JPS6314693A - 植物ウイルスｒｎａベクタ− - Google Patents

植物ウイルスｒｎａベクタ−

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JPS6314693A
JPS6314693A JP61158443A JP15844386A JPS6314693A JP S6314693 A JPS6314693 A JP S6314693A JP 61158443 A JP61158443 A JP 61158443A JP 15844386 A JP15844386 A JP 15844386A JP S6314693 A JPS6314693 A JP S6314693A
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JP
Japan
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rna
coat protein
transcription
gene
vector
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JP61158443A
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English (en)
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Yoshimi Okada
岡田　吉美
Tetsuo Han
飯　哲夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Sumitomo Chemical Co Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、植物ウィルスＲＮ　Ａ−ベクター、該ＲＮＡ
ベクター製造用転写・ベクターお、１、びこれらの製造
法並びに植物細胞への外来遺伝子の導入方法に関する。
・従来技術 トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉ　ｒｕｓ）は、タバ
コ、トマト、ササゲ、キュウリ等の植物から分離される
棒状ＲＮＡウィルスであり、タバコ、トマト等を宿主と
するタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）及びキュウリ等
を宿主Ａするキュウリ緑斑モザイクウィルス（ＣＧＭＭ
Ｖ）等がこれに属する。
ＴＭＶは、タバコから単離された普通系、トマト、ササ
ゲから単離されたトマト系やササゲ系等の数種類がある
ことが知られている。
すでに、トマト系Ｔ、ＭＶ−Ｌ株やその弱毒株ＴＭＶ−
ＬＩＩＡ株等の数種類のトバモウイルスの塩基配列が決
定され、報告されている（例えば、ＮｉｓｈｉＮ１５ｈ
ｉ　ｅｔ　ａｌ、：　Ｎｕｃｌｅｉｃ、　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　１３゜５５８５　（１９８５）；開田：細胞
工学Ｖｏ１．４．　Ｎｏ、１１．　Ｐ、９７９−９９０
　　（１９’８５）　”）。
また、ＴＭＶ−Ｌ株およびＴＭＶ−Ｌ、、Ａ株ＲＮＡの
完全長ｃＤＮＡを作成し、これをアールキスト（Ａｈｌ
ｑｕｉｓｔ）らの開発した転写ベクターｐＰＭ１へクロ
ーニングし、これを線状化した後、大腸菌のＲＮＡポリ
メラーゼでインビトロ転写反応を行い感染性ＴＭＶ−Ｒ
ＮＡを再生することに成功している。
本発明らは、１〜バモウイルスＲＮＡを植物細胞の形質
転換に用いる植物ベクターに利用する目的で更に研究を
進め、本発明を完成した。
発明の概要 本発明は、植物細胞への外来遺伝子の導入に用いるＲＮ
Ａベクター、該１’？ＮＡベクターの製造用転写ベクタ
ーおよびこれらを製造する方法および植物細胞への外来
遺伝子の導入方法を提供する。
発明の詳細な説明 本発明のＲＮＡベクターは、Ｉ・ハモウィルスのコート
タンパク遺伝−ｊ’ｐｆｌ域を所望の外来遺伝子で置換
することにより製造することができる。
トバモウイルスのゲノムには、ウィルス複製に関与して
いるタンパクであるとｔｌｌ、定されている２種類のタ
ンパク、３０にタンパクおよびコートタンパクの４種類
のタンパクがコードされていることが知られており、Ｔ
ＭＶについて言えば、１３０にタンパクおよびそのリー
ドスルータンパクである１８０にタンパク、３０にタン
パクおよびコートタンパクの４種類の遺伝子から成り立
っていることが知られている。　本発明のＲＮＡベクタ
ーは、このコートタンパクをコードする遺伝子領域を外
来遺伝子で置換することにより製造することができる。
このＲＮＡベクターの製造は、以下の工程により実施す
ることができる。
１）ウィルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを合成２）ウィル
スＲＮＡの完全長ｃＤＮＡのコートタンパクをコードす
る領域が外来遺伝子で置換された完全長の組み換えｃＤ
ＮＡを含む転写ベクターを構築 ３）上記の転写ベクターを線状化 ４）線状化された転写ベクターを常法によりＲＮＡポリ
メラーゼによる転写反応を行い、目的の組み換えＲＮＡ
ベクターを製造する。
この際、ｍ　’　Ｇ　ｐｐｐ　Ｇの存在下にＲＮ　Ａポ
リメラーゼにより転写反応を行い、ＲＮ　Ａの５゛末端
をキャップ構造でブロックした場合には、植物細胞への
組み換えＲＮＡの感染性が顕著に増大するが、ＲＮＡの
５゛末端をキャンプ構造でブロックすることは必須では
ない。　また、ＲＮＡの３゛末端については、３゛末端
を越えて多くのヌクレオチドが接続してないことが望ま
しく、転写ベクターによるｃＤＮＡからのＲＮＡの転写
に際し、ＲＮＡの３゛末端で正ｉｌｌに転ｆｆｊ゛が終
了することが望ましい。　この為に、鋳型となるｃＤＮ
Ａ３”末端の直近に適当な制限酵素（例えば、Ｍ　ｌ　
ｕ　Ｔ　）による切断部位を組め込み、転写の前に、そ
こでｃＤＮＡを切断することにより転写を停止させるこ
とが望ましい。
上述の転写ベクターとしては、複製開始領域、選択マー
カー、プロモーターおよび転写開始点の直後に鋳型とな
るＤＮＡの挿入部位および挿入されたＤＮＡのすぐ下流
に制限酵素切断部位を有するすでに公知の転写・ベクタ
ーを用いることができる。　例えば、アールキスト（Ａ
ｈｌｑｕｉｓｔ）の開発したｐＰＭｌ等（本ベクターに
関しアグリジエネテイクス　リサーチ　アソシエイツ　
リミテッドが特許出願：公開特許公報　昭和６１年５７
７９号を出願しており、本ベクターを業として使用する
場合は、権利者の承諾を必要とする。本願発明に至る実
験において、アールキスト氏から提供されたｐＰＭｌを
用いた。）の公知の転写ベクターを用いることができる
。
ｐＰＭｌは、転写が挿入したｃＤＮＡの一番端から開始
し、ＲＮＡの３゛末端に相当する部分に制限酵素部位を
有し、この部位で切断し線状化後、転写することにより
ウィルスＲＮＡの３”末端をこえて感染性に影響を与え
る程度の余分なヌクレオチドを接続しないように工夫さ
れた転写用ベクターである。
本発明において、ベクターとして使用するトバモウイル
スとしては、トマト系、普通系、ササゲ系等のＴＭＶお
よびＣＧＭＭＶを用いることができる。　野生株および
植物に対し病徴を生じない感染性を示す自然度）°−株
あるいは組み換え技術により変異を生じさ−Ｕ弱毒化し
たものを用いることが可能である。
ウィルスＲＮへの完全１４のｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａは、逆転
写酵素でＲＮＡを逆転７ノ°する公知の方法で容易に作
成することができる。　例えば、１’　Ｍ　Ｖ　−Ｌ株
のゲノムＲＮＡ　（１〜（７２１５番１１）のｃＤＮ、
Ａおよび３°末端１’、６ＫｂのｃＤＮＡ、並びにＴＭ
Ｖ、Ｌ＋＋Ａ株の完全長ｃ、　Ｉ）　Ｎ　Ａをクローニ
ングしたプラスミドｐ　Ｌ　Ｔ　−１）　２７、　　ｐ
Ｌ−１−１３およびｐＬ＋＋Ａ　　Ａ２５などが公知で
あり、それぞれ０ｈｎｏ　ｅｔａｌ、：Ｊ、旧ｏｃｈｅ
ｍ、りｆｉ、　１９１５−１９２３（１９８４）　、　
Ｔａｋａｍａｓｔｕ　　ｃｌ　　ａｌ、：Ｎｕｃｌ　ｅ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　１１．３７６７−３
７７８（１９８３）　、およびＮｉｓｈｉｇｕＮ１５ｈ
ｉ　ａｌ、　：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
　１３．５５８５−５５９０（１９８５）に記載の方法
で製造できる。
本発明のＲＮＡベクターの製造に鋳型として用いられる
ＤＮＡは、ウィルスＴ？ＮＡの完全長ｃＤＮＡのコート
タンパクの遺伝子１ｉｒｆ域を外来遺伝子ＤＮ、Ａで置
換したＩ）　Ｎ　Ａを転写ベクターに組み込むことによ
り製造されるが、この組み換え転写ベクター自体の構築
は、遺伝子組み換えで用いられる常法を用いることによ
り行うことができる。
特に、第２図に示した転写ベクターｐＬＤＣ３２９の如
くトバモウイルスＲＮＡのｃＤＮＡのコートタンパク遺
伝子領域を除去し、この部分に外来遺伝子の挿入を可能
にする制限酵素切断部位を導入することにより構築した
複製開始領域、選択マーカー、プロモーターおよびコー
トタンパク遺伝子領域が外来遺伝子挿入のための制限酵
素切断部位へ変換された配列のトバモウィルスＲＮＡの
ｃＤＮＡから成り、該プロモーターの転写開始ヌクレオ
チドが該ｃＤＮＡの最初のヌクレオチドであるように接
続されているユニバーサル転写ベクターを用いることに
より容易に行うことができる。
このユニバーサル転写ベクターの外来遺伝子挿入部位に
所望の遺伝子を通常の遺伝子組み換え技術を用い挿入す
ることにより目的とする転写ベクターを構築することが
できる。
本発明により植物細胞へ導入される遺伝子としては、特
に限定されるものではないが、例えば、高温や低温に対
する耐性を改善する遺伝子、霜、害虫、病原微生物、ウ
ィルス等に対する耐性を改善する遺伝子、除草剤に対す
る耐性を改善する遺伝子、植物の成長に関与する遺伝子
、窒素固定化に関与する酵素等、光合成に関Ｊｊする遺
伝子、植物の栄養上の特性や風味に関ずろ遺伝子、有用
物質の遺伝子など種々の遺伝子が挙げられる。
植物細胞の形質転換＆、ｌ：　、１．述のようにして作
成した組み換えＲＮΔベクターを植物細胞へ感染させる
ことにより行うことができる。　この際、ウィルスのコ
ートタンパクを用いウィルスの再構成を行った後に、植
物−・接種！ｌ−るごとにより植物細胞へ感染させるこ
とに、１、す、感梁率を増大させることができる。　植
物細１１；シへの感染は、再構成反応液を必要に応じ水
、緩衝液等で適゛１′Ｉな濃度へ希釈後、あるいはウィ
ルスまたはＩ’？　Ｎ　Ａを緩衝液等で懸濁しカーボラ
ンダＪ、と共に植物・＼接種することにより行うことに
より容易に行うことができる。
対象となる植物とし“ζは、例えば、タバコやトマド等
のトバモウイルスが感染しうるちのであればよく、特に
制限はない。
以下に実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明する。
本発明は、この実施例にのみ限定されるものではなく、
本発明の技術分野において通常なされる変更および改良
を含むものである。
ＲＮＡベクターのｃＤＮＡの構築 ＴＭＶのコートタンパク遺伝子領域を外来遺伝子で置換
したｃＤＮＡを含む組み換えｃＤＮＡを以下のように製
造した。
なお、本実施例においてＤＮＡのクローニングには、大
腸菌Ｈ８１０１株を用いた。
■）完全長のクロラムフェニコール　アセチルトランス
フェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｅ
ｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　：　ＣＡ　Ｔ　）遺伝
子を含むプラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２５（Ｆ、Ｂｏｌｉｖ
ａｒ、　Ｇｅｎｅ　４，１２１　　（１９７Ｂ）　）か
らＢａｎ１フラグメントを切出し、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノー（ＫｌｅｎｏｌＩＩ）フラグメント
を用いフィルインした後、５ａｕ３ＡＩで消化すること
により０．７４Ｋｂフィルド−イン＋１３　ａ　ｎ　Ｉ
　／　Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａ　Ｉフラグメン（ＣＡＴの全
コード領域、　５９ｂｐの５゛非翻訳領域および２４ｂ
ｐの３°非翻訳領域を含む）を単離した。
転写ベクターｐｌ）、Ｍｌへ′Ｉ″ＭＶ−Ｌの完全長ｃ
ＤＮＡを組み込んだ公知の転写ベクターｐＬＦＷ３　（
石川ら：　第１１川１１本分子生物学会年会（１９８５
））をＡ　Ｖ　；Ｊ　Ｉ＋で消化し１”　Ｍ　Ｖ　−１
−のゲノムＲＮＡの６１ｆｌｉＯ化＋１に相当する個所
で切断し、クレノー（ＫＩｃｎｃ＋＋ｕ）フラグメント
を用いフィルインした後、更にｉ’　Ｍ　Ｖのｒ、　ｌ
）　ＮΔの４ｂｐＴ流において３ａｌｌで消化すること
によりＴＭＶの３゛末端部分および：Ｉ−１タンパク遺
伝子の２２ｂｐを含む０　、２　：（’Ｉ＜　ｂの）２
ｆルド−インＡｖａｌｌ／５ａｌｌＤＮＡ断片を得た。
　これらの２フラグメントを結合後、ｐ１目ン３２２の
１３　ａ　ｍ　ＨＩと５ａｌｌザイｌの間にりｕ　−＝
　７グし、ｐＣＡＴ３Ｌ−１０を構築した。
ｐｃＡＴ３１、−ＩＯをｐ　ＢＩ？　３２２由来のＥｃ
ｏＲＶサイトで切断し、　綿状化した後、Ｂａ１３１エ
キソヌクレアーゼで＜　　０．６Ｍｌ　　１− ＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８
）　　、１２ｍＭ　　ＭｇＣｊ！、、　１２ｍＭ　　Ｃ
ａＣｊ！２．１１．６μｇｐＣＡＴ３Ｌ−ｔｏ　／ｇｃ
、ｏＲＶ、２．６’ｕＢａ１３１エキソヌクレアーゼを
含む反応液中、３０℃、７，５分間反応”）ＣＡＴ遺伝
子の開始コドンの近くまで切り詰めた。
これに５ａｃＩリンカ−（１）ｄＣＧＡＧＣＴＣＧ）を
接続し、５ａｃｌおよび５ａｌｌで消化した後、ＣＡＴ
遺伝子およびＴＭＶの全３゛非翻訳領域を含むＤＮＡ−
ｔ−ｐＵＣｌ　８の５ａＣＩおよび５ａｌｌサイトの間
にクローニングした。　結合反応液を用いＥ、ｃｏｌｉ
ＨＢｌｏｌを形質転換し、アンピシリンおよびクロラム
フェニコールに耐性のコロニーからプラスミドを単離し
た。
グイデオキシ法でＤＮＡ配列を決定し、１ｏｂｐの５゛
　リーダー領域を゛含むＣＡＴ遺伝子およびＴＭＶの３
゛末端およびコートタンパクの一部を含むｐｔＣ３Ｌ″
５−２・を選択した。
一方、ｐ　、Ｌ　Ｆ　Ｗ　３コートタンパク遺伝子領域
中（７）ＢｓｔＥＩｒサイト（ＴＭＶゲノムＲＮＡの５
７９９番目に相当する部位））で消化し、　Ｂａ１３１
エキソヌクレアーゼで（０，６ＭＮａ’Ｃｐ２２０ｍＭ
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ７！　（ｐｌ＋８．０）　、１２ｍ
　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ７！ｔ、ｌ　２ｍＭＣａＣｊ！ｚ　、
１０．ｌｊｇＰ　Ｌ　Ｆ　Ｗ　３　／　Ｔｌ　ｓ　Ｌ　
ｌ’：　Ｔｌ、１．３ｕＢａ　１３１ｍｍキスクレアー
ゼを含む反応液中、３０℃、３分間反応）コートタンパ
ク遺伝子の開始コドンの近くまで切り詰めた。　これに
Ｓ　、Ｊ（二［リンカ−を接続した後、Ｓａ　ｃ’　ｌ
およびＫ　ｐ　ｎ　Ｔ’　（ＴＭＶゲノムの４３９０番
口に相当する部位）で消化した。
コートタンパクの上流を含む１．２５〜１．３５Ｋｂの
Ｓ　ａ　ｃ　Ｉ　／　Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉフラグメントをｐ
Ｕ’Ｃ１８のＳａｃ■およびに’ｐｎ！リーイトの間に
クローニングした。　上記と同様に大腸菌を形質転換後
、プラスミドを単離、１．）　Ｎ　Ａ配列を決定し、Ｔ
ＭＶの３０にタンパク遺伝子、１８０にタンパク遺伝子
の一部およびコートタンパク遺伝子Ａ’ＴＧに続く４ｂ
ｐを含むｐｔ５Ｌ２９を′選択した。
ｐＣＬ２９の構築： ｐｔ５Ｌ２９の１．３２Ｋｂの５ａｃＩ／Ｋｐｎｌフラ
グメント（１８０にタンパク遺伝子の一部、３０にり、
ンパク遺伝子およびコートタンパク遺伝子の開始コドン
およびその下流４ｂｐを含む）、ｐ　ｔｃ３Ｌ５−２の
０．９６３Ｋｂの５ａｃｌ／Ｍ　Ｉ　ｕ　Ｉフラグメン
ト（ＣＡＴ遺伝子およびその上流１０ｂｐ並びにＴＭＶ
の３゛末端領域を含む）およびｐＬＦＷ３のＫｐｎｌ／
Ｍｌｕｌフラグメントを結合しｐＣＬ２９を構築した。
このｐＣＬ２９は、ｐＬＦＷ３のＴＭＶコートプロティ
ン遺伝子領域をＣＡＴ遺伝子で置換された構造を有する
。
ｐ　ＣＬ　Ｂ　２９の構築： ｐｔ５Ｌ２９の５ａｃｌ／Ｋｐｎｌフラグメントおよび
ｐ　ｔＣ３Ｌ５−２の５ａｃＩ／Ｍ１ｕＩフラグメント
の５ａｃｌサイトをクレノーフラグメントでフィルアウ
トし平滑末端とした後、ｐＣＬ２９構築と同様に結合し
ｐ　ＣＬＢ　２９を構築した。
ユニバーサル転写ベクターｐＬＤＣ３２９の構築：コー
トタンパク遺伝子領域を除去し、この部分に外来遺伝子
の挿入を可能にする制限酵素切断部位（Ｓａｃｌ）を導
入したユニバーザル転写ベクターｐＬＤｃｓ２９を以下
のように、構築した。
ｐＬＦＷ３をＡ　Ｖ　ａ　ＩＩで消化、クレノーフラグ
メントでフィルインした後、３　ａ　ｃ、　ｌリンカ−
を接続し、５ａｃｌおよびＭ　ｌ　ｕ　Ｉで消化し、０
．２３Ｋｂの５ａｃｌ／Ｍｌｕｌフラグメント（ＴＭＶ
の３゛非翻訳領域およびコートタンパクのＣ末端２２ｂ
ｐを含む）を単離した。
このＳａ　ｃ　Ｉ／Ｍｌ　ｕＩフラグメントをｐｔ５Ｌ
２９から単離した１、３２Ｋｂの５ａｃｌ／Ｋｐｎｌフ
ラグメントおよびｐＬ、ＦＷ３から単離したＫ　ｐ　ｎ
　Ｉ　／　Ｍ　、１　ｕ　Ｉフラグメント（大きい方の
フラグメントを使用）と結合し、コートタンパク遺伝子
の５７１０−６１６０番目が除かれ５ａｃｌサイトを挿
入されたｐＬＤｃｓ２９を構築した。
転写： 上記のように製造した転写ベクターｐＣＬ２９、ｐＣＬ
Ｂ２９をＭ　Ｉ　ＩＪ　Ｉで消化後、大腸菌ＲＮＡポリ
メラーゼを用い公知法　（ＡＩ＋１ｑｕｉｓｔ　ｅｔ　
ａｌ。
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ
５Ａ　０１．７０６６−７０７０（１９８４）により転
写した。　得られたＲＮＡをフェノール抽出およびエタ
ノール沈澱で精製した。
これを公知の酢酸法（Ｆｒａｅｎｋｅｌ　−Ｃｏｎｒａ
ｔ、Ｈ。
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４．１−４（１９５７））で精製し
たＴＭＶの普通株のコートタンパク（４ｍ　ｇ　／　ｍ
　ｊ！　）を用い０、！Ｍリン酸ナナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ７，０）中で２０℃で１６時間処理しウィルス粒子再
構成を行った。
植物細胞への感染および発現： 上記のように再構築した反応液を緩衝液で５倍に希釈し
、Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　Ｓａｍｓｕｎ
　　の葉に塗布した。　１０日栽培した後、葉を採集し
抽出液（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５
）、２．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％アスコルビン酸
、０．５ｍＭロイペプチン、１　ｍＭＰＭｓＦ）を加え
、磨砕し、６０℃で１０分間加温した。　遠心分離（１
４，０００ｘ　ｇ、５分）後、上清を緩衝液で１０．０
μｎとし５μｌの１０ｍＭアセチルＣｏＡおよび０．０
６７μＣｉの１４Ｃラベル−クロラムフェニコール（５
３ｍＣｉ　／ｍｍｏ　Ｉ　；アマシャム）と混合し３７
℃で３０分間インキュベートした。　クロラムフＬ二二
１−ルおよびその誘導体を酢酸エチルで抽出し、減圧下
に乾固した後、５μｌの酢酸エチルに懸濁した。
このＬＰｆｉ＋液をクロロポルノ、／メタノール（９５
：５）を溶媒としシリガゲル薄層り１１マドグラフイー
にかけ、　クロラムソ丁−二ごＩ−）しおよびそのアセ
チル誘導体（ｌＡｃｃｍ：ｌ　　アセチルクロラムフェ
ニコール、　３ＡｃＣｒ＋＋：３−アセチルクロラムフ
ェニコール、　　Ｉ、３ＡｃＣｒｒｚ　ｌ、３−ジアセ
チルクロラムフェニコール）をオートラジオグラフィー
（室温、１６時間）により検出した。　結果を第６図に
示す。　この図中、レーンｌは、未反応１４　Ｃラヘル
−りロラムフェニコール（Ｃｍ）　、レーン、２は、転
回反応液を塗布してない対象植物の葉０．５ｍｇの抽出
物、レーン３は野生株のＴＭＶを感染させた植物の抽出
物、レーン４は、コートタンパク遺伝子を有しない転写
ベクターｐＬＤ、Ｃ３２９の転写産物、レーン５および
６は、ｐＣＬ２９およびｐＣＬＩ３２９の転写塵物を塗
布した植物の抽出物のものである。　レーン７は、０．
０３単位のＣＡＴの反応物のものである。
この結果から明らかなように、ｐＣＬ２９およびｐＣＬ
Ｂ２９によるＣＡＴの発現が確認された。
参考例 完全長のＴＭＶ−ＬのｃＤＮＡを含む転写ベクターｐＬ
ＦＷ３の構築： ＴＭＶ−ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの合成１）ＴＭＶ−Ｌ
株あるいは弱毒株Ｌ＋＋Ａをタバコに接種し増殖させた
。　感染されたタバコを磨砕後、ウィルス粒子を公知の
方法で精製し、次いでウィルス粒子からＲＮＡを公知法
（ＴａｋａＩＩａｔｕ　ｅｔ訂、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．３７６７−３７７８　（１９
８３））で精製した。このＲＮＡを過剰の合成プライマ
ー　（ＴＭＶ−ＲＮＡの３°末端の１８残基に相補的な
配列を有する。或いは、必要に応じ、　３゜末端の第９
番目に相当するＡをＴに変換したものを使用）とアニー
ルした。　このアニールしたＲＮＡを用い、５０　ＩＩ
　ｌ：　／　ｍ’　１．のアニールＲＮＡおよび２５０
単位／　ｍ　Ｉの逆転′す°酵素を含む反応液を調製、
これを４２℃、９０分間反応しｃ　ＤＮＡを合成した。
フェノール抽出、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収後
、＋１　、１　Ｎ　Ｎ　’ａ　ＯＨによりＲＮＡを分解
した。　これを５〜２０％　アルカリ−ショ糖密度勾配
遠心あるいは２．５％ポリアクリルアミド／８．３Ｍ尿
素ゲル電気泳動にかけ完全長のＲＮＡに相当するｃＤＮ
Ａを分取した。
上記のように合成した完全長ｃＤ’ＮＡに過剰の合成プ
ライマー（ＴＭＶ−４Ｎへの１〜１９残基に相当する配
列を有する）を加え！　ＯｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　
　　（ｐ　　Ｈ７，５）　　、　　Ｉ　　Ｏ’ｍＭＭｇ
Ｃ１ｚ　、５０ｍＭＮａＣρ中で、９０℃で５分間加熱
した後、徐々に冷却しアニールした。
このｃＤＮＡを１　ｔｌｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ！、
（１）’Ｈ７’、５）　、２’５ｍＭ　　ＮａＣ７，１
０ｒｒ＋ＭＭ　ｇ　Ｃ１２，５ｍＭジ千オスレイ１−ル
、０．２ｍＭの各ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ中で２５０中位／ｍ７
！の大腸菌ＤＮ−Ａポリメラーゼ１ラージフラグメント
を加え２１　”Ｃで３時間反応し二本鎖ｃＤＮＡに変換
した。
低融点アガロースゲルにより精製し完全長の二本鎖ｃＤ
ＮＡを得た。
完全長ｃＤＮＡのクローニング ｐＵｃＧ’Ｊ１の構築 ｐＵＣ９のポリリンカー配列部位にＭｌｕｌサイトを導
入するために、ｐ　Ｃ０９Ｆ　２　（Ｍｅｓｉ　ｅｔａ
ｌ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２７．５４−６４　（１９
８３）　；　ｃｕｃｏｍｂｅｒｇｒｅｅｎ　ｍｏｔｔｌ
ｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　　のＭ　ｌ　ｕ　Ｉサ
イトを含む約１．６Ｋｂを含む）のＱ、２１　Ｋ　ｂの
ＨｉｎｄｌｌＩ／フィル−インＭ　ｌ　ｕ　Ｉフラグメ
ントをｐＵ　Ｃ９（Ｖｉｅｉｒａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅ
ｎｅ　１９．２５９−２６８　（１９Ｂ２）のｌ（ｉ　
ｎ　ｄ　［７／フィルーイン５ａｌｌサイトへ挿入しｐ
ＵｃＧ９１を構築した。
ｐＵＣＧ９１のＭ　Ｉ　ｕ　Ｉサイト周辺の構造を第５
図にしめす。
ＴＭ’Ｖ＝Ｌ株の完全長ｃ’　Ｄ　Ｎ　Ａを含むプラス
ミドｐＬＦＷｌの構築 １）ｐＬＭ５１およびｐＬＭ３１の構築上記のようにし
て得られた完全長二本鎖ｃＤＮ２ｌ− ＝２０　＝ Ａ　（ＴＭＶ−Ｌ株）をＢ　ｇ　Ｉ　ＩＩで消化し、Ｒ
ＮＡの５°末端部分に相当する２、６２Ｋｂを得た後、
精製した。
これをｐ’Ｐ’Ｍ１のＰｍプロモーターを含む３．０３
ＫｂのＡａｔＴＩ／ＳｍａｌフラグメントおよびｐＵＣ
９の０．４７　Ｋ　ｂのＡａＬｎ／ＢａｍＨＩフラグメ
ントと結合した。　　結合したＤＮＡをＥ、　　ｃ　　
ｏ　　Ｉ　　ｉＭｃｌ　　０　６　１　　（Ｃａｓｄｒ
ｌａｂａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、：Ｊ９Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
ｌ、　１３８．１７’９−２０７　　（１９８０）　）
　ヘ形質転換した。　コロニーハイプリダイジョンおよ
び制限酵素地図を作成し、第４図に示した構造のｐＬＭ
５’ｌを゛含む大腸菌を選択した゛。
２）ｐＬＭ３１の構築 上記のようにしてｊｉｔられた完全長二本鎖ｃＤＮＡ（
ＴＭＶ−’Ｌ３°末端の第９番「１のＴがＡへ変換され
た変異体のｒ、１）ＮＡ）をｐ　ｓ　ｔ　ｌで消化し、
ＲＮＡの３“末端部分に相当する４、５４Ｋｂ４得た後
、精製した。
これをｐＵＣ９の２．１ＩＩＫｂのΔａｔｌｌ／Ｐｓｔ
ｌフラグメントおよびｐＵｃＧ９１の０．４９ＫｂのＡ
ａｔｌｌ／フィルインＭ　Ｉ　ｕ　Ｉフラグメントを結
合した。　結合したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉＭＣ１０６１
へ形質転換した。　コロニーハイブリディジョンおよび
制限酵素地図を作成し、第４図に示した構造のｐＬＭ３
１を選択した。
３）ｐＬＦＷｌの構築 ｐＬＭ３１のＰｓｔｌサイトに、ｐＬＭ５１のＰｓｔｌ
フラグメント（Ｐｍプロモーターおよび５”末端を含む
。）を挿入することにより完全長ｃＤＮＡを含むｐＬＦ
Ｗｌを構築した。
ｐＬＦＷ３の構築 ｐＬＦＷｌのＮｃｏｌ／Ａｐａｌフラグメントをｐ　Ｌ
　−１−１３（Ｔａｋａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．３７６−３７
７８　（１９８３）　　：約１　、６００ｂｐのＴＭＶ
−Ｌ株の３°末端の（、ＤＮＡを含む。）のＮｃｏｌ／
Ａｐａｌフラグメントで、ＥｃｏＲ１／Ｎｃｏｌフラグ
メントをｐＬＴ７Ｄ２７　（Ｏｈｎｏ　　ｅｔａｌ、：
Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、９６．　１９１５−１９２３
　　（１９８４）：ＴＭＶ−Ｌ株ＲＮＡの５”末端から
６２１５番までのｃＤＮＡを含む）のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ
　、／　Ｎ　ｃ　、ｏ　Ｉフラグメントで置換するごと
により第４図に示した構造のｐＬＦＷ３がｉｉＩられた
。
ｐＬＦＡｌの構築 上記と同様にｐ　ｌ　ＦＷ　１のｌ−Ｃｃ　ｏ　ＲＩ　
／　Ａ　ｐ　ａ　ＩフラグメントをｐＬｚΔ−八２５０
）ＥｃｏＲＴ／Ａｐａｌフラグメントで置換することに
よりＴＭＶ　　Ｌ＋＋Ａ株の完全Ｍ　（：　Ｄ　Ｎ　Ａ
を３．１１み込んだ転写ベクターｐＬＦＡＩを横築した
。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の転写ベクターｐＣＬ２９構築の概略
を示す図である。 図中Ｐｍは、アールキストの開発したｐＰＭ１由来のλ
ファージのプロモーターを表す。 １３０に／１８０Ｋ、３０におよびｃｐは、ＴＭＶの１
３０に／１８０にタンパク遺伝子、３０にタンパク遺伝
子およびコートタンパク遺伝子を表す。　その前後の四
角で囲んだ５および３は、それぞれ５°末端非翻訳領域
および３”末端非翻訳領域を表す。 第２図は、ユニバーサル転写ベクターｐ　ＬＤＣ３２９
構築の概要を表す図である。 第３図は、ＣＡＴ遺伝子を含む転写ベクターｐＣＬ２９
　（ｐＣＬ、Ｂ２９）　、転写ベクターｐ　ＬＤＣ３２
９およびＴＭＶ（７）ＲＮＡ、＋７）ｃＤＮＡを組み込
んだ転写ベクターｐＬＦＷ３のＤＮＡ構造を表す図であ
る。 第４図は、プラスミドｐＬＭ３１．ｐＬＭ５１゜ｐＬＷ
Ｆ　１、ｐＬＷＦ３、およびｐ−Ｌ−１−１３のＤＮＡ
構造を表す図である。 第５図は、ｐＵｃＧ９１、ｐＬＦＷｌ、ｐＬＦＷ３のＭ
　ｌ　ｕ　Ｉサイト周辺のＤＮＡ配列を表す図である。 第６図は、ＣＡＴの発現を確認する実験におけるオート
ラジオグラフィーの結果を示す図である。 完 一２５＝ 特ｆＬ’ＪＲ，ＶＧ３−１４６９３　（９）ｌ　　− −Ｈ ｄ　　φ　　！ ω　　■　　Σ１「÷１ →−〉 藁 ； あ 旧 ６諧　ｊを 第５図 ｐＵｃＧ９１のＭ　ｌ　ｕ　Ｉサイト周辺のＤＮＡ配列
ｐＬＦＷ１のＭｌｕＩサイト周辺のＤＮＡ配列ＡｐａＩ
　Ｍｌｕｌ ｐＬＦＷ３のＭ　１　ｕ　Ｉサイト周辺のＤＮＡ配列Ａ
ｐａＩ　ＭｌｕＩ 第６図 １．３ＡｃＣｍ ０　０、　　　　ＩＡｃＣｍ ｌＡｃＣｍ０００ ０ＤＯ４５６７

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）トバモウイルスＲＮＡのコートタンパク遺伝子領
    域を外来遺伝子で置換することにより製造した植物ＲＮ
    Ａベクター
  2. （２）トバモウイルスＲＮＡのコートタンパク遺伝子領
    域が外来遺伝子で置換された配列を有するトバモウイル
    スＲＮＡを転写産物とする転写ベクター
  3. （３）複製開始領域、選択マーカー、プロモーターおよ
    びコートタンパク遺伝子領域が外来遺伝子で置換された
    配列のトバモウイルスＲＮＡのｃＤＮＡからなり、該プ
    ロモーターの転写開始ヌクレオチドが該ｃＤＮＡの最初
    のヌクレオチドであるように接続されている特許請求の
    範囲第２項記載の転写ベクター
  4. （４）プロモーターがλファージのプロモーターである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２あるいは３項記載
    の転写ベクター
  5. （５）複製開始領域、選択マーカー、プロモーターおよ
    びコートタンパク遺伝子領域が外来遺伝子挿入のための
    制限酵素切断部位へ変換された配列のトバモウイルスＲ
    ＮＡのｃＤＮＡから成り、該プロモーターの転写開始ヌ
    クレオチドが該ｃＤＮＡの最初のヌクレオチドであるよ
    うに接続されているユニバーサル転写ベクター
  6. （６）ｐＬＤＣＳ２９として特定される特許請求の範囲
    第５項記載のユニバーサル転写ベクター
  7. （７）トバモウイルスＲＮＡのコートタンパク遺伝子領
    域を外来遺伝子で置換することにより製造した植物ＲＮ
    Ａベクター、あるいは該植物ＲＮＡベクターを用い再構
    成したウイルスを接種することを特徴とする植物細胞へ
    外来遺伝子を組み込む方法
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