JPS63158459A - 感受性アツセイの精度を調整する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ豆立豆！ 本発明は、種々の作用物の細胞に対する有効毒性の測定
方法であって、種々の化学的及び物理的作用物、例えば
限定はされないが化学治療薬剤及び照射のようなものに
対する細胞の感受性の組織培養試験（感受性試験）を行
うことによる方法に係わる。

従来の技術 ｍｔｓ細胞の治療薬剤に対する応答を正確に定量し得る
ということは、個体レベルにおいては、例えば特定の患
者について最も有効な治療を選択するために重要であり
、また研究レベルにおいては、例えば新規な薬剤あるい
は薬剤の組合わせを試験するのに重要である。細胞生物
学、生化学及び癌の研究を含む医学研究においては、組
織培養において細胞増殖を行うのが標準的な方法である
。癌の研究においてこのような方法で細胞増殖を行なう
１つの目的は、正常細胞に対するのと比較した腫瘍細胞
に対する種々の薬剤の毒性を試験することである。毒性
は、これ等の培養中での癌治療薬剤により腫瘍細胞の増
殖速度が鈍化させられるかあるいは該細胞が完全に破壊
されることにより明らかにされ得る。

一つのインビトロ法では、半固体アガー懸濁物系中で細
胞増殖を行う。Ｓａｌｍｏｎ等の米国特許第４４１１９
９０号は、２層ゲル系中で悪性細胞を増殖さ化剤を含む
。上部には、ゲル化可能剤を含む液体栄養培地中に入れ
た試験する腫瘍細胞が置かれている。この培地がゲル化
すると前者の層の上に第２の層を形成し、この中で細胞
は独立したコロニーあるいはクローンとして増殖し得、
各コロニーあるいはクローンは単一の母輔胞に由来する
ものである。このシステムにおいては、薬剤の毒性はコ
ロニーあるいはクローンの数の減少により観察され、こ
れは増殖の終了時に目視によりカウントすることができ
る。変形方法を含めてこのタイプのアッセイはクローン
発生法（ＣＩＯｎｏｏｅｎｉＣａｓｓａｙ）と呼ばれる
。クローン発生法はいくつかの欠点を有していることが
判明した。第１に、アッセイにおいて増殖しないかある
いは良く増殖しない細胞が多いので、通常数多くの腫瘍
細胞が必要となる。

第２に、個々の細胞が塊あるいは凝集の形で互いに接触
していない腫瘍細胞の均一な懸濁物を形成するのが技術
的に困難であり、クローン発生法に使用するための均質
な懸濁物を調製できないと、アッセイにおいてエラーが
発生する可能性がある。

５ａｒａ　Ｒｏｃｋｗｅｌｌは、このタイプの問題を“
ＥＦＦＥＣＴＯＦ　ＣＬＵＨＰＳ　ＡＮＤ　ＣＬＵＳＴ
ＥＲ３ＯＮ　５ＵＲＶＩＶＡＬ　ＨＥＡＳＵＲＥＨＥＮ
ＴＳ　ＷＩＴＨＣＬＯＮＯＧＥＮＩＣＡＳＳＡＹＳ、Ｃ
ｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

４５：、１６０１−１６０７．１９８５”に記載してい
る。第３に、互いに接近したコロニーは成長して重なっ
てしまうことがあり、それ等は別々に区別することがで
きないので、コロニーを実際にカウントしようとするこ
とは非常に非現実的な技術である。第４に、コロニーを
実際にカウントするのにはｆｆＨＦ！Ｉがかかり、労力
を必要とし、また機械化もしにくい。技術的な問題によ
り、クローン発生法においては患者から外科的に採取さ
れた１Ｍｇ！１９ンプルの３０〜４０％のみが増殖する
にすぎない。またクローン発生法においてはかなりの制
御し得ない技術的エラーが存在（、結果に有意なばらつ
きが生じてしまう。

このような研究に商業的可能性のないことの証拠として
、ＲＯＣｈｅが１９８４年より“Ｃｈｅｌｃｈｅｋ　　
ｔｍ”の商標で販売を開始したクローン発生法は、あま
りに売れず科学的な批判もあったため、１９８５年に市
場から撤退してしまったということがある。

従来の単−腸組織培養法においては、細胞は直接例えば
プラスチックやガラスのような培養表面で増殖させられ
る。これは多くの細胞の増殖が、該培養表面に付着した
ｍ胞によってのみ起り得るからである。多くの癌患者か
ら得られた生検試料に含まれるａｇｉｉ胞についてもこ
れは言えることである。これ等のタイプの固着細胞の増
殖特性は、“固定依存″と呼ばれる。腫瘍１１１胞の“
固定依存”増殖の問題を解決することは、２０年以上前
から大きな科学的課題であった。

ごく僅かの可能性のある例外を除いて、全ての細胞は組
織及び器官中において″゛細胞外マトリックス”と呼ば
れる物質により緊密に包囲されている。細胞外マトリッ
クスは細胞を互いに接着し、物理的支持及び固定をもた
らし、また選択的透過性障壁として働き、さらには細胞
増殖及び胚発生の間の変異を制御するものとしてｍ能し
得る。腫瘍細胞の表面への固着を促進する因子が細胞外
マトリックスから単離されており、これ等の因子のなか
には組織培養において“固定依存″腫瘍細胞の増殖をも
促進するものがある。このような因子は、例えば下記の
ような文献に記載されている。

ＡＬＰＩＮ等、“Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　
Ｍａｔｒｉｘ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、Ｉｎｔｅｒａｃ
ｔｉｏｎｓ。

ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅｓ”　、Ｂｉ
ｏｃｈ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ。

Ｖｏｌ、　６９４．　ｐｐ、　３７５−４１８　（１９
８３）は、　３９８頁第２列において、フィブロネクチ
ンがＩｆ細砲を含む特定の細胞型のプラスチック及びガ
ラス上での接着と展開の両方を促進することが知られて
いると記載している。

ＬＴＯＴＴＡ等、”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｉｎｔ
ｅｒａＣｔｉＯｎＳ　　ｏｆＴｕｍｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　
ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｂａｓｅｍｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ”、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂ１０ＣｈＱ１１．、　Ｖ
ｏｌ、　ｓｓ、　ｐｐ、１０３７−１０５７゜１９８６
は、腫瘍細胞増殖におけるラミニン、■型コラーゲン、
ヘパランスルフェートプロテオグリカン及びフィブロネ
クチンの重要性について開示している。

組織培養において腫瘍細胞の増殖を促進することができ
る増殖因子が開示されてきた。それ等は例えば血清、血
漿、腫瘍細胞が増殖した組織培養培地及び血小板のよう
な種々の生物学的ソースから単離されたものである。組
織培養において特定の型の腫ｆ！細胞の増殖を促進する
ことが知られている成長因子もあるー。例えば下記のよ
うな文献に記載されている。

ＨＭＣＩＡＧ等、　　“Ｈｏｒｍｏｎａｌ　　Ｒｅｑｕ
ｉｒｅａ＋ｅｎｔｓ　　ｏｆ　　ＢａｂｙＨａｌＳｔｅ
ｒに１ｄｎｅｙ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ”
、Ｃｅ１ｌｅｔｏ＋ｏｇｙ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ　ＲｅｐＯｒｔＳ、　　１９８０年　１月は、その
要約において、フィブロネクチンでコートした細胞培養
皿にインシュリン、トランスフェリン、フィブロブラス
ト増殖因子及び上皮漏殖囚子を添加した合成培地におけ
る新生ハムスター腎細胞の増殖を開示している。

現在、最も効果的な固着因子の組合せと最良の増殖因子
の組合せを含む腫瘍細胞増殖用の最良の組成物は知られ
ていない。しかしながら、最近の幾多の進歩により固着
因子をコートした表面上で腫瘍細胞を日常的に増殖させ
ることが可能になった。市販されている例としては、Ｉ
ＢＴ、　Ｊｅｒｕｓａ　ｆｅｗ。

ｌ５ｒａｅｌにより市販されている細胞外マトリックス
物質（ＥＣＭ）　、Ｌｉｆｅｔｒａｃ、　Ｉｒｖｉｎｅ
、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａより市販されている細胞固着
マトリックスでコートしたプレート（ＣＡＭ）　、Ｃｏ
ｌＣｏ１１ａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐａ１〇八
ｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａより市販されている被
覆プレート用のコラーゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）等があ
る。これ等の方法により、当業者は外科的腫瘍物質から
の１瘍細胞の増殖を良好な自然の増殖により特別に被覆
された表面上で日常的に行うことができるようになった
。

このようなＩ！瘍細胞の増殖における最近の多くの進歩
は、化学治療薬剤あるいは放射線照射に対する腫瘍ｍ胞
の感受性の日常的な試験を阻害している有意な技術的障
害に注目を集めさせることとなった。特にこれ等の障害
は、細胞の凝集及び集塊化による技術的問題（上記の通
り）、細胞増殖の定量における問題、腫瘍細胞増殖速度
の差異と接種物の質の種類（これ等は細胞の過剰増殖あ
るいは増殖不足を招く）の正確な制御及び最終試験結果
に及ぼされるそれ等の影響の問題、及び異なる作用物の
腫瘍細胞に対する毒性の正確な計算における問題を含む
。以下のいくつかの段落の記載は、これ等の技術的問題
の重要性についての説明に及ぶものである。

細胞の凝集（即ち集塊化）及び不均一な分布は、アッセ
イ隔室を構成する種々の組織培養ウェル中で再分布する
ことによって起こり、両者はいずれも２つ以上のコロニ
ー形成母細胞を含む集団からの腫瘍細胞コロニーの発生
を生起する。これは放射線感受性試験においては、この
ようなコロニーが単一のコロニー形成単位から発生した
のに較べて２倍の照射を必要とすることになる。このよ
うな欠陥のあるデータをプロットすると照射生存曲線に
おいて本来のものではないプラトーが示されることにな
り、結果全体が歪められてしまうか、あるいはｌ１ｉｓ
が２つ以上の異なる放射線感受性タイプからなるように
見えるために結果の解析が困難になってしまう。

さらに培養培地の流動性のために感受性試験に通常使用
されるアッセイ隔室の底部で細胞が不均一になるという
技術的問題もある。液体培地の高流動性のために、取扱
い中の動きや環境中の震動により組織培養ウェルの中央
部よりも辺縁部により多くのｆ４ｓ細胞が集まる可能性
がある。やはりこれも不確定要素であって現状では殆ど
のアッセイにおいてコントロールされておらず、ウェル
縁部のコロニーは正確にカウントすることが困難なので
結果に重大な影響を与え得る。

コロニーのカウントのような細胞増殖の非現実的な定量
の問題は、カウントしたコロニーの数において大幅な誤
りを出す可能性がある。試験に使用し得る腫瘍細胞の数
は通常限られているので、試験は薬剤あるいは放射線の
各治療用量につき腫瘍試料のレプリカを２つしか使用し
ないのが普通である。２つの同じものについての結果を
平均して最終なアッセイ値を得る。従って、個々の誤差
を平均することの累積効果はかなり重大なものとなり得
、実際は腫瘍がある特定の薬剤に対して感受性を有する
のに、抵抗性を有するかのごとく解されてしまうことも
あり得る。これはより定石的な方法を使用した場合に見
られる。従って、化学薬剤、放射線あるいはその他の作
用物に対する種々のＷＱの相対的感受性／抵抗性をラン
ク付けしようとするアッセイシステムはどれ“も正確で
明確なデータを必要とする。

ｌｌ１１瘍ｍ胞の増殖効率の差は、同じ組織学型の腫瘍
間でも存在するのが普通である。これが組織培養プレー
トに接種するのにとのぐらいの数のａ胞を使用すればよ
いかを予想するのを当業者にとって困難にしている原因
である。多すぎる細胞を使用すると、アッセイの終了前
に腫瘍細胞がアッセイウェルで過剰増殖してしまい、そ
の結果多くの細胞が死滅したりお互いの上で増殖するこ
とになるので増殖量を定量することができなくなる。さ
らに、腫瘍が増殖の対数期にあって盛んに増殖している
ときに癌治療薬剤の毒性効果を試験することが重要であ
る。これは細胞増殖を鈍化させるが、直接細胞を殺すこ
とはない薬剤の場合特に重要である。この場合、多すぎ
る細胞を接種して細胞培養を行うと、培養期間の終了時
にこれらのタイプの治療薬剤の増殖鈍化効果を観察する
ことができず、患者にとって可能性のあり得る効果が完
全に見過ごされてしまうことがある。また使用する細胞
が少なすぎると、やはり増殖を定量することは不可能で
ある。

上述の問題に加えて、ヒト腫瘍の外科的生検体から得ら
れる組織サンプルは、その組成が非常に多様であるとい
うことがある。このことから起こる１つの問題は、サン
プル中の粉砕されていない塊や組織断片が、アッセイの
定量において１ｖｉの増殖を反映するものとして誤って
判読されてしまい得ることである。このためランダムな
誤差が含まれることになり、極端な場合には判読不可能
な結果を導いてしまうことがある。

上記のような技術的問題があるので、計算において適切
な定量コントロールを使用するようにすること、及び種
々の患者から得られた腫瘍サンプルの治療薬剤に対する
応答性（あるいは非応答性）の相対的程度を定倦的に比
較することができるよう１にすることのために、いかに
して最終データを計算し、表現するかが当業者にとって
非常に重要な課題となっている。

これまで、ある個体からの細胞における１つの試験薬剤
の相対臨床能力（即ち、他の個体に対して相対的な）を
確かめることはできなかった。これは、既に述べたよう
に細胞増殖の定量に関連する大きな誤差によるものであ
る。このような誤差は、各個体間での１つの試Ｍ薬剤の
臨床能力の有意な比較を実質的に不可能にしていたもの
である。

要するに、腫瘍細胞の薬剤及び物理的作用物（例えば放
射Ｉりに対する感受性を測定するためのインビトロでの
アッセイの正確さを技術的に改良するための方法を見付
けることが重要になっているものである。

従って、腫瘍細胞を組織培養プレート中に正確に分布さ
せることができるようにするために、腫瘍細胞の凝集を
簡単に防止する方法が強く求められる。また、容易に自
動化及びコンピューター解析できるような、細胞コロニ
ーの増殖を容易にカウントできるような１方法も強く求
められるであろう。さらには、異なる個体から得られた
細胞サンプルの増殖速度における個々の変化を制御する
方法もまた強く求められる。また、試験サンプル中の分
裂していないｌ１ｌＩｌ！！や組織断片の影響が、アッ
セイで得られた値においてどの程度バックグラウンドノ
イズとして含まれているかを定量し得、それを最終結果
から差引くことができるようにすることも有利であろう
。また、感受性アッセイにおいて得られたデータを正確
に取扱い、種々の薬剤及び物理的作用物の毒性を計算す
る方法が提供されることも望ましい。

発明の要旨 本発明は、種々の作用物の細胞に対する有効毒性の測定
を同じく目的とするいくつかの方法であって、種々の化
学的及び物理的作用物、例えば限定はされないが癌化学
治療薬剤及び放射線のようなものに対する細胞の感受性
の組織培養試験を行うことによる方法を提供する。その
他の応用としては、正常細胞に対する作用物の毒性試験
に係わるものでもよく、これは例えば化学的毒物の作用
の環境安全試験、あるいは作業場所で遭遇するような作
用物の職業健東上及び安全上の試験のようなものである
。本発明は、ａ）細胞の液体懸濁物中での凝集を防止し
、細胞を均一に分布させる方法、ｂ）ｍｌ胞増加効率の
変化の制御方法、Ｃ）作用物の細胞に対する毒性を感受
性試験において測定するための光学密度法、ｄ）アッセ
イでコントロールとして使用するためのバックグラウン
ド消去法、及びｅ）処理効率を決定するための生存曲線
の計算方法を提供する。これ等の種々の方法は、組合わ
せであるいは独立して実施することができる。これ等を
組合わせれば、Ｍ瘍細胞あるいは正常細胞の種々の試験
作用物に対する感受性を試験するための、高い正確度を
もった１つのｔｉｌＩＩｌｌされたシステムとなる。従
って、試験作用物の相対臨床能力を高い信頼度をもって
決定することができる。

本発明は、液体培養培地の流動性による問題を取除く、
Ｕ瘍細胞の均一な懸濁を確保する方法を提供する。該方
法は、細胞を懸濁する培地に有効量の粘度調整剤を添加
することからなる。粘度調整剤はゲルあるいは架橋マト
リックスを形成するために使用されるのではなく、これ
等が生ずるのは望ましくない。

粘度調整剤は、限定されるものではないが好ましくは、
メチルセルロース、ペクチン、植物ゴムあるいは限定は
されないがシュクロースのような化学的粘性物質である
。粘度調整剤がメチルセルロースの場合、０．６％の量
で加える。本発明によれば、細胞懸濁物は、限定はされ
ないがＤｕｌｂｅｃｃ。

の改変イーグル最小必須培地のような適当な液体中に：
約２，０００−５００，０００１１胞／ｌｄヲ含む。

さらに本発明は、 ａ）細胞試料、 ｂ）懸濁液体、及び Ｃ）毛管作用により細胞が周辺部に分布することを実質
的に防止し、細胞が細胞培養表面に置かれたときにその
均一な分布を促進するのに充分な吊の粘度調整剤、 からなる、アッセイ隔室に導入する細胞懸濁物にも係わ
る。

また本発明は、実質的に架橋したゲルマトリックスを形
成することなく細胞懸濁物中に有効ａの粘度調整剤を添
加することからなる、細胞懸濁物中の細胞の均一な分布
を確保する方法にも係わる。

このような方法は、その後の細胞培養隔室に分散懸濁物
のアリコート部分を取る段階も含んでもよい。

また本発明は、アッセイにおける腫瘍細胞増殖の速度及
び程度の差異に起因する問題を軽減する方法を提供する
ことも目的とする。これ等の差異は、増殖過剰を招き、
これは光学密度測定により細胞増殖の定量を行なう場合
に不正確な結果を導き得る。

上記の目的は、本発明の細胞集団の過剰増殖の存在を検
出する方法により達成される。該方法は以下の段階、 ａ）３つの培養隔室に、３種以上の異なる濃度（細胞数
／ｄ）の胛＊＊細胞を接種し、 ｂ）増殖促進培地の存在下に、所与の期間細胞試料を増
殖させ、これらのコントロール細胞試料のそれぞれの密
度を光学的に測定し、 Ｃ）Ｉｆ胞の当初試料中量も低い２つの濃度で測定した
光学密度と、それぞれの細胞濃度の間のグラフ的あるい
は数学的な関係を決定し、 ｄ）その数学的あるいはグラフ的な関係を使用して第３
の試料について外挿し、その試料について外挿された（
予想された）光学密度と実際に測定された光学密度の比
率を計算し、 ｅ）この比率に基づいて過剰増殖が起ったアッセイを拒
絶する段階からなる。

好ましい実施態様においては、３つの細胞試料のうち少
なくとも２つは第３の試料に比べて低い細胞濃度のコン
トロール試料であり、この第３の試料がアッセイのため
の試験接種に使用される細Ｗ＆濃度と実質的に同じ濃度
を有しているものである。細胞の増殖に従い、２つのよ
り低い細胞濃度について測定した光学密度の間に実質的
に直線的な関係が決定される。この直線的な関係により
数学的に外挿して第３のコントロール細胞濃度について
予想される光学密度値を推定する。予想される値と実際
に測定された値の比率を計算し、この比率が許容できな
いぐらい大きい場合にはそのアッセイを拒絶する。

最も好ましくは、細胞は癌細胞であり、該方法は、１：
２：４：８の細胞個数の比率、即ち直径１６＃ｌＩのウ
ェル当り２５０．５００．１０００．２０００個の細胞
の４つの細胞コントロール試料を接種することからなる
。

アッセイは化学的感受性アッセイあるいは放射線感受性
アッセイのいずれでもよく、あるいは正常または腫瘍細
胞に対する作用物の毒性を試験するその他のアッセイで
あってもよい。

外挿した予想される光学密度値を実際に観察された値と
比較して、自動的に細胞の過剰増殖あるいは過剰増加を
検出する装置を設けるのが好ましい。このような装置は
、適当なプログラムを設定したコンピューターを光学密
度測定用装置に接続したものが好ましい。プログラムを
組込んだコンピューターは、少なくとも２つの試料で測
定された光学密度値の間の実質的に直線的な関係を決定
するものであり、より高い細胞接種濃度において予想さ
れる光学密度値を外挿して計算する手段を含むものとし
得る。このようなコンピューターシステムは、予想され
る値と実際に観察される値の間の偏差を計算する方法も
含み得、またその偏差が許容できない場合は自動的にア
ッセイを拒絶する手段をも含み得る。

本発明はさらに、細胞コロニーを定量する方法と装置を
提供することも目的としており、これは従来のり０−ン
発生法でそうであったように非現実的なものではなく、
実際的で容易に自動化をすることもできるものである。

上記の目的は、細胞コロニーをアルコール、ホルムアル
デヒド、あるいはその他の通常使用される組織学的固定
剤で固定し、それ等を染料（限定されるものではないが
例えばクリスタルバイオレット、あるいはＧｉｅｍｓａ
、あるいはＨａｌｙ　ＧｒＵｎＷａｌｄＧｉｅｍｓａ）
で染色し、試料に光線を当て、そして試料の光学密度を
測定することからなる本発明の方法により達成される。

本発明の方法によれば、コロニーは腫瘍細胞あるいは正
常細胞であり、該方法は、 ａ）直径１６ｍのウェル当り２５０〜１６，０００の細
胞を培養隔室に接種し、 ｂ）ｌ！瘍細胞を接種しないコントロールウェルでのア
ッセイも行い、 Ｃ）細胞試料を増殖促進培地の存在下に所与の期間増殖
させ、 ｄ）限定はされないが例えばアルコール、ホルムアルデ
ヒドのような適当な組織学的固定剤で細胞を固定し、次
に限定されるものではないが例えばクリスタルバイオレ
ットあるいはＨａｙ　ＧｒｕｎｗａｌｄＧｉｅｍｓａの
ような染料で細胞コロニーを染色し、ｅ）染色した細胞
コロニーに光線を当て、各細胞培養中の密度を光学的に
測定することからなる。

感受性アッセイにおいては、各アッセイ隔室は、例えば
異なる用量の化学治療薬剤や異なる用量のイオン化照射
のような異なる治療条件にさらされ、作用物に対して生
き残る細胞コロニーを増殖させ、それらの増殖を固定、
染色及び光学密度の測定によって定量する。

当初試料に含まれる非増殖細胞あるいは非細胞質破片の
塊に起因し、アッセイに影響を与えるバックグラウンド
ノイズを定量し消去する方法を提供することも本発明の
目的である。該方法は、接種物に作用物を加えて分裂細
胞を殺し、その後この細胞の死滅した接種物をアッセイ
の培養隔室に加える。この方法により、アッセイの最後
に当初試料の全光学密度に対する影響を測定し消去する
ことができる。この作用物は、トリチウム化チミジン、
コルキシン及びマイトマイシンＣからなる化合物の群か
ら選択されるが、同様に作用し、実質的に同じ結果を達
成するその他の作用物も使用できることは極めて明らか
である。

本発明は、アッセイにおける多数の変動を数学的に調整
し制御してアッセイの結果を計算する方法を提供するこ
とも目的とする。これにより、試験される特定の細胞に
対する試験中の種々の作用物の毒性を示す正確かつ詳細
で鋭敏なデータが提供される。そしてこのデータは、試
験中の作用物に対する試験される細胞の相対的な感受性
あるいは抵抗性を決定するのに用いられる。

さらに本発明は、・アッセイの結果を分析する方法を提
供することも目的とする。この方法は、それ自体容易に
コンピューターによるデータ処理及び評価とすることが
できる。

これらの目的は他のアッセイステップ（上述）と、以下
の付加的ステップを組合せることにより達成される。即
ち、 ａ）アッセイにおける複数の細胞試料を、試験する作用
物の異なる処理量で処理するか、作用物の異なる条件で
処理し、 ｂ）光学密度測定により細胞の増殖を定量して（上述の
通り）各処理の効率を測定し、 Ｃ）過剰増殖あるいは増殖不足についての細胞増加コン
トロール（上述）を使用してアッセイの有効性を計算し
、 ｄ）バックグラウンド消去コントロール（上述）を使用
してアッセイ結果から非特異的バックグラウンドノイズ
を消去し、 ｅ）データをプロットするかあるいは数学的に表して生
存曲線の形にし、細胞増殖（光学密度測定により表され
る）と処置用量あるいは条件との相関を示し、 ｆ）ＩＩＩ胞の９０％が作用物により死滅する用量ある
いは条件（９０％細胞毒性あるいはＩＣ９０値と呼ぶ）
を数学的に決定し、 １；ｌ　）　ＩＣ９０値を試用して特定の処理作用物の
相対効率を決定するステップである。

ステップｂ）で行なう測定間の連続的なデータ曲線を作
成して上記分析方法を自動化・し、ステップＣ）〜ｇ）
の数学的作業をコンピューター化するのが最も好ましい
。処理は、同じ数の腫瘍細胞を化学治療薬剤の異なる用
量あるいは放射線の異なる用量により処理する形にし得
る。

また前記一方法は、アッセイからの少なくとも１つの数
値、即ちＩＣ９Ｇ値をノートあるいはコンピューター中
に記録し、異なる患者から得られた細胞に対する１つの
作用物の相対治療効果の間での比較、あるいは同じ細胞
に対する異なる作用物の間での比較ができるようにする
ことも含む。同じ化学治療薬剤、あるいは放射線の同じ
用量に対する、異なる患者からの腫瘍の感受性の比較を
行なうのが最も好ましい。この特に好ましい態様におけ
る方法は、１人の患者の腫瘍の増殖を鈍化させ・る・、
かあるいは消滅させることについての種々の制癌゛剤の
相対効率をランク付けすることに一致する。その他の態
様においては、種々の現存する（あるいは新しく開発さ
れた）化学治療作用物、薬剤或いは毒性物質について、
あらゆる哺乳類あるいは動物ソースからのＩ！！瘍細胞
または正常細胞を含む細胞の増殖を鈍化せしめたり、消
滅せしめたりする能力に関し統計的にランク付けするこ
とができる。

（以下余白） 好ましい　　イ例の　細な説 本願発明の手法は、例えば腫瘍細胞の化学薬品感受性又
は放射線感受性テストのような、細胞用化学薬品又は物
理薬品の毒性をテストするアッセイと組合わせて採用す
るのが好ましい。

アッセイは、（ａ　）例えばガラス又はポリスチレンプ
ラスチックを含むプラスチックのような、組織培養室の
器壁に塗布された細胞外マトリックス物質、及び（ｂ）
インシュリン、インシュリン様増殖因子、上皮生長因子
、血小板由来生長因子、酸性又は塩基性の繊維芽細胞生
長因子を含有してなる組織培養基のような、０．１〜６
５％の血清（ウシ、ウマ、ブタ、ヒト又はその他の）及
び／又は細胞増殖を促進するその他の増殖及び栄養因子
を含有してなる細胞増殖を促進する適当な液体培地、の
使用により細胞増殖が最適化される細胞培養手法を使用
して行なわれる。細胞外マトリックス物質は増殖に「足
場依存性」を必要とする細胞の付着を促進し、液体組織
培養基と組合わせて使用されると細胞増殖が促進され、
肺癌、黒色腫、肉腫、乳癌及びその他の一次又は転移腫
瘍からの培養物を樹立することができる。

細胞懸濁液は、当業者に標準的な方法により組織及び器
官サンプルから得られる。このような方法には、例えば
メスとはさみにより組織を切り刻むといったような機械
的方法、コラゲナーゼを含む酵素により組織を消化して
細胞を結合組織から遊離すること、及びサンプルを遠心
分離にかけて細胞の集合体及び不消化の組織片を除去す
ることが含まれる。

細胞が組織培養アッセイに適切に分散し均一に分布する
ことが、再現性のある結果を得るための鍵である。組織
培養室（すなわち、組織培養板の穴）のぶち又は組織培
養フラスコ若しくは平板のふちにＳＵｌが局部的に蓄積
すると細胞濃度が局部的に高いものとなる。本発明によ
る粘度調節剤の添加はその効果としてふちにおける毛管
力減少作用を有し、組織培養室における細胞の均一な分
布をもたらす。

本発明の好ましい具体化によれば、メチルセルロースを
細胞が０．６％濃度で分散している液体培地に添加する
。メチルセルロース範囲は、０．３〜０．８％、好まし
くは０．５〜０．１％、そして最も好ましくは０．６％
である。本発明の目的上はメチルセルロースが好ましい
けれども、本発明はこの特定の粘度調節剤に限定される
わけではなく全ての調節剤に及ぶ。

粘度調節剤の使用量は、使用される調節剤のタイプに依
存し、１＃Ｉｉ！当り２，０００〜ｓｏｏ、ｏｏｏ個の
細胞を含む細胞懸濁液に種々の量の調節剤を添加してみ
ることにより経験的に決定される。細胞はヒトの一次腫
瘍または正常組織から得られる細胞並びにヒト及び動物
の樹立細胞系の細胞から選ぶことができる。得られるＩ
Ｉｌ胞分数分散液覆組織培養室に加えられ、細胞は空気
中５〜１％ＣＯ□を用いる３７℃におけるインキュベー
ション中に培養室の表面に付着することができる。適当
Ｖ＃間（通常６〜２４時間）後分散培地を除去し、細胞
を０．０１Ｍ燐酸塩で緩衝した０、１４　Ｍ塩化ナトリ
ウム（ＰＢＳ）で静かに洗浄し、ついでこれを増殖培地
で置き代える。適当時間（通常５〜１３日）後生長した
細胞コロニーを固定・染色して原細胞接種材料（１ｎｏ
ｏｕｌｕｌ）の分布の均一性を視覚的に検査する。

本発明はまたアッセイにおけるｌ１１ｗ＆の［過増殖（
ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ）　Ｊの対照（Ｃｏｎｔｒｏｌｓ
　）製造法と関連して使用される。対照は、毒物が最適
条件下で例えば細胞の対数増殖期中にテストされること
を確保し、またアッセイの結果が適切に解釈されること
を確保するのに極めて重要である。細胞増殖を定量する
のに自動光学濃度測定装置を使用できるアッセイにおけ
る許容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅｓ）を定める対照法を使用
することはとりわけ重要である。

要するに、アッセイは上記のように適当な粘度調節剤を
含む液体培地における分散細胞を適当な細胞外マトリッ
クス物質で被覆した組織培養室に加えることにより始ま
る。細胞を加える發は１ｄ当り２，０００〜ｓｏｏ、ｏ
ｏｏ個であって、好ましい具体化においては組織培養室
は２４穴組織培養板であり、各穴に細胞懸濁液を１ｍ宛
加える。組織培養板は空気中５〜１％Ｃｏ２を用い、３
７℃で６〜２４時間インキュベートし、これにより細胞
は穴の表面に付着できる。インキュベーションの終りに
穴をＰＢＳで静かに洗浄し、ついで新鮮組織培養増殖培
地を加える。

薬物又は毒物のテストには、テストすべき薬物又は毒物
を種々の用量で又は種々の処理条件（＃、’ｏｄａｌｉ
ｔｉｅｓ）とともに新鮮培地に含有せしめる。放ｌＨｍ
感受性テストには、穴中の細胞に種々の用量の放射線を
照射する。

アッセイは全て第６日に培地を薬物又は毒物を含まない
新しい新鮮培地と交換し、培養物はテスト接種材料のス
ポット汚染又は［増殖なしくｎ。

ｇｒｏｗｔｈ）　Ｊをチェックし、そして増殖中の培養
物はさらに７日間３１℃で５〜１％ＣＯ２内でインキュ
ベートする。汚染培養物は毒物、好ましくは９５％エタ
ノールを添加して「消毒」する。これにより汚染培養物
は近隣培養物に影響を与えないようになる。

アッセイは細胞をエタノール（又は適当な組織学的固定
液）で固定することで終了し、クリスタルバイオレット
（又はその他の適当な染料）で染色し、光を照射して各
染色培養穴の光学濃度を測定する。

薬物又は毒物テストには、１〜４枚の多穴板に接種する
。これにより、原組織又は腫瘍サンプルから得られる細
胞の収率に依存して決まる、比較的狭い濃度範囲の２〜
６種の用量での３〜９種の薬物の二重テストが可能とな
る。アッセイで使用すべき種々の薬物の用量は、当該薬
物の既知の骨髄毒性ｍに等しい濃度としての最高濃度を
使用して、最初に決定する。用量はついで経験的に下方
調整し、当該アッセイで当該薬物について蓄積された経
験に基き「微調整」する。最終アッセイで使用されるで
あろう濃度の２０倍の濃度で０．２−のアリコート闇の
薬物用量の組をいくつも調整する。

これら濃厚「貯蔵」液はついで使用するまで一７０℃で
凍結貯蔵する。

薬物又は毒物感受性アッセイにおける対照には次のもの
が含まれる： ａ）ブランク対照：細胞を接種してない被覆組織培養穴
（好ましい具体化においては通常少なくとも２個）　（
培養物の光学濃度の最終測定値に対する塗布表面の寄与
に対する対照として；この対照は「マトリックス」対照
と称する。）：ｂ）バックグランド対照二本発明方法の
もう１つの主題である対照で、被覆培養穴（又は副尺）
に特別に調整した「殺菌した」　（死んだ）接種材料を
接種することを含む（培養物の光学濃度の最終測定値に
対する接種材料の寄与の変動に対する対照として）：そ
して Ｃ）接種材料対照：少なくとも３つの対照からなるもう
１つの組で、もう１つの発明方法の主題であって、被覆
穴に３種の異なる濃度に調製した細胞を、好ましくは例
えば１：２：４：８の比の細胞数からなる接種材料を、
直径１６１１ｍの穴当り２５０．５００．１，０００及
び２，０００個の細胞を、細胞の［過増殖」を確認する
ための対照（「接種材料滴定」対照と称することができ
る）として、接種することを含む。アッセイサンプルの
１００％基準点（＃−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｏｉｎｔ
　）は上記の組から決定することができる。

上記のステップｂ）の主題であるバックグランド対照の
調製に用いられる本発明の手法は、細胞を殺して接種材
料を増殖に関して「殺菌した」ものとする薬剤に細胞懸
濁液をさらすことを含んでなる。本発明による好ましい
薬剤は、分裂（癌又は正常）細胞のみを絶滅し、非分裂
（死んだ）残骸を残し、その結果光学濃度に対するその
寄与が測定可能となるものである。そのような薬剤は、
好ましくは、トリチウム化チミジン−、コルヒチン（Ｃ
ｏｌｃｅｍｉｄｅ−ｔｍ）及びマイトマイシンＣから選
ばれる。トリチウム化チミジンの添加母は一般に１１Ｒ
１当り０．５〜５マイクロキユリー、より好ましくは１
〜５マイクロキユリーそして最も好ましくは５マイクロ
キユリーである。コルヒチンの使用量は一般に１Ｍ１当
り　１〜１０埒として最も好ましくは２馬である。

放射線感受性をテストする対照は約２個の多穴板を必要
とする。アッセイは６種の放射線量で行い、副尺を各線
量で処理する。線量は０．５〜６グレイ（ＧＹ、放射線
量の１単位）である。対照は上に詳述したものと同じで
あり、培養物は同じ（第６日に上に詳述したように新鮮
培地が「与えられる。Ｊ培養は、上に詳述したと同一の
仕方での固定・染色により終了する。

本発明方法によるアッセイが終了すると、穴の光学濃度
を、個々の組織培養穴を照射し、例えばニコンマジスキ
ャン（Ｎｉｋｏｎ　　Ｍａｏｉｓｃａｎ　）自動像解析
器のような光学的像解析器を用いて各穴の光学濃度を測
定して確認する。極めて明らかなことであるが、治療薬
の効能を測定する目的のいかなる利用可能な代替方法、
例えば細胞コロニー計数法等、を使用することができる
。

次に、「接種材料滴定」対照の低い方から２又は３個の
穴の光学濃度を、初期細胞接種材料濃度に対してプロッ
トする。この結果は理想的にはリニアプロトであって、
データは好ましくはできるだけぴったりと線形数学モデ
ルに一致していることである。しかしながら、「過増殖
」が生じたかも知れない細胞接種材料の高濃度域では光
学濃度の測定値はより低い接種材料値の線形外挿により
予測される値よりも低い値を示すことがあり、そしてこ
の場合考慮できるのは曲線の低い方の（線形）部分のみ
である。

細胞接種材料の濃度と光学濃度との間の算出された最終
の線形関係は、感受性アッセイにおける接種材料、これ
は５ｔｅｐ　ｃ）の対照接種材料であるが、として用い
られる細胞接種材料に対する光学濃度の「期待」測定値
を数学的外挿によって得るのに用いられる。［プラス対
照（ＥｌｏＳｉｔｉＶｅ　　０ＯｎｔＦＯＩシ畔）」の
光学濃度の「期待」値と「実測」値との比を計算する。

この比が容認し難いほど高い場合は、そのことは当該ア
ッセイを考慮外におく根拠となる。光学濃度の「期待」
値対「実測」値の比が容認できるものであるかどうかの
評価基準は当該アッセイが行なわれる［致死率ベース（
ｋｉｌｌｒａｔｅ　　ｂａｓｉｓ　）　Ｊの凶数である
。理想的には、容認できるアッセイは次の場合に生起し
たといえる：ＯＤｅ　１０Ｄａ　＜　１００／Ｋｒ ここで、ＯＤｅは外挿によって得られる光学濃度値又は
「期待」値であり、ＯＯａはプラス対照の「実測」値で
あり、そしてｌ（ｒは当該アッセイにおける生残率（％
）で表わした抑制性値（ｉｎｈｉｂｉ−ｔｏｒｙ　　ｖ
ａｌｕｅ　）である。好ましくはこれは１０％であるが
、他の生残率（５０％）を選んでもよい。

最後に、本発明の方法によれば、補正データは「生残曲
線」を得るためのプロット用に使用される。生残曲線に
おいては、（処理培養物で測定された光学濃度により又
は他の自明の利用可能なコロニー計数法のような方法に
より測定される）「生残」又はその逆の「致死」を、処
理として用いられた毒物の用量又は条件に対してプロッ
トする。薬剤感受性テストの好ましい具体化においては
、これには半対数プロットでテストサンプルの補正光学
濃度を当該アッセイの処理に用いられた薬物の濃度に対
してプロットすること（例えば、「生残」又は「致死」
を対数縦座標にとり、濃度を線形横座標にとる）が含ま
れる。結果は、データの線形回帰分析その他の各種の標
準曲線調整手法のいずれかにより、ある曲線に数学的に
調整することができる。データの曲線への調整はまた明
らかに自動的に例えばコンピューターにより行なうこと
もできる。（「プラス対照」の調整値の１０％である光
学濃度によって示されるがごとき）９０％の細胞が殺さ
れる（又は１０％が生残っている）薬物濃度、用量又は
条件は当該特定の細胞に対してテストされている薬物又
は毒物の１Ｑ９０値と定義する。ある増殖（即ち、生残
）値を選ぶので、そのような増殖をもたらす用量値を「
抑制性値」と定義する。抑制性値、この場合はＩＣ９０
値は、例えばコンピューターにより自動的に計算するこ
とができそして「生残曲線」は全て又は一部分及びＩＣ
９０値は将来の参照のためにコンピューターデータファ
イルまたはノートブックに保存することができる。蓄積
された経験をこれらのデータファイルに関連づけること
によって本発明は百分位数スケールで細胞のある特定の
一連の薬剤に対す相対的感受性又は抵抗性を統計的に「
ランク付けする」方法を提供する。

化学療法薬感受性、放射線感受性又は毒物テストの好ま
しい具体化において、ある特定の患者の腫瘍細胞のある
特定の薬剤に対する、生残曲線（全て又は一部分）及び
ＩＣ９０値により定義される反応を、テスト薬剤に対す
るある特定の感受性又は抵抗性について観察されたテス
トサンプルのパーセントが当該薬剤の横座標に対して縦
座標としてプロットされている百分位数ヒストグラムの
類似する他の保存されている結果の反応と比較する。か
くして、あるテスト薬剤の相対的な臨床効能が確認され
る。

薬剤感受性テストの好ましい具体化においては、薬剤の
各濃度において所与のＩＣ９０値を示す患者サンプルの
パーセントを計算し、これを薬剤濃度の横座標に対して
縦座標としてプロットする。

放射線感受性テストの具体化においては、各放射ｍｌに
おいて所与のＩＣ９０値を示す患者サンプルのパーセン
トを計算し、これをグレイ（ＧＹ）単位で示した放射線
量の横座標に対して縦座標としてプロットする。ヒスト
グラム上の特定のテスト値の位置によりテストサンプル
の当該特定の薬剤に対する相対的「反応性」又は「感受
性」が定まる。ヒストグラムからの百分位数が低い。例
えば当該薬物（又は放射線）に対してそのような低濃度
で反応する腫瘍を保持する患者が極めて少ないならば感
受性のあることがうかがわれる。

あるいはまた、放射線感受性テストには綜目のある選択
値を選ぶことができ、そしてその選択線量（典型的には
２グレイ）における増殖（即ち、生残又は致死）を「抑
制性値」として測定する。

そのような抑制性値はついで他の人間からの細胞に対す
る抑制性値と比較することができる。

少なくとも用量のある選択値を選ぶ状況では、アッセイ
細胞サンプルを１個だけ使用することもまた可能となら
しめられ得る。このことは薬剤及び放射線のいずれのテ
ストにも可能である。そのような場合、その用量におけ
る増殖値は個人間で比較可能である。

本発明はかくして患者の癌の処置に使うことができるで
あろう種々の薬剤及び物理的作用物の比較的な処置効能
を正確に支持する方法を与える。

あるいはまた、本発明は人間及び動物組織由来の正常細
胞に対する種々の化学薬品又は物理的作用物の毒性を正
確に比較する方法を与える。下に掲げる実施例は本発明
の様々な側面を示す。

ＬＬＬ この実施例は、細胞培養物の接種における粘度調節剤の
使用を示すためのものである。

腫瘍のバイオプシーサンプルを、癌患者から日常の診断
又は治療行為の間に得た。

固体腫瘍バイオプシーをメスで１ｍ１１の細片に切り刻
んだ。液体腫瘍サンプル中で凝固が起るのを防止するた
めに、ヘパリンを抗凝固剤として１０単位／ｄの濃度で
加えた。これらサンプル中の腫瘍細胞を遠心分離により
回収した。固体又は液体検体からの組織を、０．０７５
％のコラゲナーゼタイプｍ　（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂ　ｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ　、　Ｍａｌｖｅｒｎ、　ＰＡ、　）、
０．０５％のＤＮアーゼ（Ｓｉｇａ＋ａ、　Ｓｔ　、　
Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ，）及び１０％のウシ胎児血清を含む組織培養培地
中に一定の攪拌下に一夜インキユベーションすることに
より分解した。

一夜酵素消化した後、得られた細胞懸濁液は遠心分離に
かけて酵素溶液を除去し、細胞塊はその大きさに応じて
１〜１０ｊｄ！のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に再懸濁し
た。少岱のアリコート（０，０５ｄ）を細胞懸濁液から
分取し、等体積のトリバンブルー染料（０，５％）を混
合し、サンプル中の腫瘍生細胞数を顕微鏡と血球計数器
計数室を用いて計測した。この過程は生細胞を視覚化す
る相グラジェント・イマジング・システムの使用により
促進された。要するに、生存の基準は次の通りである：
１、細胞がトリバンブルーで染色されない、２゜細胞の
サイズが比較的大きい（＞１５戸）　、３．細胞の核対
細胞質比が大きい、４．核内で核小体が顕著である、そ
して５３位相差検査の際、細胞は殺性（ｏｒａｎｕｌａ
ｒｉｔｙ　）を加減するものを有しない。

拡大率ｘ４００で計測した腫瘍生細胞数を細胞濃度（細
胞数／ｍ１）の計算に使用し、当該アッセイに必要な数
の細胞（即ち、９薬物感受性アツセイには約２００，０
００個）を含むアリコートを引き扱き、所望の最終細胞
濃度（即ち、１ｄ当り細胞２，０００個）になるまで「
付着培地」で希釈した。ここに付着培地は、０．６％の
メチルセルロースを他の添加物、即ち、トランスフェリ
ン（１０１１ｇ／ｊ１１！）、ヒドロコーチシン（０，
５１Ｍｍ）　、へベス緩衝液（２，７ｍＭｍ）上皮生長
因子＜５ｎＱ　／ｄ　：　Ｃｏ１１ａ−ｂｏｒａｔｉｖ
ｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　
ＭＡ、　）、インシュリン（５ＩＩ１ｇ／ｊ！１り、抗
生物質（ペニシリン士ストレプトマイシン；１００単位
／Ｍ１）及び１０％の牛胎児血清又はブタ胎児血ＷＩ　
Ｌｌ、　Ｒ，５ｃｉ−ｅｎｔｉｆｉｃ　、　Ｗｏｏｄｌ
ａｎｄ　１ＣＡ、　）に加えて含有するａｌｐｈａ　Ｍ
　Ｅ　Ｍであった。１〆の最終細胞懸濁液を、細胞付着
マトリックス（Ｌ　１ｆｅｔｒａｃ　、　Ｉ　ｒＶｉｎ
ｅ／、ＣＡ、）又は細胞外マトリックス物質（１８Ｔ、
　Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、　　ｌ５ｒａｅｌ　）をプレコ
ートシた３４穴組織培養板（Ｃｏｓｔａｒ　、　Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ、　）に接種するのに用いた。「
付着培地ｊ中の粘度調節剤の使用（０，６％メチルセル
ロース）は、穴底面に付着している間における細胞の凝
集を防止し、また取扱中に生ずる擾乱振動によっては容
易には妨げられない均一な細胞懸濁性を維持するのに役
立った。細胞は約２〜６時間にわたって粘性の付着培地
内に徐々に「雨のようにしみこみ」、培養表面との接触
２〜１２時間後に細胞は同表面にかたく付着し始めた。

付着過程は通常２４時間で極めて充分に発現する。２４
時間侵、「付着培地」を注意深く穴から除去し、付着細
胞はＰＢＳで２〜３回静かに洗浄し、そして最後に、（
全て上記の１度の）トランスフェリン、ヒドロコーチシ
ン、へベス緩衝液、上皮成長因子、インシュリン、抗生
物質及び１０％のウシ胎児血清を添加したａｌｐｈａＭ
ＥＭに溶解又は懸濁したテスト薬物又は毒物を含む完全
組織培養培地を穴に加えた。

粘度調節剤の利点を「付着培地」から粘度調節剤を含有
せぬ組織培着培地より成立っていた初期の研究と比較す
ることにより見ることができた。

初期の研究においては、細胞が表面に付着する時間の経
過前に培養穴の周囲に迅速かつ顕著な、細胞の再分布が
見られた。取扱い中の及び組織培養インキュベーター内
の環境からの振動は細胞に特に顕著な影響を及ぼし、即
ち、細胞は培養穴のふちから振動により徐々により深く
培地に入り込んでいった。そのような問題は、電気送風
機を用いてＣｏ２雰囲気を強制空気循環するインキュベ
ーターにおいて特に顕著であった。細胞の周囲付着によ
りアッセイに持ち込まれる誤差は、穴により、培養板に
より、また組織培養インキュベーター内の位置により変
化するところが大であった。最終結果におけるこの誤差
の変動寄与は量を決めることが難かしく従って最終計算
から除去するのが困難であった。

（以下余白） 尖Ｊ１九２ この実施例は、本アッセイで細胞の「過剰僧殖」を調整
するために本アッセイで使用した「接種コントロールサ
ンプル」の使用を例示するものである。

本実施例は、電離放射線に対するヒト腫瘍細胞の感受性
をテストするためのアッセイと組合せた本発明の使用と
正当性を例示する。本実施例のプロトコルは、Ｂａｋｅ
ｒら、Ｄｒｕｇ　ａｎｄ　ＲａｄｉａｔｉｏｎＳｅｎｓ
ｉｔｉｖｉｔｙ　Ｈｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　５
ｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
ｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｌｌｌｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ、
　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ＶＯｌ、　４６
．　ｌ１ｌ）、　１２６３−１２７４　（１９８６）ニ
記載すレテいる。

細胞接種材料を上記と同様にしてヒトミ！瘍組織から調
製し、細胞をやはり上記と同様にして［付着培地」に１
６．０００コ／ｄ、８，０００コ／ｄ１４，０００：］
／ｄ、２．Ｇｏｏ：ｌ／ｄ、およヒＯ：ｌ／Ｉｌｄ！（
７）濃度で懸濁した。次にこの細ＩＩ！　１ｍを、上に
詳細に説明したようにして、細胞外マトリックス材料で
予め被覆した２４ウエルのマイクロタイタープレートの
各ウェルに入れる。上記と同様に、被覆されたウェルの
表面に細胞を接着せしめた後洗浄し、新しい培地に入れ
、１Ｂ、Ｇｏｏコ／Ｉｄのテストウェル１列と別のａ、
ｏｏｏコ／ｍｅのテストウェル１列とを、０．５〜６グ
レイ（Ｇｒａｙ）のいろいろな段階に分けられた照０４
量の電離放射線にそれぞれ゛さらした。

さらに５日間細胞をインキュベートし、この時点で培地
を交換する。この培養細胞をさらに６日間インキュベー
トし、この時点で固定してクリスタルバイオレットで染
色する。各ウェルの光学密度を測定して細胞の成長を定
量化する。

光学密度を測定するのに使用する装置は任意の適当なも
のでよいが、マルチウェルプレートの個々のウェルの光
学密度を読取るように適切に改良されたコンピューター
を備えたＮ１ｋｏｎ＝Ｈａｏｉｓｃａｎ　Ｉｌａｇｏ　
ＡｎａｌｙＺｅｒが最も好ましい。

この接種材料の滴定の光学密度測定結果を第１Ａ図に示
す。本実施例においては、細胞４，０００コ／ウエルま
では接種材料中の細胞の数が増加すると光学密度が直線
的に増加した。細胞８．０００コ／ウエルまでは光学密
度が上昇し続けたが、１６．０００細胞／ウエルになる
と直線からのずれが顕著になる。本実施例では、直線か
らのずれは接種材料の細胞数が４．０００コ／ウエルと
ａ、　ｏｏｏコ／ウェルの間で起こり、１６，０００で
の「予想される」光学密度の外挿値（テストウェル中の
接種細胞数）は、細胞数が０．２，０００．４，０００
および８．０００の点で測定した光学密度の値に対して
引いた直線を外挿して決定する。本実施例の接種細胞密
度１６，０００コの点における外挿した「予想される」
値は６．０００であり、接種ＩＢＪｌａが１６．０００
の点における「予想される」値と「実際の」値の比率は
６０００／２０５０　＝　２．９３である。

「予想」と「実際」の比の値が許容できなくなるレベル
を決定するために、接種細胞濃度ａ、ｏｏ。

コ／ウェルと１６，０００コ／ウエルの両者に対してＩ
Ｄ９０値（９０％の細胞が死ぬ放射線旦）を決定した。

これは、細胞を８，０００コ／ウエルかｉｅ、ｏｏｏコ
／ウェルで接種した複数のウェルを０．５〜５ＧＹの１
！聞の電離放射線にさらすことによって行なった。結果
を第１Ｂ図に示す。どららの接種濃度の値に対しても決
定されたｌ０９０値は同じであり、したがってこの場合
「予想」／「実際」の比−２，９３（上で計算した値）
は放射線感受性アッセイに対して受は入れられる比であ
る。さらに、これらの結果によって「正のコントロール
」が「過剰増殖」を示す際の培養における「予想」値に
対する外挿値の使用が正当化され、たとえば、「正のコ
ント０−ル」が「過剰増殖」を示す場合でもこの方法を
用いてデータを解釈することが可能であろう。

すなわち、本実施例において、細胞１６，０００コ／ウ
エルの正のコントロールは「過剰増殖」するがこの１６
，０００細胞／ウエルの正のコントロールの「予想」値
の外挿値はｅ、ｏｏｏであった（第１Ａ図）。

細胞の１０％だけが生存している場合（たとえばＩＤ９
０値）の光学密度は６．０００の１０％、すなわち６０
０となるであろう。生存曲線上で６００の値になった点
は３．３０ｒａｙであり、この値は、細胞を１６，００
０コではな（８，０００コ接種した非過剰増殖ウェル（
第１Ｂ図）から得られたＩＤ９０の観察値とよく一致し
°Ｃいる。このように、上記のようにＯＤ。

ＺＯＤａ比を１００７Ｋｒに見做す技術は有効である。

１１里ユ 次の実験は、成長の光学密度測定から得られる主要なヒ
ト腫ｓｍ胞の薬剤および放射線生存曲線が上で説明した
カウント（計数）　（多重度）の問題を回避することを
例示するためのものである。

腫瘍細胞の調製 日常の診断または治療処置の間にガン患者から生検腫瘍
組織を得た。この生検組織を研究室に運んだ。

固形腫瘍の生検組織は細断してＩｊｌｌの細片にした。

流体試料は１０Ｕｎｉｔ／＃ｔｅのヘパリンで抗凝固処
理をし、遠心して細胞を回収した。固体試料または流体
試料から得た組織は、１０％子ウシつ児血清を添加した
培地中で、コラゲナーゼ（０，０７５％）とＤＮａｓｅ
　　（０，００５％）から成る酵素混合物を用いて、常
時撹拌しながら一晩インキユベーションしてばらばらに
分解した。

一晩酵素で消化した後、得られた細胞懸濁液を洗浄して
酵素溶液を除く。これは、消化物を遠心した後細胞ベレ
ットをそのサイズに応じて１〜１０ｄのリン酸緩衝生理
食塩水に再度懸濁して行なう。

この細胞懸濁液から受石の試料（０，０５ｒｄ”）を取
り、等量のトリパンブルーと混合し、腫瘍細胞計数を実
施する。

腫瘍細胞をカウントするには、生存細胞が目で見えるよ
うにできる相勾配造影システムを備えた顕微鏡と血球計
数機を用いる。目に見える腫瘍細胞の数を４００倍の倍
率で以下の基準に準じて計数する。

１、トリパンブルー染料で染色されない。

２、大きいく〉１５ミクロン）。

３、核／細胞質の比率が大きい。

４、核小体が目立つ。

５、顆粒性がないかまたは中程度までである。

これらの基準に合う領域を血球計数器で印を付け、その
１／９の中にある細胞の数をカウントする。

細胞濃度を計算し、アッセイに必要な数の細胞（αＭＥ
Ｍ培地を用いる９ドラツグアツセイでは細ｍ２０Ｇ、０
００コ）を含有する試料を取る。

アッセイに必要な細胞の試料を付着培地で希釈して最終
的に細胞２．０００コ／ｄの細！！濃度とする。

付着培地は、トランスフェリン（１０４／ａｉり、ヒド
ロコルチゾン（０，５＊／ｄ）　、ＨＥＰＥＳバッファ
ー　（５ｍｇ／ｍｌり　、Ｊ：皮成長因子（５ｎａ／ｄ
）、インシュリン（５４／ｄ）　、抗生物質、および１
０％子ウシつ児血清に加えて０．６％メチルセルロース
を含有するαＭＥＭで構成する。前もって細胞接着マト
リックス（ＣＡＭ）またはＥＣＭ（１８Ｔ１イスラエル
、エルサルム）をコートしたマルチウェルプレート（Ｃ
０３ｔａｒ１米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）の
各つｌルに、付着培地に懸濁した細胞１１１１を接種す
る。

培養 細胞を以下のようにして、前もってＣＡＭをコートした
マルチウェルプレートに接種する。（１）各ウェルに付
き細胞が２，０００コ、１　、０００コ、５００コ、２
５０コ、または０コ入れである接種コントロールサンプ
ル（これらは１００％生存レベルを確立するために使用
する）と、（２）各ウェルにつき２１０００コの細胞を
高用量のトリヂウム化チミジンと共にインキュベートし
た接種材Ｆｌ（これはバックグラウンドレベルを確立す
るために使用する）とから成るコントロール培養物を、
４個のウェルからなる最初の２列にセットする。プレー
トの残りのウェルには薬剤試験用の細胞を各ウェルに付
き２．０００コずつ接種する。

接種後標準的な条件で２４時間インキュベートして、接
種した細胞を培養器表面に固く接着させる。

この２４時間の接着期間の後上清培地を除き、接着細胞
をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、新しい補足αＭＥＭ
培地を加える。試験対象が放射線であれば、個々のウェ
ルに照射を限定するためにシールドを用いて０．５〜６
　Ｇｒａｌ／の範囲に亘ってクラス分けした用量の？ｌ
１ｉｔ１１射線をウェルに照射する。

試験対象が化学療法剤であれば、その薬剤を含有する培
地を加える。

薬剤の用量は４種用いる。その用量は比較的狭い範囲に
亘っており、これは通常１：２：４：６または８のスケ
ール値で記載される。基準参照濃度は単位スケール値の
濃度とする。標準的な化学療法剤を９種まで試験する。

１種の薬剤を４つのウェルからなる各列で試験する。各
列内の４つのウェルに４種の用量を適用するが、最低の
用量（スケール値１）は頂部のウェルに、最高の用量（
スケール値６または８）は底部のウェルに用いる。

薬剤を加えた後、または放射線を照射した後、５日間イ
ンキュベートし、その後培地を新しい培地と交換して薬
剤にさらされる期間を５日に限定する。次いでさらに７
日間インキュベートした後プレートをエタノール（７０
％）で固定し、クリスタルバイオレット（０，５％）で
染色する。

本発明の手順によると、各ウェルの全表面に亘る細胞染
色密度または光学密度はコンピューター化された影像分
析によって測定される。これによると各ウェルでの細胞
染色密度に比例する数が得られる。各供試薬剤に対する
生存率は１００％生存値と供試薬剤の各用量に対して測
定された光学密度とを用いて計算される。生存曲線は最
小二乗法によるコンピュータープログラムを用いて作成
する。これによって最もよく合った線が得られる。

放射線の場合を第２Ａ図に、薬剤の場合を第２Ｂ図に示
す。

生存曲線の典型的なものを第２Ａ図と第２Ｂ図に示す。

注目すべきことは、用ａレベルが高いときにプラトーが
ないということである。プラトー、特に放射線の生存曲
線の場合のプラトーは多重性（すなわち細胞凝集）によ
って起こるものであり、本発明の光学密度を記録する方
法においてプラトーが生じないということは、この記録
方法では以下のような多重性の問題が回避されることを
示唆している。一般に、ひとつのコロニーはひとつのコ
ロニー形成細胞から生じ、このコロニーはある程度のサ
イズまで成長し、一定堡の細胞染色密度に寄与する。し
かし、ｆ４瘍細胞は凝集して集合体を形成することか多
いので、２個以上のコロニー形成細胞の集合体からひと
つのコロニーが派生していることがある。この場合、コ
ロニー形成細胞の集合体に由来するコロニーは大きさが
大きく、細胞染色密度に比例する以上に寄与することに
なる。

第３図に、この考え方と一致するコロニーサイズの異種
性を示す培養物を例示する。この図は培養期間の終りに
典型的なコロニー形成を示す染色培養物の写真である。

この写真には１３個のコロニーが明らかに見える。それ
らのコロニーのうち１０個は７５〜約２５０個の範囲の
細胞からなるサイズをもっている。これらの１０個のコ
ロニーは単一のコロニー形成細胞に由来していると思わ
れる。２個の大きいコロニーは細胞３，０００個を越え
る数だけ含有しており、おそらく集合したコロニー形成
細胞に由来するのであろう。コロニーアッセイではこれ
らの大きいコロニーも申−のコロニー形成細胞に由来す
るものとして数えてしまうのに対して、本発明の手順で
はこれらの大きいコロニーは複数のコロニー形成細胞に
由来するものとして計数されるであろう。したがって、
細胞染色密度はコロニー形成細胞および多重性の数に比
例する。これはコロニーアッセイの問題であって、本発
明による成長を光学密度で測定する方法では相殺される
。

実施例４ 次の実施例は、バックグラウンド値の確立と、生存曲線
の構築におけるその使用とを例示するためのものである
。

細胞の調製 実施例３参照。

培養 子めＣＡＭかＥＣＭでコートしたマルチウェルプレート
に細胞を以下のようにして接種する。各ウェル当り細胞
２　、　Ｇｏｏコ、　１　、０００コ、　５００コ、２
５０コ、および０コを入れて構成した接種滴定から成る
接種コントロールサンプルを１００％生存レベルを確立
するために使用する。

本発明の手順では、バックグラウンドを確立する目的で
２粗目のコントロール培養物に細胞をウェル当り２，０
００コ接種する。プレートの残りには薬剤を試験する目
的でウェル当り２，０００コの細胞を接種する。

接種機標準的な条件で２４時間インキュベートして、接
種した細胞を培！器表面に固く接着させる。

この２４Ｒ間の接着期間の後、上清培地を除き、接着ｌ
ｌｌ胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、新しい補足α
ＭＥＭ培地を加える。

本発明の手順では、同様に２４時間の接着期間の後５μ
Ｃ／ｄのトリチウム化チミジンを含有する培地を２粗目
のコントロール培養物に加える。

薬剤または放射線のいずれの感受性を試験するかによっ
て、やはり２４時間の接着期間の後残りのウェルに薬剤
を加えるかまたは放射線を照射する。

５日間インキュベートした後、培地を新しい培地と交換
して薬剤暴露を５日に限定する。次いでさらに７日間イ
ンキュベートした後、プレートをエタノール（７０％）
で固定し、クリスタルバイオレット（０，５％）で染色
する。

すでに記載したのと同様にして、つンビューター化され
た影像分析によって、各ウェルの全表面に亘って合わせ
た細胞染色密度または光学密度を測定する。これによっ
て各ウェルでの細胞染色密度に比例する数が得られる。

試験する薬剤または放射線の各用量に対して生存割合を
算出する前に、コントロール値からバックグラウンド値
を差し引いて１００％生存値を求めると共に残りの全て
の光学密度値からもバックグラウンドの値を差し引く。

各供試薬剤に対する生存率を、１００％生存値と供試薬
剤の各用量に対して測定された光学密度とを用いて計算
する。生存曲線は最小二乗法によるコンピュータープロ
グラムを用いて作成する。これによって最もよく合った
線が得られる。

最後の点は、増殖している細胞の９０％を殺すかまたは
抑制した薬剤の濃度（ＩＣ９０）であり、これは、個々
の生存曲線の交点を決定することによって計算され、こ
の点は１０％生存として定義される点であり、９０％が
死ぬということと同じである。

実施例５ 次の実験は、多重点生存曲線の確立を例示するためと、
治療に対してさまざまな応答を示す患者における感受性
の違いをこれらの曲線がどのように反映するかを例示す
るためのものである。

細胞の調製 実施例３参照。

■ 予めＣＡＭでコートしたマルチウェルプレートに細胞を
以下のようにして接種する。（１）各ウェルに付き細胞
が２．０００コ、１　、０００コ、５００コ、２５０コ
、または０コ入れである接種コントロールサンプル（こ
れらは１００％生存レベルを確立するために使用する）
と、（２）各ウェルにつき２，０００コの細胞を高用曲
のトリチウム化チミジンと共にインキュベートした接種
材料（これはバックグラウンドレベルを確立するために
使用する）とから成るコントロール培養物を、４個のウ
ェルからなる最初の２列にセットする。プレートの残り
には薬剤試験用の細胞を各ウェルに付き２　、０００コ
ずつ接種する。

接種後、標準的な条件で２４時間インキュベートして、
接種した細胞を培養器表面に固く接着させる。この２４
時間の接着期間の後上清培地を除き、接＠細胞をリン酸
緩衝生理食塩水で洗浄し、新しい補足αＭＥＭ培地を加
える。試験対象が放射線であれば、個々のウェルに照射
を限定するためにシールドを用いて０．５〜６　Ｇｒａ
ｙの範囲に亘ってクラス分けした用量の電離放射線をつ
Ｉルに照射する。試験対象が化学療法剤であれば、その
薬剤を含有する培地を加える。

本発明の方法では、薬剤の用量は４種用いる。

その用量は比較的狭い範囲に亘っており、これは通常１
：２：４：６のスケール値で記載される。基準参照ｉｕ
ｔは単位スケール値とする。このスケール範囲は概ね直
線の生存曲線を示す試験対象について用いる。肩付きの
生存曲線を示す対象に対してはスケール範囲は３：４：
５：６であろう。標準的な化学療法剤を９種まで試験す
る。本発明の好ましい具体例においては、１種の薬剤を
４つのウェルからなる各列で試験する。各列内の４つの
ウェルに４種の用量を適用するが、最低の用量（スケー
ル値１）は頂部のウェルに、最高の用量（スケール値６
）は底部のウェルに用いる。

薬剤を加えた後、または放射線を照射した後、　　　□
５日間インキュベートし、その後培地を新しい培地と交
換して薬剤にさらされる期間を５日に限定する。次いで
さらに７日間インキュベートした後プレートをエタノー
ル（７０％）で固定し、クリスタルバイオレット（０，
５％）で染色する。

コンピューター化された影像分析によって各ウェルの全
表面に亘って合計された細胞染色密度または光学密度を
測定する。これによると各ウェルでの細胞染色密度に比
例する数が得られる。各供試薬剤に対する生存率は、１
００％生存値と供試薬剤の各用量に対して測定された光
学密度とを用いて計算する。生存曲線は最小二乗法によ
るコンピュータープログラムを用いて作成する。これに
よって第４図に示したような最もよく合った線が得られ
る。

最後の点は、増殖している細胞の９０％を殺すかまたは
抑制した薬剤の濃度（ＩＣ９０）であり、これは、個々
の生存曲線の交点を決定することによって計算され、こ
の点は１０％生存として定義される点であり、９０％が
死ぬということと同じである。

これらの用量は第１図に見ることができる。すなわち、
生存曲線が水平の１０％生存線と交わる点である。ＩＣ
９Ｇスケール値はアッセイで使用した実際の薬剤濃度に
変換される。それには、ＩＣ９０スケール値にｃｉｓｐ
ｌａｔｉｎの場合０．０７５ｕＪ／ｄの値である基準濃
度を掛ければよい。しかし、このアッセイでは、実際に
投与すべき用量に関するデータは何も得られない。

第４図に示した例は、感受性の異なる３人の患者に対す
るｃｉｓｐｌａｔｉｎに関する典型的な生存曲線である
。図中の左の曲線は最も小さいＩＣ９０をもっており、
この３つの中で最も感受性が高い。右にある曲線はＩＣ
９０が最も大きく、この３つの中では感受性が最も低く
、中央の曲線は中間の感受性である。

ＩＣ９０ｉｆｉに対するこのタイプの解析を、各種の組
織構造をもつ百以上のいろいろな主要ヒト腫瘍に関する
ほとんどの普遍的な化学療法剤に対して繰返して行なっ
た。こうして蓄積されたＩＣ９０ｉ１はＣ１５ｐｌａｔ
ｉｎについて第５図に示したように平均のまわりに正規
分布を示している。

たとえば、個々の患者の腫瘍のＣ１５ｐｌａｔｉｎに対
する感受性は、個々のＩＣ９０値と第５図に示したＩＣ
９０値の分布とを比較することによって決定される。こ
の場合、特定のＩＣ９０は分布の感受性の端に近いので
最も小さいＩＣ９０がこの薬剤に対して感受性であると
考えられる。

まとめ 主要ヒト腫瘍細胞を薬剤ＩＣ９０値についてアッセイす
る際に上述の改良点を全て適用した結果、主要ヒトｆ！
瘍細胞の同じ試料に対して５回アッセイをして決定した
変動係数（標準偏差で平均を割った値）は３．９５％で
あった。寒天懸濁アッセイシステムは再現性が非常に悪
いことはよく知られており、それは２０％を越えるよう
なものであるが、本発明のアッセイシステムの優れた再
現性は本出願中で議論した本発明の新規で優れた改良を
組合ゼて適用した結果であると考えられる。

さらに、以上の記載は本発明の好ましい態様に関するも
のであり、本発明の思想と範囲を外れることなくさまざ
まな変更や修正が可能であることは当業者には理解でき
るであろう。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、一連の［接種コントロールサンプル］につ
いて、相対的初期１１１ＪＩｌ数に対して光学密度をプ
ロットした図であり（実施例２参照）、第１８図は、Ｇ
ｒａｙ単位の放射線用量に対して光学密度（対数目盛り
）をプロットした図であり（実施例２参照）、 第２Ａ図は、いろいろな細胞タイプの生存割合対Ｇｒａ
ｙ　（ＧＶ）単位の放１）１線用吊の関係を示す図であ
り（実施例３参照）、 第２Ｂ図は、細胞の生存割合対いろいろな用量の各種細
胞毒性薬剤の関係を示す図であり（実施例３参照）、 第３図は、染色された培養細胞の写真であり（実施例３
参照）、 第４図は、３体の異なる個体から得た腫瘍細胞に対する
生存曲線（％生存対薬剤濃度）を示す図であり（実施例
５参照）、 第５図は、腫瘍細胞がｌ１ｌＩｌｌ毒性薬剤の各濃度で
ＩＣ９０値をもつ大集団における個体の数を示すグラフ
である。 代理人弁理士　ｆ４ａ　　山　　　武 図面の浄、）（内）ンに変更なし） 手続補正書団式） 昭和６３年１月１８８ １、事件の表示　　　昭和６２年特願第２２１７８９号
２、発明の名称　　　感受性アッセイの精度を調整する
方法３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　ライフトレイク ４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号　山田ピル５、補正指令の日付　昭和６２年１１月４
日６、補正の対象　　　願出中、出願人の代表者の欄、
明［ｌ素中、図面の簡単な説明の欄、図面、委任状及び
法人７、補正の内容 （１）明ｔＩＡｓ中、第７９頁第５行目の［染色された
培養細胞の写真であり］を、［染色された培養細胞生物
の形態を示す図面に代る写真であり］と補正する。 ■　上分に濃厚な黒色で鮮明に描いた適正な図面を別紙
の通り補正するＳ　（内容に変更なし） ■　出願人の代表者を記載した適正な願出、委任状及び
法人格証明書については本願に関する昭和６２年１１月
１３日付提出の手続補正Ｉ！（自発）にて提出致しまし
た。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）個体に由来する細胞に対するテスト因子の相対的
   臨床効力を決定する方法であって、 前記個体由来の複数個のアッセイ細胞サンプルをさまざ
   まな用量の前記因子で処理してその細胞サンプルの成長
   を測定し、この用量と成長のどちらか一方の予め選定さ
   れた値に対応する他方の値として抑制値を計算し、次い
   で、この抑制値を、複数の別の個体に由来する細胞に対
   する抑制値と比較して、このテスト因子の相対的臨床効
   力を確認することからなる方法。
2. （２）前記因子にさらした後に前記細胞サンプルを培養
   し、次にそれらの光学密度を測定して、各サンプル中で
   前記処理後に生存する細胞の成長の尺度を得ることによ
   り、前記細胞サンプルの成長を測定することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）さらに、バックグラウンドコントロール細胞サン
   プルを毒性物質で処理して分裂している細胞だけを殺し
   、これを前記のアッセイサンプルと同様な方法で培養し
   、その後その光学密度を測定して得られた値を、前記ア
   ッセイ細胞サンプルに対して測定された光学密度から差
   引いて、前記アッセイ細胞サンプルに対する補正された
   光学密度を得ることを含む、特許請求の範囲第２項に記
   載の方法。
4. （４）さらに、初期細胞カウントがそれぞれ異なる複数
   個の接種コントロールサンプルを前記アッセイサンプル
   と同様に培養した後、この接種コントロールサンプルの
   光学密度を測定し、これらの接種コントロールサンプル
   に対して測定された光学密度と初期細胞カウントとの最
   良の直線関係に基づいて、前記アッセイに用いたのと同
   じ初期細胞カウントをもつ特定の接種コントロールサン
   プルに対して予測される光学密度を計算し、この特定の
   接種コントロールサンプルに対して計算された光学密度
   と測定された光学密度の比が、培養されたアッセイ細胞
   サンプル中の細胞の過剰増殖を示す値を越えている場合
   にはそのアッセイ結果を捨てることを含む、特許請求の
   範囲第２項に記載の方法。
5. （５）細胞サンプルをそれぞれ別々のチャンバーの中に
   入れることと、前記方法がさらに、各細胞サンプル中に
   粘度調節剤を混入してその中での細胞凝集および再分配
   を阻止することを含む、特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。
6. （６）前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。
7. （７）前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする特許
   請求の範囲第４項に記載の方法。
8. （８）テスト因子が化学療法剤および放射線の中から選
   択されることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載
   の方法。
9. （９）テスト因子が細胞毒性薬であり、特定の接種コン
   トロールサンプルの細胞カウントがこれらコントロール
   サンプルの中で最も高いことと、特定の接種コントロー
   ルサンプルに対して計算された光学密度と測定された光
   学密度の比が、テスト因子にさらした後のこれら細胞の
   選定された生存比の逆数を越えている場合には、これら
   のアッセイ細胞サンプルに対して得られた光学密度測定
   値を捨てることとを特徴とする特許請求の範囲第４項に
   記載の方法。