JPS6317698A - モノクロ−ナル抗体ｔｓ−１およびトリフコシル−ｎ−アセチルラクトサミン糖誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト癌細胞と特異的に反応する’ｒｓ−ｔと
命名したモノクローナル抗体、並びにこのモノクローナ
ル抗体と反応する新しいタイプの抗原、すなわちＬｅＹ
構造（ＦｕｃａＩ→２ＧａｌＡ　→４　（Ｆｕｃａｌ　
→３　）　ＧＩｃＮｈｃ−）とフコシル化したタイプ２
鎖とからなる次式 ％式％ （式中、ＱａＡ’はガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはアセ
チルグルコサミン５Ｆｕｃｔｆｉフコースを示？）で表
わされる楯の部分構造を有するトリフコシル−Ｎ−アセ
チルラクトサミン糖誘導体に関する。　　　　　　゛ 本抗体ＴＳ−１は上記抗原を有するヒト癌の診断及び治
療に使用でき、また本抗原の構造は新しいタイプのもの
で、それ自身能動免疫の可能な標的として有用であると
共に、癌の診断薬としても有用である。

〔従来の技術〕

モノクローナル抗体作製法はに６ｈｌｅｒ　Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎによりＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ
　Ｋ紹介されて以来、ヒトの癌と特異的に反応するモノ
クローナル抗体を選んで、多くの腫瘍関連抗原を規定し
ている。これらの多くは、糖脂質又は糖蛋白質のいづれ
かの形として存在する炭水化物抗原である。このうちの
最初の例は、マウスのザルコーマおよびリンフオーマ中
のガングリオトリオシルセラミドである（　Ｒｏｓｅｎ
ｆｅｌｄｅｒ　＋ｃ、ｌ　Ｙｏｕｎｇ＋　Ｗ、　Ｗ、＋
　Ｊｒ、、　ａｎｄ　Ｈａｋｏｍｏｒｉ　＋　Ｓ、　−
ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、＋　２７　＋　１３３３−１３３
９＋１９７７；Ｙｏｕｎｇ＋　Ｗ、Ｗ、　＋Ｊｒ　、ｅ
　ａｎｄ　Ｈａｋｏｍｏｒｉ　ｅ　Ｓ、＋　Ｓｃ　１ｅ
ｎｃｅ　＋２１１＋４８７−４８’Ｌ１９８１）；Ｆｏ
ｒｓｓｍａｎ陰性個体から誘導てれたＦｏｒｓ　ｓｍａ
ｎ抗原（Ｈａｋｏｍｏｒｉ。

Ｓ、　ｅ　Ｗａｎｇ、Ｓ　、Ｍ、　ａ　ａｎｄ　Ｙｏｕ
ｎｇ　ｅＷ、Ｗ、　ｅ　Ｊｒ、　ｅ　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳＡ−，７４，３０２３−３０２
７，１９７７）；そして血液型Ｏ又はＢの腫瘍中のＡ型
様抗原（ＹｏｋｏｔａｅＭ、　＋　Ｗａｒｎｅｒ＋Ｇ、
　＃　ａｎｄ　）ｌａｋｏｍｏｒｉ　＋Ｓ−ｔＣａｎｃ
ｅｒＲｅｓ−ｔ　４１　＋４１８５−４１９０ｓ１９８
１）。

ヒトのメラノーマに対して作製でれたモノクローナル抗
体の特異的抗原はＧＤ３ガングリオシドと同定でれた（
Ｎｕｄｅｌｍａｎ　＋　Ｅ−＋　Ｈａｋｏｍｏｒｉ。

Ｓ、＊ａｎｄ−ＫａｎｎａｇＬＲ，＊Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、＋　２５７゜１２７５２−１２７５６，１９８
２：Ｐｕｋｅｌ　　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｅｘｐ−Ｍｅｄｌ、１５５．１１３３−１１４７．１９
８２）；胃腸腫瘍と特異的に反応す−るモノクローナル
抗体（Ｎ−１９−９）は抗原シアリルＬｅａガングリオ
シドとして同定された（Ｋａｐｒｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａ
ｌ、　。

５ｃｉｅｎｃｅ＋　２１２　＋　５３−５５　＊’ｌ　
９８１　；Ｍａｇｎａｎｉ　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ
：Ｃｈｅｍ、、２５７　、１４３６５−１４□３６９　
。

１９８２）；　　一連のモノ、ゾおよびトリフコシルタ
イ７°２鎖（ＧａＪβｌ→４　Ｇｌ　ｃＮＡｃ　）糖脂
質マーカーを分離同定した（）（ａｋｏｍｏｒｉ　ｅｔ
　ａｌ、＋Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５９．４６７２−４６８０．１９８４）
：特異的抗体が、異なった内部構造を有する各々のタイ
プのＬｅｘ抗原に対して作られた（Ｆｕｋｕｓｈｉｅｔ
ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９．４６８１
−４６８５＊１９８４）；そしてこれらの抗原は各種ヒ
トおよび動物のカルシノーマから検出された（Ｆｕｋｕ
ｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ−Ｍｅｄ、＋　１
５９　、５０６−５２０．１９８４）０各種のヒト癌細
胞のだめの、ＬｅＹ構造に対するモノクローナル抗体を
、各研究室が独立して作製した（Ａｂｅ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５８　、１１７９３−１１，
７９７．１９８３　；Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｒ　３　ｅ　１６
３−１７０；１９８３　：　Ｌｌｏｙｄ　ｅｔ　ａｔ、
＊　Ｉｍｎｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ＋　１７　＃３３７
−３４１．１９８３）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記の抗体は、特別に規定されたＬｅｘおよびＬｅＹに
密接に関係しているが、特異性は低く、ＬｅＹに対する
抗体は正常と癌組織の両方に反応する。本発明の第１の
目的は、ＬｅＹ構造、あるいは正常組織とは反応せず、
ヒト癌組織と特異的に反応するモノクローナル抗体を開
発することである。得られた抗体は腫瘍を検出し、癌診
断に有用であり、さらに癌患者を治療するのに有効であ
る。本発明の第２目的は、本モノクローナル抗体と反応
する抗原を得ることである。得られた抗原はそれ自身、
能動免疫の可能な標的として有用であり。

又癌の診断薬、あるいは血中癌抗体を取除く抗体として
も有用である。

〔問題点を解決するための手段〕

本願発明者らは、上記各報告に関連して、ヒト癌細胞に
対して、より特異性の高いモノクローナル抗体を得るた
め、鋭意研究を重ねた結果、ヒト癌細胞に極めて特異性
の高いモノクローナル抗体を得た。さらに該抗体を用い
て、ヒト癌細胞から、当該抗体と特異的に反応する新規
な糖鎖構造を有する抗原を分離することに成功した。そ
して、この塘鎖構造はヒト癌細胞に共通に表現される抗
原構造であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明モノクローナル抗体は、ヒトの大腸ガ
ン組織を免疫原として用いて、後述の方法に従って調整
出来る。

上記免疫原を免疫する哺乳動物は、例えば、マウス、ラ
ット等が使用される。

免疫は一般的方法によって行われ、上記の免疫原を生理
食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等に適当濃度に希
釈後、これを動物に静脈内もしくは腹腔内注射等によっ
て投寿すればよい。より具体的には、例えばヒト癌細胞
の膜分画物を免疫原として用いる場合は、癌細胞をプロ
テアーゼ阻害物質等を含む蒸溜水中でホモジナイズし念
後、数回遠心分離を行ない、粗製膜成分を得る。膜成分
懸濁液’ｋ　ＰＢＳ等で適当濃度に希釈し、これを動物
に２〜１４日間に毎日〜数回投与し、総投与量が蛋白質
含量として１−１００１９／マウス程度になるようにす
るのが好ましい。細胞自体を用いる場合は総投与量がＩ
　Ｘ　１０’〜ｌ　Ｏ’個／マウス程度となる様てする
のが好ましい。免疫細胞としては、最終免疫約３日後に
摘出した牌細胞を使用するのが好ましい。

次いで、かくして得た免疫細胞と骨髄種細胞を融合する
０骨髄肺細胞としては、すでに公知の種々の細胞１例え
ばマウスにおけるＭＳ　−１％Ｐ３、Ｐｊ−Ｕ１％Ｘ４
５、ＳＦ３、Ｘ６３゜６．５．３、ラットにおけるＹ３
．　Ａｇ　１．２．３　等が使用される０融合反応は公
知の細胞融合方法に準じて行われ、例えば融合促進剤の
存年下培地中でインキュベートすることによって行われ
る。

融合促進剤としては１例えば破りエチレングリコール（
ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ　）等が使用式れ
、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスル
ホキシド等の補助剤ｔ−添加することができる。免疫細
胞と骨髄種細胞との使用比は一般の方法と変りがなく、
例えば骨髄種細胞に対し、免疫細胞を約１〜ｌＯ程度用
いればよい０上記融合時の培地としては、例えば骨髄種
細胞株の増殖に用いられるよりな■潤培地、その他のダ
ルベツコ改質培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、その他こ
の種の細胞培養に利用される通常の各種培地を利用でき
、通常はＰＣ８等の血清を抜いておくのがよい。

融合は、上記免疫細胞と骨髄腫細胞との所定量を上記培
地内でよく混ぜ、遠沈後上清を除去し、予め３７℃程度
に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６
０００＝度のもの分通常培地に約３０〜６０　Ｗ／Ｖ％
の濃度で加えてまぜあわせることにより行われる。以後
、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操
作を繰り返すことによりハイプリドーマが形成される。

所望のハイプリドーマの分離は、上記細胞融合後の細胞
全、通常のハイブリドーマ選別用培地で培養することに
より行なわれる。前記した骨髄腫細胞株はと？キサンチ
ングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰ
ＲＴ　）欠損株であり、したがってＨＡＴ培地（ヒ？キ
サンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）中
では生育できない。従ってＨＡＴ培地中で生育してくる
細胞を選択すればよい。

該ＨＡＴ培地での細胞の培養は、目的とするノ・イブリ
ドーマ以外の細胞〔未融合細胞等〕が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間行えばよい。

かくして得られるハイプリドーマは通常の限界希釈法に
従い、目的とする抗体の産生株の検索、及び単一クロー
ン化が行なわれる〇該産生株の検索は、例えばＥＬＩＳ
Ａ法（Ｅｎｇｖａｌ　１　ｅＥ、＊Ｍｅｔｈ、Ｅｎｇｙ
ｍｏ１．，７０，４１９−４３９．１９８０）及びプラ
ーク法、ス献ット法、凝集反応法、ＲＩＡ法等の一般に
抗体の検出に用いられる種々の方法によって行なわれる
〔［ハイブリドーマ法トモツクローナル抗体」、■Ｒ＆
Ｄｆランニング発行、昭和５７年３月５日〕０より具体
的には、所望の癌細胞に選択的に結合し、正常細胞に結
合しない抗体産生株を選択する。例えば、癌細胞として
肺癌細胞ＱＧ−５６゜ＱＧ−９０、ＰＣ−１、−３、−
７、−９、および−１Ｏ（Ｏｂｏｓｈｉ、　Ｓ、、　ａ
ｎｄ　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ、蛋白質、核酸。

酵素＃　２３，６９７−７１１．１９７８）；各種胃癌
細胞■（ト）−１，−２，−２８，−４５および−７４
（Ｍｏｔｏｙａｍａ＊　Ｔ、　＋　Ｈｏｊｏ＊　Ｈ，ｌ
　５ｕｚｕｋｉ　＊　Ｔ、　、　ａｎｄＯｂｏｓｈｉ、
　Ｓ、ｅ　Ａｃｔａ　Ｍｅｄｉｃａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａ、　２７　＊　４９−６３．１９７９）：表皮種瘍細
胞ＲＴ−４、および卵巣アゾ／　力）Ｌシ／−マ５Ｋ−
ＯＶ３　（Ｆｏｇｈ、　Ｊ、。

ＦｏｇＬ　Ｊ、　Ｍ、　＃　ａｎｄ　０ｒｆｅｏ＊　Ｔ
、＋　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ、＊５
９−２２１−２２６，１９７７）；単核細胞白血球ＴＯ
Ｐ　−１（Ｔｓｕｃｈｉｙａ、　Ｓ、　＊　ｅｔ　ａｌ
−＋　Ｉｎｔ、　Ｊ−Ｃａｎｃｅｒ＋　２６　＃　１７
１−１７２　＋　１９８０　）　；ヒト肺癌細胞α−１
，ヒト乳癌細胞ＥＪ　−２３等が使用できる。また、正
常細胞としては、各種正常繊維芽細胞、ＷＩ−３８，Ｌ
−５、およびＣｒｏｗ−Ｆ、オヨび各ａヒトＢ細胞、Ｐ
ｒｅｎｔ　−Ｂ　＋　Ｃｒｏｗ　−ＢｓおよびＫａｓｎ
ｅｒ　−Ｂ％あるいは外科手術で得られた正常組織片が
使用できる。

斯くして得られる本発明のモノクローナル抗体を産生ず
るハイプリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また
液体窒素中で容易に長時間保存が可能である。本発明者
は、このハイプリドーマの代表として、後記実施例によ
って得られたものを自ら分譲可能な状態に保持している
。

上記のようにして得た特定のハイプリドーマから本発明
のモノクローナル抗体ＴＳ−１を得るには、ハイプリド
ー−Ｆを常法に従って、組織培養をする。すなわち、Ｆ
ｅ２．ピルビン酸、クルクミンを含有するＲＰＭＩ　−
１６４０培ｍで、３７℃、　ＣＯ２インキュベーター中
で３日以上〜７日以内培養して、培養上清から分離する
方法、あるいはハイプリドーマをこれと適合性のある嘩
乳動物、例えばマウスに投与し増殖させ、その腹水から
分離する方法等が採用される。前者の方法は高純度のも
のを得るのによく、後者の方法は大量生産に優れている
。

得られたモノクローナル抗体π−１は２％ホウ酸で沈澱
回収し、セファクリルＳ−３００を用いゲル濾過を行な
った。次いで、クラス・サブクラス特異抗体（Ｃａｐｐ
ｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋（ｏｃｈｒａｎｖｉ
　１１　ｅ　ｅ　ＰＡ　）　’に用いて検定し、ＴＳ−
ｔはＩｇＭと同定された。

斯くして得られる抗体ＴＳ−１は、通常の例えば酵素、
螢光物質又は放射性物質等の標識剤を結合させることに
よって、標蹟抗体ＴＳ−１′ｆ！：裂造することができ
る。さらに詳しくは、例えばこれに１１２５　、１１３
１等の放射性ヨード′ｆ：４入することにより、ラジオ
イムノアッセイ法（ＲＩＡ法）において用いられる標識
抗体の製造用原料である標識抗体として利用できる。上
記放射性ヨードの導入は、通常のヨード化法、例えばク
ロラミンＴを用いる酸化的ヨード化法（Ｗ、　Ｍ、　Ｈ
ｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆ、Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ　＊
　Ｎａｔｕｒｅ　ｒ１９４．４９５．１９ｆｉ２：Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｊ、、８９ｙｌ１４゜１９６３）により標
識することができる。

さらに、本発明抗体さ−１を螢光色素で標識することに
より、螢光免疫測定法に利用することができる。その具
体例としては１例えばフルオレラセン・イソチオシアナ
ート（Ｆ工Ｔｃ入テトラメチルローダミン・インチオシ
アナ−）　（ＴＲＩＴＣ）、［ｍローダミン・インチオ
シアナ−）　（ＸＲＩＴＣ）、ローダミンＢインチオシ
アナート、シクロロトリアゾンフルオレッセン（ＤＴＡ
Ｆ）等が挙げられる。螢光色素の使用量は、特に限定で
れないが、通常の方法（特開昭５８−３５１５６　）に
準じて行なわれる。

かくして得られた標識抗体ＴＳ−１は細胞提示抗原の免
疫細胞組織学的検出用として、さらには抗原定廿用試薬
として利用することができる０ さらに、ヒト癌細胞から、本発明のモノクローナル抗体
ＴＳ−１と特異的に反応する糖の部分構造として式 ％式％ 〔式中、　Ｇａｌはガラクトース、ＧＥｃＮＡｃ　　は
Ｎ−アセチルグルコサミンｓ’　Ｆｕｃはフコース、Ｇ
ｌｃはグルコースを表わす〕、ヲ有する糖、または糖脂
質などの誘導体を得た。

すなわち、当該糖誘導体は、種々の培養癌細胞、手術組
織由来癌細胞等のヒト癌細胞より、常法に従って、本発
明モノクローナル抗体ＴＳ−１との反応性を指標として
、物理的、化学的、又は生化学的性質を利用する分離手
段により分離精製することにより得られる。

例えば、ヒト癌細胞より砧、または糖脂質成分を分離し
、これより糖、または糖脂質などの当該性質を利用する
化学的、物理的、または生化学的手段、例えばグル濾過
、イオン交換、クロマトフオーカシング、吸着クロマト
グラフィー、または高速液体クロマトグラフィー、もし
くは薄層クロマトグラフィー、等電点電気泳動、または
通常の電気泳動法、透析法、抽出法、分配法等を単独、
あるいは適宜組合せ２本発明モノクローナル抗体ＴＳ−
１との反応性を指標として精製単離できる０さらに、本
発明の糖誘導体は、　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて酵素
的、筐た化学的合成法によっても製造することができる
。

本発明の糖誘導体は、ポリエチレン、？リスチレン等の
合成樹脂、あるいはガラスピーズ等の不溶性担体と共に
生理食塩水、緩衝液、あるいは適当な溶媒中で混合させ
ることにより、該糖誘導体と不溶性担体とを物理的に結
合させ、不溶性結合体を得ることができる。

得られた不溶性結合体は、体液中に存在する自己抗体を
除去し、もしくは抗体の単離精製に利用することができ
る。また、診断用試薬としても使用することができる。

〔発明の効果〕

斯くシて得られる本発明モノクローナル抗体はヒト癌細
胞と特異的に反応し、特に大腸癌アゾンカルシノーマと
特異的に反応する０このような癌細胞との反応性を利用
し、放射性物質、螢光物質、または酵素のような標識剤
を結合させ、血液学的診断用キットに、あるいは組織学
的に免疫細胞組織学的検出法のための試薬として利用で
きる。さらに当該モノクローナル抗体に制癌剤を結合さ
せ、癌治療に応用することもできる０ 他方、本発明モノクローナル抗体と特異的に反応する誘
導体は癌患者に当該物質を投与することにより、能動免
疫を付与し、癌治療に役立て得る。さらに、本願発明の
糖誘導体と不溶化担体との結合体は、ヒト血清中の自己
抗体の除去、または単離に利用することができる０ 〔実施例〕 以下、本発明の詳細な説明する為に実施例を挙げるが、
本発明はこれ等に限定されるものではない。

実施例 １−　ａ、　　ヒトアデノ力ルシノーフと特異的に反応
するモノクローナル抗体の作表 ヒト大腸アデノカルシノーマの膜分画が免疫原として用
いられ念。Ｉ凍傷組織（１，２〜２、Ｏｆ）はＤｏｕｎ
ｃｅホモゾナイザー中、プロテアーゼ阻害物質（１０力
リクレイン単位：アデロチニン、シグマ社製）を含む蒸
溜水１０−とホモジナイズした。氷水浴中、５０ストロ
ークでホモジナイズした後、ホモジネートは２０００ｒ
ｐｍでｉｏ分間遠心分離を行ない、上清を分離した。そ
して、更に３５００　ｒｐｍで１時間遠心した。ペレッ
トは・アプロチニン含有水１０−中に懸濁した（蛋白質
濃度として２、５　ｍＱ／ゴ）。懸濁液０．５　ｍ／　
（蛋白質含量：１．２５１１９）を、４８置に、４回静
脈内注射した。

宿主の牌臓細胞とＳＰ／２マウスメラノーマとの融合は
最終注射後３８目に行われた。ハイプリドーマクローン
は各種ａｉｍ胞と正常細胞とで下記のように選別された
。

肺癌Ｋｍ胞ＱＧ−５６，ＱＧ−９０、ＰＣ−１，−３゜
−７，−９，および−１０（０ｂｏｓｈｉｔ　Ｓ、ａｎ
ｄ　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ　ｒＭ、、蛋白質・核Ｃα・酵
素、・２３　、６９７−７１１　。

１９７８）；各種胃癌細胞ＭＫＮ　−１、−２、−２８
。

−４５，および−７４（Ｍｏｔｏｙａｍａ＋　Ｔ、　ｒ
　Ｈｏｊｏ　＊　Ｈ，＋５ｕｚｕｋｉ　ｒ　Ｔ−＋　ａ
ｎｄ　０ｂｏｓｈｉ　＊　Ｓ、　＊　Ａｃｔａ　Ｍｅｄ
ｉｃａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ。

２７．４９−６３．１９７９）；　　表皮ｊ」瘍細胞Ｒ
Ｔ−４、および卵巣アゾンカルシノーマＳＫ−ＯＶ３（
Ｆｏｇｈ、　Ｊ、＋　Ｆｏｇｈｅ　Ｊ−Ｍ、＋　ａｎｄ
　０ｒｆｅｏ＋　Ｔ、＋　Ｊ。

Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｊｎｓｔ、ｓ　５９　＋　２
２１−２２６　＋　１９７７　）；単核細胞白血球ＴＨ
Ｐ−１（Ｔｓｕｃｈｉｙａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ＋　２６．ｔ　７１−１７２
　＋　１９８０）　；ヒト肺ガン細胞ＬＸ−１、ヒト乳
癌細胞ＥＪ−２３、各種正常繊維芽細胞％　ＷＩ−３８
，Ｌ−５、およびＣｒｏｗ−Ｆ、および各種ヒトＢａ胞
％　　Ｐｒｅｎｔ　−Ｂ　ｒＣｒｏｗ−Ｂ　＊およびＫ
ａｓｎｅｒ　−ＢはＤｒ、　ＣｉｃｅｌｙＢｅｒｇｌｕ
ｎｄ　（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ＊　Ｆ
ｒｅｄ　ＨｕｔｃｈｉｓｏｎＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、　５ｅａｔｌｅ　）　　から供
寿された。各種の前場癌組織、および正常胃腸上皮は外
科手術で得られ、凍結切片が作られた０ハイプリドーマ
の上清は大腸癌組織、および胃癌細胞に陽性反応を示し
たが、正常組織と細胞には陰性を示した。２５クローン
のうち、１つのクローンがＩｇＭ抗体を分泌し、大腸癌
組織と強い反応性を示したが、胃癌組織と細胞では反応
は弱かった。このハイプリドーマを再クローンし％ＴＳ
−１と老台した０ハイブリド一マ作製法はに’ｏｈｌｅ
ｒ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ。

２５ｆ５．４９５−４９７．１９７５）、およびその変
法（Ｊ、Ｅｘｐ、’Ｍｅｄ、、　１５０　、１００８−
１０１９　。

１９７９）に記載され、一般に知られ、そして十分に確
立された方法である。

ハイプリドーマは、上溝中に存在する抗体の反応性、す
なわち抗体結合アッセイで測定して選別した。このアッ
セイ法は、細胞あるいｎ組！＆ヲ抗体とインキュベート
し、次いで第２抗体とＩ”　ｐｒｏｔｅｉｎ　）、とイ
ンキュベートする方法で、多くの研究者により良く用い
られている（Ｙｏｕｎｇ、　’ｉＶ、　Ｗ、＋　Ｍａｃ
Ｄｏｎａｌｄ、　Ｅ、　Ｍ、　Ｓ、　＋Ｎｏｗｉｎｓｋ
ｙ、　Ｒ，Ｃ，＋　ａｎｄ　Ｈａｋｏｍｏｒｉ　＊　Ｓ
　、＃　Ｊ　、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　。

１５０．１００８−１０１９，１９７９；Ｆｕｋｕｓｈ
ｉ、Ｙ−。

ｌａｋｏｍｏｒｉ　、　Ｓ、　ｔ　Ｎｕｄｅｌｍａｎ　
＋　Ｅ、　＋　ａｎｄ　Ｃｏｃｈｒａｎ　＊　Ｎ１Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９．４６８　］−４６８５
，１９８４）。

ハイプリドーマハＦＣ８、ピルビン酸とグルタミンの含
有するＲＰＭＩ　−１６４０培地中培養し、限外希釈法
で繰返しクローンした。そして最後に、クローンはデリ
ステンで前処理したＢａ１ｂ／ｃマウスの腹腔中に入れ
、童子された抗体を腹水液として採取した（Ｙｏｕｎｇ
＋Ｗ、　Ｗ、　。

ＭａｃＤｏｎａｌｄ＊　Ｅ、　Ｍ、　Ｓ、　ｅ　Ｎｏｗ
ｉｎｓｋｙ＊　Ｒ−Ｃ，ｅ　ａｎｄＨａｋｏｍｏｒＬ　
Ｓ−＊　Ｊ−Ｅｘｐ６Ｍｅｄ、、　ｌ　５０　＃　ｌ　
００８−１０１９．１９７９）。

抗体はセファクリルＳ−３００によるグル濾過により精
製した後、サブ・クラス特異抗体（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ参
ＰＡ）　ｔ’用い調べ、抗体ＴＳ−１はＩｇＭとして同
定した。

以下余白 １−ｂ　　抗体’ｒＳ　−１による大腸癌患者の癌細胞
の検出。

正常大腸粘膜と大腸癌粘膜中のＬ＠猟原と本発明モノク
ロナール抗体ＴＳ−１によって規定される抗原の反応性
について比較した。この結果、表１に示すように、ＴＳ
−１と反応する抗原が大腸癌において特異的に出現する
ことが判る。この結果は、大腸癌を検出するための抗体
ＴＳ−１の特異性はＡＨ−６のような単純なＬｅ　　を
検出する抗体よりもはるかに高いことを示している。腫
瘍に隣接した粘膜表皮、および他の粘膜表皮の正常部位
は抗体ＴＳ−１に対して陰性を示す。抗体ＡＨ−６はこ
の部位も陽性反応を示す点で、対照的である。しかも十
分に分化した大腸癌では抗体ＴＳ−１０陽性染色の強度
がＡＨ−６より低い。

表１　正常大腸粘膜と大腸癌粘膜中のＬｅＹ抗原、及び
ＴＳ−１提示抗原の反応性 との反応性　との反応性 正常大腸粘膜　近位部　１８／２０　　　１／２０遠位
部　１５／２０　　　０／２０ 遠位部　３０／３０　　　１９／３０ ※：分子の反応陽性率の数（細胞の５０％以上が陽性で
ある数）、分母は試験数 を示す。

※※：陽性染色の強度は正常粘膜よシ、大腸癌粘膜の方
がはるかに強く示した。

本発明抗原は十分に、または中程度に分化した腫瘍によ
く検出される。この傾向はＡＨ−６により規定されたＬ
＠に対しても見られる。癌と隣接した正常粘膜間での陽
性、および陰性染色差を比較したとき、ＴＳ−１抗体は
癌に対しては非常に高い陽性率を示し、隣接正常粘膜に
対しては陰性を示す。抗体ＡＨ−５は腫瘍関連Ｌ・　抗
原を検出すると考えられて来次が（Ａｂ＊＋に、　ｔＭ
ｃｋｉ　ｂｂ　ｉ　ｎ　ｒ　Ｊ、Ｍ、　ｌ　ａｎｄ　Ｈ
ａｋｏｍｏｒ　ｉ　＋　ｓ、ｒＪ、旧ｏ１−Ｃｈｓｍ、
＋２５８＊１１７９３−１１７９７＋１９８３　；　Ａ
ｂｅ、に−＋Ｈａｋｏｍｏｒｉ＋　Ｓ、、ａｎｄ＋ｏｈ
ｓｈｉ　ｂａｎＳ、、Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｒ＠Ｉす４６　ｍ
　２６３９−２６４４　。

１９８６）％正常組織と反応陽性率が比較的に高い。こ
れに対して、本発明抗体ＴＳ−１は癌Ｍｉ織を検出する
のにＡＨ−６よりはるかに特異性が高い。

１−ｅ　　ヒト癌組織、および細胞から糖誘導体の検出
。

ヒト癌細胞又は組織をイソクロノ９ノール／ヘキサン／
水（５５：２５　：２０１　Ｖ／Ｖ／Ｖ）でホモジナイ
ズし、その抽出物をクロロホルム／メタノール／水中Ｆ
ｏｌ　ａｈの分画にかける。その上層糖脂質分画を上記
の方法で処理する（　Ｋａｎｎａ　ｇｉ　＋ルー＋Ｎｕ
ｄ＊１ｍａｎ＋Ｅ−ル＠Ｖ＠ｒＦ＋５−Ｂ−ｙａｎｄ　
Ｈａｋｏｍｏｒｉ＋Ｓ−＋Ｊ−Ｂｉｏ１．Ｃｈ＠ｍ−１
２５７＋１４８６５−１４８７４．１９８２）。ＨＰＬ
Ｃで分離された糖脂質、Ｑターンを上記の免疫染色法で
検出しｆｃ（Ｍａｇｎａｍｉ＋　Ｊ、Ｌ−＋５ｔａｌｔ
ｈ＋Ｄ、Ｆ、ｓ　ａｎｄＧｉｎｓｂ＊ｒｇｔＶ、ｅＡｎ
ａｌ　、Ｂｌｏｃｈ＠ｍ、＊　１０９　＊　３９９−４
０２．１９８０＞。典型的な）ｑターンを第１図に示す
。すなわち、ＨＰＴＬＣで糖脂質抗原を分離した後、抗
Ｌｅ　　抗体ＡＨ−６とＴＳ−１により免疫染色した。

Ａ：オルシノール染色；Ｂ：抗体ＡＨ−６で免疫染色；
Ｃ：抗体ＴＳ−１で免疫染色。糖脂質試料は間食の組織
（蛋白質に基づいて）から抽出した。大腸アデノカルシ
ノーマからの糖脂質の収率は約２００〜３５０ｐｆ／１
（１０■蛋白質、正常細胞を組織からは約１００〜２０
０ｐＰ／１００９蛋白質０各ＨＰＴＬＣプレートにのせ
た試料の電は組織蛋白質の１．０１９に相当する。図中
Ａ％　ＢおよびＣの１−９は共通した試料である。

ｌ：ム型赤血球換：２：Ｂ型赤血球膜；３：Ｂ型赤血球
膜；４：正常肝；５：正常大腸粘模；６：大腸癌組織、
症例２０；７：肝癌（肝のアデノカル７ノーマ）％　症
例Ｇ　−０６；８：３つのし＠ＹＩＭ脂質標準物質。

１”Ｆｕｅ　ＩＶ　”ＦｕｃｎＬｅ、　（上のバンド）
　、　　Ｖ”ＦｕｃＶｌ”ＦｕｃｎＬｅ６（中間のバン
ド）、■”ＦｕｃＶ”ＦｕｅＶｌ”ＦｕｅｎＬｅ＠　（
下のバンド）；９：大腸癌、症例４５゜ １−ｄ　　抗体の特異性 抗体ＴＳ−１は、第２図に示すように、抗原トリ７コシ
ルＬ・　と反応したが、セラ之ドヘキササツカライドと
反応せず、又Ｌ＠”構造をもった各種の糖脂質とも反応
しない。すなわち、第２図はモノクロナール抗体ＴＳ−
１と各種のフコシルＴｙｐｅ　２鎖抗原との反応性を示
す。反応性は各種濃度の糖脂質（横座標に示し′ｆｃ）
にたいして５倍量のレシチンと３倍量のコレステロール
の混合比で固層ラジオイムノアッセイによシ測定した。

これらの脂肪混合物はビニールストリップウェル上でカ
ウントした。抗体−抗原結合アッセイは上記の方法によ
り１：１０００に稀釈したＴＳ−１抗体で行われた（　
Ｋａｎｎａｇｌ＋Ｒ，＋５ｔｒｏｕｐ＋Ｒ，＋Ｃｏｈｒ
ａｎ＋Ｎ−Ａ−＋ｌｎｄ　Ｈａｋｏｍｏｒｉ　！５ＩＣ
ａｎｃｅｒ　　Ｒ＠ｓ１４３　曽４９９７−５００５　
ｔ　１９８３　　）ｏ　　Ａ　：　ＬｅＸへブタサツカ
ライド（Ｖ”ＦｕｃｎＬｅ６　＊　Ｏ型赤血球から）；
Ｂ：大Ｍ癌組織から単離したＡと１６］じ抗原；　Ｃ：
　Ｅｘｔｅｎｄｅｄ　Ｌｅ　　（ｎ”ＦｕｃＶ”Ｆｕｃ
ｎＬｅ６　＋大腸癌から）：Ｄ：ゾメリックＬ６ｘ （１”ＦｕｅＶ’ＦｕｅｎＬｃ＠　＋上のバンド）；Ｅ
：移動度の遅い同じ抗原；ＦとＧニトリフコシルＬｅＹ
構造をもった移動度の遅い抗原の二つのバンド；Ｈ：８
製したＥｘｔｅｎｄｓｄ　ＬｅＹ抗原（■”ＦｕｃＶ３
Ｆｕｃｎ　Ｌｅ６　　）　０２−ａ　抗原ＴＳ−１によ
υ規定される抗原構造の特異性 抗体ＴＳ−，１の抗原は、腫瘍細胞又は組織がＦｏｌｅ
ｈ　−Ｐｉらの方法（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈａｍ−９２２
６ｖ４９７−５０９．１９５７）により、クロロホルム
／メタノール（２：１）で抽出され、そしてＳｖａｎｎ
ｅｒｈｏｒｍの変法（Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ
、＋１７．２３９−２５０．１９６３　）により、クロ
ロホルム／メタノール１０９１％ＮａＣ１（１：　１０
　：１０）で繰返し分配抽出した場合に、その大部分が
中性糖脂質分画中に検出された。上層はＤＥＡＦＪ−セ
ファデックス（Ｙｕ＋Ｐ−に−＋ａｎｄＬｅｄｅｅｎ＋
Ｒ−Ｗ・＋Ｊ−Ｌｉｐｉｄ　　Ｒｅ５−＋　　１３　　
＋　　６８０−６８６　＋１９７２）によシ分離すると
、活性が中性糖脂質分画にある。すぐれた方法として、
組織や細胞をイソデロノＱノール／ヘキサン／水（５５
：２０：２５）で抽出する方法がある（　　Ｋａｎｎａ
ｇｉ＋Ｒ＋＋Ｎｕｄｅ１ｍｉｎ＋Ｅ−＋Ｌ＠ｖｅｒｙ＋
Ｓ、Ｂ−ｌａｎｄＨａｋｏｍｏｒｌ＋５−ｅＪ−Ｂｉｏ
ｃｈ＋ｅｍ・ｙ　　２５７　＋　１４８６５−１４８７
４．１９８２　）。この方法では、抗原が完全に抽出で
きる抽出物はＤＥ　ＡＥ−セファデックスで中性糖脂質
とシアリルガングリオシドに分離される。さらに、抗原
を護送と荒尾（Ｊ−Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ１−＋　２２．１
０２０−１０２４　＋　１９８１　）そして神奈木ら（
Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈ＠ｍ−＋　２５７　＋１４８６５
−１４８７４．１９８１　）による、既に記載された方
法によシイソデロノＱノール／ヘキサン／水で平衡化し
た極性シリカゲル、イアトロビーズ６Ｒ−８０１０（Ｉ
ａｔｒｏｎＣｈｓｍｌｃａｌ　Ｃｏ−製）を充填し之カ
ラム（１×５０　ｃｍ　）を用いたＨＰＬＣにより各種
の糖脂質に分ける。溶出プログラムはカラムにかけた試
料の量によシ異なる。一つの典型的な条件は以下のよう
である。カラムはイソプロピルアルコール／ヘキサン／
水、５０：４０：５から５５：２５：２０（ｖ／ｖ／ｖ
）の溶媒勾配で、１５０分間溶出が行なわれる。そして
更に５０分間、同溶媒で溶出される。１．０１７分の流
速になるように圧を調整する。各試験管あたｐ２．Ｏｗ
ｌの分画でフラクションコレクターにて分取する。各分
画より５μｔをＨＰＴＬＣ（Ｍｅ　ｒｋ　Ｄｒａｍｓｔ
ａｄｔ社製）にのせ、クロロホルム／メタノール／水（
５０：４０：１０１．ｖ／ｖ／ｖ）で展開分離する。そ
してＨＰＴＬＣプレートはＭａｇｎａｍｉ　ｒ　Ｓｍｉ
　ｔｈとＧｉｎｓｂａｒｇ（Ａｎａｌ−Ｂｌｏｅｈｅｍ
−９１０９＋３９９−４０２，１９８０）によりＴ８−
１抗体で免疫染色した。また、ＨＰＬＣからの各分画は
ＨＰＴＬＣで分析し、さらに抗体５ＳＥＡ−１、ＦＨ−
４、およびＡＨ−６によって分析された。本抗原は分５
画、■（チューブ阻８０〜８９）に溶出された。他の分
画は強い反応性を示さなかった。これは、ＡＨ−６抗体
によシ規定されたＬｅＹ抗原と著しい対照をなし、そし
てもつと大きなス？ットを示した。分画は■は、さらに
イアトロビーズ６ＲＳ−８０１０カラム（ｉｘ３ｏｃｉ
ａ）によるＨＰＬＣｆ繰返し、イソゾロ、Ｑノール／ヘ
キサン／水の勾配法で６０分間溶出した。流速は０、５
　＊ｌ　７分であった。活性成分は溶出され、ＴＳ−１
抗体で免疫染色し、確認された。そしてさらに、調整用
ＨＰＴＬＣにより精製された。

この時、螢光指示薬としてデリムリン （人１ｄｒｉ　ｅｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、製）を
噴霧してＵＶライトにて検出した（　５ｋｌｐｓｋｉ＋
Ｖ、Ｐ、＋Ｍ＠ｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ１・、３５，３
９６−４２５＋１９７５）。

ＨＰ　Ｔ　ＬＣで分離した糖脂質分画はプレートからか
きｓ、ｂ、イソゾロノｑノール／ヘキサン／水（５５：
２０：２５．Ｖ／Ｖ／Ｖ）で超音波をかけながら１０分
間抽出、ついで遠心分離を行なった。このようにして精
製した抗原は炭水化物残基に関しては均一である。抗原
成分の構造は以下のようにして同定された。

１　抗原はＡＨ−６抗体と強く反応することから、Ｌｅ
Ｙ決定基を有する。ＬｅＹに対する人Ｈ−６抗体の反応
性は、既でに十分同定されている（　人ｂｅ　＋に＋＋
Ｍｅｋｉｂｂｉｎ　＋Ｊ−Ｍ、＋　ａｎｄ　　Ｈａｋｏ
ｍｏｒ　［＋８．＋Ｊ、Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ−＋　　２
５８　．１１７９３−１１７　９７　　。

１９８３）。

ＩＩ　　ガスクロマトグラフィーのデータに基づき、セ
ラミドあたり３ケ以上のＦｕｅ、３ケ以上のＧａｔ、　
　２ケのＧｔｅＮＡｅ　、および１ケのＧｌｃ残基から
なる。

−糖の結合部位と構造はメチル化分析 （ＨａｋｏｍｏｒｌｔＳ−＋Ｊ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、（Ｔ
ｏｋｙｏ）＋　５５　＋　２０５−２０８　　＋１９６
４；Ｂｊｉｊｒｎｄａｌ−ＨｌＬｉｎｄｂｓｒｇ、Ｂ、
＋ａｎｄ　Ｓｗｅｎａｓｏｎ＋Ｓ１Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
−Ｒａｍ、＋　５　＋　４３３−４４０．１９６７）、
および化学イオン化マススペクトルの改良法（Ｋａｎｎ
ａｇｉ＋Ｒ−＋Ｌｅｖｓｒｙ＋５−Ｂ−＋ａｎｄ　　Ｈ
ｉｋｏｍｏｒｉ−８，＋Ｊ、Ｂｉｏｌ−Ｃｈ＠ｍ−＋　
　２５９　　＋　　８４４４−８４５１．１９８４）に
より決定した。

１ｖ　２つのフコシル残基はＬｅＹ決定基の末端Ｇａｔ
とその次のＧｔｅＮＡｅについている。さらに別のＦｕ
ｃはＬｅＹに結合しているタイプ２鎖の合して存在して
いる。本抗原はＣｈａｒｏｎｌａｌ　ａｍｐａ　ｓα−
ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｆ処理すると、その分解物はＤ
ｉｍｅｒｉｃ　ＬｅＸ％Ｉ”ＦｕｃＶ’ＦｕｅｎＬｅ６
に一致し、特異抗体ＦＨ−４と反応した（　Ｆｕｋｕｓ
ｈｉ＋Ｙ−＋Ｈａｋｏｍｏｒｉ＋Ｓｊ＋Ｎｕｄｅ１ｍａ
ｎｌＥ１ａｎｄ　　Ｃｏｅｈｒａｎ＋Ｎ、、Ｊ−Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｓｔｎ−１２５９，４６８１−４６８５。

１９８４）。

以上の結果より１本発明モノクロナール抗体ＴＳ−１と
特異的に反応する抗原は、糖の部分構造として、次の式
を有する Ｆｕｃ　α、　　　　　　　　Ｆｕｅ　αＩ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｆｕｃ　α。

トリフコシルーＮ−アセチルラクトサミン塘誘導体であ
る。

２−ｂ　　漏分解能’Ｈ−ＮＭＲによる抗原構造の解析
。

上記精製手段により精製し念当該糖誘導体を高分解ｇ　
’Ｈ−ＮＭＲ（５Ｑ　ｉＪ　ＭＨｚ　）にて解析を行な
った。当該精製糖誘導体１００〜２００μｔを２％Ｄ、
Ｏと１％ＴＭＳ　（テトラメチルシラン）を含有するＤ
ＭＳＯ（ジメチルスルホオキサイド）に溶解し、　’Ｈ
−ＮＭＲに付与し、３２８°Ｋにて行なった。

その結果を表’ｌ−ａ、２−ｂ及び表３に示す。表中人
：　Ｆｕｅｌ−＋２；　Ｂ　：　Ｇａｌβ、；Ｃ：Ｆｕ
ｅｌ−＋３　；　Ｄ　：　４ＧｔｅＮＡｅβ＋　：　”
　：　３Ｇｕｔβｔ：Ｆ：Ｆｕｅｌ→３　ｙ　　Ｇ　　
：　　４ＧｔｃＮＡｅβ＋　　；　Ｈ：　　３Ｇｌｃβ
１　；　Ｉ　：］　Ｃｓ　ｒａｍｉｄ＊を示す。

また１表中数字は各プロトンのｐｐｍを、０内の数字は
カップリング定数を示し、単位はＨｚである。

以下余白 表３は同一条件で解析した各７コースのＨ−５とＨ−６
の結果である。表中人はＦｕｃα１→２、Ｃはｐｕｅα
、−＋３．ＦはＦｕｃα、→３をそれぞれ示し、数字は
各プロトンのｐｐｒｎを表す０ 表３ Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　ＣＦＨ−５Ｈ−
６Ｈ−５Ｈ−６Ｈ−５Ｈ−６４，５９０１，０２０−− ４，０２７１，１０３４，６４４１，０６０−−４，５
８９１，０２０−− ４，６０４１，０２０４，５９２１，０１５４，０２７
１，１０３４，６４０１，０７２−−４，０２５１，１
０１４，６５３１，０？２４．５８６１．０１４

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＰ　Ｔ　ＬＣで分離した糖抗原を抗Ｌｅ抗体
＾Ｈ−６と本発明抗体ＴＳ−１により免疫染色した結果
を示す。第２図はモノクロナール抗体ＴＳ−１と各種の
フコシルタイプ２鎖抗原との反応性を示す。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト癌細胞と特異的に反応するモノクローナル抗体
   ＴＳ−１。 ２、モノクローナル抗体ＴＳ−１と特異的に反応し、次
   式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはアセチ
   ルグルコサミン、Ｆｕｃはフコースを示す）で表わされ
   る糖の部分構造を有するトリフコシル−Ｎ−アセチルラ
   クトサミン糖誘導体。