JPS63141590A - 遺伝物質を単子葉植物またはそれらの生育部分に挿入する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、適当なトランスファー微生物を用いて、単子
葉植物またはそれらの生育部分に遺伝物質を挿入する新
規な方法、単子葉植物またはそれらの生育部分における
挿入された遺伝物質の発現および前記の方法により得ら
れる遺伝子導入植物体に関する。

〔従来の技術〕

世界の人口の急速な増加およびそれに伴う食糧および原
材料への要求性の増大を考えると、有用植物の収量を増
やすことおよび植物貯蔵物の抽出を高めること、つまシ
食品および医薬品の分野における進歩は、生物学的およ
び生物工学的研究の最も緊急な課題の一つである。これ
に関して、例えば下記の事項を実質的な目的として記載
すべきである：好ましくない土壌条件または病気および
有害生物に対する有用植物の耐性を向上させること、植
物保護剤例えば殺虫剤、除草剤、殺菌剤および殺バクテ
リア剤に対する耐性を向上させること、および植物の栄
養吻合ｔまたは収量を有利に変えること等である。

そのような望ましい効果は、一般に保饅物質、重要なタ
ンパク質または毒素の導入または増加した形成により、
および植物代謝の制御系への介入により生じ得る。植物
の遺伝型に影響を与えることは、例えば新しい遺伝子を
植物全体または植物細胞にトランスファーすることによ
り行われる。

農業経済の観点から最も重要な栽培植物の多くは、単子
葉綱に属し、そしてわれわれの最も重要なタイプの穀物
、例えばとりわけ小麦、大麦、ライ麦、オート麦、トウ
モロコシ、コメ、アワを含むイネ科植物を特別に言及す
べきである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

単子葉類の植物において、組換えＤ　Ｎ　Ａ技術を用い
る最大の問題は、その助けによって実際的な適用に対し
て十分に高い形質転換頻度を達成し得、および植物ゲノ
ム内に特異的に導かれた挿入のための補助物としてこの
ように使用し得る適当なトランスファー微生物の欠如に
ある。

アグロバクテリウム　テユメファシエンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、以後Ａ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）　、例えば植物に遺伝物質
を挿入するための最も使用されるトランスファー微生物
の一つは、多くの双子葉植物の遺伝子操作に特に適して
いるが、しかし単子葉植物の代表的なもの、特に単子葉
類からの単子葉栽培植物でそれに相当する十分な結果を
達成することが今まで可能となっておらず、今まで少数
の選ばれた科の植物だけがＡ、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓでの感染に応答し、このように少なくとも理論的に
は遺伝子操作を利用できることが知られているにすぎな
い。しかしながら、これらの科は、農業経済の観点から
、せいぜいモデル植物として重要であるにすぎない、と
るに足らない耕作には不適な群である〔参考文献：　１
）、２）、３）、４）下記の文献一覧表を参照、以下同
様〕。

植物プロトプラスト内に外来性ＤＮＡの直接挿人に基づ
いた最近開発された形質転換方法、例えば「直接遺伝子
トランスファーＪ　（５）、６）。

７）、８）、９））または、マ・ｒイ・り９イゼ：ジエ
、クシッン（１０）、１１）］は、多くの植物種、特に
イネ科植物群の能力の限シでは問題があると見なさなけ
ればならず、植物プロトプラストから再生することは、
現在まで依然実質的に未解決の問題を残している。

しかしながら、イネ科植物は、農業経済の観点から最も
重要である栽培植物、例えばとシわけ小麦、大麦、ライ
麦、オート麦、トウモロコシ、コメ、アワを含み、特に
経済的に重要であシ、そこで上記の限界に無関係に、イ
ネ科の代表的槽を直接遺伝子的変性させうる方法の開発
を、緊急の問題として見なさなければならない。

〔問題点を解決するための手段〕

驚くべきことに、単純な手段により本発明の範囲内で、
この問題を解決することができた。

全ての予想に反して、本発明の範囲内で行なわれた研究
の間に、適当な培養法および適用法を用いることにより
、単子葉群の植物もまた、ある種のトランスファー微生
物、例えばＡ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いて特異的に導かれる方法
で形質転換され得ることが驚くべきことにわかった、つ
まり単子葉群の重要な代表種、特にイネ科に属する栽培
植物もまた前記トランスファー微生物により感染され易
いことがわかった。

イネ科植物を含むＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの宿主
範囲の領域拡大に特に注意が払われ、それによってこの
科の代表種においてさえも直接および特異的に標的とさ
れる遺伝子操作が可能となる。

本方法において形質転換された植物は、適当な評価方法
により同定し得る。植物病原性ウィルス例えばマイズ　
ストリーク　　ウィルス（Ｍａｉｚｅ　５ｔｒｅａｋ　
Ｖｉｒｕｓ、　ＭＳＶ）の使用がこのために特に適当で
あることが確認され、これによって成功した形質転換は
、現われる病気の徴候によって大変効果的に確認し得る
。

その面の１つにおいて、本発明は故に、移送可能な形態
で遺伝物質を含み、そして該遺伝物質を単子葉植物また
はそれらの生育可能な部分に挿入可能であるトランスフ
ァー微生物を、該トランスファー微生物の毒性遺伝子作
用の誘導を可能にする適当な培養方法および適用方法を
用いることにより単子葉植物の感染のために使用可能と
し、そして単子葉植物またはそれらの生育可能な部分を
前記トランスファー微生物で感染させることを特徴とす
る遺伝物質を単子葉植物またはそれらの生育部分に挿入
する方法に関する。

上記の方法の範囲内で、トランスファー微生麹例えばＡ
、　ｔｔｕｎｅｆａｃｉｅｎｓは、微生物を培養するた
めに通常使用される栄養培地の１つの中で、１５ないし
４０℃の温度で３０ないし６０時間、攪拌液体培養液中
有利に増殖される。好ましい増殖温度は、２４ないし２
９℃である。次いで１回またはそれ以上の継代培養工程
を、好ましくは同じ培地中で、１：２０の希釈比で有利
に、各工程を１５ないし３０時間、好ましくは１８ない
し２０時間続ける。これらの場合において、培養温度は
１５ないし４０℃、好ましくは２４ないし２９℃である
。

好熱性微生物を使用する場合、増殖温度は明らかに４０
℃以上であって良い。

本発明の範囲内で行われるトランスファー微生物の増殖
に適当であるその他の培養方法もまた明らかに可能であ
る。

例えばトランスファー微生物を培養するために、固形培
地を使用することもでき、該培地は、例えばアガロース
またはアルギネートまたはあらゆる他の適当な固形化剤
を使用して製造し得る。

接種溶液を調製するために、細胞を遠心分離し、そして
接種に適当なある濃度になるように、適当な接種培地に
、例えばＭＳＳＰ培地１／２０容量部（１２））に再懸
濁する。

感染方法は、前記のトランスファー微生物を植物材料に
接触させることにより、例えばプロトプラストとの培養
により、植物全体もしくは一部の組織を傷つけることに
より、または特に植物への直接微生物懸濁液の注射によ
り、本発明に従って始める。

生長帯の領域に１好ましくは植物の茎および葉鞘の領域
に接種溶液の注射が特に好ましい。

本発明の範囲内で、接種された植物の形質転換の頻度は
、植物への施用部位に決定的な程度まで依存するが、そ
ればかシでなく試験した特定の植物の生長段階、並びに
その他の要因にも特に依存することを示すことかさらに
驚くべきことに可能になった。

それ故に本発明の重要な部分は、植物への施用部位のさ
らに複雑な区別および植物への正確に規定された部位へ
の形質転換する微生物含有接種溶液の特に指定された施
用に関し、その結果として接種された植物の形質転換の
頻度を顕著に増加させる。さらに、形質転換の頻度は、
接種される植物の発生段階に関して施用の時期の適当な
選択によっても増加され得る。

本発明は、単子葉植物またはそれらの生育部位に遺伝物
質を挿入するための新規な方法にも特に関し、即ち該方
法は単子葉植物またはそれらの生育部分に該遺伝物質を
挿入可能であシ、そして移送可能な形態で挿入されるべ
き遺伝物質を含有するトランスファー微生物を、微生物
懸濁液の形態で、前記植物またはそれらの生育部分の分
裂組織領域に接種することを特徴とする。

発明の詳細な説明および特許請求の範囲並びに該特許請
求の範囲の明確なそして一定の解釈を確実にするために
、本発明の範囲内での定義を下に示す。

トランスファー微生物：自らのＤＮＡの一部を植物材料
に換える微生物（例えばＡ、　　ｔｕｍｅ　−ｆａｃｉ
ｅｎｓ　）。

Ｔ−レプリコン：レプリコン自身に、または同一の微生
物に存在する他のレプリコンに局在する遺伝子の援助で
、植物細胞に全体または一部を移送できる（例えばＡ、
　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミド）レプリ
コン（１３））。

製物において、微生物の作用の援助で植物材料にＤＮＡ
）ランスファーをもたらすＤＮＡ配列。

カルボＤＮＡ　：　ＤＮＡベクターに人工的に挿入され
たＤＮＡ０ ゲノムＤＮＡ：器官のゲノムから誘導されたＤＮＡ　０ ｃｍＤＮＡ　：逆転写酵素により生産されたｍＲＮＡの
複製物。

合成りＮＡ：特定の産物または生物学的機能をコードし
、そして合成手段により生産されるＤＮＡ配列。

異種遺伝子またはＤＮＡ：特定の産物または生物学的機
能をコードし、そしてその中に該遺伝子が挿入されるも
のとは異なる種から生じるＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配列は
外来遺伝子または外来ＤＮＡとも表現される。

同種遺伝子またはＤＮＡ：特定の産物または生物学的機
能をコードし、そしてその中に該遺伝子が挿入されるも
のと同一の種から生じるＤＮＡ配列。

植物細ａ培養物：植物ユニットの培養物例えば種々の生
長段階におけるプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組
織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合子および
胚。

植物：被Ｉｌ核、染色体の形態で組織化された遺伝物質
、被膜細胞質オルガネ２および減数分裂を行う性質によ
り特徴づけられる植物界のあらゆる光合成活性のもの。

植物細胞：プロトプラストおよび細胞壁からなる植物の
構造的および生理学的ユニット。

プロトプラスト：細胞クローンまたは植物全体く再生さ
れる能力を有する、植物細胞または組織から分離され九
細胞壁のない１裸の植物細胞”。

植物組織：構造的および機能的ユニットの形態に組織化
された植物細胞の群。

植物器官：限定され、そして明らかに肉眼で見れる植物
の一部、例えば根、墓、葉または胚。

十分に形質転換された植物：所望の方法で、各細胞のゲ
ノムが形質転換された植物。

特に本発明は、形質転換を行ない得るアグロバクテリウ
ムの菌株を用いて単子葉植物を形質転換させる改良され
た方法に関し、該方法は、接種される植物の生長段階に
関する接種の時期、および生長帯の領域における接種部
位を、公知の方法との比較により達成され得る形質転換
の割合を著しく増大させるように調整することを特徴と
する。

本発明によると、形質転換する微生物含有懸濁液を施用
するための感染される植物の生長段階に関し、好ましい
時期は、植物胚の生長に始まり、セして倍化段階に終わ
る期間にわたシ、そしてこのように感染される植物の増
殖および生長（分化）相にわたる。

種子の発芽と４葉期との間の生長段階に達した植物が、
本発明に係る施用に特に適している。

本発明の別の実施態様において、微生物を含有する形質
転換接種溶液の接種は、精核により胚珠の授粉および受
精後の未成熟の生長胚上で行うが、しかし好ましくは種
皮ができる前に行う。

胚盤節と頂点の子葉鞘との距離が１ないし２傭である１
表いし３日の実生がさらに好ましい。

しかしながら、子葉鞘筒が明らかに同定し得る生長段階
にある植物が特に好ましい。

微生物を含有する形質転換懸濁液の接種は、分裂組織を
含む植物の領域に好ましくは行われる。これらは分裂お
よび代謝に関して活性であシ、そして特に全ての体細胞
の細胞および組織が分化し、および結局、胚細胞の生長
の出発点である全能の胚細胞を含む組織の部分である。

本発明に係る方法を用いることにより、形質転換され死
体細胞を有するトランスジェニックｙ；（ｔｒａｎｓｇ
ｅｎｉｃ　）植物だけでなく、特に他の細胞および組織
の分化の間に、形質転換された胚珠および／または花粉
が生長し得る形質転換された胚細胞を含む植物をも得る
ことができる。

形質転換された胚珠および／または形質転換された花粉
が加わった受精の後、遺伝子変換胚を含み、そして遺伝
子変換植物を生産するために使用し得る種子が得られる
。

形質転換する微生物を含有する懸濁液の既に茎、根およ
び葉に分化した植物体への挿入のための特に適当な施用
部位は、根と茎との間、いわゆるルートカラー（ｒｏｏ
ｔ　ｃｏｌｌａｒ　）の境界部分である。

形質転換する微生物を含有する接種溶液の植物の分裂組
織領域への繰シ返し施用は、本発明の範囲内で特に好ま
しい。

本発明の特別な実施態様において、形質転換する微生物
を含有する懸濁液の施用は、発芽後約１ないし３日の実
生で効果的である。好ましい施用部位は、子葉鞘および
板組部分である。

非常に良好な形質転換の結果は、子葉鞘筒の近傍への施
用により、または特に子葉鞘筒への直接施用により達成
され得る。

従って、本発明の別の特に好ましい実施態様は、形質転
換する微生物を含有する接種溶液の施用を、発芽後１な
いし３日目に、実生の子葉鞘部近傍にまたは核部に直接
行うことを特徴とする。

形質転換する微生物を含有する接種溶液の植物への導入
は、広範囲に変化しうる方法により、例えば表皮組織を
人工的に傷つけ、そして微生物含有形質転換懸濁液を傷
つけた組織内にこすシつけることによるか、またはトラ
ンスファー微生物および植物プロトプラストを一緒に培
養することにより行い得る。

皮下注射器を使用しての接種溶液の注射が好ましく、こ
れにより植物の正確に規定された部位に、非常に正確に
、そして特異的に指定された施用が行われる。

一般に、関係する植物種の要求および特別の必要性に合
わせて、そして施用の時期における生長段階に合わせて
、Ｑ、１ないし０．５簡の断面を有する交換可能な針を
つけた皮下注射器が使用される。施用容量も、関係する
植物種および生長段階との関係で、１ないし２０μ形の
範囲を変化するが、５ないし１０μ影が好ましい。

当然であるが、植物への接柱溶液の標的とされる施用の
ためのその他の適当な援助、例えば極細ガラスキャビラ
イ−により、マイクロマコブレータ−を使用して、最小
の施用量を植物の正確に規定された組織領域（例えば分
裂組織）に施用し得る。

植物または実生に接種溶液を施用する方法は、同様に変
化しても良いが、しかし異なる植物種のために容易に最
適となし得る。これらの最適に活用し得る試験は、当該
分野の当業者により、かなシの出費を必要とせずに、本
発明のガイドラインに従って、標準的な最適に活用し得
るプログラムの範囲内で実行し得る。

上記したパラメータに加えて、接種されるトランスファ
ー微生物の濃度および発育段階も、形質転換の効率に関
して重要である。好ましい濃度は１♂ないし１０１０個
／ｄの範囲の接種溶液である。１０７ないし１０９個／
ｄの接種溶液が特に好ましい。

本発明の範囲内で行われる希釈実験は、接種溶液の希釈
が増すにつれて、形質転換の頻度が減少するということ
を示した。単子葉植物へのアゲロバクチリムの与えたＤ
Ｎ人トランスファーの頻度は、双子葉の宿主植物へのＤ
ＮＡ）ランスファーと同じオーダーである（結果の部分
のＤ参照）。

本発明に係る方法の範囲内での可能な変法は、結果とし
て例えば施用方法の選択、植物組織への穿孔の深さ、バ
クテリア懸濁液の組成物および濃度、および感染毎に行
われる接種の数に存在する。

本発明に係る他の特定の実施態様において、形質転換す
る微生物を含有する溶液の施用は、子葉鞘筒の領域にあ
る子葉鞘先端を切り落とした後の子葉鞘筒の組織に直接
実施する。大部分のプルムール（ｐｌｕｍｕｌｅ　）を
、実生の他の生長に対し悪影響を及ぼすことなしに除去
できる。

この場合の施用の好ましい方法もまた、皮下注射器の使
用を含み、穿孔の深さが子葉鞘筒の切落した領域の除去
との関係で特定の範囲内で変化させることができる。し
かしながら、子葉鞘部組織への直接接種は、あらゆる場
合に好ましい。

接種溶液の施用は、露出された子葉鞘部組織の周辺部分
または特に中央部分のどちらかに行うことができ、分裂
組織の領域が特に好ましい。

未成熟の胚を使用する場合、既に記載した接種溶液法と
は別に、調製において先づ最初に胚を母植物から除去し
、次いで適当な培地中のトランスファー微生物と接触さ
せる方法を使用することも可能である（　１４））。

単子葉植物に遺伝物質をトランスファーできる、そして
本発明に係る方法に使用し得る適当なトランスファー微
生物は、特にＴ−レプリコンを含む微生物である。

Ｔ−レプリコンを含む微生物は特にバクテリア、好まし
くは土壌細菌、そしてこれらの中でも特にアグロバクテ
リウム種のものと理解される。

当然ながら、無害のバクテリアの株のみが、本発明に係
る方法の範囲内で使用し得るが、例えは自然環境で生存
できないバクテリアの株または何ら環境的な問題のない
バクテリアの株等である。

適当なＴ−レプリコンは、特にバクテリアのレプリコン
、例えばアゲロバクチリムのレプリコン、特にアグロバ
クテリウムのＴｉ−またはＲｉ−プラスミドである。

Ｔｉ−プラスミドは、形質転換された細胞の生産に欠く
ことのできない２つの領域を有する。

双子葉植物において、これらの１つは、植物にトランス
ファーし、そしてｍｆｓを導入するトランスファーＤＮ
Ａ領域である。もう１つは、生長ばかシでなく腫瘍の維
持にも欠かせないとルレンス供与（ｖｉｒ　）領域であ
る。トランスファーＤＮＡ領域は、形質転換する能力が
損われることなく、外来ＤＮＡを組込むことにより大き
さを増加させることができる。腫瘍を起こす遺伝子を除
去することにより、その結果として遺伝子変換植物細胞
は非腫瘍性のまま残り、そして選択的マーカーを組込む
ことにより、変性Ｔｉ−プラスミドを、適当な植物細胞
に遺伝物質をトランスファーするためのベクターとして
使用することができる。

ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ領域およびｖｉｒ−領域が同
一のベクター上に存在するか、または同一のアグロバク
テリウム細胞内の異なるベクター上に存在するかに関係
なく植物細胞のゲノムへのアグロバクテリウムのＴ−Ｄ
ＮＡ領域のトランスファーを遂げる。

染色体上のｖｉｒ領域は同様に１ベクターからのＴ−Ｄ
ＮＡの植物細胞へのトランスファーを訪導する。

アグロバクテリウムからのＴ−ＤＮＡ領域を、ｖｉｒ領
域およびＴ−ＤＮＡ領域が異なるベクター上にあること
を特徴とする植物ｍ胞ヘトランスファーする系が好まし
い。そのような系はに元ベクター系”として知られ、セ
してＴ−ＤＮＡを含むベクターはに元ベクター”と呼ば
れる。

植物細胞に移送可能であシ、形質転換された細胞の検出
ができるＴ−ＤＮＡ含有ベクターが、本発明の範囲内で
の使用に適している。

本発明に従って形質転換された植物細胞または植物は、
適当な表現型マーカーによって選択できる。該表現型マ
ーカーの例は、抗生物質耐性マーカー、例えばカナマイ
シン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、または
除草剤耐性マーカーを含むが、これらに限定されない。

その他の表現型マーカーは、当業者には公知であり、本
発明の範囲内で同様に使用し得る。

本発明の好ましい実施態様は、ウィルスＤＮＡまたはそ
の等個物を植物全体またはそれらの生育部分に挿入する
ことにより、単子葉植物の遺伝子的変性の新規で一般的
に適用可能な方法に関する。

選択したＤＮＡ断片をウィルスＤＮＡ内に組込み、次に
該断片をウィルスと共に別の有機体内に挿入することは
ある程度既に成功していた。一方、自然条件下で多くの
植物ウィルスは、感染および非感染植物を食べ、そして
結果として新しい植物の感染を引き起こす昆虫によりト
ランスファーされるが、この方法は直接的々および計画
的なトランスファーに制御するためには、余りにも高価
で、あまりにも困難である。例えば、そのような方法の
ためには、調整条件下で飼育された多くの昆虫が必要で
あろう。さらに大量の植物のために特に、計画的なウィ
ルス感染は実行が極めて困難である。

遺伝子工学において使用されるウィルスで葉を機械的に
感染させる方法は、クローン化ウィルスＤＮＡがある場
合においてのみ感染性であるが、多くの場合そうでは危
いために、限定された範囲においてのみ実際に適用する
ことができる。バクテリア内の特定のタイプのウィルス
ゲノム、例えば二重鎖ＤＮＡをクローン化することによ
う得られる一重鎖ＤＮＡウィルス（１６））をクローン
化し、研究することは可能であるが、バクテリア内でク
ローン化された多くのウィルスは、植物に再挿入するこ
とができないか、または植物材料を感染させるために使
用できない。

それ故に、このこともまた方法の使用、例えば基礎研究
用の試験管内での突然変異ＤＮＡおよび組換えＤＮＡ、
および選択された外来ＤＮＡのキャリアーとしてそのよ
うなウィルスの使用を妨げる。

下記の本発明に係る方法を用いる場合、このような問題
は生じない。

染色体ＤＮＡとは別の植物内でウィルスレプリコンの放
出および複製を行わせる方法で挿入された１個またはそ
れ以上のウィルスレプリコンまたはウィルスレプリコン
の一部を含む構造物は本方法において特に好ましい。

ツレ故に、ウィルスレプリコンのこの配置ハ、転写、逆
転写または遺伝物質を再編成するその他の方法を介して
分子内組換えに基づいた感染性ウィルスＤＮＡの放出を
可能くする。

本発明の範囲内で、Ｔ−レプリコン、例えば１個または
それ以上のＴ−ＤＮＡ境界配列に隣接シテ、ウィルスＤ
ＮＡ例えばマイズ　ストリークウィルス（ＭＳＶ）のＤ
ＮＡを含み、所望にょ）カルゴ−ＤＮＡを含み、ウィル
スＤＮＡ、！：Ｔ−ＤＮＡ境界配列との距離を、存在し
ても良いカルゴＤＮＡを含むウィルスＤＮＡが植物材料
中にトランスファーされるように選択した、アグロバク
テリウムのＴｉ−プラスミドまたはＲｉ−プラスミドで
ある。

カルゴ−ＤＮＡとして、同種または異種のいずれかの遺
伝子またはＤＮＡ並びに合成りＮＡを、本発明の範囲内
で与えられた定義に従って使用し得る。

コードするＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡから、ｃ、、ｐ
ＮＡから、または合成りＮＡからのみ構成され得る。別
の可能性は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方および
／または合成りＮＡからなるハイブリッドＤＮＡ配列か
らなるものである。

その場合、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと同じ遺伝子に由来
しても良く、マたｃＤＮＡとゲノムＤＮＡの両方の一方
は異なる遺伝子に由来しても良い。

しかしながら、どちらの場合においてもゲノムＤＮＡお
よび／またはｃＤＮＡの両方は各々別々に同一または異
なる遺伝子から製造しても良い。

ＤＮＡ配列が１個以上の部分を含む場合には、これら遺
伝子は、１種および同一の器官に由来しても、１種以上
の株に属する数稽の器官に由来しても、１種以上の同一
または別の指標単位（界）に属する帰管に由来しても良
い。

ＤＮＡ配列の異なる部分は、お互いに結合し、それ自体
公知の方法で完全なコードＤＮＡ配列を形成している。

適当な方法は、例えば同種の部分を有するＤＮＡ配列の
生体内での組換えおよび制限断片の試験管内結合を含む
。

本発明に係る方法は、 ａ）所望により組入れられたカルゴ−ＤＮＡを含むウィ
ルスＤＮＡ例えばマイズーストリークウィルス（ＭＳＶ
）を、Ｔ−レプリコン例えばアグロバクテリウムのＴｉ
−プラスミドまたはＲｉ−プラスミド中の１個またはそ
れ以上のＴ−ＤＮＡ境界配列の付近に、該ウィルスＤＮ
Ａと該Ｔ−ＤＮＡ境界配列との距離を、存在しても良い
カルゴＤＮＡを含むウィルスＤＮＡが植物材料中にトラ
ンスファーされるように選択して、組込み、ｂ）引き続
いて、前記Ｔ−レプリコンが適当なトランスファー微生
物内に吸収されるようにして、該レプリコンを該トラン
スファー微生物中に移し、 ｂ）に従って変性されたトランスファー微生物ぐ。

で単子葉類の植物を感染させるから実質的になる。

この方法は、プラスミドＤＮＡの植物へのトランスファ
ーを促進する微生物の作用が誘導された後に、存在して
も良いカルゴ−ＤＮＡを含む挿入されたウィルスＤＮＡ
もまたトランスファーされることを確実にする。

本発明に係る方法は、 ａ）ウィルスＤＮＡまたはその等価物（下記参照）を、
感染した植物材料例えばコムギ属の植物から単離し、そ
して適当な細菌例えば犬ｍ菌内のベクター内で、該ＤＮ
Ａをクローン化し、ｂ）そのクローン化したウィルスＤ
ＮＡまたはその一部並びにそれらの中に組入れられても
良いカルゴ−ＤＮＡを用いて、ウィルスＤＮＡとＴ−Ｄ
ＮＡ境界配列との距離を、それらの中に組入れられても
良いカルゴ−ＤＮＡを含むウィルスＤＮＡが植物材料中
にトランスファーされるように選択して、１個またはそ
れ以上のＴ−ＤＮＡ境界配列の付近に局在化している１
個以上のウィルスゲノムまたはウィルスゲノムの一部並
びにそれらの中に含まれて込ても良いカルゴ−ＤＮＡを
含むプラスミド（Ｂａｐ）を形成し、Ｃ）前記プラスミ
ドＢａｐを適当なトランスファー微生物（例えばＡ、　
　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ。

ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　）内にトランスファーさせ、植
物に使用し得るベクター系を形成し、 ｄ）このように変性されたベクター系で、単子葉類の植
物全体またはそれらの生育部分を感染させることから実
質的になる。

本発明は単子葉植物またはそれらの生育部分の調節され
九形質転換のための、ベクター系、例えば上記Ｃ）のベ
クター系および新規なベクター系、例えばＡ、　ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎ５ｊ・株（Ｒｉｆ）Ｃ５８（ｐＴｉＣ５
８；ｐＥＡＰ２ｏ０）およびＡ、ｔｕｍｅ−ｆａｃｉｅ
ｎｓ”　　Ｃ５８（’ｐＴｉＣ５８；ｐＥＡＰ３７）、
Ｃ５８（’ｐＴｉＣ５８；ｐＥＡＰ２９　）、Ｃ３Ｂ（
ｐＴｉＣ５８；ｐＥＡＰ　４０　）およびＣ５８（ｐＴ
ｉｃ５８．　ＭＳＶ１０９　）のバクテリアの使用にも
関する。

Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ５ｔ：　Ｃ５８（（’ｐＴ
ｉＣ５８；　ｐＥＡＰ３７）、Ｃ３Ｂ（’９ＴｉＣ５８
：　ｐＥＡＰ２９　）、　Ｃ５８（ｐＴｉＣ５８；ｐＥ
ＡＰ４　ｏ　）およびＣ３Ｂ（：ｐＴｉＣ５８、ＭＳＶ
１０９）の株のバクテリアが非常に好ましい。

本発明の範囲内で、ウィルスＤＮＡおよびその等価物Ｆ
ｉ特に下記のタイプのＤＮＡと理解される：・一重鎖Ｄ
ＮＡの二重鎖ＤＮＡ体（例えばジエミニウィルス、例え
ばマイズ　ストリーク　ウィルス（ＭＳＶ）） 一天然のウィルスＤＮＡ（例えばＣａＭＶ）・ウィルス
ＲＮＡＩたけウィロイドＲＮＡのｃ　ＤＮＡ複製物（例
えばタバコモザイクウィルスまたはカダンーカダンウイ
ロイド（（’ａｄａｎｇ　−Ｃａｄ　ａ　ｎ　ｇｖｉｒ
ｏｉｄ　）　） ・ウィルスの致死または生育突然変異体拳ウィルス複製
シグナルおよび／または発現シグナルの影響下のクロー
ン化ＤＮＡ ・真核生物の複製シグナルおよび／または発現シグナル
の影響下のクローン化ＤＮＡ ・ウィルスＤＮＡの一部 ・タンデム型ＤＮＡの上記タイプの等価物、および ・挿入されたカルゴ−ＤＮＡを有するＤＮＡの上記タイ
プの等価物。

上記のベクター系の例に記載した本発明に係る方法の適
用は、例えば下記の重要な有利点を有する： ・通常の双子葉植物に特異的なトランスファー微生物例
えばＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ、ｒｈｉｚ
ｏ−ｇｅｎｅｓの宿主の範囲を単子葉植物に拡げる。

・ウィルスＤＮＡまたはそれらの等価物により植物全体
の浸透感染の可能性。

・これまで人工的に感染させることができなかったウィ
ルス（例えばＭＳＶ）を感染性にし、天然のベクター例
えば昆虫の使用を避ける。

・バクテリア系例えば大腸菌内でのウィルスＤＮＡを操
作する可能性。

・ウィルスの宿主の範囲を拡げる。

・ＤＮＡ精製を避け、接種に必要な量の顕著な減少によ
り接種を単純化させる。

・プロ）ドプラストから植物全体を再生する困難さの結
果として起こる限界が克服された結果と共に、細胞、組
織および植物全体を形質転換させる可能性。

・バクテリアにコードされた機能の制御の下で、選択さ
れたウィルスＤＮＡを含むＴ−ＤＮＡを宿主ゲノム内に
挿入できる。これより、多くの場合において、バクテリ
アでの形質転換の後に、植物全体を単一細胞から再生し
得、ウィルスＤＮＡを植物の全細胞の核ゲノム内に誘導
し得る。

そのような融合されたウィルスゲノムは、ａ）性的な手
段により後代に受は継がれ、ｂ）過感染するウィルスに
よる感染を防ぎ、Ｃ）所望により、選択されたカルゴＤ
ＮＡを含んでいても良い、および寄託されているその他
のウィルス複製物の源として、転写、逆転写、同種組換
え、または遺伝材料を再配置するその他の方法を介して
融合複製物から作用し得る。

ｄ）さらに核ＤＮＡ内に挿入されたウィルスゲノムを含
む植物材料の第二の感染（超感染）は、多分 α）核ＤＮＡからのウィルスＤＮＡの発現かく第二の感
染を起こすウィルス内の外来ＤＮＡによりウィルスＤＮ
Ａを転置することの可能性を提供し得ることから、よシ
良いウィルスペクｐ−ｏ進展を導くであろうし、そして β）宿主−寄生関係のよシ良い理解においておよび植物
の改善された保護作用においてかなり支持し得る。

このように本発明は、広い概念の多数の実施態様を含む
。

上記の方法を用いて、ウィルスゲノムに挿入されたカル
ゴＤＮＡは、それが増殖する植物材料に移すこともでき
る。植物を無性的に繁殖させるか、または直接および可
能な最短期間有害な影響に対して保護しようとする場合
、ウィルスおよびそれらにより移送された外来遺伝子の
植物内での増殖は、特に有利である；例えば植物内に耐
性遺伝子の導入による。

本発明に係る方法は、選択された遺伝子および望ましい
特性を、植物材料および十分生長した植物にも挿入する
ために特に適当で、そしてこれら中に増加させるために
適当である。

本発明に係る方法は、上記のトランスファー微生物によ
って、弱められた非病Ｒ１性またはわずかに病原性のウ
ィルス、つまり、望ましくはない別のウィルスの感染か
ら植物を保護する成果を有するウィルスで植物を形質転
換することによりウィルスによる攻撃に対し植物を“免
疫感作する”ための植物保護の分野で使用されることも
できる。

本発明に係る方法の範囲内で使用し得るウィルスＤＮＡ
として、例えばカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭ
Ｖ）を含むカウリ玉ウィルスのＤＮＡ、ジエミニウィル
スの代表的なもの、例えばビーン　ゴールデン　モザイ
ク　ウィルス（ＢＧＭＶ）、クロリス　ストリエート　
モザイク　ウィルス（Ｃ８ＭＶ）、カサパ　レイテント
ウィルス（ＣＬＶ）、カーレイ　トップ　ウィルス（Ｃ
ＴＶ）、マイス　　ストリークウィルス（ＭＳＶ）、ト
マト　ゴールデン　モザイク　ウィルス（ＴＧＭＶ）お
よびウィート　ドウォルフウィルス（ＷＤＶ）のＤＮＡ
もまた使用できるが、これに限定されない。

カウリモウィルス群の代表的なもの、特にカリフラワー
　モザイク　ウィルスは、本発明の範囲内での使用には
特に適している。これは、それらウィルスが遺伝子操作
に直接受は入れられ易いゲノム構造（二重鎖ＤＮＡ’）
のためである。

これまでのすべての実験および関連した観察は、ジエミ
ニウィルスの代表的なもの、一重鎖（ｋｊｊ）ＤＮＡか
ら構成されるゲノムもまた、形質転換する遺伝物質のた
めのベクターとして使用し得ることを示す。さらにジエ
ミニウィルスの生活環において、二重鎖ｄｓ−ＤＮＡが
感染された植物内で形成され、そしてこのｄｓ−ＤＮＡ
が感染性であることも知られている（１７））。

その生活環においてｄｓ−ＤＮＡを形成し、そしてこの
ように遺伝子操作に利用できるジエミニウィルスの代表
的なものも、外来遺伝子のキャリアーとして本発明の範
囲内で適当である。

つ・イルスを使用して植物への遺伝子トランスファーの
成功は、通常肉眼で見れる感染の徴候において、例えば
Ｍ　Ｓ　Ｖを用いた場合、新しく形成された葉の基部に
黄色のドツトかストリークにより、非常に容易に認めら
れるため、本発明はジエミニウィルスのマーカーとして
の使用にも関する。

ジエミニウィルスの宿主の範囲は、一連の経済的に重要
な栽培植物、例えばトウモロコシ、小麦、タバコ、トマ
ト、大豆、および種々の熱帯植物を含む。

マイズ　ストリーク　ウィルスの宿主の範囲は、商業的
に特に重要であり、種々の単子葉栽培植物および穀物、
例えばトウモロコシ、コメ、小麦、アワ、サトウモロコ
シおよび種々のアフリカの草を含む。

本発明に係る方法は、単子葉類の植物全体またはそれら
植物の生育部分、例えば植物組織培讐物または細１ａ培
養細胞をウィルスＤＮＡおよびそれらの等価物で感染さ
せるために特罠適している。それ故に本発明は、形質転
換されたプロトプラスト、植物細胞、細胞クローン、細
胞集合物、植物および種子、および本発明の方法で得ら
れたそれらの後代にも関し、それらは形質転換から得ら
れた新規な特性を有し、そして形質転換により得られた
新規な特性を有する形質転換植物材料の全てのハイブリ
ッドおよび融合産物にも関する。

本発明は、形質転換された植物全体およびそれら植物の
生育部分、特に花粉、胚珠、接合子、胚または形質転換
された生殖系列細胞から生じるその他の再生材料にも関
する。

本発明はさらに、形質転換された単子葉植物の生育部分
から再生された完全に形質転換された植物をも含む。

本発明に係る使用に適当である単子葉植物は、例えば下
記の科の種を含む：アリデアセアエ、ヒガンバナ科、ア
スパラガセアエ、パイナツプル科、イネ科、ユリ科、パ
シ冒つ科、ラン科またはヤシ科。

イネ科の代表的なものが、特に好ましく、例えば広い地
域で生長する植物および高収量を生産する植物である。

例として、トウモロコシ、コメ、小麦、大麦、ライ麦、
オート麦およびアワを記載し得る。

本発明に係る方法の適用のその他の標的作物は、例えば
下記の属の植物である：ネギ属、カラスムギ属、オオム
ギ属、イネ属、パニクム属、サトウキビ属、ライムキ属
、セタリア属、モロコシ属、コムギ属、トウモロコシ属
、バシ冒つ属、ココス属、フェニックス属およびエラエ
イス属。

関係する試験植物に対してトランスファ　−Ｍｓｓ−Ｄ
ＮＡによる形質転換の成功は、それ自体公知の方法で確
認できる、例えば病気の徴候を考えて、および特に６サ
ザンブロツト”分析を含む分子生物学的試験による。

抽出したＤＮＡを、まず最初に制限酵素で処理し、次に
１％アガロースゲルの電気泳動に供し、ニトロセルロー
ス膜に移しく３９）：ｌ、そして予めニックトランスレ
ーション（３１）に晒した検出すべきＤＮＡと共にハイ
ブリッド化する（５Ｘ１０８〜１０Ｘ１０”　ｃ、ｐ、
ｍ／ｐｉのＤＮＡ特異活Ｌ）フィルターを６５℃で３回
各１時間、０．０５Ｍクエン酸ナトリウムおよびＣＬ３
Ｍ塩化ナトリウムの水溶液で洗浄する。ノ・イブリッド
化ＤＮＡを２４〜４８時間Ｘ−線フィルムを暗化するこ
とにより可視化する。

さらに一般的に記載をするために、そして本発明のよシ
良い理解のために、参考例を特定の実施例に示したが、
特定の指示がない限り、本発明の本質を制限するもので
はない。

〔実施例および発明の効果〕

本発明は下記の実施例に制限されない。

実施例１：二量体ＭＳＶゲノムとのベクターの製造 ＭＳＶ−ゲノムを、天然に生じている感染したトウモロ
コシ植物体から、１６）に従ってクレノーポリメラーゼ
（ｋｌｅｎｏｗ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　）　ｌと自長
ブライマーを使用する二重鎖ＭＳＶ−ＤＮＡの試験管内
合成のだめのマトリックスとしてピリオンｓｓ　ＤＮＡ
　（１８）　）　’ｔ”作用させて分離しうる。

別の可能性は、感染した葉材料からの直接二ｚ鎖ＭｓＶ
−ＤＮＡ　（＠超らせ／ＣＭＳＶ−ＤＮＡ−）の分離か
らなる。二重鎖Ｍ　Ｓ　Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａはウィルス複
製の間の中間体として形成される。それは°複製型ＤＮ
Ａ″または”ＲＦ−ＤＮＡ”　と呼ばれる。

へＩＳ■−ゲノムは、ＲＦ−ＤＮＡまたは試験管内合成
りＮＡをＢａｍＨＩにより直線化したｐＵＣ９ベクター
内に挿入することによりクローン化される（１９））。

１（ａｃ相補性テストを、組換えファージの同定に用い
る。

製造の次の段階は、先づ１個のＢａｍＨＩ制限切断部位
でクローン化ＭＳＶ−ＤＮＡを切断することである。生
成した直線化ＤＮＡ断片を、次にＤＮＡ混合物のゲル−
電気泳動分画により分離する（２０））。

２個またはそれ以上のＢａｍＨＩ制限部位を有するウィ
ルス株において、ＭＳＶ−ゲノムが部分的に消化される
か、またはＭＳＶ−ゲノム内に１度だけ現われる別の適
当な制限部位を捜す。

これはＭＳＶ−ゲノム内１ｃＢａｍＨＩ制限部位がない
場合ても適用する。

次にタンデム配置のＢａｍＨＩｌｆ？片を１ラスミドｐ
ＧＡ４７１のＢｇｌ　Ｉ［ｔｆｙｌｌ限部位内にスズラ
イジングする（２１））、該部位はＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ境
界配列の間に局在している。このいわゆるタンデム−ク
ローニングは、ベクターおよび、挿入物の代表的な濃縮
の方法により調節され得る。挿入物は、過剰な連結溶液
内に存在している。好ましい濃縮比は、この場合１０：
１　（挿入物：ベクター）である。

プラスミドｐＧＡ４；Ｍは、いわゆるシャトルベクター
であり、テトラサイクリンの存在下で大腸菌内とＡ、　
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｃ内の両方に安定して複製され
たものである。

このベクターは、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の間に存在するＣ
ｏ１Ｅ１　　複製開始点に加え、プラスミドがＡ、　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎうσ内に受は入れられることを可能
とするざらだ広い宿主域の複製開始点を有している。こ
の複製開始点は、プラスミドｐＴＪ　Ｓ７５、広範囲の
宿主およびテトラサイクリン耐性遺伝子、ＰＫ２の誘導
体を有するプラスミドから得る（２１）　）。

プラスミドｐＧＡ４７１のその他の特徴は下記の通シで
ある： １）Ｔ−ＤＮＡ境界配列の間に外来ＤＮＡの挿入を可能
にするウィルス制限部位の保有 ２）大きいＤＮＡ断片（２５−３５ｋｂ）のクローニン
グを可能にするバクテリオファージ入のｃｏｓ−領域。

３）ナバリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の制御配列お
よびネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードす
るＤＮＡ配列からなるチマー（（ｃｈｉｍａｒ　）　？
　−７！Ｊ　−遺伝子、オヨヒ４）グラスミドを大腸菌
からＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｔ）’にトランスファー
することを可能にするｂｏｍ　−切断部位。

スプライシングされる上記のベクターとＭＳＶ−ＤＮＡ
を含む培養溶液ｔ、好ましくは１：１０の濃度１：を；
で大腸菌株ＤＨ１の形質転換のために使用する［２２）
）。選択は、形質転換されたクローンのテトラサイクリ
ン耐性に基づいて、および放射標識Ｍ８Ｖ’−ＤＮＡを
用いたハイブリッド化実験に基づいて行う。

陽性クローンを選択したものを、次にタンデム配置中に
ＭＳＶ−ゲノムの存在を試験する。この目的のために、
グラスミドＤＮＡ’ｉ公知の方法で陽性クローンから分
離しく２０））、次いで制限分析を行う。

”タンデムクローン″の１つは、選択され、そしてＥ、
ｃｏｌｉ　ＤＨＩからＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｆ／
、！、　（Ｒｉｆ　　）Ｃ５８（醪１Ｃ５８）　　にト
ランスファーされる。

トランスファーｕ、’）リペアレンタル　メイテング（
ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ　）　２により
、２５）に詳述された方法で行なう。この場合、す７ア
ムビシン（１００μｇ７ｔｓｔ　）およびテトラサイク
リン（５μｇＡｔ）が選択のために使用される。二量体
のＭＳｖ−ゲノムのトランスファーの成功は、サザンハ
イブリッド化により試験される（２４））。

Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ・：　（ＲｉｆＲＩ　Ｃ５
８（ｐＴｉＣ５８）（２５））は、完全なウィルス機能
を持つ野生型Ｔｉ−１ラスミドを含み、シャトルベクタ
ーの植物細胞内へのトランスファーを可能にする。

上記の方法で形質転換されたアゲロバクチリム株を下記
の法名とする：　Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎら・（Ｒ
ｉｆＲ）Ｃ５８（ｐＴｉｃ５８：ｐＥＡＰ２００　）。

実施例２：制御ベクターの製造 Ｔ−ＤＮＡ境界配列のない制御ベクターを製造するため
に、Ｔ−ＤＮＡ境界配列のないプラスミドｐＲＫ２５２
　Ｋａｎ　Ｉ、プラスミドル几にの誘導体（２６）　）
を使用する。

二量体ＭＳＶ−Ｓノーを制御ベクターへの挿入は、Ｓａ
ｔ　Ｉ／Ｂａｍ　ＨＩアダプターの援助で、プラスミド
ｐＲＫ２５２Ｋａｎｌの５ａｌＩ制御部位内に、タンデ
ム配置中の上記の１３ａｍＨＩ断片をスプライシングす
ることにより行う。

制御ベクターｔＤ　此ｃｉｅｎ５　・（Ｒ＋ｉ　ｆ　Ｒ
）　Ｃ５８（ｐＴｉＣ５８）内へのトランスファーは、
２３）に詳しく記載された“トリベアレンタルメイティ
ングにより行う。

形質転換されたアグロバクテリウム株を下記の法名とす
る：　Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ５　　（ＲｉｆＲ）　
ｃｓａ（ｐＴｉＣ５８：　ｐＥＡ２１　）。

実施例３：バクテリアのベクターｐＥＡＰ　２５の製造 コスミドｐＨｃ　７９　、　Ｅ、ｃつｌｉプラスミドｐ
ＢＲ。

３２２の誘導体（２７））内のα６５　ｋｂ　Ｈｉｎｄ
　ｌ−８ａｌ　［断片Ｅやカナマイシン耐性遺伝子を担
うトランスホゾｙ　Ｔｎ　９０５からの１．２ｋｂ断片
〔２８）〕に交換することにより、ハイブリッドコスミ
ド９２２Ｇ１が形成される。ｐＨＣ７９のＨｉｎｄ　ｌ
−５ａｌＩ制御部位への１．２ｋｂ断片の加入は、Ｈｉ
ｎｄ璽−８ａｌ工連結配列を添加することにより可能と
々る。

植物中にカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含む２
．９　ｋｂｓａｌ　Ｉ−ＢｓｔＥＩ断片〔６）〕　　を
プラスミドｐｃａＭＶ６　ＪＧｎから切断し、そして９
２２Ｇｌから（Ｄ　２．４　ｋｂ　ＯＳａｌ　Ｉ−Ｂｓ
ｔＥ［断片に交換する。

ｐＥＡＰ　２５の最終的な製造は、Ｓａｌ　ｌで予め切
断したプラスミドｐＢ６の、ｐＥＡＰｌのＳａｌ　ｌ切
断部位に加入することにより行う。プラスミドｐＢＡは
英国、ノルウィッチのＪ、Ｄａｖｉｅｓ　ｏｆＪｏｈｎ
　Ｉｎｎｅｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅにより開発され、そ
して利用可能である。それ以来このプラスミド２９）は
ｐＭＳｖ１２の名称で発表された。

プラスミドｐＢ６は、プラスミドｐＡＣＹ０１８４（３
０））中に予めクローン化した二量体のＭＳＶ−ゲノム
を含む。

実施例４：バクテリアのベクターｐＥＡＰ　３７　　の
製造 ８ａｌ　ｌで予め切断したプラスミドｐＢ６　　をプラ
スミドｐｃＩＢ１０のＳａｌ　ｌ制限部位内に挿入する
ことくより、バクテリアのベクターｐＥＡＰ３７を製造
した。

米国、ラレイＮ、Ｃ、リサーチ　トライアングル　パー
ク　チバーガイギー　バイオテクノロジー　ファシリテ
ィのプラスミドｐｃＩＢ１０は、マリーーデル　チルト
ンにより開発され、そして利用できる。

実施例５：バクテリアのベクターｐＥＡＰ　４０の製造 １．６ｍｅｎのＭＳｖ−ゲノＡ　（Ｂｇｌ　Ｉ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（α６ｍｅｖ　）　＋　ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片、　（モノマー）〕を３１）に記載されているプ
ラスミド１）ＴＺ１９ＲのＢａｍＨＩ制限部位にスプラ
イスする。

生成したプラスミドをｐ３５４７と呼び、これは１．６
ｍｅＶのＭＳＶ−ゲノムを含み、そしてこれをＥｃｏＲ
Ｉで切断し、次いでプラスミドｐｃ’ｌＢ２００（３２
））のＥｃｏＲＩ部位にスプライスする。これらの工程
ニヨリ、Ｍｓｖ配列ｔ、ｐｃＩＢ２００　（７）Ｔ−Ｄ
ＮＡ境界配列間に位置させる。

実施例６：バクテリアのベクターｐＭｓｖ　１０９の製
造 既に実施例３に記載した構造物、プラスミドｐＭｓＶ１
２−５　μｇを緩衝液中１３ａｍＨＩにより３７℃の温
度で２時間消化する（２０））。　この酵素消化から生
じる２、７　ｋｂＤＮＡ断片を、１易アガロース−ＴＡ
Ｂゲル（４０ｍＭ　）リス−ＨＣＩ、　２０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、２ｍＭＥＤＴＡ）中、　試料の電気泳動分離
後、後者から溶出させ、そして二元のＴ　−ＤＮＡ　ベ
クターｐＢｉｎ１９（２６））　ノ単一のＢａｍＨＩ割
限部位門限部位内イスする。

連結のために、ベクターｐＢｉｖ＋１９に対して１００
倍モル過剰の２．７　ｋｂ　ＭＳＶ断片、および高ａ度
（Ｄ　Ｔ４−ＤＮＡ　ＩＪアガー上、ベクター内に二量
体ＭＳＶ−ＤＮＡの高率での挿入を確実にするために使
用する。詳しくは、使用された濃度はｐＭｓＶＤＮＡ６
２５　ｎｇおよびｐａｉｎ　１９　ＤＮＡ　２５　ｎｇ
であり、１０℃で１６時間、総量１０μｌ中Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼ５単位の存在下で連結させる。この連Ｍ溶液
の半量を、コンピテントＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭＢ　５　
ｒｅｃＡ細胞内に形質転換させ、そしてカナマイシンス
ルフニー）５０μν’ＩＬＩ　、！：　５−シフ”コモ
−４−クロロ−５−インドリルガラクトシド（Ｘ−ｇａ
ｌ）４０μｇ／ｄで補足した°ルリアプロス′（ＬＢ）
−７ガー（２０））上にプレートアウトし、そして３７
゜で−晩培養した。

λｌ５Ｖ−挿入物を含む白いコロニーを選択し、／ｉ　
：／　テＡ配置（ｐＭｓＶ　１０９　）　中ノ二Ｊｉ体
ＭＳＶ　ｆ含むクローンをＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ　Ｃ５８Ｎａ　ｌ　”〔５５）３に接合することによ
り選択し、これはジ１り（Ｄｉｔｔａ　）等の記載によ
る方法で行った。非接合物の選択は、カナマイシン５０
１＠／ＩＬｔおよびナリジキシ酸５０μｍを含有するＬ
Ｂ−アガー上で行った。選択されたコロニーは、後記の
トウモロコシへの感染を開始するものであり、ｐｈｔｓ
ｖ１１４と分類する。

制御ベクターｐＥＡ２を製造するために、ｐＢＩＮ１９
の前駆体プラスミド〔２６）〕のプラスミドｐＲＫ　２
５２　／ｋｍｌ　（Ｄ　Ｓａｌ　［制限部位を８ａｌ　
ｌ切断プラスミドｐＢ６と連結する。

ｐＥＡ２の選択を、制御ベクターのカナ１イシン（Ｉ（
ｍ　’　）−およびクロラムフェニコール（Ｇｍ　Ｒ）
−′＃性に基づいて行う。

グラスミドｐＥＡＰ２５ｆｔ、菌株Ｅ、Ｃａｌ　ｉ　Ｇ
Ｊ　２３（ｐＧＪ２８　、Ｒ６ａ　ｒｄ　１１　）（３
５）　）のバクテリア内にクローン化する。このＥ、Ｃ
ｏ１１株は、Ａ、ｔｕｍｅ−ｆａｃｉｅｎｃｅ内に１〕
Ｏｍ切断部位を有するプラスミドの接合によりトランス
ファーを可能にする。プラスミ）’　９ｇＡ２　、　ｐ
ＥＡＰ３７　オよびｐＥＡＰ４０ｉ、”トリベアレンタ
ルメイティングゝを介してＡ。

ｔｕｒｎｅｆａｃｉｅｎｓ内に形質転換する（２３））
。使用される感受性法は、２つのＡ、　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ株である： １）二元ベクターｐＥＡＰ４０．ｐＥＡ２およびｐＥＡ
Ｐ５７のためのＣ５８（ｐＴｉＣ５８）２）　　７’　
ラスミ）’　ｐＥＡＰ２５　ノタメ（７）Ｃ５８（ｐＴ
ｉＣ５８，ｐＥＡＰ１８） Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　（７）野生型株は、”
　ｆｊ　Ａ／　ｆ　ヤーコレクション　オブ　ラボラト
リ−オプ　ミクロバイオロジー、ミクロバイオロジー　
デパートメント　オプ　ザ　ユニバーシティ　オプゲン
ト（Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ　ｏｆｔｈｅ　［Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ
　Ｇｅｎｔ　）　’から得られる。

ｐＥＡＰ２５　　：　アグロバクテリウム株ｃｓａ（ｐ
’ｒｉＣ５８，ｐＥＡＰ１８３は、プラスミドｐＥＡＰ
２５の感受性法として作用する。ｐＥＡＰ　１８は、プ
ラスミドｐＧＡ４７２〔２１）〕の６．７　Ｋｂ　Ｅｃ
ｏ几Ｉ−ＢａｔｎＨＩ断片を、プラスミドＰＨＣ７ｑ　
〔２７）　）の２．６ｋｂ　Ｅｃｏ几Ｉ−Ｂｇｌ亘断片
により置換した二元ベクターであシ、Ｔ　−ＤＮＡ境界
配列の間に、グラスミドｐＥＡＰ２５内の相同組換え領
域を含む。プラスミドｐＥＡＰ２５は、Ａ、ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ　　内で複製しなめため、リファムピシン
、カナマイシンおよびカルベニシリン上での非接合の選
択は、新規な７グロバクテリウム株Ａ、ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓｃｓｓ（ｐＴｉｃ５８．ｐＥＡＰ２９）を得、
その中にはプラスミドｐＥＡＰ２５が相同組換えにょシ
ニ元ベクターｐＥＡＰ１８内に加入されている。

ｐＥＡ’Ｐ５７　、　ｐＥＡＰａ　Ｏ：　Ｅ、ｃｏｌｉ
からのプラスミ）”　ｐＥＡＰ　３７　オよびｐＥＡＰ
４０　（Ｄ　”　トＩＪ　ヘアＬｚタルメイティングを
介するＡ、　ｔｕｒｎｅｆａｃｉｅｎｓ　ヘノ流動は、
二元ベクター系の製造を生じる。

ｐＥＡ２：制御プラスミドｐＥＡ　２を、既に存在して
いるＴ１−１ラスミドに対してトランス位に置くアグロ
バクテリウム株ｃｓａ　（ｐＴｉ０５８）内に挿入する
。

上記の方法で新規に製造したグラスミドを、ＤＮ人分離
および制限マツピングの方法により試験する。

本発明の範囲内で使用されるグラスミド、ｐＥＡＰ３７
　、　ｐＥＡＰ４０　オヨヒｐＭｓＶ１０９１ｄ、西ド
イツのゲッチンゲンにある１トイチエ　ザンムルング　
フォノ　ミクロオルガニズメン（Ｄｅｖｔｓｃｂｅ　Ｓ
ａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｎ　）　”（Ｄ８Ｍ）およびアバディーン１３５アベ
イロード、ピーオーボックス３１、トリイ　リサーチス
テーシランの１ザ　ナショナル　コレクショ／　オブ　
インダスリアル　バクテリア（ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌ
　Ｃｏ１１、ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩｎｄｕｓｔＶｉａ
ｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　）　’（ＮＣＩＢ）に寄託し、
両方とも本発明の目的のために微生物の寄託の国際協定
に関するプタベス条約の要求に従った国際寄託として認
められた。寄託された試料の生存に関する認定は、該国
際寄託機関により行われた。

前記微生物の利用に関する制限は、寄託者により要求さ
れていない。

接種の前に、アグロバクテリウム株を、使用前にリファ
ムビシン１００μν家およびカナマイシン２５μＶ−ま
たはナリジキシ酸５０μν官を増やし、１．５％アガー
で固化させたＹＥＢ培地〔バクトぎ−フエクストラクト
５ｇ／ｌ！、バクトイ−ストエクストラクト１ｇ／ｌ！
、ペプトン５７７／ｌ　。

サッカロースｓ　Ｉ／ｌ　、　Ｍｇ　８０４２ｍＭ、　
ｐＨ７，２）上にプレートアウトする。２８℃で４８時
間培養後、液体培養物を接種するために単一コロニーを
使用する。接種を、前記した濃度の抗生物質１増やした
液体ＹＥＢ培地の入った１００ｄエルレンマイヤーフラ
スコ中で行う。培養を、攪拌Ｍを２０　Ｏｒ、ｐｌｍの
速度にし２８℃で行う。培養時間は２４時間である。

第２の継代培養工程を、１：２０の希釈比で、他の条件
を同一にして、液体培地中で行つ。この場合の培養時間
は２０時間である。

これらの工程は、生存するアグロバクテリウムの個体濃
度的１０　／ｌ／ｍｌを導く。

バクテリアの細胞を遠心分離により集め、次いで等容量
の抗生物質を含まない１０　ｒｎＭ　Ｍｇ８（Ｊ４溶液
中に懸濁する。

この懸濁液は、下記の工程において未希釈法溶液として
引用する。一連の希釈系列を調製する場合、１ｏ　ｍＭ
　Ｍｇ５Ｏ，溶液を希釈液として再び使用する。

１ｉ［１１Ｊ１０：）ウモロコシの種子の殺菌と発芽ゴ
ールデン　クロス　パンタム、Ｂ７５、ノーめに使用し
、これらすべては成功裡に農薬感染され得る。

下記の実験のために、一般に３葉期の予め殺菌された実
生を使用する。実生の殺菌は、次の工程からなる： １、０７％ＷΔ過塩素酸カルシウム塩中で種子の殺菌（
２ｓｏ＊溶液／Ｗｉ子１００個）。１子および溶液をマ
グネットスターラーを用いて十分に混合する。２０分後
、殺菌溶液をデカンテーシ舊ンする。

Ｚ　この方法で処理した種子を次に蒸留水で３回、各３
０分間洗浄する（２５０ｄ蒸留水／種子１００個）。

この方法で殺菌した種子を、次に既に殺菌した種子室に
導く。種子室は、各々が直径ａ５ｍを有する５個の殺菌
Ｍ　ａｃｈｅｒｅｙ　−Ｎ　ａｇｅｌ■丸型フィルター
および、およそ１０ｉ１ｊの殺菌水を含むベトリニであ
る。

これらの種子室の各々に２０個の種子を導き、そして暗
室で約３日間２８℃で培養する。

ひき続く接種実験のために、圧盤節と頂点の子葉鞘先端
との距離が１〜２偲である実生だけを使用する。しかし
ながら、あらゆる場合において、子葉鞘筒は明らかに区
別され得ることを確認しなければならない。

実施例１１：トウモロコシの実生の接種直径０．４ｍの
交換可能な針を取りつけたハミルトン皮下注射器（５０
μｌまたは１００μｚ）ｈ、′：下記３に記載した接種
溶液を、トウモロコシの実生に導入するために使用され
る。

気泡が形成されなりような方法で、接種溶液を皮下注射
器内に入れる。

１１．１．　１０日日目トウモロコシ植物体の妾櫨１０
日目のトウモロコシ植物体へのバクテリア含有懸濁液の
接ａｌを、種々の方法により、そして植物上の異なる部
位に行う。

１、　バクテリアの懸濁液２０μｌ！金上Ｂ１１１の葉
の１枚に施用し、葉全体が湿めるまでカーポランダム粉
を用いて該懸濁液ｆ：葉内にこすりつける（第１図中の
入部位）。

Ｚ　植物の中心部分 ａ）第−葉の葉舌のちょうど上方（第１図中のＢ部位） ｂ）　第−葉の葉舌の下方１　ｃｍ　（第１図中のＣ部
位） Ｃ）いわゆるルートカラーの植物の基部、偶発の根が後
に生長する分裂組織（第１図中のｆ）部位）に１００μ
ｌのハミルトン皮下注射器を用いてバクテリア懸濁液１
０μｌを注射する。

１１．２．！Ｓ５日目トウモロコシの実生の接種３日目
のトウモロコシの実生へのバクテリア懸濁液の接種を、
１００μｌのハルミトン皮下注射器を用いて実生内に注
射することにより行う。

１、　頂点の子葉鞘先端から始まり、子葉鞘節の領域に
至る子葉鞘を介して、皮下注射器を導入することにより
子葉鞘節内にバクテリア懸濁液を注入（第２図中のＥ部
位）。

２　頂点の子葉鞘先瑞の下方２１１ｍの子葉精白に直接
バクテリア懸濁液を注入（第２図中のＦ部位）。

五　子葉鞘節の上方２１の子葉精白に直接バクテリア懸
濁液を注入（第２図中のＣ部位）。

４、　子葉鞘節に直接バクテリア懸濁液を注入（（第２
図中のＨ部位）。

１　子葉鞘節の下方２　ｃｍの子葉精白に直接バクテリ
ア懸濁液を注入（第２図中の工部位）。

＆　胚盤節に直接バクテリア懸濁液を注入（第２図中の
Ｊ部位）。

Ｚ　根の先端に始まり、そして胚盤節の領域に至る第一
の根を介して皮下注射器を導入することにより、胚盤節
内にバクテリア懸濁液を注入（第２図中のに部位）。

１１、五　子葉鞘節の領域内の子葉鞘の切断３日目のト
ウモロコシの実生を、子葉鞘節の領域内の種々の点で切
り落す（第３図参照）。

１、　子葉鞘節の高さで直接 ２　子葉鞘節の上方Ｉｍ 五　子葉鞘節の上方２ｒｍ ４、　子葉鞘節の上方５ｒｔｙｓ 切落した実生を次に湿った土壌内に植え、ポイント６に
与えた条件に従って栽培する。

アグロバクテリウムでの実際の接種実験を、子葉鞘先端
が調製時子葉鞘節の上方２ｍを除去された実生で行う。

接種処理後直接、トウモロコシの実在を湿った土壌内に
植え、１００日目トウモロコシ植物体と同様の方法で、
２２℃±２℃、３０００−５０００ルクスの白色光（フ
ィリップス４００Ｗ／Ｇ／９／１２）で−足元を与え−
Ｃ栽培する。

植物を次に、新しく形成された葉の基部に黄色のドツト
および／またはストリークの出現を特徴とするウィルス
感染の徴候を日々観察する。

若い葉組織約４００η（新鮮を量）をまず、　組織、消
化を助けるために、５ＴＥＮ（１５％サッカロース、５
０　ｍＭ　）り又−Ｈｅ　ｌ　５０　ｍＭ　Ｎａ５ＥＤ
ＴＡ、　（Ｌ２５　ＭＮａｃｌ　、　ｐ）（ａ　）　　
（Ｌ５−１．０　ｔｄおよび砂（〜５０　ｖｑ　）を添
加して氷上でモータ中ホモジナイズする。ホモジネート
物を次に、小さい遠心分離チューブ（１，５ｄ）に移し
、卓上遠心分離機内最高速度で４℃、５分遠心分離する
。

上清を捨て、沈澱を先づ無菌の歯ブラシで攪拌しながら
、そして次【ポルテックスミキサーを短時間（５秒）使
用して、水冷５ＥＴ（１５％サー／　カＯ−ス、５０　
ｍＭ　Ｎａ、　ＥＤＴＡ、　５０　ｍＭ　トリス−ＨＣ
Ｌ　ｐＨ８）α５ｄ内に再懸濁する。引き続き、２０％
ＳＤＳ溶液１０μｌおよびプロテナーゼＫ　（２（ｌｙ
／ｄ）１００μｌを添加混合し、そして全体を次に小さ
いチューブ内で６８℃に１０分間加熱する。３Ｍ酢酸ナ
トリウム（１／１０容量）を添加後、消化物をフェノー
ル／クロロホルム（３：　１　）で２度抽出する。ＤＮ
Ａ　ｆ：次にエタノール２容量部添加して沈澱させ、そ
して−２０℃に一晩貯蔵する。卓上遠心機中最高の速度
で遠心分離し、（１０分間Ｉ　ＤＮＡ含有沈澱を得、こ
れを引き続きＴＥ緩衝液（４０ｍＭト！ｊスーＨＣＩ、
　１　ｍＭ　Ｎａ、　ＥＤＴＡ％ｐＨ８）　４０　ｔｔ
ｌ中に溶解させる。

分取したＤＮＡ溶液を１サザンプロツト°実験（３６）
　）に使用する。

＜ａ：１サザンプロッド１分析 抽出したＤＮＡを、１ず制限酵素で処理し、次いで１壬
アガロースゲル中の電気泳動を行い、ニトロセルロース
展上に移し〔３Ｇ）〕、そして検出される予めニックト
ランスレージ曹ンに晒した〔１）））Ｌ）ＮＡとハイブ
リッド形成させる（５Ｘ　１　ａｓ−１ｏ　ｘ　１ｏ’
　ｃ、ｐ、ｍ、／ｐｙのＤＮＡ％異活性）。

フィルター′Ｉｋ６５℃で３同各１時間、α０３Ｍクエ
ン酸ナトリウム水溶液で洗浄する。ノ・イブリッドＤＮ
Ａを２４〜４８時間Ｘ線フィルムを暗化することにより
可視化する。

結果： Ａ）１００日目トウモロコシ植物体の接（第１表は、１
［Ｌｌで述べた１００日目トウモロコシ植物体への接種
実験の結果を示す。

接種は、ｐＥＡＰ　３７　ＤＮＡを使用して行った。

１」］Ｌ 第１表の結果は明らかに、植物への施用の好ましい部位
はルートカラーの領域に局在していることを示し、処理
植物の６２％および４０％が感染の徴候を示すが、これ
に対し植物へのその他の陰種部位（Ａ、Ｂ、Ｃ）に接種
後の感染の徴候を示す植物数は、０かまたは無視できる
程小さい。

Ｂ）　　３日目のトウモロコシの実生の接種第２表は、
１α２で述べた３日目のトウモロコシの実生への接種実
験の結果を示す。

ｍｓは、ｐＥＡＰ３７　オヨびｐＥＡＰ４０　ＤＮＡ　
ｋ使用して行った。

第２表 第２表の結果は明らかに、トウモロコシの実生への施用
の好ましい部位は子葉鞘部の領域であることを示し、子
葉鞘部への直接にバクテリアの懸濁液を直接および間接
に施用すると、８３チおよび８８％または７８９６の植
物が感染され、実験したその他の施用部位と比較して明
らかに好ましいことを示す。懸濁液全子葉ｍＮＫ側部か
ら直接注射するか、または子葉鞘を介して間接に注射す
るかは、明らかに重要ではない。

ｃ）　　５日目のトウモロコシの実生の切断第３表は、
子葉鞘部の領域の種々の部位での子葉鞘の切断の後２週
間生存した実生の数を示す。

第５表 本方法で処理した実生の生存力を損うことが観察される
ことなしに、子葉鞘部の上方２１１ｔｌｌまで幼芽は除
去し得ることがわかる。子葉鞘部の上方１鰭だけの幼芽
の除去でさ乞、完全に生存可能な植物体が約６０％の結
果を示す。

第４表は、子葉鞘部の上方２ｆｆｉｍを除去した実生で
の接種実験の結果を示す。接種はｐＥＡＰ３７ＤＮＡ　
を使用して行った。

第４表 第４表の結果は明らかに、切断した実生の部位り、即ち
分裂組織領域が、該組織の周辺部分を占めるＭ部位よシ
も明らかに好ましいことを示す。

Ｄ）希釈実験 前記実施例９に記載したバクテリアの懸濁液を、抗生物
質を添加することなしにＹＥＢ培地で希釈し、そして下
記の濃度で子葉鞘節内に施用する。

非希択　　　　　　２　Ｘ　１０６　　　　８４／１０
２　（８２％）１０”　　　　　　　　２Ｘ　１０！　
　　　　４２／　５５　（７６％）１０”　　　　　　
　　２Ｘ　１０４　　　　５４／　５４　（６２％）１
０″′″３　　　　　　　　２Ｘ１０３　　　　　１９
１５６　（３４％）１０−４　　　　　　　　　　　０
　　　　　　　　　　０／　１０　　（＜１０易）１０
−５　　　　　　　　　０　　　　　　　　０／　１０
　（＜１０％）ＭＳＶ配列を含む二元ベクターの複製叔
がおよそ１０であり、そしてバクテリアは接種部位にお
いてさらに増えないと仮定すると、１０４バクテリアは
およそ４００　ｆｇ（４Ｘ　１０’ｇ）　（７）ＭＳＶ
−ＤＮＡを含む。

このことは、アグロバクテリウムが、双子葉宿主植物へ
トランスファーするのに匹敵する効率でアグロバクテリ
ウム力゛そのＤＮＡ　＝ｋ　）ウモロコシへトランスフ
ァーすることを意味する。

Ｅ）アグロバクテリウム宿主範囲 トウモロコシの他に、イネ科のその他の代表的な植物が
アグロバクテリウムによる感染に感受性で心ることを確
認することができた。

これらイネ科の種での接種実験の結果全第５表に示す： 第５表 より低い効果を示す結果のいくつかは、接種の間に生じ
る技術的な困難さに明らかに起因し得るが、これは植物
がある場合には非常に小さく、それ故に接種溶液の特定
の場所への注入を困難にする小さい茎径を有するためで
ある。

これとは別に、上記の結果は、トウモロコシの他に、多
くのイネ科の代表的植物をアグロバクテリウムにより形
質転換することができることを示す。

Ｆ）　アグロバクテリウム株 トウモロコシへの接種実験に一貫して使用したＡ、　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｃ５８株に加えて、その他のＡ
。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡ、　ｒｌｘｉｚｏｇｅ
ｎｅｓ　の株も試験した。下記の第６表にあげたアグロ
バクテリウムのａを用いて、ＭＳＶ−ＤＮＡのトウモロ
コシへのトランスファーを検出することもできた：串１
　ｐＭｓＶｌｏｑ　　でｏ接種実験は、１０日口のトウ
モロコシ植物体で行った。

・２　　ｐＥＡＰ　５７での接種実験は、３日目のトウ
モロコシの実生で行った。

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、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１１
８：　６５０−６５３頁、１９Ｅ１６年２４）　　トハ
エセ　ビー（Ｄｈａｅｓｅ　Ｐ　）等、　Ｎｕｃｌ、Ａ
ｃ１ｄｓと、ヱ：　１８３７−１８４９貞、１９７９年
２５）ホルスターズ（Ｈｏ１ｓｔｅｒｓ　）等、　Ｐｌ
ａｓｍｉｄ、　５　：　２１２頁、１９８０年 ２６）ベバｙ　　エム（Ｂｅｖａｎ　Ｍ、）　、　Ｎｕ
ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

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ビーおよびニーリン　ジエイ（Ｈｏｈｎ、　Ｂ、　ａｎ
ｄＣｏｆｆｉｎｓ、　Ｊ、）、　Ｇｅｎｅ　１１　、２
９１−２９８頁（１９８０年） ２８）グリ７ドＬ／−ｚヌ　デ４−！７）等、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ。

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Ｈ）等。

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びテ冒ン　エスエヌ）Ｊ。

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１９７８年）５１）　ｙｌｙＹ　　デ４−　ｘ　−（Ｍ
ｅａｄ　ＤＡ　）等、　ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ　１　、６７−７４頁、（１９８６年）３２）
ロートスタインエスジェイ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　８Ｊ
　）等。

Ｇｅｎｅ、　５３　、１５３−１　ｂ１頁、（１９８７
年）３３）へツブバーン（）ｌｅｐｂｕｒｎ　）等、・
・・・・・・・・・・・（１９５５年）３４）ジッタ　
シイ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５
ｃｉ０．ＵＳＡ。

７７　（１２）　、７３４７−７３５１頁、（１９８０
年）３５）　／＜ンホイｆ　　イー（Ｖａｎ　Ｈａｕｔ
ｅＥ）等、ＥＭＢＯＪ、　２．　Ｎｏ、３　４１１−４
１７頁、（１９ａｓ年）第１図は、本発明の実施例にお
ける１０日口のトウモロコシ植物体へのバクテリア懸濁
液の接種部位を示す説明図、 第２図は、本発明の実施例における３日目のトウモロコ
シの実生へのバクテリア懸濁液の接種部位を示す説明図
、 第３図は、本発明の実施例における５日目の切断したト
ウモロコシの実生へのバクテリア懸濁液の妥種部位を示
す説明図である。

特許出願人　　チバーガイギー　マフ命１〉イ亀”ゝ′
’Ｊ”７′″つプ゛ｌシーｖ−，す°ｔλそ残、ｑス　
ベンつ一ス！し一ヲ１’／ｌｉ’ほか２名 第１図 第２図 第３図 １ｍｍ

Claims (69)

【特許請求の範囲】
1. （１）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺伝
   物質を単子葉植物またはそれらの生育可能な部分に挿入
   可能であるトランスファー微生物を、該トランスファー
   微生物の毒性遺伝子作用の誘導を可能にする適当な培養
   方法および適用方法を用いることにより単子葉植物の感
   染のために使用可能とし、そして単子葉植物またはそれ
   らの生育可能な部分を前記トランスファー微生物で感染
   させることを特徴とする遺伝物質を単子葉植物またはそ
   れらの生育部分に挿入する方法。
2. （２）トランスファー微生物を、それ自体が公知の培地
   中で増殖させ、所望により１またはそれ以上の継代培養
   工程を行い、そのトランスファー微生物を遠心分離し、
   そして次いで適当な培地中に再懸濁し、そして生成した
   接種溶液を単子葉植物の生長領域に導入することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）トランスファー微生物を３０ないし６０時間の間
   攪拌された該トランスファー微生物の培養に適する培地
   中、１５ないし４０℃の培養温度で増殖させ、そして次
   いで所望により１回またはそれ以上の継代培養工程を行
   い、これらの継代培養工程の各々を１５ないし３０時間
   の間、１５ないし４０℃の温度で続けることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. （４）トランスファー微生物の培養時間および所望によ
   る継代培養工程の培養時間が４０ないし５０時間である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）トランスファー微生物の培養温度および所望によ
   る継代培養工程の培養温度が２４ないし２９℃であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。
6. （６）アガロースまたはアルギネートまたはあらゆる他
   の適当な固形化剤で固形化された培地を使用することを
   特徴とする特許請求の範囲第１ないし３項のいずれか１
   項に記載の方法。
7. （７）植物またはそれらの生育部分の分裂組織領域に微
   生物懸濁液の形態で、トランスファー微生物を、接種す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）微生物懸濁液を繰り返し接種することを特徴とす
   る特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）植物の発生段階および分化段階に関する接種の時
   期、および植物の接種部位を、形質転換の頻度が著しく
   増大するように調整することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
10. （１０）植物胚の発生初期と催花初期との間の発生段階
    にある植物に、形質転換する微生物懸濁液の接種を行う
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
11. （１１）感染される植物が、種子の発芽と４葉期との間
    の発生段階であることを特徴とする特許請求の範囲第１
    ０項記載の方法。
12. （１２）植物が、発芽期の第１日目、第２日目または第
    ３日目にあり、胚盤節と頂点の子葉鞘先端との距離が約
    １ないし３ｃｍであることを特徴とする特許請求の範囲
    第１１項記載の方法。
13. （１３）形質転換する微生物懸濁液の接種を、植物の分
    裂組織領域への注射により行うことを特徴とする特許請
    求の範囲第７項記載の方法。
14. （１４）形質転換する微生物懸濁液を、既に根、茎およ
    び葉に分化した小植物のルートカラーの領域に注射する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載の方法。
15. （１５）形質転換する微生物懸濁液を、子葉鞘節近傍の
    実生に注射することを特徴とする特許請求の範囲第１３
    項記載の方法。
16. （１６）形質転換する微生物懸濁液を、子葉鞘節に、ま
    たは子葉鞘節の周囲約２ｍｍの部分内に直接注射するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の方法。
17. （１７）形質転換する微生物懸濁液を、子葉鞘先端を切
    り落とした後の子葉鞘の分裂組織領域に直接注射するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載の方法。
18. （１８）子葉鞘先端を、子葉鞘部の上方１ないし５ｍｍ
    の部分で切り落としたことを特徴とする特許請求の範囲
    第１７項記載の方法。
19. （１９）遺伝物質が、所望により組入れたカルゴ−ＤＮ
    Ａを含んでいても良いウィルスＤＮＡであることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
20. （２０）ａ）所望により組入れられたカルゴ−ＤＮＡを
    含むウィルスＤＮＡを、Ｔ−レプリコン中の１個または
    それ以上のＴ−ＤＮＡ境界配列の付近に、該ウィルスＤ
    ＮＡと該Ｔ−ＤＮＡ境界配列との距離を、存在しても良
    いカルゴ−ＤＮＡを含むウィルスＤＮＡが植物材料中に
    トランスファーされるように選択して組込み、ｂ）引き
    続いて、前記Ｔ−レプリコンが適当なトランスファー微
    生物内に吸収されるようにして、該レプリコンを該トラ
    ンスファー微生物中に移し、 ｂ）に従って変性されたトランスファー微生物で単子葉
    類の植物を感染させることを特徴とする所望により組入
    れられたカルゴ−ＤＮＡを含むウィルスＤＮＡを単子葉
    類の植物に挿入する特許請求の範囲第１９項記載の方法
    。
21. （２１）ａ）ウィルスＤＮＡまたはその等価物を、感染
    した植物材料から単離し、そして宿主器官内の適当なベ
    クターの作用でクローン化し、ｂ）そのクローン化した
    ウィルスＤＮＡまたはその一部並びにそれらの中に組入
    れられても良いカルゴ−ＤＮＡを用いて、ウィルス ＤＮＡとＴ−ＤＮＡ境界配列との距離を、それらの中に
    組入れられても良いカルゴ−ＤＮＡを含むウィルスＤＮ
    Ａが植物材料中にトランスファーされるように選択して
    、１個またはそれ以上のＴ−ＤＮＡ境界配列の付近に局
    在化している１個以上のウィルスゲノムまたはウィルス
    ゲノムの一部並びにそれらの中に組入れられても良いカ
    ルゴ−ＤＮＡを含むバクテリアプラスミド（ＢａＰ）を
    形成し、 ｃ）前記プラスミドＢａＰを適当なトランスファー微生
    物内にトランスファーさせ、植物に使用し得るベクター
    系を形成し、 ｄ）このように変性されたベクター系で、単子葉類の植
    物またはそれらの生育部分を感染させることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１９項記載の方法。
22. （２２）ウィルスＤＮＡとして、一重鎖ＤＮＡウィルス
    の二重鎖ＤＮＡ体を使用することを特徴とする特許請求
    の範囲第１９ないし２１項のいずれか１項に記載の方法
    。
23. （２３）ウィルスＤＮＡとして、ジェミニウィルスのＤ
    ＮＡを使用することを特徴とする特許請求の範囲第２２
    項記載の方法。
24. （２４）ウィルスＤＮＡとして、マイズ　ストリーク　
    ウィルス（ＭＳＶ）、ビーン　ゴールデンモザイク　ウ
    ィルス（ＢＧＭＶ）、クロリスストリエート　モザイク
    　ウィルス（ＣＳＭＶ）、カサバ　レイテント　ウィル
    ス（ＣＬＶ）、カーリィ　トップ　ウィルス（ＣＴＶ）
    、トマトゴールデン　モザイク　ウィルス（ＴＧＭＶ）
    またはウィート　ドウオルフ　ウィルス（ＷＤＶ）のＤ
    ＮＡを使用することを特徴とする特許請求の範囲第２３
    項記載の方法。
25. （２５）使用されるウィルスＤＮＡが天然のウィルスＤ
    ＮＡであることを特徴とする特許請求の範囲第１９ない
    し２１項のいずれか１項に記載の方法。
26. （２６）ウィルスＤＮＡとして、カリフラワー　モザイ
    ク　ウィルスを使用することを特徴とする特許請求の範
    囲第２５項記載の方法。
27. （２７）ウィルスＤＮＡとして、ウィルスＲＮＡのｃＤ
    ＮＡ複製物を使用することを特徴とする特許請求の範囲
    第１９ないし２１項のいずれか１項に記載の方法。
28. （２８）ウィルスＤＮＡとして、ウィロイドＲＮＡのｃ
    ＤＮＡ複製物を使用することを特徴とする特許請求の範
    囲第１９ないし２１項のいずれか１項に記載の方法。
29. （２９）ウィルスＤＮＡとして、ウィルスの致死または
    生育突然変異体のウィルスＤＮＡを使用することを特徴
    とする特許請求の範囲第１９ないし２１項のいずれか１
    項に記載の方法。
30. （３０）ウィルスＤＮＡとして、ウィルス複製シグナル
    の制御下にあるクローン化ＤＮＡを使用することを特徴
    とする特許請求の範囲第１９項記載の方法。
31. （３１）ウィルスＤＮＡとして、ウィルス発現シグナル
    の制御下にあるクローン化ＤＮＡを使用することを特徴
    とする特許請求の範囲第１９項記載の方法。
32. （３２）ウィルスＤＮＡとして、ウィルス複製および発
    現シグナルの制御下にあるクローン化 ＤＮＡを使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
    ９項記載の方法。
33. （３３）ウィルスＤＮＡとして、真核生物の複製および
    発現シグナルの制御下にあるクローン化ＤＮＡを使用す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１９項記載の方法
    。
34. （３４）ウィルスＤＮＡとして、ウィルスＤＮＡの部分
    を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１９項記
    載の方法。
35. （３５）ウィルスＤＮＡをタンデム型で使用することを
    特徴とする特許請求の範囲第１９項記載の方法。
36. （３６）ウィルスＤＮＡまたはそれらの等価物をタンデ
    ム型で使用することを特徴とする特許請求の範囲第１９
    ないし３４項のいずれか１項に記載の方法。
37. （３７）組込まれたカルゴ−ＤＮＡを有するウィルスＤ
    ＮＡを使用することを特徴とする特許請求の範囲第１９
    ないし３６項のいずれか１項に記載の方法。
38. （３８）組込まれたカルゴ−ＤＮＡを有するウィルスＤ
    ＮＡまたはそれらの等価物を使用することを特徴とする
    特許請求の範囲第１９ないし３６項のいずれか１項に記
    載の方法。
39. （３９）バクテリアのＴ−レプリコンを使用することを
    特徴とする特許請求の範囲第２０項または第２１項記載
    の方法。
40. （４０）アグロバクテリウム種のバクテリアのＴ−レプ
    リコンを使用することを特徴とする特許請求の範囲第３
    ９項記載の方法。
41. （４１）使用されるＴ−レプリコンがアグロバクテリウ
    ム種のバクテリアのＴｉ−プラスミドまたはＲｉ−プラ
    スミドであることを特徴とする特許請求の範囲第３９項
    または第４０項記載の方法。
42. （４２）特許請求の範囲第３９ないし４１項のいずれか
    １項に記載のＴ−レプリコンを提供する微生物として、
    バクテリアを使用することを特徴とする特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
43. （４３）Ｔ−レプリコンを提供する微生物として土壌細
    菌を使用することを特徴とする特許請求の範囲第４２項
    記載の方法。
44. （４４）Ｔ−レプリコンを提供する微生物としてアグロ
    バクテリウム種のバクテリアを使用することを特徴とす
    る特許請求の範囲第４３項記載の方法。
45. （４５）カルゴ−ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまた
    は合成ＤＮＡからなることを特徴とする特許請求の範囲
    第３８項記載の方法。
46. （４６）カルゴ−ＤＮＡがゲノムＤＮＡ並びにｃＤＮＡ
    および／または合成ＤＮＡから構成されることを特徴と
    する特許請求の範囲第３８項記載の方法。
47. （４７）カルゴ−ＤＮＡがさまざまな属に属する種々の
    有機体の遺伝子断片から構成されることを特徴とする特
    許請求の範囲第３８項記載の方法。
48. （４８）カルゴ−ＤＮＡが１株以上、１変種以上または
    １種以上の同一有機体の遺伝子断片から構成されること
    を特徴とする特許請求の範囲第３８項記載の方法。
49. （４９）カルゴ−ＤＮＡが１属以上の同一有機体の部分
    から構成されることを特徴とする特許請求の範囲第３８
    項記載の方法。
50. （５０）単子葉植物の生育部分として、植物組織培養物
    または細胞培養細胞を使用することを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
51. （５１）植物またはそれらの生育部分として、アリアセ
    アエ、ヒガンバナ科、アスパラガセアエ、パイナップル
    科、イネ科、ユリ科、バショウ科、ラン科またはヤシ科
    の植物を使用することを特徴とする特許請求の範囲第５
    ０項記載の方法。
52. （５２）植物またはそれらの生育部分として、イネ科の
    植物を使用することを特徴とする特許請求の範囲第５１
    項記載の方法。
53. （５３）植物またはそれらの生育部分として、トウモロ
    コシ、コメ、小麦、大麦、ライ麦、オート麦またはアワ
    を使用することを特徴とする特許請求の範囲第５２項記
    載の方法。
54. （５４）植物またはそれらの生育部分として、ネギ属、
    カラスムギ属、オオムギ属、イネ属、パニクム属、サト
    ウキビ属、ライムギ属、セタリア属、モロコシ属、コム
    ギ属、トウモロコシ属、バショウ属、ココス属、フェニ
    ックス属、エラエイス属の植物またはこれら植物の部分
    を使用することを特徴とする特許請求の範囲第５０項記
    載の方法。
55. （５５）プロトプラストをトランスファー微生物と共に
    培養することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
56. （５６）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺
    伝物質を単子葉植物またはそれらの生育可能な部分に挿
    入可能であるトランスファー微生物であって、毒性遺伝
    子作用の誘導を可能にする適当な培養方法および適用方
    法を用いることにより単子葉植物の感染のために使用可
    能とすることができ、そして単子葉植物またはそれらの
    生育可能な部分を感染させ得ることを特徴とするトラン
    スファー微生物またはそれらの部分。
57. （５７）プラスミドｐＥＡＰ３７もしくはｐＥＡＰ４０
    、またはこれらプラスミドの１つを含有するトランスフ
    ァー微生物。
58. （５８）プラスミドｐＭＳＶ１０９または該プラスミド
    を含有するトランスファー微生物。
59. （５９）寄託番号ＤＳＭ４１４７の下に寄託した形質転
    換された大腸菌株ＤＨ１（ｐＥＡＰ３７）、および該株
    の特性を依然有するそれらの全ての誘導体および突然変
    異体。
60. （６０）寄託番号ＤＳＭ４１４８の下に寄託した形質転
    換された大腸菌株ＤＨ１（ｐＥＡＰ４０）、および該株
    の特性を依然有するそれらの全ての誘導体および突然変
    異体。
61. （６１）寄託番号ＮＣＩＢ１２５４７の下に寄託した形
    質転換された大腸菌株ＪＭ８３＾Ｒ＾ｅ＾ｅ＾Ａ、およ
    び該株の特性を依然有するそれらの全ての誘導体および
    突然変異体。
62. （６２）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺
    伝物質を単子葉植物またはそれらの生育可能な部分に挿
    入可能であるトランスファー微生物を、該トランスファ
    ー微生物の毒性遺伝子作用の誘導を可能にする適当な培
    養方法および適用方法を用いることにより単子葉植物の
    感染のために使用可能とし、そして単子葉植物またはそ
    れらの生育可能な部分を前記トランスファー微生物で感
    染させ、該植物およびそれらの後代の体細胞および／ま
    たは胚細胞の大部分を形質転換させたことを特徴とする
    単子葉植物およびそれらの後代。
63. （６３）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺
    伝物質を単子葉植物またはそれらの生育可能な部分に挿
    入可能であるトランスファー微生物を、該トランスファ
    ー微生物の毒性遺伝子作用の誘導を可能にする適当な培
    養方法および適用方法を用いることにより単子葉植物の
    感染のために使用可能とし、そして単子葉植物またはそ
    れらの生育可能な部分を前記トランスファー微生物で感
    染させ、該植物およびそれらの後代の体細胞および／ま
    たは胚細胞の大部分を形質転換させたことを特徴とする
    単子葉植物およびそれらの後代の種子。
64. （６４）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺
    伝物質を単子葉植物またはそれらの生育可能な部分に挿
    入可能であるトランスファー微生物を、該トランスファ
    ー微生物の毒性遺伝子作用の誘導を可能にする適当な培
    養方法および適用方法を用いることにより単子葉植物の
    感染のために使用可能とし、そして単子葉植物またはそ
    れらの生育可能な部分を前記トランスファー微生物で感
    染させることにより形質転換されたことを特徴とする単
    子葉植物またはそれらの生育部分。
65. （６５）形質転換された部分が種子、花粉、胚珠、接合
    子、胚または形質転換された生殖系列細胞から生じるそ
    の他の生殖器官であることを特徴とする特許請求の範囲
    第６４項記載の単子葉植物の生育部分。
66. （６６）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺
    伝物質を単子葉植物の生育可能な部分に挿入可能である
    トランスファー微生物を、該トランスファー微生物の毒
    性遺伝子作用の誘導を可能にする適当な培養方法および
    適用方法を用いることにより単子葉植物の感染のために
    使用可能とし、そして単子葉植物の生育可能な部分を前
    記トランスファー微生物で感染させることにより形質転
    換された単子葉植物の生育部分から再生されたことを特
    徴とする完全に形質転換された植物。
67. （６７）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺
    伝物質を単子葉植物またはそれらの生育可能な部分に挿
    入可能であるトランスファー微生物を、該トランスファ
    ー微生物の毒性遺伝子作用の誘導を可能にする適当な培
    養方法および適用方法を用いることにより単子葉植物の
    感染のために使用可能とし、そして単子葉植物またはそ
    れらの生育可能な部分を前記トランスファー微生物で感
    染させることにより生じ、および形質転換によって生じ
    た新たな性質を有する形質転換されたプロトプラスト、
    植物細胞、細胞集合体、植物および種子およびそれらの
    後代。
68. （６８）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺
    伝物質を単子葉植物またはそれらの生育可能な部分に挿
    入可能であるトランスファー微生物を、該トランスファ
    ー微生物の毒性遺伝子作用の誘導を可能にする適当な培
    養方法および適用方法を用いることにより単子葉植物の
    感染のために使用可能とし、そして単子葉植物またはそ
    れらの生育可能な部分を前記トランスファー微生物で感
    染させることにより生じ、および形質転換によって生じ
    た新たな性質を有する形質転換された植物材料との全て
    のハイブリッド形成物および融合物。
69. （６９）移送可能な形態で遺伝物質を含み、そして該遺
    伝物質を単子葉植物またはそれらの生育可能な部分に挿
    入可能であるトランスファー微生物であって、毒性遺伝
    子作用の誘導を可能にする適当な培養方法および適用方
    法を用いることにより単子葉植物の感染のために使用可
    能とすることができ、そして単子葉植物またはそれらの
    生育可能な部分を感染させ得ることを特徴とするトラン
    スファー微生物を、植物の保護において、望ましくない
    ウィルスの攻撃に対して植物を免疫感作するために使用
    する方法。