ（）リブトファン）プロモータを用い
、それにβ−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子を
連結した複合プラスミドｐＴ−ＲＥＺＩを保持する大腸
菌Ｈ８１０１株（微工研菌寄第８１３６号）による培養
制御方法を示す。
例の中から高効率培養制御方法を示す具体例として、プ
ロモータにｔｒｐ（）リブトファン）プロモータを用い
、それにβ−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子を
連結した複合プラスミドｐＴ−ＲＥＺＩを保持する大腸
菌Ｈ８１０１株（微工研菌寄第８１３６号）による培養
制御方法を示す。
複合プラスミドｐＴＲＥＺ１のｔｒｐプロモータ部分は
大腸菌のｔｒｐオペロンのプロモータ、ｔｒｐＬ （リ
ーグペブタイド）及びｔｒｐＥ （アントラニル酸合成
酵素）の先端部分の一部を含む約５ｏｏｂｐ（ｂａｓｅ
ｐａｉｒｓ、塩基対）のＤＮＡ断片であり、ｐＢＲ３
２２プラスミドのＥｃｏＲ１部位に挿入したものである
。一方、β−ｇａｌ遺伝子はｐＭｃ１４０３ （Ｊ。
大腸菌のｔｒｐオペロンのプロモータ、ｔｒｐＬ （リ
ーグペブタイド）及びｔｒｐＥ （アントラニル酸合成
酵素）の先端部分の一部を含む約５ｏｏｂｐ（ｂａｓｅ
ｐａｉｒｓ、塩基対）のＤＮＡ断片であり、ｐＢＲ３
２２プラスミドのＥｃｏＲ１部位に挿入したものである
。一方、β−ｇａｌ遺伝子はｐＭｃ１４０３ （Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４ムｐ、９７１〜９８０．１９
８０）より切り出した６、２ｋｂの大きさのもので、ｔ
ｒｐプロモータのＥ−ｃｏＲ１部位とｐＢＲ３２２の５
ａｉ１部位間に挿入した。このように複合プラスミドｐ
ＴＲＥＺ１のβ−ｇａｌ遺伝子はｔｒｐプロモータの制
御下にある。
８０）より切り出した６、２ｋｂの大きさのもので、ｔ
ｒｐプロモータのＥ−ｃｏＲ１部位とｐＢＲ３２２の５
ａｉ１部位間に挿入した。このように複合プラスミドｐ
ＴＲＥＺ１のβ−ｇａｌ遺伝子はｔｒｐプロモータの制
御下にある。
ｔｒｐプロモータを有する複合プラスミドは培養中にｌ
ＡＣ３−β−インドールアクリル酸）を添加することに
より、遺伝子が発現することが知られている（Ｎａｔｕ
ｒｅ、２９１． ｐ、５０３〜５０６．１９８１）。こ
れは遺伝子の転写を抑制するりプレッサがＩＡにより不
活性化されるため、ＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡ
の合成が開始されるからである。
ＡＣ３−β−インドールアクリル酸）を添加することに
より、遺伝子が発現することが知られている（Ｎａｔｕ
ｒｅ、２９１． ｐ、５０３〜５０６．１９８１）。こ
れは遺伝子の転写を抑制するりプレッサがＩＡにより不
活性化されるため、ＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡ
の合成が開始されるからである。
本発明者らはβ−ｇａｌを生産する遺伝子組換え大腸菌
をモデルに用いてβ−ｇａｌを効率よく生産させるため
の培養制御方法について種々検討した結果、細胞を効率
よく増殖させ、目的とする物質を効率よく生産させるこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。
をモデルに用いてβ−ｇａｌを効率よく生産させるため
の培養制御方法について種々検討した結果、細胞を効率
よく増殖させ、目的とする物質を効率よく生産させるこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。
第１図に遺伝子組換え大腸菌を用いて流加培養を行った
結果を示す。溶存酸素濃塵の上昇を指標として基質であ
るグルコース、カザミノ酸培地を流加した。１８時間目
には菌体濃度が１３ｇ／ （ｌに達したが、これ以後菌
体増殖は停止した。β−ｇａｌ生産を誘導させるため、
誘導剤のＩＡと栄養物質であるカザミノ酸を３２時間目
に添加したが、β−ｇａｌ生産は誘導されなかった。こ
のように、菌体増殖が停止し、β−ｇａｌ生産が誘導さ
れないのは培養上清液に菌体増殖やβ−ｇａｌ生産を抑
制する物質が存在するためではないかと考えられた。
結果を示す。溶存酸素濃塵の上昇を指標として基質であ
るグルコース、カザミノ酸培地を流加した。１８時間目
には菌体濃度が１３ｇ／ （ｌに達したが、これ以後菌
体増殖は停止した。β−ｇａｌ生産を誘導させるため、
誘導剤のＩＡと栄養物質であるカザミノ酸を３２時間目
に添加したが、β−ｇａｌ生産は誘導されなかった。こ
のように、菌体増殖が停止し、β−ｇａｌ生産が誘導さ
れないのは培養上清液に菌体増殖やβ−ｇａｌ生産を抑
制する物質が存在するためではないかと考えられた。
そこで、菌体の増殖停止後の培養１９時間目の培養上清
液を採取し、そこから菌体増殖阻害物質の分離を検討し
た。培養上清液を分画分子１ｉ１１０００の限外濾過膜
を用いて分子量分画した液について、菌体増殖を阻害す
るかどうかを調べた。分子量１０００以下の分画液が菌
体の増殖を阻害したことから、阻害物質は低分子物質で
あることが分った。つぎに、この分画液から陰イオン交
換樹脂ＩＲＡ−４００と陽イオン交換樹脂Ｉ Ｒ−１２
０Ｂを用いて、イオン性物質を分離し、菌体増殖に及ぼ
す影響を検討したところ、陰イオン性物質が菌体の増殖
を阻害した。これより、菌体増殖阻害物質は低分子の陰
イオン性物質であることが分かり、細胞が分泌すること
が良く知られている有機酸であろうと推定された。そこ
で、細管式等速電気泳動分析装置を用いて低分子の陰イ
オン性物質を含む液について有機酸を分析した結果を第
２図に示す。リーディング液に０．ＯＩＭ塩酸β−アラ
ニン液、ターミナル液に０．０１Ｍカプロン酸液を用い
て、泳動電流１００μＡで泳動した。培地成分と比較し
た結果、酢酸■が３３ｇ／ ｌの高濃度に蓄積している
ことが分かった。
液を採取し、そこから菌体増殖阻害物質の分離を検討し
た。培養上清液を分画分子１ｉ１１０００の限外濾過膜
を用いて分子量分画した液について、菌体増殖を阻害す
るかどうかを調べた。分子量１０００以下の分画液が菌
体の増殖を阻害したことから、阻害物質は低分子物質で
あることが分った。つぎに、この分画液から陰イオン交
換樹脂ＩＲＡ−４００と陽イオン交換樹脂Ｉ Ｒ−１２
０Ｂを用いて、イオン性物質を分離し、菌体増殖に及ぼ
す影響を検討したところ、陰イオン性物質が菌体の増殖
を阻害した。これより、菌体増殖阻害物質は低分子の陰
イオン性物質であることが分かり、細胞が分泌すること
が良く知られている有機酸であろうと推定された。そこ
で、細管式等速電気泳動分析装置を用いて低分子の陰イ
オン性物質を含む液について有機酸を分析した結果を第
２図に示す。リーディング液に０．ＯＩＭ塩酸β−アラ
ニン液、ターミナル液に０．０１Ｍカプロン酸液を用い
て、泳動電流１００μＡで泳動した。培地成分と比較し
た結果、酢酸■が３３ｇ／ ｌの高濃度に蓄積している
ことが分かった。
そこで、相当量の酢酸塩を新鮮培地に添加して培養した
ところ、菌体の増殖が阻害されたことから菌体の増殖阻
害に最も関与している物質は酢酸であることが判明した
。さらに、ガスクロマトグラフを用いた培養上滑液の分
析においても酢酸であることを確認した。
ところ、菌体の増殖が阻害されたことから菌体の増殖阻
害に最も関与している物質は酢酸であることが判明した
。さらに、ガスクロマトグラフを用いた培養上滑液の分
析においても酢酸であることを確認した。
微生物や動植物細胞が培養経過とともに有機酸を分泌す
ることは知られているが、有機酸の中で酢酸が多量に蓄
積すると、それが細胞の増殖及び代謝物生産を阻害する
ことは全く知られておらず、本発明者らにより明らかに
された知見である。
ることは知られているが、有機酸の中で酢酸が多量に蓄
積すると、それが細胞の増殖及び代謝物生産を阻害する
ことは全く知られておらず、本発明者らにより明らかに
された知見である。
培養液中に蓄積した有機酸とくに酢酸量と細胞増殖速度
との関係を検討した。遺伝子組換え大腸菌を用いて培養
開始４時間１５分後より連続的にグルコース・カザミノ
酸培地を流加した時の菌体濃度と毎時の比増殖速度と培
養液中の酢酸濃度の経時変化を第３図に示す。矢印で示
したように、培養１０時間目と１１時間目にかけて、及
び１８時間目と１９時間目にかけて、比増殖速度の急激
な変化がみられた。そして、培養１９時間目以降の菌体
増殖速度はきわめて低くなり、菌体増殖がほぼ停止した
と考えられる。酢酸濃度は１０時間目では６ｇ／ｌ、１
８時間目では１７ｇ／ ｌであった。このことから、培
養液中の酢酸濃度は少なくとも１７ｇ／ ｌ以下、望ま
しくは６ｇ／β以下に抑制すべきであることがわかる。
との関係を検討した。遺伝子組換え大腸菌を用いて培養
開始４時間１５分後より連続的にグルコース・カザミノ
酸培地を流加した時の菌体濃度と毎時の比増殖速度と培
養液中の酢酸濃度の経時変化を第３図に示す。矢印で示
したように、培養１０時間目と１１時間目にかけて、及
び１８時間目と１９時間目にかけて、比増殖速度の急激
な変化がみられた。そして、培養１９時間目以降の菌体
増殖速度はきわめて低くなり、菌体増殖がほぼ停止した
と考えられる。酢酸濃度は１０時間目では６ｇ／ｌ、１
８時間目では１７ｇ／ ｌであった。このことから、培
養液中の酢酸濃度は少なくとも１７ｇ／ ｌ以下、望ま
しくは６ｇ／β以下に抑制すべきであることがわかる。
さらに、誘導剤の添加により遺伝子を発現させる際には
、８ｇ／ｌの酢酸濃度ではＩＡ添加によるβ−ｇａｌ生
産は行われず、３ ｇ／ １以下の酢酸濃度でβ−ｇａ
ｌが誘導生産された（実施例２、実施例３及び比較例１
）。
、８ｇ／ｌの酢酸濃度ではＩＡ添加によるβ−ｇａｌ生
産は行われず、３ ｇ／ １以下の酢酸濃度でβ−ｇａ
ｌが誘導生産された（実施例２、実施例３及び比較例１
）。
以上より、細胞増殖の際には培養液中の有機酸とくに酢
酸濃度を１７ｇ／４２以下、望ましくは６ ｇ／ １以
下に抑制し、誘導剤の添加による、代謝生産物の生産に
関する目的遺伝子の発現の誘導の際には、３ｇ７１以下
にすることが望ましいことがわかった。
酸濃度を１７ｇ／４２以下、望ましくは６ ｇ／ １以
下に抑制し、誘導剤の添加による、代謝生産物の生産に
関する目的遺伝子の発現の誘導の際には、３ｇ７１以下
にすることが望ましいことがわかった。
なお、酢酸濃度は零であることが菌体増殖及び遺伝子発
現に望ましいのであるが、酢酸の除去費用などを考慮し
て酢酸濃度の下限値を設定することになる。
現に望ましいのであるが、酢酸の除去費用などを考慮し
て酢酸濃度の下限値を設定することになる。
培養液中に蓄積された有機酸とくに酢酸を除去する方法
として次のようなものがある。培養液の一部を抜き出し
遠心分離により細胞を回収し再び培養槽に戻す方法、透
析膜や限外濾過膜さらには多孔性セラミック、チューブ
などを用いて除去する方法またはイオン交換樹脂を用い
る方法などがある。
として次のようなものがある。培養液の一部を抜き出し
遠心分離により細胞を回収し再び培養槽に戻す方法、透
析膜や限外濾過膜さらには多孔性セラミック、チューブ
などを用いて除去する方法またはイオン交換樹脂を用い
る方法などがある。
本発明における有機酸とくに酢酸は培養上清液などを等
速電気泳動装置、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグ
ラフ、質量分析計などに導入することにより迅速に検出
することができる。
速電気泳動装置、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグ
ラフ、質量分析計などに導入することにより迅速に検出
することができる。
本発明における細胞としては前記した大腸菌以外の細胞
、例えば酵母、枯草菌、放線菌、動物細胞及び植物細胞
などについても、それらに適した培地を用いかつ誘導さ
せて目的物質を生産させる場合には本発明を適用できる
。また、目的物質の生産を誘導させるには細胞が遺伝子
組換え大腸菌の場合にｔｒｐプロモータに対しては上記
のＩＡの添加が、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ
に対してはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシド）等の添加が、ＰＬプロモータに対しては培養
液の温度を上昇させることが有効である。
、例えば酵母、枯草菌、放線菌、動物細胞及び植物細胞
などについても、それらに適した培地を用いかつ誘導さ
せて目的物質を生産させる場合には本発明を適用できる
。また、目的物質の生産を誘導させるには細胞が遺伝子
組換え大腸菌の場合にｔｒｐプロモータに対しては上記
のＩＡの添加が、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ
に対してはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシド）等の添加が、ＰＬプロモータに対しては培養
液の温度を上昇させることが有効である。
目的物質の生産を誘導させる時に添加する栄養物質とし
ては、アミノ酸の混合物であるカザミノ酸、アミノ酸、
グルコース、酵母エキスなどが有効である。
ては、アミノ酸の混合物であるカザミノ酸、アミノ酸、
グルコース、酵母エキスなどが有効である。
上記した菌体増殖阻害物質除去方法、誘導方法及び添加
する栄養物質に関しては、用いた細胞、増殖阻害物質及
び生産する目的物質に応じて選択すれば良い。
する栄養物質に関しては、用いた細胞、増殖阻害物質及
び生産する目的物質に応じて選択すれば良い。
つぎに、本発明の実施例について具体的に説明するが、
本発明はこれによりなんら限定されるものではない。
本発明はこれによりなんら限定されるものではない。
実施例１
培養液中に蓄積した菌体増殖阻害物質である酢酸を除く
ため、下記のように、培養中に遠心分離により上清液を
除去する反復流加培養を行った。
ため、下記のように、培養中に遠心分離により上清液を
除去する反復流加培養を行った。
菌体：複合プラスミドｐＴＲＥＺ１を保持する大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ株。
ＢＩＯＩ株。
初発培地：Ｍ９−カザミノ酸培地、組成はＮＨ４−Ｃｌ
ＩｇＳＮａＪＰＯｔ ６ｇ５ＫＨｚＰＯ４３ｇ、
ＮａＣ１５ｇ−Ｍｇ５０４１１ＨｚＯＯ，１ｇ、 Ｃａ
Ｃ１ｚ ・２Ｈｚ０１５ｍｇ １チアミン塩酸塩０．１
ｇ、プロリン０．１ｇ、トリプトファン０．０１ｇ、グ
ルコース５ｇ、カザミノ酸２．５ｇ１酵母エキス１．５
ｇ、蒸留水１１、ｐＨ７，０である。なお、本培地には
複合プラスミドを保持する大腸菌のみを増殖させるため
、アンピシリン（ＡＰ ）を５０■／β添加した。
ＩｇＳＮａＪＰＯｔ ６ｇ５ＫＨｚＰＯ４３ｇ、
ＮａＣ１５ｇ−Ｍｇ５０４１１ＨｚＯＯ，１ｇ、 Ｃａ
Ｃ１ｚ ・２Ｈｚ０１５ｍｇ １チアミン塩酸塩０．１
ｇ、プロリン０．１ｇ、トリプトファン０．０１ｇ、グ
ルコース５ｇ、カザミノ酸２．５ｇ１酵母エキス１．５
ｇ、蒸留水１１、ｐＨ７，０である。なお、本培地には
複合プラスミドを保持する大腸菌のみを増殖させるため
、アンピシリン（ＡＰ ）を５０■／β添加した。
流加用培地ニゲルコース２００ ｇ 、プロリン４ｇ。
カザミノ酸１００ ｇ 、酵母エキス６０ｇ、）リプト
ファン０．４ ｇ 、アンピシリン１ｇ、蒸留水１１゜
ｐＨ７，０である。
ファン０．４ ｇ 、アンピシリン１ｇ、蒸留水１１゜
ｐＨ７，０である。
培養条件：複合プラスミドを保持する大腸菌を５０ｍＺ
のＭ９−カザミノ酸培地を入れた５００ ｍｆ容振とう
フラスコ４本に接種し、振とう培養機により、振幅７
ｃｎ 、振とう回数１１５回／ｍｉｎ、３７°Ｃで一晩
培養した。この種菌液２００−をＭ９−カザミノ酸培地
の入った５ｉジヤーフアーメンタに接種し、初発液量２
１で３７℃、ｐＨ７，０、通気量３１７ｍ１ｎで培養を
開始した。培養中の溶存酸素濃度の変化を検知し、溶存
酸素濃度が急激に上昇した時点で流加用培地を５０〜１
５０−添加した。培養液中の酢酸は培養上滑液をユニカ
ーボンＡ−３００６０／８０を充填したガスクロマドグ
ラスに導入することにより測定し、酢酸がＬｏｇ／ １
２程度蓄積した時点を指標として上清液を除去した。上
清の除去は遠心分離機により、回転数６０Ｏｒｐｍ、１
０分間培養液を遠心することにより行い、回収した細胞
は新鮮な初発培地に懸濁して全量２１とした後再び培養
を開始した。
のＭ９−カザミノ酸培地を入れた５００ ｍｆ容振とう
フラスコ４本に接種し、振とう培養機により、振幅７
ｃｎ 、振とう回数１１５回／ｍｉｎ、３７°Ｃで一晩
培養した。この種菌液２００−をＭ９−カザミノ酸培地
の入った５ｉジヤーフアーメンタに接種し、初発液量２
１で３７℃、ｐＨ７，０、通気量３１７ｍ１ｎで培養を
開始した。培養中の溶存酸素濃度の変化を検知し、溶存
酸素濃度が急激に上昇した時点で流加用培地を５０〜１
５０−添加した。培養液中の酢酸は培養上滑液をユニカ
ーボンＡ−３００６０／８０を充填したガスクロマドグ
ラスに導入することにより測定し、酢酸がＬｏｇ／ １
２程度蓄積した時点を指標として上清液を除去した。上
清の除去は遠心分離機により、回転数６０Ｏｒｐｍ、１
０分間培養液を遠心することにより行い、回収した細胞
は新鮮な初発培地に懸濁して全量２１とした後再び培養
を開始した。
結果：第４図に示すように、培養１２．１８．２２及び
２６時間目において遠心分離により上清を除去しなから
流加培養を行ったところ、菌体濃度は乾燥重量で２１．
３ｇ／ ｌの高濃度に達した。培養２６．５時間目に誘
導剤であるＩＡを５０ｖａｇ／ Ｎとβ−ｇａｌ生産原
料のカザミノ酸を２５ｇ／ １添加したところ、培養４
１．５時間目にβ−ｇａｌの生産量はＩＡ添加前の約８
倍の１６ｕ／−に達した。
２６時間目において遠心分離により上清を除去しなから
流加培養を行ったところ、菌体濃度は乾燥重量で２１．
３ｇ／ ｌの高濃度に達した。培養２６．５時間目に誘
導剤であるＩＡを５０ｖａｇ／ Ｎとβ−ｇａｌ生産原
料のカザミノ酸を２５ｇ／ １添加したところ、培養４
１．５時間目にβ−ｇａｌの生産量はＩＡ添加前の約８
倍の１６ｕ／−に達した。
このように、本発明により菌体増殖阻害物質である酢酸
を遠心分離により除くことで、細胞を高濃度に培養でき
、かつ目的遺伝子を誘導剤により発現させることで有効
物質を大量に得ることができる。
を遠心分離により除くことで、細胞を高濃度に培養でき
、かつ目的遺伝子を誘導剤により発現させることで有効
物質を大量に得ることができる。
実施例２
培養液中に蓄積した菌体増殖阻害物質である酢酸により
菌体増殖が停止した段階で、下記のように、遠心分離に
より上清を除去した後、誘導剤を添加しβ−ｇａｌを生
産させた。
菌体増殖が停止した段階で、下記のように、遠心分離に
より上清を除去した後、誘導剤を添加しβ−ｇａｌを生
産させた。
使用した菌体、培養条件は菌体増殖時に遠心分離による
上滑除去を行わなかった以外、実施例１と同様にして流
加培養を行った。
上滑除去を行わなかった以外、実施例１と同様にして流
加培養を行った。
結果：第５に示すように、培養液中の酢酸濃度が１４ｇ
／ ｌとなった培養１４時間目以降菌体増殖がほぼ停止
した。その後、基質を流加するも酢酸が大量に生産され
るだけであった。そこで、培養２２時間口に遠心分離に
より上清を除去した後再び新鮮培地に菌体を？Ａ濁して
培養を開始した。基質のグルコースが消費された培養開
始３０分後に、ｒＡを５０ｔａｇ／ ｌとカザミノ酸を
２５ｇ／ ｌ添加したところ、培養４５時間口に９．Ｉ
Ｕ／ｍ＃のβ−ｇａｌが生産された。
／ ｌとなった培養１４時間目以降菌体増殖がほぼ停止
した。その後、基質を流加するも酢酸が大量に生産され
るだけであった。そこで、培養２２時間口に遠心分離に
より上清を除去した後再び新鮮培地に菌体を？Ａ濁して
培養を開始した。基質のグルコースが消費された培養開
始３０分後に、ｒＡを５０ｔａｇ／ ｌとカザミノ酸を
２５ｇ／ ｌ添加したところ、培養４５時間口に９．Ｉ
Ｕ／ｍ＃のβ−ｇａｌが生産された。
さらに、この時点で前回と同量のＩＡとカザミノ酸を添
加したところ、培養６８時間目には２２．ＩＵ／ｄの大
量のβ−ｇａｌが生産された。この時の培養液中の酢酸
濃度は上清除去して再び培養を開始した時点で２．８ｇ
／ ｌであったが、その後徐々に低下し、培養６８時間
目にはほぼ零になった。
加したところ、培養６８時間目には２２．ＩＵ／ｄの大
量のβ−ｇａｌが生産された。この時の培養液中の酢酸
濃度は上清除去して再び培養を開始した時点で２．８ｇ
／ ｌであったが、その後徐々に低下し、培養６８時間
目にはほぼ零になった。
このように、本発明により菌体増殖阻害物質である酢酸
を遠心分離により除くことで、目的遺伝子を誘導剤によ
り発現させることができ有用物質を大量に得ることが可
能になる。
を遠心分離により除くことで、目的遺伝子を誘導剤によ
り発現させることができ有用物質を大量に得ることが可
能になる。
実施例３
培養中に蓄積した菌体増殖阻害物質である酢酸の濃度が
下記のように、はぼ３ｇ／Ｉｔになった時点で、酢酸を
除外することなく誘導剤を添加しβ−ｇａｌを生産させ
た。
下記のように、はぼ３ｇ／Ｉｔになった時点で、酢酸を
除外することなく誘導剤を添加しβ−ｇａｌを生産させ
た。
使用した菌体、培養条件は初発培地及び流加用培地から
トリプトファンを除き、かつ遠心分離による上清除去を
行わなかった以外は実施例１と同様にして流加培養を行
った。
トリプトファンを除き、かつ遠心分離による上清除去を
行わなかった以外は実施例１と同様にして流加培養を行
った。
結果：第６図に示すように、培養液中の酢酸濃度が２．
９５ｇ／ ｌとなった培養６時間目にＩＡを１５ｍ１／
ｌとカザミノ酸を２．５ ｇ／ ｌ添加した。これによ
り培養２０時間口−にβ−ｇａｌ生産量は１５Ｕ／−と
なり、誘導剤の添加によりβ−ｇａｌの生産を約２倍向
上できた。
９５ｇ／ ｌとなった培養６時間目にＩＡを１５ｍ１／
ｌとカザミノ酸を２．５ ｇ／ ｌ添加した。これによ
り培養２０時間口−にβ−ｇａｌ生産量は１５Ｕ／−と
なり、誘導剤の添加によりβ−ｇａｌの生産を約２倍向
上できた。
このように、菌体増殖阻害物質である酢酸濃度が３ｇ７
１以下であれば、酢酸を除外しなくても目的遺伝子を誘
導剤により発現させることができ、有用物質を大量に得
ることが可能となる。
１以下であれば、酢酸を除外しなくても目的遺伝子を誘
導剤により発現させることができ、有用物質を大量に得
ることが可能となる。
比較例１
培養液中に蓄積した菌体増殖阻害物質である酢酸を除去
することなく培養し、下記のように、酢酸濃度がほぼ８
ｇ／ ｌとなった時点で誘導剤を添加した。
することなく培養し、下記のように、酢酸濃度がほぼ８
ｇ／ ｌとなった時点で誘導剤を添加した。
使用した菌体、培養条件は遠心分離による上清除去を行
わなかった以外、実施例１と同様にして流加培養を行っ
た。
わなかった以外、実施例１と同様にして流加培養を行っ
た。
結果：第６図に示すように、菌体濃度９．５ｇ／ ｅ、
酢酸濃度８．２ｇ／ ｌとなった培養１２時間口に、Ｔ
Ａを５０ｍｇ／ ｌとカザミノ酸を２５ｇ／ ｌ添加し
たが、β−ｇａｌの生産は誘導されなかった。
酢酸濃度８．２ｇ／ ｌとなった培養１２時間口に、Ｔ
Ａを５０ｍｇ／ ｌとカザミノ酸を２５ｇ／ ｌ添加し
たが、β−ｇａｌの生産は誘導されなかった。
なお、上記実施例においては、いずれも、基質または誘
導物質と基質を同時に添加して、代謝生産物の生産に関
する目的遺伝子の発現を誘導するプロセスを含んでいる
が、培養中の細胞が前記培地中に分泌する有機酸の濃度
を検知し、前記検知結果を指標として、有機酸を除去し
て細胞を増殖させる工程をとるのみでも、細胞の増殖が
増大する結果、その細胞による代謝生産物の生産は相対
的に向上し、本発明の目的を達成することができる。
導物質と基質を同時に添加して、代謝生産物の生産に関
する目的遺伝子の発現を誘導するプロセスを含んでいる
が、培養中の細胞が前記培地中に分泌する有機酸の濃度
を検知し、前記検知結果を指標として、有機酸を除去し
て細胞を増殖させる工程をとるのみでも、細胞の増殖が
増大する結果、その細胞による代謝生産物の生産は相対
的に向上し、本発明の目的を達成することができる。
本発明によれば、菌体増殖や有効物質生産を阻害する物
質を検知しながら培養することができるので、目的とす
る物質を効率よく生産させる効果がある。
質を検知しながら培養することができるので、目的とす
る物質を効率よく生産させる効果がある。
第１図は遺伝子組換え大腸菌の流加培養結果の一例を表
わす図、第２図は細管式等速電気泳動分析装置による酢
酸の分析結果の一例を表わす図、第３図は遺伝子組換え
大腸菌の流加培養における酢酸濃度、比増殖速度及び菌
体濃度の経時変化の一例を表わす図、第４図は遺伝子組
換え大腸菌の反復流加培養店果の一例を表わす図、第５
図は遺伝子組換え大腸菌の流加培養における酢酸除去に
よるβ−ｇａｌ生産結果の一例を表わす図、第６図は遺
伝子組換え大腸菌の流加培養における酢酸濃度を指標と
したβ−ｇａｌ生産結果の一例を表わす図、第７図は遺
伝子組換え大腸菌の流加培養における比較例の一つを表
わす図である。
わす図、第２図は細管式等速電気泳動分析装置による酢
酸の分析結果の一例を表わす図、第３図は遺伝子組換え
大腸菌の流加培養における酢酸濃度、比増殖速度及び菌
体濃度の経時変化の一例を表わす図、第４図は遺伝子組
換え大腸菌の反復流加培養店果の一例を表わす図、第５
図は遺伝子組換え大腸菌の流加培養における酢酸除去に
よるβ−ｇａｌ生産結果の一例を表わす図、第６図は遺
伝子組換え大腸菌の流加培養における酢酸濃度を指標と
したβ−ｇａｌ生産結果の一例を表わす図、第７図は遺
伝子組換え大腸菌の流加培養における比較例の一つを表
わす図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、微生物または動植物の細胞を培地中で好気的に培養
し、その代謝物を生産させるプロセスにおいて、培養中
の細胞が前記培地中に分泌する有機酸の濃度を検知し、
前記検知結果を指標として、 （１）有機酸を除去した後または除去しながら、前記培
地中に基質または誘導物質と基質を同時に添加して前記
代謝物の生産を誘導する工程、（２）有機酸を除去する
ことなく、前記培地中に基質または誘導物質と基質を同
時に添加して前記代謝物の生産を誘導する工程、 または、 （３）有機酸を除去して細胞を増殖させる工程、のいず
れかの工程をとることを特徴とする微生物の高効率培養
制御方法。 ２、有機酸が酢酸であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３、細胞増殖の際には、培養液中の酢酸濃度を１７ｇ／
ｌ以下、望ましくは６ｇ／ｌ以下にすること、基質また
は誘導物質と基質を同時に添加することによる代謝物生
産の誘導の際には、３ｇ／ｌ以下にすることを特徴とす
る特許請求の範囲第１または２項記載の方法。 ４、細胞が遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする
特許請求の範囲第１、２または３項記載の方法。 ５、遺伝子組換え大腸菌が保持する発現ベクターがトリ
プトファンプロモータを含有していることを特徴とする
特許請求の範囲第１、２、３または４項記載の方法。 ６、誘導物質が I Ａ（３−β−インドールアクリル酸
）であることを特徴とする特許請求の範囲第１、２、３
、４または５項記載の方法。 ７、基質がグルコースかカザミノ酸、またはグルコース
とカザミノ酸混合物であることを特徴とする特許請求の
範囲第１、２、３、４、５または６項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28682186A JPS63141579A (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 高効率培養制御方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28682186A JPS63141579A (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 高効率培養制御方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63141579A true JPS63141579A (ja) | 1988-06-14 |
Family
ID=17709473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28682186A Pending JPS63141579A (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 高効率培養制御方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63141579A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5613871A (en) * | 1993-12-28 | 1997-03-25 | Yazaki Corporation | Pinch preventive connector |
| US7033205B2 (en) | 2003-02-27 | 2006-04-25 | Sumitomo Wiring Systems, Ltd. | Connector with a collision preventing projection |
-
1986
- 1986-12-03 JP JP28682186A patent/JPS63141579A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIO-TECHNOLOGY=1984 * |
| J FERMENT TECHNOL=1980 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5613871A (en) * | 1993-12-28 | 1997-03-25 | Yazaki Corporation | Pinch preventive connector |
| US7033205B2 (en) | 2003-02-27 | 2006-04-25 | Sumitomo Wiring Systems, Ltd. | Connector with a collision preventing projection |
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