JPS6314947B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6314947B2 JPS6314947B2 JP59248203A JP24820384A JPS6314947B2 JP S6314947 B2 JPS6314947 B2 JP S6314947B2 JP 59248203 A JP59248203 A JP 59248203A JP 24820384 A JP24820384 A JP 24820384A JP S6314947 B2 JPS6314947 B2 JP S6314947B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- csf
- medium
- cell
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は、新規なヒト腎臓癌組織の細胞から株
化されたヒトコロニー形成刺激因子（Human
Colony−stimulating factor：以下単に、ｈ−
CSFと略す）産生細胞株TRC−29Rに関する。 従来の技術 骨随系幹細胞に由来する白血球に分類される顆
粒球、単球、マクロフアージ系幹細胞に作用し、
これを成熟白血球、すなわち顆粒球及び／又はマ
クロフアージに分化誘導させる刺激性因子として
CSFが知られている〔ジヤーナルオブイムノロジ
カルメソツド（Journal of Immunological
Methods）42、253−284（1981）〕。 またCSFは、骨髄系幹細胞を顆粒球やマクロフ
アージに分化誘導せしめる作用を有することか
ら、例えば癌患者等の白血球減少症に対する治療
薬または種々の感染の予防薬として有用な生理活
性物質である。さらにｈ−CSFのインビトロ生成
量に起因するｈ−CSF増多症および減少症の診断
用試薬としても有用なものである。 このようなｈ−CSF産生細胞としてヒト由来の
ものは肺癌細胞（KONT、KSNY）、甲状腺癌細
胞（T3M−５）、口腔癌細胞（T3M−１）、白血
病細胞（MO）などが株化されているが、腎臓癌
由来のｈ−CSF産生細胞は未だない。 発明が解決しようとする問題点 癌の化学療法や放射線治療の際の重篤な副作用
の１つとして顆粒球減少症があり、そのために免
疫系の生体防制機構が働かなくなり、感染症をひ
きおこす場合が多い。従つて、顆粒球減少を抑え
るために骨髄幹細胞、顆粒球、マクロフアージの
分化を促進させるｈ−CSFが必要となる。 そのため、従来ではヒトの尿またはヒト胎盤の
培養上清を原料として採取していたが原料に制限
があり、現在まで、常に一定のｈ−CSF活性を有
する標品を安定的に大量製造する方法がなかつ
た。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、ｈ−CSFの持続産生能を有する
細胞株の検索につき種々研究を重ねた結果、ヒト
腎臓癌組織由来の細胞からｈ−CSF産生能を有す
る細胞を新たに単離して継代培養を継続し、つい
に、無限に継代培養し得る株化細胞の樹立に成功
した。この株化細胞はTRC−29Rと命名され、
現在までに84回の継代培養を行なつたが、細胞形
態、細胞増殖性、ｈ−CSF生産性、ポピユレエイ
シヨン・ダブリング・タイム（Population
Doubling Time）等継代培養間において変動が
少なく、かなり安定したTRC−29Rの特徴的性
質を維持する細胞株であることを認めた。これに
よつて該細胞株を培養することにより、ｈ−CSF
を均質な状態で大量生産することが可能となるこ
とを見出した。 本発明はこれらの新しい知見にもとづいて完成
されたものである。 すなわち、本発明は下記の特性を有するヒト腎
臓癌組織由来のヒト株化細胞TRC−29Rである。 (a) 由来：ヒト腎臓癌組織より分離。 (b) 形態：上皮細胞様。 (c) 染色体数：高３倍体域である染色体数74本の
モーダル・ナンバー（Modal No.）を示すこ
とを特徴とする染色体数の分布モード。 (d) 継代培養：無限な継代培養。 (e) 機能的特徴：ｈ−CSF産生。 (f) 細胞増殖性：細胞の増殖が進み、飽和状態に
なると重層状に増殖する傾向が見られる。特
に、５〜20％牛胎児血清（FCS）含有RPMI−
1640培地にて増殖性良く、ポピユレエイシヨ
ン・ダブリング・タイムは29±６時間である。 (g) 保存条件：−80〜−190℃で凍結保存。 本発明の細胞株はヒト腎臓癌組織由来の樹立さ
れたコロニー形成刺激因子（CSF）産生細胞株で
あり、ヒトCSF産生に有用であり、これを大量に
製造することができる。更に、CSF産生能は長期
にわたり安定であり、低下が認められない。 まず、本発明のｈ−CSF産生細胞株TRC−29R
を得るに当つて、人体から外科的に摘出された腎
臓癌組織の１〜２ｇを細切し、これを10〜100ml
のトリス緩衝生理食塩水（Tris Buffer Saline
Solution；以下、TBSと略す）にて洗浄する。
次いでこれを細胞分散用酵素の溶液10〜50mlに加
えて、37℃にて60〜120分間撹拌して組織を分散
せしめる。その後該酵素活性を停止せしめ、細胞
を回収する。このようにして分離した細胞は、通
常培養用培地１ml当り104〜106個の細胞数になる
ように調製して初代培養する。この培養において
は、簡便にはシヤーレまたはプラスチツクボトル
の培養容器を用いて培養温度37℃、５％CO2混合
気相、湿度100％の条件下にて静置培養する。次
いでこれを継代培養するに当つて、まず初期培養
において細胞が増殖して飽和に達したことを確認
後、洗浄して細胞を剥離し、回収する。 この際、洗浄液としてはカルシウム、マグネシ
ウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水〔以下、
PSB（−）と略す〕を用いればよく、また細胞剥
離の際は、トリプシンやナガーゼ酵素液を用いれ
ばよい。このようにして得られた細胞は、さらに
細胞数を調製して培養用培地に加え、これを簡便
には、37℃、５％CO2混合気相、湿度100％の条
件下培養容器内で飽和増殖せしめる。次いでこの
飽和増殖時の３分の１量の細胞数を、新たな培地
に接種し、同一条件下にてくり返し（継代培養回
数50回以上）培養した。 このようにして継代培養を行なつた結果、限界
なく継代培養が可能な株化細胞が得られ、さらに
この細胞はｈ−CSFを産生する機能的特徴を有す
るもので、この細胞をｈ−CSF産生細胞株TRC
−29Rと命名したものである。 以下に本発明に用いられる培養用培地、血清、
細胞分散用酵素および緩衝液（塩類溶液）につい
て説明する。 (1) 培養用培地にはイーグルMEM（Ｅ−MEM）、
アルフアーMEM（α・MEM）（第２表）、ダル
ベツコMEM（DME）、イスコブ培地
（IMDM）、フイツシヤー培地、グレース培地、
マツコイ・5A培地、199培地、ハム・Ｆ−10培
地、ハム・Ｆ−12培地、RPMI−1640培地（第
１表）、ウエイマウス培地、ウイリアム培地が
ある。 代表的な培地としてRPMI−1640培地の組成
は例えばペニシリンG100μｇ／ml、硫酸ジヒド
ロストレプトマイシン100μｇ／mlなどの抗菌
性物質および血清、好ましくは牛胎児血清10〜
15％を添加する。 (2) またTRC−29Rの増殖の際の血清には、牛
胎児血清が好適であるが、その他ヒト血清、子
牛血清、成牛血清、馬血清、ニワトリ血清を用
いてもよい。培養液中の血清比率は１−25％
（容量）で、好ましくは５〜20％であり、抗生
物質（ペニシリンG100μｇ／ml、硫酸ジヒドロ
ストレプトマイシン100μｇ／ml）を含む。 (3) 細胞用分散用酵素は次のものが使用、例示さ
れる。 トリプシン（１：250） 0.1〜0.25％ コラゲナーゼ 0.05％ デイスパーゼ 500〜1000U／ml ナガーゼ 25U／ml これらの蛋白分解酵素の溶液は、TBSに溶
解（なお0.02％のEDTA・２ナトリウム塩を含
有する）し、減菌後、いずれも0.45μｍミリポ
アーフイルタ濾過を行なつた。 (4) 塩類溶液としては、PBS、ハンクス液、ア
ール液およびTBSが使用される。 (5) 細胞の増殖 湿度100％、５％CO2混合気相中で培養温度
37℃で培養し、限界なく継代培養が可能であ
る。 (6) 保存条件： TRC−29R株の培養物より酵素的に細胞を
剥離させた後10％ジメチルスルホオキシド
（DMSO）又は10％グリセリン含有RPMI−
1640番地（10％FCSを含む）に懸濁して−80〜
−190℃にて凍結保存する。 (7) 細胞の特徴： 上皮様の形態を有する。染色体数の分布は74
本にモードをもつ高３倍数体である。 (8) CSF産生の確認 マウス骨髄細胞を用いたコロニー形成法 仁保の方法（「免疫実験操作法」、日本免疫学会
編、1974年、第927頁）に従いメチルセルローズ
を用いる下記の方法で行つた。 2.2％メチルセルローズ／α−MEM 1.6ml ウマ血清 0.8ml マウス骨髄細胞懸濁液／α−MEM 0.8ml 被験サンプルまたはCSF標準液 0.8ml メチルセルローズはダウ社製（Dow）、α−
MEMはフロー社製（Flow）、ウマ血清はギブコ
社製（GIBCO）（＃28K8024）CSF標準液はギブ
コ社製（GIBCO）GCT−CMを使用した。また
マウス骨髄細胞は静岡実験動物農業協同組合より
購入した雄性７週令のICRを使用し、大腿骨骨髄
の単核球を分離し、α−MEMに懸濁して５×
105／mlに調整した。 上記混合液を３枚の35mmの口径からなるプラス
チツクデツシユに１mlずつ分注し37℃、５％CO2
混合気相下で７日間培養した後、20個以上の細胞
からなる細胞集団を１コロニーとみなして算出
し、上記条件で１コロニーを形成させるｈ−CSF
活性を１単位（Ｕ）とした。 ｈ−CSFの活性はいずれも３枚のデツシユの平
均値で算出した。
化されたヒトコロニー形成刺激因子（Human
Colony−stimulating factor：以下単に、ｈ−
CSFと略す）産生細胞株TRC−29Rに関する。 従来の技術 骨随系幹細胞に由来する白血球に分類される顆
粒球、単球、マクロフアージ系幹細胞に作用し、
これを成熟白血球、すなわち顆粒球及び／又はマ
クロフアージに分化誘導させる刺激性因子として
CSFが知られている〔ジヤーナルオブイムノロジ
カルメソツド（Journal of Immunological
Methods）42、253−284（1981）〕。 またCSFは、骨髄系幹細胞を顆粒球やマクロフ
アージに分化誘導せしめる作用を有することか
ら、例えば癌患者等の白血球減少症に対する治療
薬または種々の感染の予防薬として有用な生理活
性物質である。さらにｈ−CSFのインビトロ生成
量に起因するｈ−CSF増多症および減少症の診断
用試薬としても有用なものである。 このようなｈ−CSF産生細胞としてヒト由来の
ものは肺癌細胞（KONT、KSNY）、甲状腺癌細
胞（T3M−５）、口腔癌細胞（T3M−１）、白血
病細胞（MO）などが株化されているが、腎臓癌
由来のｈ−CSF産生細胞は未だない。 発明が解決しようとする問題点 癌の化学療法や放射線治療の際の重篤な副作用
の１つとして顆粒球減少症があり、そのために免
疫系の生体防制機構が働かなくなり、感染症をひ
きおこす場合が多い。従つて、顆粒球減少を抑え
るために骨髄幹細胞、顆粒球、マクロフアージの
分化を促進させるｈ−CSFが必要となる。 そのため、従来ではヒトの尿またはヒト胎盤の
培養上清を原料として採取していたが原料に制限
があり、現在まで、常に一定のｈ−CSF活性を有
する標品を安定的に大量製造する方法がなかつ
た。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、ｈ−CSFの持続産生能を有する
細胞株の検索につき種々研究を重ねた結果、ヒト
腎臓癌組織由来の細胞からｈ−CSF産生能を有す
る細胞を新たに単離して継代培養を継続し、つい
に、無限に継代培養し得る株化細胞の樹立に成功
した。この株化細胞はTRC−29Rと命名され、
現在までに84回の継代培養を行なつたが、細胞形
態、細胞増殖性、ｈ−CSF生産性、ポピユレエイ
シヨン・ダブリング・タイム（Population
Doubling Time）等継代培養間において変動が
少なく、かなり安定したTRC−29Rの特徴的性
質を維持する細胞株であることを認めた。これに
よつて該細胞株を培養することにより、ｈ−CSF
を均質な状態で大量生産することが可能となるこ
とを見出した。 本発明はこれらの新しい知見にもとづいて完成
されたものである。 すなわち、本発明は下記の特性を有するヒト腎
臓癌組織由来のヒト株化細胞TRC−29Rである。 (a) 由来：ヒト腎臓癌組織より分離。 (b) 形態：上皮細胞様。 (c) 染色体数：高３倍体域である染色体数74本の
モーダル・ナンバー（Modal No.）を示すこ
とを特徴とする染色体数の分布モード。 (d) 継代培養：無限な継代培養。 (e) 機能的特徴：ｈ−CSF産生。 (f) 細胞増殖性：細胞の増殖が進み、飽和状態に
なると重層状に増殖する傾向が見られる。特
に、５〜20％牛胎児血清（FCS）含有RPMI−
1640培地にて増殖性良く、ポピユレエイシヨ
ン・ダブリング・タイムは29±６時間である。 (g) 保存条件：−80〜−190℃で凍結保存。 本発明の細胞株はヒト腎臓癌組織由来の樹立さ
れたコロニー形成刺激因子（CSF）産生細胞株で
あり、ヒトCSF産生に有用であり、これを大量に
製造することができる。更に、CSF産生能は長期
にわたり安定であり、低下が認められない。 まず、本発明のｈ−CSF産生細胞株TRC−29R
を得るに当つて、人体から外科的に摘出された腎
臓癌組織の１〜２ｇを細切し、これを10〜100ml
のトリス緩衝生理食塩水（Tris Buffer Saline
Solution；以下、TBSと略す）にて洗浄する。
次いでこれを細胞分散用酵素の溶液10〜50mlに加
えて、37℃にて60〜120分間撹拌して組織を分散
せしめる。その後該酵素活性を停止せしめ、細胞
を回収する。このようにして分離した細胞は、通
常培養用培地１ml当り104〜106個の細胞数になる
ように調製して初代培養する。この培養において
は、簡便にはシヤーレまたはプラスチツクボトル
の培養容器を用いて培養温度37℃、５％CO2混合
気相、湿度100％の条件下にて静置培養する。次
いでこれを継代培養するに当つて、まず初期培養
において細胞が増殖して飽和に達したことを確認
後、洗浄して細胞を剥離し、回収する。 この際、洗浄液としてはカルシウム、マグネシ
ウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水〔以下、
PSB（−）と略す〕を用いればよく、また細胞剥
離の際は、トリプシンやナガーゼ酵素液を用いれ
ばよい。このようにして得られた細胞は、さらに
細胞数を調製して培養用培地に加え、これを簡便
には、37℃、５％CO2混合気相、湿度100％の条
件下培養容器内で飽和増殖せしめる。次いでこの
飽和増殖時の３分の１量の細胞数を、新たな培地
に接種し、同一条件下にてくり返し（継代培養回
数50回以上）培養した。 このようにして継代培養を行なつた結果、限界
なく継代培養が可能な株化細胞が得られ、さらに
この細胞はｈ−CSFを産生する機能的特徴を有す
るもので、この細胞をｈ−CSF産生細胞株TRC
−29Rと命名したものである。 以下に本発明に用いられる培養用培地、血清、
細胞分散用酵素および緩衝液（塩類溶液）につい
て説明する。 (1) 培養用培地にはイーグルMEM（Ｅ−MEM）、
アルフアーMEM（α・MEM）（第２表）、ダル
ベツコMEM（DME）、イスコブ培地
（IMDM）、フイツシヤー培地、グレース培地、
マツコイ・5A培地、199培地、ハム・Ｆ−10培
地、ハム・Ｆ−12培地、RPMI−1640培地（第
１表）、ウエイマウス培地、ウイリアム培地が
ある。 代表的な培地としてRPMI−1640培地の組成
は例えばペニシリンG100μｇ／ml、硫酸ジヒド
ロストレプトマイシン100μｇ／mlなどの抗菌
性物質および血清、好ましくは牛胎児血清10〜
15％を添加する。 (2) またTRC−29Rの増殖の際の血清には、牛
胎児血清が好適であるが、その他ヒト血清、子
牛血清、成牛血清、馬血清、ニワトリ血清を用
いてもよい。培養液中の血清比率は１−25％
（容量）で、好ましくは５〜20％であり、抗生
物質（ペニシリンG100μｇ／ml、硫酸ジヒドロ
ストレプトマイシン100μｇ／ml）を含む。 (3) 細胞用分散用酵素は次のものが使用、例示さ
れる。 トリプシン（１：250） 0.1〜0.25％ コラゲナーゼ 0.05％ デイスパーゼ 500〜1000U／ml ナガーゼ 25U／ml これらの蛋白分解酵素の溶液は、TBSに溶
解（なお0.02％のEDTA・２ナトリウム塩を含
有する）し、減菌後、いずれも0.45μｍミリポ
アーフイルタ濾過を行なつた。 (4) 塩類溶液としては、PBS、ハンクス液、ア
ール液およびTBSが使用される。 (5) 細胞の増殖 湿度100％、５％CO2混合気相中で培養温度
37℃で培養し、限界なく継代培養が可能であ
る。 (6) 保存条件： TRC−29R株の培養物より酵素的に細胞を
剥離させた後10％ジメチルスルホオキシド
（DMSO）又は10％グリセリン含有RPMI−
1640番地（10％FCSを含む）に懸濁して−80〜
−190℃にて凍結保存する。 (7) 細胞の特徴： 上皮様の形態を有する。染色体数の分布は74
本にモードをもつ高３倍数体である。 (8) CSF産生の確認 マウス骨髄細胞を用いたコロニー形成法 仁保の方法（「免疫実験操作法」、日本免疫学会
編、1974年、第927頁）に従いメチルセルローズ
を用いる下記の方法で行つた。 2.2％メチルセルローズ／α−MEM 1.6ml ウマ血清 0.8ml マウス骨髄細胞懸濁液／α−MEM 0.8ml 被験サンプルまたはCSF標準液 0.8ml メチルセルローズはダウ社製（Dow）、α−
MEMはフロー社製（Flow）、ウマ血清はギブコ
社製（GIBCO）（＃28K8024）CSF標準液はギブ
コ社製（GIBCO）GCT−CMを使用した。また
マウス骨髄細胞は静岡実験動物農業協同組合より
購入した雄性７週令のICRを使用し、大腿骨骨髄
の単核球を分離し、α−MEMに懸濁して５×
105／mlに調整した。 上記混合液を３枚の35mmの口径からなるプラス
チツクデツシユに１mlずつ分注し37℃、５％CO2
混合気相下で７日間培養した後、20個以上の細胞
からなる細胞集団を１コロニーとみなして算出
し、上記条件で１コロニーを形成させるｈ−CSF
活性を１単位（Ｕ）とした。 ｈ−CSFの活性はいずれも３枚のデツシユの平
均値で算出した。
【表】
【表】
【表】
【表】
実施例
次に実施例を掲げて本発明を説明するが、これ
に限定されるものではない。 実施例 (a) 生体試料 外科的に摘出された腎臓癌の腫瘍組織の一部
２ｇをあらかじめ冷却しておいた組織培養用培
地（イーグル−ミニマムエセンシアル培地、10
％FCS含有培地（Ｅ−MEM＋10％FCS）に無
菌的に入れ可及的速かに実験室に運び細胞の初
代培養実験に供した。 (b) 初代培養 鋭利な手術メスで前記組織１ｇを細切し、20
mlのTBSで三回洗浄した後20mlの0.25％トリプ
シン（DIFCO社製）TBS溶液を加えて37℃の
もとに90分間撹拌して組織を充分に分散させ
た。次いで牛胎児血清を含む培地で希釈するこ
とにより酵素活性を停止させ150メツシユの篩
を通して濾過し、その濾液を1000rpm5分間遠
心分離して細胞成分を集めた。次いで、分離し
た細胞をRPMI−1640培地＋15％FCS添加培地
に懸濁させ単細胞浮遊液とした後、細胞数を計
数し、培地１ml当り細胞数が２×105個になる
様に調整しこの懸濁液５mlを径６cmのシヤーレ
で37℃、５％CO2混合気相、湿度100％下に静
置培養した。 細胞数の計測は、改良型ノイバウエルＧ
（Neubauer）血球計算板を用いて0.1％トリパ
ンブルー染色による生細胞数を計数した（な
お、継代培養およびTRC−29Rの増殖におい
ても同一計測に基づいて行なつた。 (c) 継代培養 細胞が増殖し飽和状態に達したことを検鏡に
より確認した後、培養液を除去してPBS（−）
で洗浄し、次いで25U／mlのナガーゼ（長瀬産
業社製100U／mg）のTBS溶液（0.25％の
EDTA・２ナトリウム塩含有）５mlを加えて
37℃、15分間処理して細胞を剥離させ、酵素液
を遠心除去し、RPMI−1640培地＋15％FCS添
加の培養用培地15mlを加えて充分に細胞を分散
させ、その５mlを新たな培養容器に入れて37
℃、５％CO2混合気相、湿度100％の条件下培
養した。培養後、同様に、飽和増殖時の３分の
１の量の細胞数を新たな培地に接種し、これを
37℃、５％CO2混合気相、湿度100％にて84回
繰り返し培養をおこなつた。 (d) 株細胞の維持培養 このように継代培養して得られたヒト腎臓癌
組織より株化樹立したCSF産生機能を有する
TRC−29R株（命名）の培養は、５〜20％、
好ましくは10％FCS含有RPMI−1640培地を用
い、１×105／mlの細胞密度でコーニング社製
No.25100組織培養用フラスコに５ml量播種し
て37℃、５％CO2混合気相、100％湿度の培養
条件で培養し４〜５日毎に継代を行つた。 結果 (1) 樹立株TRC−29Rの特性 CSF産性細胞として樹立したTRC−29R株の
細胞生物学的性質を検討し、以下のような特性
を明らかにした。 形態：培養細胞は密に接した多角形の細胞が
単層シート状に増殖して敷石状を呈し、典型的
な上皮細胞様配列を示した。 細胞の増殖が進み飽和状態になると重層状に
増殖する傾向が見られた。 増殖能：RPMI−1640＋10％FCS培地を用
い、35mm径組織培養用プラスチツクデイツシユ
（コーニング社製）へ５×104生細胞／mlの細胞
浮遊液を２ml播種し、37℃、５％CO2混合気
相、100％湿度下で培養を行い増殖曲線を作成
し、この増殖曲線より求めたポピユレエイシヨ
ン・ダブリング・タイムは29±６時間であつ
た。 本株は、公知のいずれの培地でも培養可能で
あるが、RPMI−1640培地＋５〜20％FCS含有
培地においては、特に良好に増殖する。 染色体分析：染色体数の分布モードは第１図
に示す通りであつて、染色体数74本をモーダル
ナンバーとして高３倍体域にあり、比較的安定
した細胞株と判断された。 機能的特徴：CSF産生機能を有する。細胞株
TRC−29Rは公多のどの培地に培養するもｈ
−CSFを産生するが、５〜40％、例えば10％
FCS添加RPMI−1640培地を用いて培養した場
合においては、細胞の増殖とｈ−CSFとの産生
が良好であつた。 (2) 細胞の増殖とｈ−CSF産生の経時的変化 TRC−29R株の増殖とｈ−CSF産生との相関
をしらべるために10％FCS添加RPMI−1640培
地を用いて35mmφの口径からなるプラスチツク
デイツシユに1.1×105個の細胞を播種し、37
℃、５％CO2混合気相、湿度、100％のもとで
培養し、経時的に３枚のデイツシユをサンプリ
ングして細胞数と培養液のｈ−CSF活性を測定
した。その結果、細胞は１日の遅滞時間の後に
増殖し４日後にほぼ飽和に近づき８日後には
5.3×105個に達した（第２図）。培養液のｈ−
CSFの活性は細胞数の増大とともに上昇し（第
３図）、飽和増殖時に最大となり１ml当りの活
性が約300単位に達することが明らかになつた。 発明の効果 本発明により新規樹立株であるｈ−CSF産生細
胞株TRC−29Rを得たもので、この新規樹立株
TRC−29R細胞の大量培養によるｈ−CSFの工業
的生産法を確立し、それによつて得られたｈ−
CSFを医薬ならびに疾病の診断に有用な物質を提
供し得るものである。特にこのｈ−CSFは該細胞
の培養によつて本発明の大量製造が可能になれ
ば、原料の安定供給ができるようになり、生体防
制機構の崩壊に起因する疾病治療、診断への利用
が期待できる。
に限定されるものではない。 実施例 (a) 生体試料 外科的に摘出された腎臓癌の腫瘍組織の一部
２ｇをあらかじめ冷却しておいた組織培養用培
地（イーグル−ミニマムエセンシアル培地、10
％FCS含有培地（Ｅ−MEM＋10％FCS）に無
菌的に入れ可及的速かに実験室に運び細胞の初
代培養実験に供した。 (b) 初代培養 鋭利な手術メスで前記組織１ｇを細切し、20
mlのTBSで三回洗浄した後20mlの0.25％トリプ
シン（DIFCO社製）TBS溶液を加えて37℃の
もとに90分間撹拌して組織を充分に分散させ
た。次いで牛胎児血清を含む培地で希釈するこ
とにより酵素活性を停止させ150メツシユの篩
を通して濾過し、その濾液を1000rpm5分間遠
心分離して細胞成分を集めた。次いで、分離し
た細胞をRPMI−1640培地＋15％FCS添加培地
に懸濁させ単細胞浮遊液とした後、細胞数を計
数し、培地１ml当り細胞数が２×105個になる
様に調整しこの懸濁液５mlを径６cmのシヤーレ
で37℃、５％CO2混合気相、湿度100％下に静
置培養した。 細胞数の計測は、改良型ノイバウエルＧ
（Neubauer）血球計算板を用いて0.1％トリパ
ンブルー染色による生細胞数を計数した（な
お、継代培養およびTRC−29Rの増殖におい
ても同一計測に基づいて行なつた。 (c) 継代培養 細胞が増殖し飽和状態に達したことを検鏡に
より確認した後、培養液を除去してPBS（−）
で洗浄し、次いで25U／mlのナガーゼ（長瀬産
業社製100U／mg）のTBS溶液（0.25％の
EDTA・２ナトリウム塩含有）５mlを加えて
37℃、15分間処理して細胞を剥離させ、酵素液
を遠心除去し、RPMI−1640培地＋15％FCS添
加の培養用培地15mlを加えて充分に細胞を分散
させ、その５mlを新たな培養容器に入れて37
℃、５％CO2混合気相、湿度100％の条件下培
養した。培養後、同様に、飽和増殖時の３分の
１の量の細胞数を新たな培地に接種し、これを
37℃、５％CO2混合気相、湿度100％にて84回
繰り返し培養をおこなつた。 (d) 株細胞の維持培養 このように継代培養して得られたヒト腎臓癌
組織より株化樹立したCSF産生機能を有する
TRC−29R株（命名）の培養は、５〜20％、
好ましくは10％FCS含有RPMI−1640培地を用
い、１×105／mlの細胞密度でコーニング社製
No.25100組織培養用フラスコに５ml量播種し
て37℃、５％CO2混合気相、100％湿度の培養
条件で培養し４〜５日毎に継代を行つた。 結果 (1) 樹立株TRC−29Rの特性 CSF産性細胞として樹立したTRC−29R株の
細胞生物学的性質を検討し、以下のような特性
を明らかにした。 形態：培養細胞は密に接した多角形の細胞が
単層シート状に増殖して敷石状を呈し、典型的
な上皮細胞様配列を示した。 細胞の増殖が進み飽和状態になると重層状に
増殖する傾向が見られた。 増殖能：RPMI−1640＋10％FCS培地を用
い、35mm径組織培養用プラスチツクデイツシユ
（コーニング社製）へ５×104生細胞／mlの細胞
浮遊液を２ml播種し、37℃、５％CO2混合気
相、100％湿度下で培養を行い増殖曲線を作成
し、この増殖曲線より求めたポピユレエイシヨ
ン・ダブリング・タイムは29±６時間であつ
た。 本株は、公知のいずれの培地でも培養可能で
あるが、RPMI−1640培地＋５〜20％FCS含有
培地においては、特に良好に増殖する。 染色体分析：染色体数の分布モードは第１図
に示す通りであつて、染色体数74本をモーダル
ナンバーとして高３倍体域にあり、比較的安定
した細胞株と判断された。 機能的特徴：CSF産生機能を有する。細胞株
TRC−29Rは公多のどの培地に培養するもｈ
−CSFを産生するが、５〜40％、例えば10％
FCS添加RPMI−1640培地を用いて培養した場
合においては、細胞の増殖とｈ−CSFとの産生
が良好であつた。 (2) 細胞の増殖とｈ−CSF産生の経時的変化 TRC−29R株の増殖とｈ−CSF産生との相関
をしらべるために10％FCS添加RPMI−1640培
地を用いて35mmφの口径からなるプラスチツク
デイツシユに1.1×105個の細胞を播種し、37
℃、５％CO2混合気相、湿度、100％のもとで
培養し、経時的に３枚のデイツシユをサンプリ
ングして細胞数と培養液のｈ−CSF活性を測定
した。その結果、細胞は１日の遅滞時間の後に
増殖し４日後にほぼ飽和に近づき８日後には
5.3×105個に達した（第２図）。培養液のｈ−
CSFの活性は細胞数の増大とともに上昇し（第
３図）、飽和増殖時に最大となり１ml当りの活
性が約300単位に達することが明らかになつた。 発明の効果 本発明により新規樹立株であるｈ−CSF産生細
胞株TRC−29Rを得たもので、この新規樹立株
TRC−29R細胞の大量培養によるｈ−CSFの工業
的生産法を確立し、それによつて得られたｈ−
CSFを医薬ならびに疾病の診断に有用な物質を提
供し得るものである。特にこのｈ−CSFは該細胞
の培養によつて本発明の大量製造が可能になれ
ば、原料の安定供給ができるようになり、生体防
制機構の崩壊に起因する疾病治療、診断への利用
が期待できる。
第１図はTRC−29R株の染色体数の分布モー
ドを示す図、第２図はTRC−29R株の培養経過
を示す増殖グラフ、第３図はTRC−29R株のCFS
生産の経時的変化を示すグラフである。
ドを示す図、第２図はTRC−29R株の培養経過
を示す増殖グラフ、第３図はTRC−29R株のCFS
生産の経時的変化を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の特性を有するヒト腎臓癌組織由来のヒ
ト株化細胞TRC−29R。 (a) 由来：ヒト腎臓癌組織より分離。 (b) 形態：上皮細胞様。 (c) 染色体数：高３倍体域である染色体数74本の
モーダル・ナンバーを示すことを特徴とする染
色体数の分布モード。 (d) 継代培養：無限な継代培養。 (e) 機能的特徴：コロニー形成刺激因子産生。 (f) 細胞増殖性：細胞の増殖が進み、飽和状態に
なると重層状に増殖する傾向が見られる。特
に、５〜20％牛胎児血清を含むRPM−1640
培地において増殖性良く、ポピユレエイシヨ
ン・ダブリング・タイムは29±６時間である。 (g) 保存条件：−80〜−190℃で凍結保存。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59248203A JPS61126030A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | ヒトコロニ−形成刺激因子産生細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59248203A JPS61126030A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | ヒトコロニ−形成刺激因子産生細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61126030A JPS61126030A (ja) | 1986-06-13 |
| JPS6314947B2 true JPS6314947B2 (ja) | 1988-04-02 |
Family
ID=17174726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59248203A Granted JPS61126030A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | ヒトコロニ−形成刺激因子産生細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61126030A (ja) |
-
1984
- 1984-11-26 JP JP59248203A patent/JPS61126030A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61126030A (ja) | 1986-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2005302258B2 (en) | Platelets from stem cells | |
| JP2001510330A (ja) | ＭＳＣ―メガカリオサイト前駆体組成物およびメガカリオサイト分離による分離メガカリオサイトと会合するＭＳＣ▲下ｓ▼の分離方法 | |
| JP3032492B2 (ja) | 骨髄の複製方法 | |
| KR20020013480A (ko) | 사람 뇌의 내피세포 및 성장배지 및 원시 ｃｄ34+ｃｄ38-골수 간세포의 증가방법 | |
| US5874307A (en) | Process for induction culture of cytotoxic T lymphocytes having killing activity against tumor cells | |
| AU595813B2 (en) | Process for replicating bone marrow in vitro | |
| JP2002543829A (ja) | 哺乳動物造血幹細胞のｅｘｖｉｖｏでの増殖 | |
| Lanotte et al. | Collagen gels as a matrix for haemopoiesis | |
| RU2272638C1 (ru) | Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения хронического гепатита и цирроза печени (варианты) | |
| WO1998021313A1 (en) | Method for culturing hematopoietic stem cells | |
| JPH08205860A (ja) | 造血細胞の膨大化および移植方法 | |
| JPS6314947B2 (ja) | ||
| Mandalam et al. | Ex vivo hematopoietic cell expansion for bone marrow transplantation | |
| CN106244545A (zh) | 外泌体在促进造血干/祖细胞增殖中的用途 | |
| US6511848B2 (en) | Process for producing and multiplying lymphocytes | |
| JP3381224B2 (ja) | リンパ球を生産し、そして増加させる方法 | |
| JPS6318470B2 (ja) | ||
| JPS6314946B2 (ja) | ||
| JPH11180877A (ja) | 巨核球前駆細胞を含む細胞製剤及びその製造方法 | |
| JP2002171967A (ja) | 造血細胞群の体外培養方法 | |
| EP0498992A2 (en) | Serum-free culture medium containing lysozyme | |
| JPS61126031A (ja) | コロニ−形成刺激因子の製造法 | |
| KR870001417B1 (ko) | Pta-210 세포주를 이용한 인간 성장호르몬의 생산방법 | |
| JP2003289856A (ja) | 造血細胞培養用培地 | |
| Apte et al. | Establishment and characterization of a novel bone-marrow-derived macrophage-like accessory cell line |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |