JPS6317839B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明の目的は新規なジペプチド

【式】を提供することにあ る。 さらにまた本発明の目的はこの

【式】を遊離のアミノ基お よび保護されたカルボキシル基を有する相当する
ペプチドと、ペプチド化学に慣用の溶媒中で３−
ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−
１，２，３−ベンゾトリアジン（HOObt）およ
びカルボジイミドを添加して反応させ、続いて
Dnp−（２，４−ジニトロフエニル）−基を分解さ
せることを特徴とするLH−RHまたはLH−RH
類似体の製法にある。 LH−RHは周知のように式 を有する視床下部から出されるホルモンであつ
て、これは脳下垂体中に生殖腺刺激ホルモンLH
およびFSHを分泌させる。LH−RH類似体とし
てはLH−RHの１個もしくは数個のアミノ酸が
交換されておりそして／またはペプチド鎖が短
縮、延長および／または誘導体化により変化され
ているペプチドがあげられる。その際６−位のグ
リシンのＤ−アミノ酸による置換および10−位の
アルキルアミンによる置換が特に重要である。 本発明による方法の第二の成分としては従つて
なかんずく一般式もしくは Ｈ−Trp−Ser−Tyr−Ｘ−Leu−Arg−Pro−
Gly −NH₂ （） Ｈ−Trp−Ser−Tyr−Ｘ−Leu−Arg−Pro −NH−C₂H₅ （） 〔上式中、ＸはGlyもしくは例えばＤ−Ser
（Bu^t）、Ｄ−Leu、Ｄ−Ala、Ｄ−Phe、Ｄ−
Trp、Ｄ−Gln（シクロヘキシル）、Ｄ−Glu
（OBu^t）およびＤ−Lys（Boc）のようなＤ−アミ
ノ酸またはその誘導体を意味する〕を有するオク
タペプチドまたはヘプタペプチドがあげられる。 出発物質として使用される新規なジペプチド誘
導体である

【式】は慣用の 方法例えば

【式】を２，４−ジニ トロフルオルベンゼンと含水性NaHCO₃で緩衝
化した溶液中で反応させることにより調製され
る。 適当な溶媒としては本発明方法に際して溶解度
の見地から例えばジメチルアセトアミド、ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、りん酸
トリ（ジメチルアミド）あるいはＮ−メチル−ピ
ロリドンのような極性溶媒が使用される。 合成は−10℃ないし室温で行われ得る。なかん
ずく約０℃で開始しそして後に室温となす。 縮合剤としては容易に入手し得るジシクロヘキ
シルカルボジイミド（DCC）が好ましいが、ま
た例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノ−エチル）−カルボジイミド−トルエンスル
ホネートあるいは１−エチル−３−（３−ジメチ
ル−アミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩の
ような他のカルボジイミドも使用され得る。中間
生成物としてはじめに、ヒスチジンのイミダゾー
ル環がジニトロフエニル残基によつて保護されて
いるペプチドが生じる。このジニトロフエニル残
基はペプチド化学に知られている方法により分解
され得る。適当な分解法は例えばチオール分解
〔「Biochem.−Biophys.Res.Commun.」第29巻第
178頁（1967）、「Biochemistry」第９巻第5122頁
（1970）〕あるいはヒドラジン分解
〔「Tetrahedron Letters」第44巻第4121頁
（1971）〕である。 Dnp含有中間生成物は一般に単離される必要は
ない。ペプチド結合の後反応物に例えばメルカプ
トエタノールもしくはエチルメルカプタンのよう
なチオールまたはヒドラジンを加え、薄層クロマ
トグラフイー制御により容易に確認され得るDnp
残基の分解の終了後に反応物を後処理する。ヒド
ラジンが脱保護基試薬として使用される場合、ジ
メチルホルムアミドは溶媒として適していない。
何故ならばこれはヒドラジンに対して安定ではな
いからである。 LH−RHならびにその類似体の製造には特に

【式】を相当するペプチドとDCC を用い且つ例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド
（HONSu）、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾー
ル（HOBt）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，
４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン
（HOObt）あるいはＮ−ヒドロキシ−５−ノルボ
ルネン−エンド−２，３−ジカルボキシイミド
（HONB）のようなラセミ化を抑制するＮ−ヒド
ロキシ化合物を添加し結合させることがすでに知
られている〔「Biochem.−Biophys.Res.
Commun.」第45巻第767〜773頁（1971）参照〕。 しかしながら高速液体クロマトグラフイー（＝
HPLC）を用いることにより、この方法ではヒス
チジンの部分的なラセミ化が避けられないことは
確認されている（表１および２参照）。ヒスチジ
ンペプチドの合成に際してヒスチジンのラセミ化
を抑制するために文献上トシル基（＝Tos基）に
よるイミダゾール環の保護が行われている。これ
に対して２，４−ジニトロフエニル基（Dnp基）
による相当する保護はヒスチジンの強いラセミ化
およびさらに汚染される傾向がある故にあまり適
当でないようにみえる〔「Recueil des Travaux
Chimiques des Pays−Bas」第93巻第256頁
（1974）〕。 それ故、出発物質たる

【式】に おいてヒスチジンをN^im２，４−ジニトロフエニ
ル基（Dnp）によつて保護し、本発明方法による
反応条件を用いた場合にヒスチジンのラセミ化が
Ｄ−ヒスチジン２％以下に減少されることは驚く
べきことであつた。これに対して同じ条件でトシ
ル基をN^im−保護に使用するとラセミ化はＤ−ヒ
スチジン５％以下に減少されない。 種々のカルボキシル成分から出発し、種々の縮
合法を用いるLH−RH合成に際しての比較研究
が表１に掲げられており、そこでは高速液体クロ
マトグラフイー（HPLC）を用いて〔Ｄ−His²〕
−LH−RH含量が測定されている。表１では、
DCC−HOObtおよびN^im−Dnp保護法をもつぱら
使用するとラセミ化がＤ−ヒスチジン２％以下に
低下され得ることが示される。LH−RH類似体
の合成に際しても表２に示されるように同様の結
果が得られる。 表１はLH−RH合成に際してのラセミ化の研
究を要約したものであり、合成条件は実施例３〜
５と同様である。HPLCはメルク社製の「リクロ
ソルブ（Lichrosorb）」（登録商標）SI60（平均孔
寸法60Åを有するシリカゲル）を充填したカラム
（0.4×25cm）を使用し、溶離剤はクロロホルム
310、メタノール190、水14、トリエチルアミン
3.1およびぎ酸１（容量単位）からなり、そて溶離
速度は毎分１mlとした。 R_T（LH−RH）＝約14.0〜14.5分、 R_T（〔Ｄ−His²〕LH−RH）＝約17.5〜18分。

【表】

【表】 表２は〔Ｄ−Ser（Bu^t）⁶〕LH−RH−（１−９）
−ノナペプチド−エチルアミドの合成に際しての
ラセミ化研究の要約である。合成条件は実施例６
および７と同じである。HPLCはメルク社製の
「リクロソルブSI60」を充填したカラム（0.4×25
cm）を使用し、溶離剤はアセトニトリル410、メ
タノール29、水29、クロロホルム20、トリエチル
アミン3.7およびぎ酸１（容量単位）からなり、そ
して溶離速度は毎分２mlとした。 R_T〔（Ｄ−Ser（Bu^t）⁶〕LH−RH−（１−９）−ノナ
ペプチド−エチルアミド）＝40分、 R_T（〔Ｄ−His²、Ｄ−Ser（Bu^t）⁶〕LH−RH−（１
−９）−ノナプチド−エチルアミド）＝48分。

【表】 実施例 １

【式】の製造

【式】30ｇ（100ミリモル） およびNaHCO₃20ｇ（238ミリモル）を水200ml
中に溶解させる。これに撹拌下に１時間以内でジ
オキサン100ml中の２，４−ジニトロフルオルベ
ンゼン22.3ｇ（120ミリモル）の溶液を滴下する。
次いで室温で３時間撹拌する。沈殿を吸引過
し、そして液を酢酸エステル各200mlずつを用
いて２回抽出する。水相を濃縮する。残留物を水
200ml中に溶解しそして1N HCl120mlを加える。
析出する赤色油から傾瀉し且つ過する。水溶液
にｎ−ブタノール300mlを加え、よく振盪し、そ
してこの相混合物を４℃で一夜放置する。翌日黄
色沈殿を吸引過しそして少量のｎ−ブタノール
で洗う。まだ存在している

【式】 を完全に除去するために沈殿を各300mlずつの水
と２回室温で１時間撹拌し、吸引過し、そして
P₂O₅で真空下に乾燥する。収量20ｇ、m.p.235〜
241℃（分解）。〔α〕_D ²¹＝−12.2゜（ｃ＝１、酢酸）
、
〔α〕_D ²¹＝＋18.9゜（ｃ＝１、ジメチルホルムアミ
ド）。 実施例２（参考例） 表１の比較物質としての

【式】 の製造

【式】３ｇ（10ミリモル）を NaHCO₃2.3ｇと共に水20ml中に溶解させる。こ
れに室温で撹拌下に約10mlのジオキサン中のｐ−
トルエンスルホクロリド2.1ｇ（10％過剰）の溶
液をゆつくり滴下する。添加終了後さらに１時間
撹拌する。この溶液をエーテルと２回振盪する。
水相を2N HClを用いてPH２に酸性化し、そして
沈殿を吸引過する。水で洗い、そして過残留
物をP₂O₅上で真空乾燥する。収量2.2ｇ。 実施例 ３（参考例） 表１による種々の結合法による

【式】 を用いるLH−RHの合成 Ｈ−Trp−Ser−Tyr−Gly−Leu−Arg−Pro
−Gly−NH₂−ジトシレート640mgおよび

【式】150mgをジメチルア セトアミド３ml中に溶解させる。これにＮ−エチ
ルモルホリン0.065mlおよびHOBt68mg（または
HOObt81mg、HONB90mg、またはHONSu57mg）
を加える。０℃に冷却し、DCC110mgを加え、そ
して０℃で１時間そして室温で一夜撹拌する。翌
日抱水ヒドラジン0.1mlを加え、室温で２時間撹
拌しそして吸引過する。液をｎ−ブタノール
30mlおよびNaHCO₃溶液30mlの間に分配する。
ｎ−ブタノール相を高真空下に濃縮しそして残留
物をエーテルですりつぶす。沈殿を吸引過しそ
して乾燥する。次いでこの物質を希酢酸中に溶解
し、そして約10mlのダウエツクス（Dowex）１
×２（アセテート型）でクロマトグラフイーする。
水で溶離する。溶離液を凍結乾燥する。収量500
〜600mg。 さらに精製するためには粗LH−RHをドイツ
特許出願公告第2438350号公報明細書（実施例1e）
の記載と同様にしてヒドロキシプロピル化交叉結
合デキストランゲルでの分配クロマトグラフイー
に付す。純粋なLH−RHの収量約250〜300mg。 実施例 ４（参考例） 表１による種々の結合法による

【式】を用いるLH−RHの 合成 Ｈ−Trp−Ser・Tyr−Gly−Leu−Arg−Pro
−Gly−NH₂−ジトシレート640mgおよび

【式】210mgをジメチルア セトアミド３ml中に溶解させる。これにＮ−エチ
ルモルホリン0.065mlおよびHOObt81mg（または
HDNSu57mg）を加える。０℃に冷却し、これに
DCC110mgを加え、そして０℃で１時間次いで室
温で一夜撹拌する。実施例３と同様にしてさらに
処理し精製する。収量275mg（または250mg）。 実施例 ５（参考例） 表１による種々の結合法による

【式】を用いるLH−RHの 合成

【式】11ｇ（25 ミリモル）およびＨ−Trp−Ser−Tyr−Gly−
Leu−Arg−Pro−Gly−NH₂・2TosOH32ｇ（25
ミリモル）をジメチルアセトアミド150ml中に溶
解させる。これに4.07ｇのHOObt（＝３−ヒドロ
キシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，
３−ベンゾトリアジン）（またはHOBt3.4ｇ、
HONB4.5ｇまたはHONSu2.9ｇ）を加え、０℃
で冷却し、次いでこれにＮ−エチルモルホリン
3.25mlおよびDCC5.5ｇを加える。０℃で１時間
そして室温で一夜撹拌する。析出する沈殿を吸引
過する。少量のジメチルアセトアミドで洗う。
液に100％抱水ヒドラジン2.5mlを加え、室温で
４時間撹拌する。黒色溶液が生じる。酢酸エステ
ル1250mlを用いてペプチドを沈殿させる。この沈
殿を吸引過し、そして酢酸エステルで洗う。こ
の沈殿をメタノール430ml中に溶解し、そして酢
酸エステル1400mlを用いてペプチドを新たに析出
させる。この沈殿を吸引過し、ｎ−ブタノール
1000ml中に溶解し、飽和NaHCO₃溶液1000mlで
１回そして飽和NaHCO₃溶液750mlでもう１回振
盪する。ｎ−ブタノール相を高真空下に濃縮す
る。残留物を酢酸エステルですりつぶしそして乾
燥させる。粗収量約25ｇ。実施例３と同様にして
さらに精製する。収量12〜14ｇ。 実施例 ６（参考例） 表２による種々の結合法による

【式】 を用いる〔Ｄ−Ser（Bu^t〕LH−RH−（１−９）
−ノナペプチド−エチルアミドの合成

【式】11ｇ（25 ミリモル）およびＨ−Trp−Ser−Tyr−Ｄ−Ser
（Bu^t）−Leu−Arg−Pro−NH−C₂H₅・
2HCl26.6ｇ（25ミリモル）をジメチルアセトア
ミド150ml中に溶解する。これに4.07ｇの３−ヒ
ドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，
２，３−ベンゾトリアジン（＝HOOBt）（また
はHOBt3.4ｇ、HONB4.5ｇあるいはHONSu2.9
ｇ）を加え、そして０℃に冷却する。これにＮ−
エチルモルホリン3.25mlおよびDCC5.5ｇを加え
る。０℃で１時間そして室温で一夜撹拌する。析
出する沈殿を吸引過し、そしてジメチルアセト
アミド50mlで洗う。液に100％抱水ヒドラジン
2.5mlを加える。室温で４時間撹拌しそして酢酸
エステル1250mlを用いてペプチドを沈殿させる。
沈殿を吸引過しそして酢酸エステルでよく洗
う。次いでこの物質をメタノール430ml中に溶解
させる。酢酸エステル1400mlを用いてペプチドを
新たに析出させる。沈殿をｎ−ブタノール1000ml
中に溶解しそして飽和NaHCO₃溶液1000mlを用
いて１回そして第２回目は飽和NaHCO₃溶液750
mlを用いて振盪する。ｎ−ブタノール相を濃縮し
そして残留物を酢酸エステルとすりつぶす。沈殿
を吸引過し、酢酸エステルで洗い、そして乾燥
する。収量18.7ｇ。 アセテートに変換するためには、先に得られた
物質を水50mlおよび酢酸５ml中に溶解し、ダウエ
ツクス１×２（アセテート型）230mlでクロマトグ
ラフイーする。水で溶離する。この物質を包含し
ているフラクシヨンを合し、そして凍結乾燥す
る。収量約15.0ｇ。〔α〕_D ²³＝−40゜（ｃ＝１、メタ
ノール）。実施例３と同様にしてさらに精製する。
収量約9.5〜11ｇ。 実施例 ７（参考例） 表２による種々の結合法による

【式】 を用いる〔Ｄ−Ser（Bu^t）⁶〕LH−RH−（１−
９）−ノナペプチド−エチルアミドの合成 Ｈ−Trp−Ser−Tyr−Ｄ−Ser（Bu^t）−Leu−
Arg−Pro−NH−C₂H₅・2HCl532mgおよび

【式】150mgをジメチルア セトアミド３ml中に溶解させる。これにＮ−エチ
ルモルホリン0.065mlおよびHOBt68mg（または
HOOBt81mg、HONB90mgあるいはHONSu57
mg）を加える。０℃に冷却し、これにDCC110mg
を加え、そして０℃で１時間そして室温で一夜撹
拌する。実施例３と同様にして後処理し精製す
る。収量104〜207mg。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １