JPS63148982A - オ−トクレ−ブ滅菌無血清培地による昆虫細胞の培養法 - Google Patents
オ−トクレ−ブ滅菌無血清培地による昆虫細胞の培養法Info
- Publication number
- JPS63148982A JPS63148982A JP61294941A JP29494186A JPS63148982A JP S63148982 A JPS63148982 A JP S63148982A JP 61294941 A JP61294941 A JP 61294941A JP 29494186 A JP29494186 A JP 29494186A JP S63148982 A JPS63148982 A JP S63148982A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture medium
- serum
- cells
- medium
- autoclave
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 24
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 title description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 22
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 16
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 8
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 5
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 abstract description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 4
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 abstract description 4
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 abstract description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 abstract description 2
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 abstract 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 239000000306 component Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 229960002337 magnesium chloride Drugs 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 4
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 4
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- -1 that is Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241001477931 Mythimna unipuncta Species 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- RCJVRSBWZCNNQT-UHFFFAOYSA-N dichloridooxygen Chemical compound ClOCl RCJVRSBWZCNNQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- WMFHUUKYIUOHRA-UHFFFAOYSA-N (3-phenoxyphenyl)methanamine;hydrochloride Chemical compound Cl.NCC1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 WMFHUUKYIUOHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- YMIFCOGYMQTQBP-UHFFFAOYSA-L calcium;dichloride;hydrate Chemical compound O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] YMIFCOGYMQTQBP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- MJMDTFNVECGTEM-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride monohydrate Chemical compound O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] MJMDTFNVECGTEM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogenphosphate monohydrate Chemical compound O.[Na+].OP(O)([O-])=O BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N sodium;hydrochloride Chemical compound [Na].Cl OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、昆虫細胞、特にヨトウガ由来細胞を培養する
ための湿熱滅菌法、好ましくはオートクレーブ加熱法で
滅菌した無血清の昆虫細胞培養培地を用いて昆虫細胞を
培養する技術に関する。
ための湿熱滅菌法、好ましくはオートクレーブ加熱法で
滅菌した無血清の昆虫細胞培養培地を用いて昆虫細胞を
培養する技術に関する。
（従来の技術〕
昆虫細胞を用いて、昆虫ウィルスを生産すること、並び
にヒトインターフェロンの生産等の、動物細胞で生産す
る有用物質を免疫的に無関係の昆虫細胞を用いて生産す
ることが研究されている。
にヒトインターフェロンの生産等の、動物細胞で生産す
る有用物質を免疫的に無関係の昆虫細胞を用いて生産す
ることが研究されている。
一般に、昆虫細胞の培養に当っては、子牛おるいは牛胎
児等より得られる血清を培地成分として使用している。
児等より得られる血清を培地成分として使用している。
ところが、この血清は高価であるのみならず、品質の不
均一性、不安定性、大量入手の困難さから、血清を含有
しないでも昆虫細胞を培養できる培地の研究がなされて
いる。その結果、いくつかの無血清培地が開発された。
均一性、不安定性、大量入手の困難さから、血清を含有
しないでも昆虫細胞を培養できる培地の研究がなされて
いる。その結果、いくつかの無血清培地が開発された。
例えば、ショウジヨウバエ細胞用の培地（ジーエカリア
ニイー、カースタック、ケー、マラモロシュ編「インバ
ーチプレイド・ティッシュウ・カルチャー・アプリケイ
ジョン・イン・メディシン・バイオロジー・アンド・ア
プリカルチャーＪ （Ｉｎｖｅｒｔａｂｒａ−ｔｅ
Ｔｉ５ｓｔ＋ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ 、Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。
ニイー、カースタック、ケー、マラモロシュ編「インバ
ーチプレイド・ティッシュウ・カルチャー・アプリケイ
ジョン・イン・メディシン・バイオロジー・アンド・ア
プリカルチャーＪ （Ｉｎｖｅｒｔａｂｒａ−ｔｅ
Ｔｉ５ｓｔ＋ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ 、Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、）
１３１−１５０頁、アカデミツク・プレス社 ニュー
ヨーク １９７６年発行：ケイ、ディ、ディビス、ニー
、シャーン：「サイエンスＪ （Ｓｃｉｅｎｃｅ）
１９６巻４３８−４４０頁、１９７７年〕、力細胞用の
培地〔ニス、キタムラ等「ジャーナル・メディカル−Ｉ
ントモロジーｊ （Ｊ、Ｈｅｄ、Ｅｎｔｏｍ−０１，）
１０巻４８８−４８９頁、１９７３年〕、りんし目、双
し目昆虫細胞の培地としてミツハシ、マラモロシュ（Ｍ
ｉｔｓｕｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ
）培地〔ジエイ、ミツハシ、ケイ、マラモロシュ「コン
トリビュート・ボイス・トンプソン・インステイチュー
トＪ（Ｃｏｎｔｒｉｂ、Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ Ｉｎ５ｔ、）２２巻 ４３５−４６０頁、１９６
４年〕より、血清を取除いた組成の培地等が使用されて
いる。
１３１−１５０頁、アカデミツク・プレス社 ニュー
ヨーク １９７６年発行：ケイ、ディ、ディビス、ニー
、シャーン：「サイエンスＪ （Ｓｃｉｅｎｃｅ）
１９６巻４３８−４４０頁、１９７７年〕、力細胞用の
培地〔ニス、キタムラ等「ジャーナル・メディカル−Ｉ
ントモロジーｊ （Ｊ、Ｈｅｄ、Ｅｎｔｏｍ−０１，）
１０巻４８８−４８９頁、１９７３年〕、りんし目、双
し目昆虫細胞の培地としてミツハシ、マラモロシュ（Ｍ
ｉｔｓｕｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ
）培地〔ジエイ、ミツハシ、ケイ、マラモロシュ「コン
トリビュート・ボイス・トンプソン・インステイチュー
トＪ（Ｃｏｎｔｒｉｂ、Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ Ｉｎ５ｔ、）２２巻 ４３５−４６０頁、１９６
４年〕より、血清を取除いた組成の培地等が使用されて
いる。
これらの無血清培地の滅菌処理方法としては、濾過滅菌
が行われている。その方法は、滅菌したメンブレン・フ
ィルターを用いるのが通常である。
が行われている。その方法は、滅菌したメンブレン・フ
ィルターを用いるのが通常である。
培地調製後、直接に除菌用のフィルターに通すと、目づ
まりが著しく、効率的でない。したがって、前処理とし
て、調製直後の培地から高速遠心分離機で沈澱物を除去
し、段階的にポアサイズの異なるフィルターで濾過する
が、フィルター交換、各操作中での容器の準備等の操作
が繁雑である。また、濾過滅菌後の培地を各々の培養器
へ移す分注作業を無菌状態で行なう必要が必り、無菌操
作技術の熟練修得者が作業する必要がおる。特に大量の
培地の分注を、雑菌の混入なしに行なうことは高度の無
菌操作技術が必要とされる。大量培養にｉＪ′−３いて
は専用の無菌濾過装置を必要とし、設備投資および維持
管理費が大きくなる。
まりが著しく、効率的でない。したがって、前処理とし
て、調製直後の培地から高速遠心分離機で沈澱物を除去
し、段階的にポアサイズの異なるフィルターで濾過する
が、フィルター交換、各操作中での容器の準備等の操作
が繁雑である。また、濾過滅菌後の培地を各々の培養器
へ移す分注作業を無菌状態で行なう必要が必り、無菌操
作技術の熟練修得者が作業する必要がおる。特に大量の
培地の分注を、雑菌の混入なしに行なうことは高度の無
菌操作技術が必要とされる。大量培養にｉＪ′−３いて
は専用の無菌濾過装置を必要とし、設備投資および維持
管理費が大きくなる。
このような事情から、高度の無菌操作を必要とせず、特
定の技術修得者に限らず誰でも簡単な操作で調製できる
安価な培地を開発することが要望されている。本発明は
、このような要望に合致した昆虫細胞培養用の無血清培
地を用いる昆虫細胞の無血清培養法を提供することを目
的とする。
定の技術修得者に限らず誰でも簡単な操作で調製できる
安価な培地を開発することが要望されている。本発明は
、このような要望に合致した昆虫細胞培養用の無血清培
地を用いる昆虫細胞の無血清培養法を提供することを目
的とする。
Ｃ問題点を解決するための手段）
本発明者らは、このような事情にもとすき、かかる問題
点を解決すべく研究を行い、これまでのミツハシ、マラ
モロシュ（Ｈｉｔｓｕｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｈａｒａｍ
−ｏｒｏｓｃｈ）培地より血清をとりのぞいた培地をオ
ートクレーブ滅菌により無菌状態とし、この培地で昆虫
細胞を培養することが可能であることを認め、本発明に
いたった。すなわち、従来用いられていた昆虫細胞培養
用培地に代り、酵母粉末とアルブミン加水分解物（水解
物）を配合し、かっ血清成分を含まない培地は、熱処理
を行なうことによっても昆虫細胞の培養に必要な成分を
失うことなく、十分に昆虫細胞の増殖を行なわしめるこ
とを知見した。
点を解決すべく研究を行い、これまでのミツハシ、マラ
モロシュ（Ｈｉｔｓｕｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｈａｒａｍ
−ｏｒｏｓｃｈ）培地より血清をとりのぞいた培地をオ
ートクレーブ滅菌により無菌状態とし、この培地で昆虫
細胞を培養することが可能であることを認め、本発明に
いたった。すなわち、従来用いられていた昆虫細胞培養
用培地に代り、酵母粉末とアルブミン加水分解物（水解
物）を配合し、かっ血清成分を含まない培地は、熱処理
を行なうことによっても昆虫細胞の培養に必要な成分を
失うことなく、十分に昆虫細胞の増殖を行なわしめるこ
とを知見した。
従って、本発明によると、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、リン酸二水素ナトリウム、＃酸水素ナトリウム、塩
化マグネシウム、塩化カルシウム、糖類、酵母粉末およ
びアルブミン水解物を含有し、実質的に血清を含まない
培地を湿熱滅菌法により無菌状態とした培地で、昆虫細
胞を培養する方法が提供される。
ム、リン酸二水素ナトリウム、＃酸水素ナトリウム、塩
化マグネシウム、塩化カルシウム、糖類、酵母粉末およ
びアルブミン水解物を含有し、実質的に血清を含まない
培地を湿熱滅菌法により無菌状態とした培地で、昆虫細
胞を培養する方法が提供される。
本発明の方法で用いる培地は、ミツハシ・マラモロシュ
（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ａｎｄ ）ｌａｒａｍｏｒｏ
ｓｃｈ）培地より血清をとりのぞいた残余の成分、すな
わち塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素ナト
リウム、炭酸水素ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化
カルシウム、糖類に酵母粉末およびアルブミン水解物を
加えて成る組成の培地を用い、従来の培地と同様に、ｉ
）Ｈ値を、水酸化カリウム、塩酸等を用いて５，６〜７
．０の範囲に調製したのら、湿熱滅菌することによって
無菌の無血清培地として調製できる。
（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ａｎｄ ）ｌａｒａｍｏｒｏ
ｓｃｈ）培地より血清をとりのぞいた残余の成分、すな
わち塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素ナト
リウム、炭酸水素ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化
カルシウム、糖類に酵母粉末およびアルブミン水解物を
加えて成る組成の培地を用い、従来の培地と同様に、ｉ
）Ｈ値を、水酸化カリウム、塩酸等を用いて５，６〜７
．０の範囲に調製したのら、湿熱滅菌することによって
無菌の無血清培地として調製できる。
上記の成分のうち、塩化マグネシウムとしては、塩化マ
グネシウム無水物、塩化マグネシウム六水和物が使用で
きるが、塩化マグネシウム六水和物が好ましい。また塩
化カルシウムとしては、塩化カルシウム無水物、塩化カ
ルシウム二水和物、塩化カルシウム穴水和物が使用でき
るが、塩化カルシウムニ水和物が好ましい。
グネシウム無水物、塩化マグネシウム六水和物が使用で
きるが、塩化マグネシウム六水和物が好ましい。また塩
化カルシウムとしては、塩化カルシウム無水物、塩化カ
ルシウム二水和物、塩化カルシウム穴水和物が使用でき
るが、塩化カルシウムニ水和物が好ましい。
また、糖類としては、Ｄ−グルコース、フラクトースが
使用できるが、Ｄ−グルコースが好ましい。また、酵母
粉末としてはパン酵母粉末、ビール酵母粉末が使用でき
るが、パン酵母粉末が好ましい。またアルブミン水解物
としては、血清アルブミン水解物、ラクトアルブミン水
解物、卵白アルブミン水解物が使用できるが、ラクトア
ルブミン水解物が好ましい。
使用できるが、Ｄ−グルコースが好ましい。また、酵母
粉末としてはパン酵母粉末、ビール酵母粉末が使用でき
るが、パン酵母粉末が好ましい。またアルブミン水解物
としては、血清アルブミン水解物、ラクトアルブミン水
解物、卵白アルブミン水解物が使用できるが、ラクトア
ルブミン水解物が好ましい。
湿熱滅菌法としては、オートクレーブ滅菌法、間欠加熱
法が使用できるが、オートクレーブ滅菌法が好ましい。
法が使用できるが、オートクレーブ滅菌法が好ましい。
ざらには、滅菌操作の前、もしくは後の上記培地成分に
血清を加えることもできる。
血清を加えることもできる。
本発明の方法で使用される昆虫細胞培養用の無血清培地
の各成分は、いずれも市販品をそのまま使用できるから
、安価に安定して入手が可能であり、ざらに、高度な技
術の濾過滅菌操作にようないで、簡単なオートクレーブ
でスチーム滅菌法により目的を達成することができるの
で、無菌操作についての技術修得者でない誰でもが調製
できる。
の各成分は、いずれも市販品をそのまま使用できるから
、安価に安定して入手が可能であり、ざらに、高度な技
術の濾過滅菌操作にようないで、簡単なオートクレーブ
でスチーム滅菌法により目的を達成することができるの
で、無菌操作についての技術修得者でない誰でもが調製
できる。
本発明の方法で使用される無血清培地を調製するには、
これまでの昆虫細胞用無血清培地の常用成分として知ら
れている次の無機塩成分、すなわち、塩化ナトリウム（
６，０〜８．０’ｉｉ／Ｑ、培地１Ｑ当りの好適な添加
最：以下同じ）、塩化カリウム（０，１〜０．３ｇ／Ｑ
＞、リン酸二ナトリウム（０，１〜０．４ｐ／り）、炭
酸水素ナトリウム（０，１〜０，４７／２）、塩化マグ
ネシウム六水和物（０，０５〜０．２ｇ／Ｑ）及び塩化
カルシウムニ水和物（０，１〜０．３ｙ＃２）、並びに
Ｄ−グルコース（２，０〜８．０９／Ｑ）と、これらに
アルブミン水解物（３，Ｏ〜１５．０９／Ｑ＞及び酵母
粉末（１，０〜８．０９／Ｑ＞を加えて成る組成の培地
を調製する。その後、ｐＨを水酸化カリウム、塩酸等を
用いてｐｔｉ５．６〜７．０の範囲に調整すればよい。
これまでの昆虫細胞用無血清培地の常用成分として知ら
れている次の無機塩成分、すなわち、塩化ナトリウム（
６，０〜８．０’ｉｉ／Ｑ、培地１Ｑ当りの好適な添加
最：以下同じ）、塩化カリウム（０，１〜０．３ｇ／Ｑ
＞、リン酸二ナトリウム（０，１〜０．４ｐ／り）、炭
酸水素ナトリウム（０，１〜０，４７／２）、塩化マグ
ネシウム六水和物（０，０５〜０．２ｇ／Ｑ）及び塩化
カルシウムニ水和物（０，１〜０．３ｙ＃２）、並びに
Ｄ−グルコース（２，０〜８．０９／Ｑ）と、これらに
アルブミン水解物（３，Ｏ〜１５．０９／Ｑ＞及び酵母
粉末（１，０〜８．０９／Ｑ＞を加えて成る組成の培地
を調製する。その後、ｐＨを水酸化カリウム、塩酸等を
用いてｐｔｉ５．６〜７．０の範囲に調整すればよい。
これらの培地成分は、いずれも市販品をそのまま使用す
ればよい。
ればよい。
また、これ以外の成分、すなわち塩化マグネシウム無水
物、塩化カルシウム無水物、塩化カルシウム二水和物、
等も同様に使用することができる。
物、塩化カルシウム無水物、塩化カルシウム二水和物、
等も同様に使用することができる。
また、湿熱滅菌法として、オートクレーブ滅菌する方法
は、通常の方法、すなわち、１．０〜１．２気圧のスチ
ーム雰囲気下に、１５〜３０分間、１１０〜１３０℃で
加熱することから成る。このようにして、本発明で用い
る無菌状態の無血清培地を調製できる。
は、通常の方法、すなわち、１．０〜１．２気圧のスチ
ーム雰囲気下に、１５〜３０分間、１１０〜１３０℃で
加熱することから成る。このようにして、本発明で用い
る無菌状態の無血清培地を調製できる。
以下に実施例を挙げて本発明を詳述するが、これらは単
なる例示であって、本発明を制限するものではない。
なる例示であって、本発明を制限するものではない。
実施例 １
後記の表１の組成で各成分を含む無血清培地を調製し、
オートクレーブで加熱（１２０’Ｃｌ２Ｏ分）、滅菌し
た無菌培地の５ｄを、コーニング社製プラスチック・フ
ラスコ（２５ｃｍ）に分注した。
オートクレーブで加熱（１２０’Ｃｌ２Ｏ分）、滅菌し
た無菌培地の５ｄを、コーニング社製プラスチック・フ
ラスコ（２５ｃｍ）に分注した。
他方、あらかじめ、オートクレーブ滅菌した表１の培地
で４日間培養して得たヨトウガ脂肪体由来細胞の４種、
５ＥＳ−ＨａＢｒ−１； ５ＥＳ−ＨａＢｒ−２； ５
ＥＳ−）ｆａＢｒ−３； ５ＥＳ−ＨａＢｒ−４と血球
由来細胞の２種ＮＩＡＳ−）１ａＢｒ−９２； ＮＩＡ
Ｓ−ＨａＢｒ−９３と、卵巣由来細胞の１種ＮＩＡＳ−
ＭａＢｒ−３２とを、それぞれ初発細胞濃度が２．０ｘ
１０５個／ｍ！！になるように接種した。
で４日間培養して得たヨトウガ脂肪体由来細胞の４種、
５ＥＳ−ＨａＢｒ−１； ５ＥＳ−ＨａＢｒ−２； ５
ＥＳ−）ｆａＢｒ−３； ５ＥＳ−ＨａＢｒ−４と血球
由来細胞の２種ＮＩＡＳ−）１ａＢｒ−９２； ＮＩＡ
Ｓ−ＨａＢｒ−９３と、卵巣由来細胞の１種ＮＩＡＳ−
ＭａＢｒ−３２とを、それぞれ初発細胞濃度が２．０ｘ
１０５個／ｍ！！になるように接種した。
これらのフラスコを２５℃に保温された細胞培養器の中
に静置して培養したところ、９日間の後の細胞数は、そ
れぞれ２１．８ｘ １０”個／ｒｒｄ！ ： １８．１
Ｘ１０ 個／ｌｒｄ！ ； ２１．７ｘ １０５個／
７： １６．４Ｘ１０ 個／ｍｌ＋ １１．９Ｘ
’ｌ ｏ５個／ｄ： １Ｂ、５ｘ１０ 個： １８
．３Ｘ １０５個／ｍｌまでに増加した。
に静置して培養したところ、９日間の後の細胞数は、そ
れぞれ２１．８ｘ １０”個／ｒｒｄ！ ： １８．１
Ｘ１０ 個／ｌｒｄ！ ； ２１．７ｘ １０５個／
７： １６．４Ｘ１０ 個／ｍｌ＋ １１．９Ｘ
’ｌ ｏ５個／ｄ： １Ｂ、５ｘ１０ 個： １８
．３Ｘ １０５個／ｍｌまでに増加した。
表 １
塩化ナトリウム ７゜Ｏｃ＋／Ｑリ
ン酸二水素ナトリウム−水和物 ０．２ ９ＩＱ炭酸水
素ナトリウム ０．１２ｑ／Ｑ塩化カリウ
ム ０．２ ｇＩＱ塩化塩化マ
グネシウム和水和物 ０．１ ａ／Ｑ塩化塩化カル
シウム和水和物 ０．２ ｇ／ＱＤ−グルコース
４．Ｏｇ、１ラクトアルブミン水
解物 ６．５ｇ／Ｑイーストレイト
５．Ｏａ！Ｑ（ディフコ ＤｉｆＣＯ製） ｐＨ６，５±０．２ なあ、上記の表中のラクトアルブミン水解物は、ニュー
トリショナル・バイオケミカルズ・コーポレーション（
Ｎｕｔｉｒｉｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
Ｃｏｒｐ、）製でおる。
ン酸二水素ナトリウム−水和物 ０．２ ９ＩＱ炭酸水
素ナトリウム ０．１２ｑ／Ｑ塩化カリウ
ム ０．２ ｇＩＱ塩化塩化マ
グネシウム和水和物 ０．１ ａ／Ｑ塩化塩化カル
シウム和水和物 ０．２ ｇ／ＱＤ−グルコース
４．Ｏｇ、１ラクトアルブミン水
解物 ６．５ｇ／Ｑイーストレイト
５．Ｏａ！Ｑ（ディフコ ＤｉｆＣＯ製） ｐＨ６，５±０．２ なあ、上記の表中のラクトアルブミン水解物は、ニュー
トリショナル・バイオケミカルズ・コーポレーション（
Ｎｕｔｉｒｉｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
Ｃｏｒｐ、）製でおる。
叉思ｆ４１ ２
表１に示した組成の無血清培地を調製し、実施例１で用
いた滅菌法により滅菌した後、牛脂児血清（ディフコ
Ｄｉｆｃｏ製〉を血清濃度３％になるように無菌的に添
加して血清含有培地を調製した。
いた滅菌法により滅菌した後、牛脂児血清（ディフコ
Ｄｉｆｃｏ製〉を血清濃度３％になるように無菌的に添
加して血清含有培地を調製した。
この血清含有培地の５ｍｌを、コーニング社製プラスチ
ック・フラスコ（２５ｃＩＡ）に分注した。他方、あら
かじめ、上記血清含有培地で４日間培養して得たヨトウ
ガ血球由来細胞ＮＩＡＳ−ＨａＢｒ−９３を、初発細胞
濃度が、２．ＯＸ １０５個／ｄになるように接種した
。
ック・フラスコ（２５ｃＩＡ）に分注した。他方、あら
かじめ、上記血清含有培地で４日間培養して得たヨトウ
ガ血球由来細胞ＮＩＡＳ−ＨａＢｒ−９３を、初発細胞
濃度が、２．ＯＸ １０５個／ｄになるように接種した
。
このフラスコを２５℃に保温された細胞培養器の中に静
置して培養したところ、９日間の後の細胞数は１８．２
Ｘ １０”個／ｄまでに増加した。
置して培養したところ、９日間の後の細胞数は１８．２
Ｘ １０”個／ｄまでに増加した。
実施例 ３
表１に示した組成の無血清培地を調製し、実施例１で用
いた滅菌法により滅菌し、内容１２５０ｍ１のガラス製
スピンナーかくはん培養器に、１０（Ｍづつ分注した。
いた滅菌法により滅菌し、内容１２５０ｍ１のガラス製
スピンナーかくはん培養器に、１０（Ｍづつ分注した。
あらかじめ、オートクレーブ滅菌した表１の培地で４日
間培養して得たヨトウガ血球由来細胞Ｎ ＩＡＳ−）１
ａＢｒ−９３を、初発細胞濃度が２．ＯＸ １０５個／
ｄになるように接種した。
間培養して得たヨトウガ血球由来細胞Ｎ ＩＡＳ−）１
ａＢｒ−９３を、初発細胞濃度が２．ＯＸ １０５個／
ｄになるように接種した。
２５℃に保温された細胞培＃Ｌ器の中で、かくはん数、
毎分６０回でかくはんし、１０日間培養した。培養後の
細胞数は、９．０７ Ｘ １０５個／ｄまで増加し、１
本のスピンナー培養器から９．０７Ｘ１０７個の細胞が
無血清培養により取得された。
毎分６０回でかくはんし、１０日間培養した。培養後の
細胞数は、９．０７ Ｘ １０５個／ｄまで増加し、１
本のスピンナー培養器から９．０７Ｘ１０７個の細胞が
無血清培養により取得された。
叉塵叢−１
表１に示した組成の無血清培地を調製し、実施例１で用
いた滅菌法により滅菌し、内容量２５０威のガラス製ス
ピンナーかくはん培養器に、１００ｄづつ分注した。あ
らかじめ、オートクレーブ滅菌した表１の培地で４日間
培養して得たヨトウガ脂肪体由来細胞５ＥＳ−）１ａＢ
ｒ−１を、初発細胞濃度が２．Ｏｘ １０”個／ｄにな
るように接種した。
いた滅菌法により滅菌し、内容量２５０威のガラス製ス
ピンナーかくはん培養器に、１００ｄづつ分注した。あ
らかじめ、オートクレーブ滅菌した表１の培地で４日間
培養して得たヨトウガ脂肪体由来細胞５ＥＳ−）１ａＢ
ｒ−１を、初発細胞濃度が２．Ｏｘ １０”個／ｄにな
るように接種した。
２５℃に保温された細胞培養器の中で、かくはん数、毎
分６０回でかくはんし、１０日間培養した。培養後の細
胞数は、１０．８Ｘ １０”個／ｄまで増加し、１本の
スピンナー培養器から１．０８Ｘ１０８個の細胞が無血
清培養により取得された。
分６０回でかくはんし、１０日間培養した。培養後の細
胞数は、１０．８Ｘ １０”個／ｄまで増加し、１本の
スピンナー培養器から１．０８Ｘ１０８個の細胞が無血
清培養により取得された。
大思輿−二
表１に示した組成の無血清培地を調製し、実施例１で用
いた滅菌法により滅菌し、内容量１．３Ｑのガラス製ス
ピンナーかくはん培養器に、５００ｄ分注づつした。あ
らかじめ、オートクレーブ滅菌した表１の培地で４日間
培養して得たヨトウガ由来細胞Ｎ ＩＡＳ−ＭａＢｒ−
９３を、初発細胞濃度が１．０×１０”個／ｍｌＧ、：
なるように接種した。２５°Ｃに保温された細胞培養器
の中で、かくはん数、毎分４０回でかくはんし、１２日
間培養した。培養後の細胞数は、８．８７ Ｘ １Ｑ５
個／ｄまで増加し、１本のスピンナー培養器から４．４
４ Ｘ ’ｌ Ｑ８個の細胞が無血清培養により取得さ
れた。
いた滅菌法により滅菌し、内容量１．３Ｑのガラス製ス
ピンナーかくはん培養器に、５００ｄ分注づつした。あ
らかじめ、オートクレーブ滅菌した表１の培地で４日間
培養して得たヨトウガ由来細胞Ｎ ＩＡＳ−ＭａＢｒ−
９３を、初発細胞濃度が１．０×１０”個／ｍｌＧ、：
なるように接種した。２５°Ｃに保温された細胞培養器
の中で、かくはん数、毎分４０回でかくはんし、１２日
間培養した。培養後の細胞数は、８．８７ Ｘ １Ｑ５
個／ｄまで増加し、１本のスピンナー培養器から４．４
４ Ｘ ’ｌ Ｑ８個の細胞が無血清培養により取得さ
れた。
実施例 ６
表１に示した組成の無血清培地を調製し、実施例１で用
いた滅菌法により滅菌し、内容ｆｆ１５Ｑのガラス製ミ
ニジャー培養器に、３Ｑ分づつ注した。
いた滅菌法により滅菌し、内容ｆｆ１５Ｑのガラス製ミ
ニジャー培養器に、３Ｑ分づつ注した。
必らかしめ、オートクレーブ滅菌した表１の培地で４日
間培養して得たヨトウガ由来細胞ＮＩＡＳ−ＨａＢｒ−
９３を、初発細胞濃度が１．０Ｘ１０”個／ｄになるよ
うに接種した。２５°Ｃに保温して、かくはん数、毎分
１５０回でかくはんし、１６日間培養した。培養後の細
胞数は、３．８３ Ｘ １０５個／ｄまで増加し、１基
のミニジャー培養器から１．１５ Ｘｉ ０９個の細胞
が無血清培養により取得された。
間培養して得たヨトウガ由来細胞ＮＩＡＳ−ＨａＢｒ−
９３を、初発細胞濃度が１．０Ｘ１０”個／ｄになるよ
うに接種した。２５°Ｃに保温して、かくはん数、毎分
１５０回でかくはんし、１６日間培養した。培養後の細
胞数は、３．８３ Ｘ １０５個／ｄまで増加し、１基
のミニジャー培養器から１．１５ Ｘｉ ０９個の細胞
が無血清培養により取得された。
本発明によれば、次のような作用効果がもたらされる。
まず第１に、培地の無菌処理方法として、これまでの濾
過滅菌によらないで湿熱滅菌法、例えばオートクレーブ
滅菌が可能となった。したがって、濾過殺菌法の高度な
無菌操作を必要とせず、大向培養においても専用の濾過
装置を必要としない。
過滅菌によらないで湿熱滅菌法、例えばオートクレーブ
滅菌が可能となった。したがって、濾過殺菌法の高度な
無菌操作を必要とせず、大向培養においても専用の濾過
装置を必要としない。
その結果、本発明では、特定の技術修得者に限らず誰で
も簡単な操作でかつ安価に調製される無菌の無血清培地
で昆虫細胞の培養をすることができる。
も簡単な操作でかつ安価に調製される無菌の無血清培地
で昆虫細胞の培養をすることができる。
第２に、本発明の方法で使用する培地の成分は高価な血
清を用いる従来の培地と比べると、すべて市販品で入手
が容易で安価な原料を用いればよく、培地調製が楊めて
容易である。
清を用いる従来の培地と比べると、すべて市販品で入手
が容易で安価な原料を用いればよく、培地調製が楊めて
容易である。
第３に、本発明で使用する無血清培地によれば、昆虫細
胞の増殖を、昆虫細胞の種類によって多少の違いがある
が、当初の接種濃度の約３．８〜１１倍にも進めること
ができる。このことは実施例１〜実施例６に示したとお
りである。
胞の増殖を、昆虫細胞の種類によって多少の違いがある
が、当初の接種濃度の約３．８〜１１倍にも進めること
ができる。このことは実施例１〜実施例６に示したとお
りである。
Claims (1)
- 塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、炭酸水素ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カル
シウム、糖類、酵母粉末およびアルブミン水解物を含有
し、実質的に血清を含まない培地を湿熱滅菌法により無
菌状態とした培地で、昆虫細胞を培養する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61294941A JPH067791B2 (ja) | 1986-12-12 | 1986-12-12 | オ−トクレ−ブ滅菌無血清培地による昆虫細胞の培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61294941A JPH067791B2 (ja) | 1986-12-12 | 1986-12-12 | オ−トクレ−ブ滅菌無血清培地による昆虫細胞の培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63148982A true JPS63148982A (ja) | 1988-06-21 |
| JPH067791B2 JPH067791B2 (ja) | 1994-02-02 |
Family
ID=17814257
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61294941A Expired - Lifetime JPH067791B2 (ja) | 1986-12-12 | 1986-12-12 | オ−トクレ−ブ滅菌無血清培地による昆虫細胞の培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH067791B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7572632B2 (en) | 1997-02-14 | 2009-08-11 | Life Technologies Corporation | Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof |
| EP2970916B1 (en) | 2013-03-13 | 2021-04-14 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Adapted lepidopteran insect cells for the production of recombinant proteins |
-
1986
- 1986-12-12 JP JP61294941A patent/JPH067791B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7572632B2 (en) | 1997-02-14 | 2009-08-11 | Life Technologies Corporation | Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof |
| JP2010233580A (ja) * | 1997-02-14 | 2010-10-21 | Life Technologies Corp | 乾燥粉末細胞および細胞培養試薬ならびにこれらの生成方法 |
| JP2014054267A (ja) * | 1997-02-14 | 2014-03-27 | Life Technologies Corp | 乾燥粉末細胞および細胞培養試薬ならびにこれらの生成方法 |
| JP2016152821A (ja) * | 1997-02-14 | 2016-08-25 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 乾燥粉末細胞および細胞培養試薬ならびにこれらの生成方法 |
| EP2970916B1 (en) | 2013-03-13 | 2021-04-14 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Adapted lepidopteran insect cells for the production of recombinant proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH067791B2 (ja) | 1994-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9957485B2 (en) | Systems and methods for virus propagation in cell cultures for vaccine manufacture | |
| US7060494B2 (en) | Growth of human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) using umbilical cord blood serum and the method for the preparation thereof | |
| Evans et al. | Chemically defined media for cultivation of long-term cell strains from four mammalian species | |
| Cohen et al. | A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture | |
| CN115261302B (zh) | 一种基质胶及其制备方法和应用 | |
| Ziegler et al. | The propagation of mammalian cells in a 20-liter stainless steel fermentor | |
| CN105462916B (zh) | 一种培养Marc‑145细胞用的无血清培养基及其制备方法 | |
| CN114276981B (zh) | 一种适应猪流行性腹泻病毒的Vero-E6悬浮细胞株sVero-E6及其应用 | |
| Goldberg et al. | Susceptibility of differentiating muscle cells of the fetal mouse in culture to coxsackievirus A13 | |
| DK147889B (da) | Fremgangsmaade til dyrkning af virus | |
| CN106834220A (zh) | 一种无血清软骨细胞培养基及其制备方法 | |
| CN102604891A (zh) | 一种用于免疫细胞治疗的高扩增多功能无血清培养基及其制备方法 | |
| JPS63148982A (ja) | オ−トクレ−ブ滅菌無血清培地による昆虫細胞の培養法 | |
| US5468635A (en) | In vitro method for stimulating cell growth by culturing cells in a serum-free culture medium comprising human lysozyme | |
| Weiss et al. | Chemically defined serum-free media for the cultivation of primary cells and their susceptibility to viruses | |
| Mason | Propagation and growth cycle of Rickettsia quintana in a new liquid medium | |
| CN117417900A (zh) | 一种狂犬病疫苗用人二倍体细胞的无血清细胞培养方法和应用 | |
| Rai | Methods in cell culture and virology | |
| JPS63148983A (ja) | 昆虫細胞培養用無血清培地 | |
| EP0148770B1 (en) | Composition for cell cultivation, production and use thereof | |
| US2990335A (en) | Fluid suspension culture method for fixed tissue cells | |
| CN106566802A (zh) | 一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法 | |
| RU2082432C1 (ru) | Способ получения вакцины против клещевого энцефалита | |
| RU2140451C1 (ru) | Штамм культивируемых клеток почки suis domestica l. для культивирования вирусов животных | |
| Van Wezel et al. | Improved cell dispersal method by low-temperature incubation of tissue in a trypsin-citrate solution |