JPS63184065A - ペプチドシ−クエネ−タ−用連続フロ−反応器 - Google Patents
ペプチドシ−クエネ−タ−用連続フロ−反応器Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ペプチド配列決定のための装置及び方法に関
する。更に詳細には、本発明は、ペプチドシークエ不−
ター用の連続フローカラム反応器、及びこの反応器を利
用するペプチド配列決定方法に関する。
する。更に詳細には、本発明は、ペプチドシークエ不−
ター用の連続フローカラム反応器、及びこの反応器を利
用するペプチド配列決定方法に関する。
実際的な自動化されたペプチド配列決定は、１９６７年
のスピン力ソブシークエネーターの採用から始まる。エ
ドマン氏（Ｅｄｍａｎ Ｐ、）及びベツグ氏（Ｂｅｇｇ
Ｇ、）著の「ア・プロティン・シークエ不一ター（Ａ
Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ ）Ｊヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏ（Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓ
ｔｒｙ ）、第１巻、第８０〜９１頁（１９６７年）を
参照。スピンカップシークエネーターに関連して問題と
なる焦点は、特に短いペプチド類での試料の損失である
。従って、別の方法（固相減成法）が立案された。それ
によれば、ペプチドを共有結合しているポリスチレンマ
トリックス若しくは、好ましくは、ガラスピーズ等の固
体担体で充填されたカラムに、試薬及び溶媒を適切なプ
ログラムで通過させる。シークエ不一ターに連結されて
いるカラム及び管の双方は、ポリテトラフルオロエチレ
ン、例えば、テフロンから作ることができる。ラウルセ
ン（Ｌａｕｒｓｅｎ、Ｒ。
のスピン力ソブシークエネーターの採用から始まる。エ
ドマン氏（Ｅｄｍａｎ Ｐ、）及びベツグ氏（Ｂｅｇｇ
Ｇ、）著の「ア・プロティン・シークエ不一ター（Ａ
Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ ）Ｊヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏ（Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓ
ｔｒｙ ）、第１巻、第８０〜９１頁（１９６７年）を
参照。スピンカップシークエネーターに関連して問題と
なる焦点は、特に短いペプチド類での試料の損失である
。従って、別の方法（固相減成法）が立案された。それ
によれば、ペプチドを共有結合しているポリスチレンマ
トリックス若しくは、好ましくは、ガラスピーズ等の固
体担体で充填されたカラムに、試薬及び溶媒を適切なプ
ログラムで通過させる。シークエ不一ターに連結されて
いるカラム及び管の双方は、ポリテトラフルオロエチレ
ン、例えば、テフロンから作ることができる。ラウルセ
ン（Ｌａｕｒｓｅｎ、Ｒ。
Ａ、）氏著の「固相ペブチドシークエネーター」、ヨー
ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト リ −
（Ｅ＋＋ｒｏｐ ｅａａ Ｊｏａｒｎａｌ ａｔ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第２０巻、第８
９〜ｌＯ２頁（１９７０年）及び／べり−（Ｓｈｉｖｅ
ｌｙ）氏著の「メソッズ・オブ・プロティン・ミスキャ
ラクタリゼーション（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｍ：５ｃｂｓｒａｃＬｅｒＪｚｓ口ＤＩＬ） Ｊ
第９章、（１９８６年）ハマナープレス（Ｒａｍａｎ！
Ｐｒ５ｓｓ）発刊、クリ７トン市、Ｎ、Ｊ、州、を参照
。
ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト リ −
（Ｅ＋＋ｒｏｐ ｅａａ Ｊｏａｒｎａｌ ａｔ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第２０巻、第８
９〜ｌＯ２頁（１９７０年）及び／べり−（Ｓｈｉｖｅ
ｌｙ）氏著の「メソッズ・オブ・プロティン・ミスキャ
ラクタリゼーション（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｍ：５ｃｂｓｒａｃＬｅｒＪｚｓ口ＤＩＬ） Ｊ
第９章、（１９８６年）ハマナープレス（Ｒａｍａｎ！
Ｐｒ５ｓｓ）発刊、クリ７トン市、Ｎ、Ｊ、州、を参照
。
１９８１年に、エドマン減成法において重要な点の液相
試薬の代わりに気相試薬を使用するシークエ不−ターが
提案された。ヒユーイック（Ｈｅｖｉｃｋ、Ｒ，Ｍ、）
氏、バンカピラー（Ｈｕｎｋｘｐｉｌｌａｒ、Ｍ、Ｗ、
）氏、フード（Ｈｏｏｄ、Ｌ、Ｅ、）氏及びドレイヤ−
（Ｄｒｅｙｅｒ、Ｗ、Ｊ、）氏共著の「ア・ガス−リキ
ッド・ソリッド・フェース・ペプチド・アンド・プロテ
ィン・シークｘ 不一ター（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓＬｒｙ）第２
５６巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１年）及びシ
ベリー（Ｓｈｉｖｅｌｙ）氏著の［メソノズ・オブ・プ
ロティン・ミスキャラクタリゼーション（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏ［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ） Ｊ第８章、第３１４９．第２２９頁（
１９８６年）ハマチ・プレスＣＨａｍａｎｘ Ｐｒｅｓ
ｓ）発刊、クリ７トン市、Ｎ、Ｊ、州、を参照。この装
置は、多孔性のグラスファイバー円板上に支持されたポ
リブレンの薄膜中に分散体としてペプチド試料が存在す
る小型の連続フローガラス反応室を収容する一体の二部
からなるガラスカートリッジアッセンブリーを含む。試
料を供給する毎にカートリッジの取り付はベースからカ
ートリッジを遮断するための手段が備えられている。カ
ートリッジはシークエ不−ター中に垂直に取り付けられ
ており、カートリッジの入口と出口の端部においてテフ
ロン管によりシークエネーターに連結されている。
試薬の代わりに気相試薬を使用するシークエ不−ターが
提案された。ヒユーイック（Ｈｅｖｉｃｋ、Ｒ，Ｍ、）
氏、バンカピラー（Ｈｕｎｋｘｐｉｌｌａｒ、Ｍ、Ｗ、
）氏、フード（Ｈｏｏｄ、Ｌ、Ｅ、）氏及びドレイヤ−
（Ｄｒｅｙｅｒ、Ｗ、Ｊ、）氏共著の「ア・ガス−リキ
ッド・ソリッド・フェース・ペプチド・アンド・プロテ
ィン・シークｘ 不一ター（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓＬｒｙ）第２
５６巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１年）及びシ
ベリー（Ｓｈｉｖｅｌｙ）氏著の［メソノズ・オブ・プ
ロティン・ミスキャラクタリゼーション（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏ［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ） Ｊ第８章、第３１４９．第２２９頁（
１９８６年）ハマチ・プレスＣＨａｍａｎｘ Ｐｒｅｓ
ｓ）発刊、クリ７トン市、Ｎ、Ｊ、州、を参照。この装
置は、多孔性のグラスファイバー円板上に支持されたポ
リブレンの薄膜中に分散体としてペプチド試料が存在す
る小型の連続フローガラス反応室を収容する一体の二部
からなるガラスカートリッジアッセンブリーを含む。試
料を供給する毎にカートリッジの取り付はベースからカ
ートリッジを遮断するための手段が備えられている。カ
ートリッジはシークエ不−ター中に垂直に取り付けられ
ており、カートリッジの入口と出口の端部においてテフ
ロン管によりシークエネーターに連結されている。
ヒユーイック氏等のシークエネーターの改良が、ホープ
（Ｈａｗｋｅ）氏、ハリス（Ｈｘｒｒｉｓ）氏及びシー
ベリー（Ｓｈｉｖｅｌｙ）氏著の「アナリテイヵル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ第１４７巻、第３１５〜３３０頁（
１９８，５年）、並びにシベリー（Ｓｈｉｖｅｌｙ）氏
著の「メソノズ・オブ・プロティン・ミスキャラクタリ
ゼーション（Ｍｅｔｈｏｄｓ 、ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍｉｓｃｂａｒａｃｔｅｒｉｚａｊｉｏｎ） Ｊ第７
章、第２１０頁（１９８６年）ハマチ・プレス（Ｈａｍ
ａｎａ Ｐｒｅｓｓ）発刊、クリ７トン市、Ｎ、Ｊ。
（Ｈａｗｋｅ）氏、ハリス（Ｈｘｒｒｉｓ）氏及びシー
ベリー（Ｓｈｉｖｅｌｙ）氏著の「アナリテイヵル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ第１４７巻、第３１５〜３３０頁（
１９８，５年）、並びにシベリー（Ｓｈｉｖｅｌｙ）氏
著の「メソノズ・オブ・プロティン・ミスキャラクタリ
ゼーション（Ｍｅｔｈｏｄｓ 、ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍｉｓｃｂａｒａｃｔｅｒｉｚａｊｉｏｎ） Ｊ第７
章、第２１０頁（１９８６年）ハマチ・プレス（Ｈａｍ
ａｎａ Ｐｒｅｓｓ）発刊、クリ７トン市、Ｎ、Ｊ。
州、に記載されている。この改良は、ヒユーイック氏の
ガラスカートリッジアセンブリーを同じデザインの総テ
フロンカートリッジに置き換え、従って、総テフロンの
デリバリ−及び反応系を提供する。試料は、反応室内の
トリメチルシリル化したグラスファイバー円板上に存在
する。テフロンが「セルフシーリング」であると気付い
たホーケ氏等は、ヒユーイック氏等のガラスカートリッ
ジで観察されるシールに比較して総テフロンデザインに
おいて達成される良好なシールからもたらされると思わ
れる低いバックグラウンドレベルを報告している。総テ
フロン製は、収量の増加をもたらすとも報告されている
。シベリーの上述の文献の第２１７頁を参照。
ガラスカートリッジアセンブリーを同じデザインの総テ
フロンカートリッジに置き換え、従って、総テフロンの
デリバリ−及び反応系を提供する。試料は、反応室内の
トリメチルシリル化したグラスファイバー円板上に存在
する。テフロンが「セルフシーリング」であると気付い
たホーケ氏等は、ヒユーイック氏等のガラスカートリッ
ジで観察されるシールに比較して総テフロンデザインに
おいて達成される良好なシールからもたらされると思わ
れる低いバックグラウンドレベルを報告している。総テ
フロン製は、収量の増加をもたらすとも報告されている
。シベリーの上述の文献の第２１７頁を参照。
シベリーの上述の文献の第９章第２４９頁以下に、多目
的シークエネーターのデザインが記載されている。この
ような多目的シークエネーターは、カップ コンパート
メント、カラム又はカートリッジでの運転に容易に切り
替えできるように交換可能なユニットで構成されている
。［交換可能な部品ｊの論述においては、固相シークエ
不一ターの微小配列決定に適した微小カラムが、装置の
他の部品を変換しないで、カートリッジにより取り替え
できると説明されている。ペプチド結合ガラス担体で充
填され、かつシークエ不一ターへの連結のためのテフロ
ン管入口及び出口路を備えたポリフルオロクロロ（Ｋｅ
ｌ−Ｆ）微小カラムが記載されている。
的シークエネーターのデザインが記載されている。この
ような多目的シークエネーターは、カップ コンパート
メント、カラム又はカートリッジでの運転に容易に切り
替えできるように交換可能なユニットで構成されている
。［交換可能な部品ｊの論述においては、固相シークエ
不一ターの微小配列決定に適した微小カラムが、装置の
他の部品を変換しないで、カートリッジにより取り替え
できると説明されている。ペプチド結合ガラス担体で充
填され、かつシークエ不一ターへの連結のためのテフロ
ン管入口及び出口路を備えたポリフルオロクロロ（Ｋｅ
ｌ−Ｆ）微小カラムが記載されている。
本発明は、生成物及び試薬によるアミノ酸の蓄積が除去
されて、実質的に流動渋滞部分（ｕｎｓｖｅｐｔｖｏｌ
ｕｍｅｓ）のない、連続フローカラム反応器を提供する
。この反応器は高価でなく、容易にシークエ不−ターに
挿入したり取り外しでき、従って、新規で汚染されてい
ない室の常用を促進する。
されて、実質的に流動渋滞部分（ｕｎｓｖｅｐｔｖｏｌ
ｕｍｅｓ）のない、連続フローカラム反応器を提供する
。この反応器は高価でなく、容易にシークエ不−ターに
挿入したり取り外しでき、従って、新規で汚染されてい
ない室の常用を促進する。
本発明の反応器は、化学的に不活性な合成樹脂管から形
成される。相対的に大きな内部直径の前記のような管の
部分より形成される反応室は、適切な寸法の締まり嵌め
入口管及び出口管が設置されている。本発明の好ましい
実施態様では、反応器はテフロン管から形成される。反
応室は、多孔性の支持手段、好ましくはテフロンが備え
られ、かつ、配列決定をすべきペプチドで被覆された離
散物、例えば、ガラスピーズで充填されている。
成される。相対的に大きな内部直径の前記のような管の
部分より形成される反応室は、適切な寸法の締まり嵌め
入口管及び出口管が設置されている。本発明の好ましい
実施態様では、反応器はテフロン管から形成される。反
応室は、多孔性の支持手段、好ましくはテフロンが備え
られ、かつ、配列決定をすべきペプチドで被覆された離
散物、例えば、ガラスピーズで充填されている。
本発明による連続フロー反応器は第１図に示され、通常
、参照番号１Ｇで表示する。連続フロー反応器ｌＯは、
反応管１４並びに締まり嵌め供給及び排水管１２及び１
６を含む。管１２、目及び１６の各々は、化学的に不活
性な柔軟な合成樹脂様材料、好ましくは、ポリテトラフ
ルオロエチレン等の自滑性のフルオロカーボン、から形
成される。多くのフルオロカーボンが利用できる。例え
ば、「プラスチックス・エンジニアリング・ハンドブッ
ク（ＰＩＩＳｔｉＣ８Ｅｎｇｉｆｉｅｅｒｉｆｉｇ Ｈ
ｓｎｄｂｏｏｋ） Ｊ、第６０〜６２頁、パン ノース
トランド ラインホールド社（１９７６年）を参照。
、参照番号１Ｇで表示する。連続フロー反応器ｌＯは、
反応管１４並びに締まり嵌め供給及び排水管１２及び１
６を含む。管１２、目及び１６の各々は、化学的に不活
性な柔軟な合成樹脂様材料、好ましくは、ポリテトラフ
ルオロエチレン等の自滑性のフルオロカーボン、から形
成される。多くのフルオロカーボンが利用できる。例え
ば、「プラスチックス・エンジニアリング・ハンドブッ
ク（ＰＩＩＳｔｉＣ８Ｅｎｇｉｆｉｅｅｒｉｆｉｇ Ｈ
ｓｎｄｂｏｏｋ） Ｊ、第６０〜６２頁、パン ノース
トランド ラインホールド社（１９７６年）を参照。
管１２及び１６の各々は、実質的に同じ寸法で良く、そ
して、反応管口は、管１２及びＩ６よりも大きくできる
。例えば、管１２及び１６は、はぼ０．１６ ｍｍ （
１／１６インチ）の外径を持ち、反応管１４は、はぼ０
．１６ ｍｍ （１／１６インチ）の内径を持ち、はぼ
０．３２ ｍｍ （ｌ／８インチ）の外径を持つことが
できる。好ましくは、反応管１４の内径は、管１２及び
１６の外径に対して、相対的に僅かに小さい。これらの
寸法の関係により、管１２及び１６を、反応管１４の向
かい合った端部に締まり嵌めまたはプレス嵌めでき、管
１２及び１６と反応管口とのあいだで耐漏連結を提供す
る。
して、反応管口は、管１２及びＩ６よりも大きくできる
。例えば、管１２及び１６は、はぼ０．１６ ｍｍ （
１／１６インチ）の外径を持ち、反応管１４は、はぼ０
．１６ ｍｍ （１／１６インチ）の内径を持ち、はぼ
０．３２ ｍｍ （ｌ／８インチ）の外径を持つことが
できる。好ましくは、反応管１４の内径は、管１２及び
１６の外径に対して、相対的に僅かに小さい。これらの
寸法の関係により、管１２及び１６を、反応管１４の向
かい合った端部に締まり嵌めまたはプレス嵌めでき、管
１２及び１６と反応管口とのあいだで耐漏連結を提供す
る。
また、管１６をより大きくして、第１図に示されている
ように反応管の内側でプレス嵌めする代わりにその外側
でプレス嵌めするような寸法にできる。流動渋滞部分の
ない反応域がこの方法で与えられる。
ように反応管の内側でプレス嵌めする代わりにその外側
でプレス嵌めするような寸法にできる。流動渋滞部分の
ない反応域がこの方法で与えられる。
円板等の多孔性支持部材Ｉ８を、反応管Ｉ４の内側に緊
密に嵌める。好ましくは、支持部材１８を、第１図に示
した実施態様の管１６の上端の位置の付近に配置する。
密に嵌める。好ましくは、支持部材１８を、第１図に示
した実施態様の管１６の上端の位置の付近に配置する。
支持部材１８は、流体の通過ができ、かつ、更に、反応
管１４の上部に充填したビーズ等の離散物２０を保持す
るのに必要な多孔性を有する。支持部材１８は、化学的
に不活性な合成樹脂、好ましくは、フルオロカーボン、
から作られる。例えば、反応管目の内径よりも僅かに大
きい円板を得るように １４−ゲージ針によって切断し
たポリテトラフルオロエチレンから、支持部材１８を作
れる。この円板を反応管Ｈに押し入れることができ、そ
れによりもたらされているプレス嵌めにより目的の位置
に保持できうる。
管１４の上部に充填したビーズ等の離散物２０を保持す
るのに必要な多孔性を有する。支持部材１８は、化学的
に不活性な合成樹脂、好ましくは、フルオロカーボン、
から作られる。例えば、反応管目の内径よりも僅かに大
きい円板を得るように １４−ゲージ針によって切断し
たポリテトラフルオロエチレンから、支持部材１８を作
れる。この円板を反応管Ｈに押し入れることができ、そ
れによりもたらされているプレス嵌めにより目的の位置
に保持できうる。
有用な支持部材１８を、「ジテックス（Ｚ ｒＴＥＸ）
」なる商標で市販されている合成樹脂材料から作ること
ができる。この材料は、特別微細、微細および中微細等
の異なる多孔性のものが、ノートンケムブラスト（Ｎｏ
ｒｔｏｎ Ｃｈｅｍｐ！ａｓｔ） にュージャージー
州 ウェーン １５０デーロード）を含む多くの供給者
により入手できる。これら総ての異なる多孔性の材料は
、本発明を構成する連続フロー反応器１０に十分に使用
できる。
」なる商標で市販されている合成樹脂材料から作ること
ができる。この材料は、特別微細、微細および中微細等
の異なる多孔性のものが、ノートンケムブラスト（Ｎｏ
ｒｔｏｎ Ｃｈｅｍｐ！ａｓｔ） にュージャージー
州 ウェーン １５０デーロード）を含む多くの供給者
により入手できる。これら総ての異なる多孔性の材料は
、本発明を構成する連続フロー反応器１０に十分に使用
できる。
反応管１４に、離散物２０を適当に充填する。
好ましくは、離散物を多孔性シリカ等の材料から作る。
離散物２０は、不定形または球形でありうる。不定形で
多孔性形状の適切な離散物２Ｇを、エレクトロンーヌク
レオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）
にュージャージー州、 フェアフィールド ３６８バ
サイツクアベヌユー）から得ることができる。
多孔性形状の適切な離散物２Ｇを、エレクトロンーヌク
レオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）
にュージャージー州、 フェアフィールド ３６８バ
サイツクアベヌユー）から得ることができる。
好ましい、不定形の離散物２０は、１２０〜２００のメ
ツシュサイズで、はぼ３７９オングストロームの孔寸法
を有する。これらの規格に合致するシリカ充填材は、ミ
リボア社のウォーターズ クロマトグラフィ一部門（マ
サチューセッツカイ、ミリホールド３４マプルストリー
ト）よりＧＣポラシルズＢおよびＣとして入手できる。
ツシュサイズで、はぼ３７９オングストロームの孔寸法
を有する。これらの規格に合致するシリカ充填材は、ミ
リボア社のウォーターズ クロマトグラフィ一部門（マ
サチューセッツカイ、ミリホールド３４マプルストリー
ト）よりＧＣポラシルズＢおよびＣとして入手できる。
「ウォーターズ・ソースブック・フォア・クロマトグラ
フィー・カラムズ・サブライズ（Ｗａｔｅｒｓ ５ｏｕ
ｒｃｅｂｏｏｋ ＩｏｒＣｈｒｏｍａｔｏ（ｒａｐｈｙ
Ｃｏｌｕｍｎｓ ａｎｄ ５ｕｐｐｌｉｅｓ） Ｊ
（１９８６年）を参照。
フィー・カラムズ・サブライズ（Ｗａｔｅｒｓ ５ｏｕ
ｒｃｅｂｏｏｋ ＩｏｒＣｈｒｏｍａｔｏ（ｒａｐｈｙ
Ｃｏｌｕｍｎｓ ａｎｄ ５ｕｐｐｌｉｅｓ） Ｊ
（１９８６年）を参照。
約１００μ〜３００μの直径の球形離散物２０が好まし
い。反応室Ｈに充填される際、各球形物は、流体が実質
的に非直線の経路に沿って流れ、かつ、閉じ込めなしで
排出されることを確保する空間を与える。非直線のフロ
ー経路の用意は、複数の異なった寸法の球形物からなる
充填材の使用によって更に促進される。例えば１００μ
〜 ３００μの範囲の異なった直径の球形粒子の混合物
が適当である。
い。反応室Ｈに充填される際、各球形物は、流体が実質
的に非直線の経路に沿って流れ、かつ、閉じ込めなしで
排出されることを確保する空間を与える。非直線のフロ
ー経路の用意は、複数の異なった寸法の球形物からなる
充填材の使用によって更に促進される。例えば１００μ
〜 ３００μの範囲の異なった直径の球形粒子の混合物
が適当である。
オクタデシルシリカおよびオクチルシリカ等のシリカ誘
導体も離散物２０に使用でき、特定のペプチドまたは蛋
白質の配列決定に好ましく使用できる。逆相高速液体ク
ロマトグラフィー用の日常的に入手できるその他の種々
のシリカ誘導体を使用できる。前記誘導体は、本発明の
反応器に使用するために特別に調製されるか、製造され
るかまたは購入されうる。シリカ誘導体の調製のための
出発材料として、ウォーターズ ＧＣポラシルズＢおよ
びＣ並びにウォーターズ ＧＣボンダパックＣ１Ｂ材が
用いられる。
導体も離散物２０に使用でき、特定のペプチドまたは蛋
白質の配列決定に好ましく使用できる。逆相高速液体ク
ロマトグラフィー用の日常的に入手できるその他の種々
のシリカ誘導体を使用できる。前記誘導体は、本発明の
反応器に使用するために特別に調製されるか、製造され
るかまたは購入されうる。シリカ誘導体の調製のための
出発材料として、ウォーターズ ＧＣポラシルズＢおよ
びＣ並びにウォーターズ ＧＣボンダパックＣ１Ｂ材が
用いられる。
離散物２０を、配列を決定されるべきペプチド２２で被
覆できる。例えば、離散物２Ｇの１ミリグラムに対して
ペプチド２２の１マイクログラムを与えることができる
。特殊な場合、 ５〜１０ミリグラムの離散物２０に
Ｉ〜３マイクログラムのクジラ精子のアポミオグロビン
を加える場合がある。
覆できる。例えば、離散物２Ｇの１ミリグラムに対して
ペプチド２２の１マイクログラムを与えることができる
。特殊な場合、 ５〜１０ミリグラムの離散物２０に
Ｉ〜３マイクログラムのクジラ精子のアポミオグロビン
を加える場合がある。
試料の最少量は、アミノ酸残基の純度、分子の大きさお
よび目的とされる数に依存し、０．１〜 ｌＯピコモル
程度の低さであることができる。１０〜２０ ミリグラ
ムの離散物２０が、Ｇ、１〜１０．ｆｌｕｌコピルの範
囲の試料量を保持するのに、しばしば、適している。し
かし、このような離散物の必要とされる量は、特定の応
用に対してＩＯ倍程度まで変化できる。
よび目的とされる数に依存し、０．１〜 ｌＯピコモル
程度の低さであることができる。１０〜２０ ミリグラ
ムの離散物２０が、Ｇ、１〜１０．ｆｌｕｌコピルの範
囲の試料量を保持するのに、しばしば、適している。し
かし、このような離散物の必要とされる量は、特定の応
用に対してＩＯ倍程度まで変化できる。
また、離散物およびペプチド双方に親和性を有する、ポ
リブレン等の、第一被覆材２４（第３図参照）を、ペプ
チド２２を適用する前に離散物２０に被覆できる。ポリ
ブレン被覆材は、多孔性離散物２Ｇが使用されるとき、
特に、適している。
リブレン等の、第一被覆材２４（第３図参照）を、ペプ
チド２２を適用する前に離散物２０に被覆できる。ポリ
ブレン被覆材は、多孔性離散物２Ｇが使用されるとき、
特に、適している。
好ましくは、１ミリグラムの離散物２０当たり少なくと
も１ミリグラムのポリプレンを適用する。
も１ミリグラムのポリプレンを適用する。
しかし、ポリプレンの量を、この量の上下約５０％まで
変化できる。− 長さ３ ｃｍであり、かつ０．５〜１．０ ｃｍの粒千
床（５〜ＩＱ ｍｇのシリカ）を備えた反応管１４中に
、に充填される、５〜１０ ｍｇの離散物２Ｇにポリブ
レンを適用するとき、１００ ｍｇ／ｍｌポリブレン約
５マイクロリットルの量を反応管１４に適用でき、そう
すると、はぼ０．５〜１．０ ｃｍの高さまでの離散物
２０の適切な充填となる。反応管口の外にある原体ベー
スの離散物２０に適用するとき、離散物２０の全表面を
覆って離散物２０を濡らすに足る量の１００ ｍｒ／ｍ
ｌのポリブレンを適用する。ｔｏ ｍ（のシリカに対し
て、約３００ｍｇ／ｍｌのポリブレンの溶液を使用でき
る。次いで、離散物２Ｇを真空デシケータ−中で乾燥す
る。
変化できる。− 長さ３ ｃｍであり、かつ０．５〜１．０ ｃｍの粒千
床（５〜ＩＱ ｍｇのシリカ）を備えた反応管１４中に
、に充填される、５〜１０ ｍｇの離散物２Ｇにポリブ
レンを適用するとき、１００ ｍｇ／ｍｌポリブレン約
５マイクロリットルの量を反応管１４に適用でき、そう
すると、はぼ０．５〜１．０ ｃｍの高さまでの離散物
２０の適切な充填となる。反応管口の外にある原体ベー
スの離散物２０に適用するとき、離散物２０の全表面を
覆って離散物２０を濡らすに足る量の１００ ｍｒ／ｍ
ｌのポリブレンを適用する。ｔｏ ｍ（のシリカに対し
て、約３００ｍｇ／ｍｌのポリブレンの溶液を使用でき
る。次いで、離散物２Ｇを真空デシケータ−中で乾燥す
る。
本発明の別の実施態様において、閉じ部材２６を、管１
２の端部に近い位置で反応管１４中に配置する（第４図
参照）。閉じ部材２６を、支持部材１８のそれと同様な
方法で構成できる。閉じ部材２６は、離散物２Ｇを閉じ
込めるために反応管１４の上部を閉じる。
２の端部に近い位置で反応管１４中に配置する（第４図
参照）。閉じ部材２６を、支持部材１８のそれと同様な
方法で構成できる。閉じ部材２６は、離散物２Ｇを閉じ
込めるために反応管１４の上部を閉じる。
連続フロー反応器１０を、反応性流体、例えば、Ｎ−末
端配列決定についてはエドマジ試薬を、または、Ｃ−末
端配列決定についてはスターク試薬、を導入するために
、管１２により、装置（シークエネーター）に連結する
。
端配列決定についてはエドマジ試薬を、または、Ｃ−末
端配列決定についてはスターク試薬、を導入するために
、管１２により、装置（シークエネーター）に連結する
。
前記の連続フロー反応器ｌＧは特定の重要な利点を有す
る。これらの利点は次の通りである＝（１）高価でなく
、使い捨てでき、組み立てに簡単、そして、シークエネ
ーターに取り付けかつ取り外しが容易であること。これ
らの特徴により、一連の反応器に予めペプチド被覆離散
物を装入しておき、必要なときにシークエネーターに連
結するようにできる。
る。これらの利点は次の通りである＝（１）高価でなく
、使い捨てでき、組み立てに簡単、そして、シークエネ
ーターに取り付けかつ取り外しが容易であること。これ
らの特徴により、一連の反応器に予めペプチド被覆離散
物を装入しておき、必要なときにシークエネーターに連
結するようにできる。
（２）物質が蓄積する可能性のある場合、流動渋滞部分
、すなわち、流体でフラッジされない部分、がほとんど
ない。実質的に、蒸気および流体に対する耐漏シールが
、反応器の長さ全体に与えられる。これらの特徴により
、副産物または配列決定されるペプチドから分離される
次のアミノ酸の蓄積が可及的に少なくされ、それ故、ペ
プチドから次のアミノ酸のクロマトグラム同定を妨害す
るバックグラウンドが最小化される。
、すなわち、流体でフラッジされない部分、がほとんど
ない。実質的に、蒸気および流体に対する耐漏シールが
、反応器の長さ全体に与えられる。これらの特徴により
、副産物または配列決定されるペプチドから分離される
次のアミノ酸の蓄積が可及的に少なくされ、それ故、ペ
プチドから次のアミノ酸のクロマトグラム同定を妨害す
るバックグラウンドが最小化される。
（３）アミノ酸や副産物を捕捉し、蓄積しうる表面は、
あったとしてもほとんどない。もしそのように捕捉され
蓄積されたアミノ酸や副産物があるとすれば、それらは
、後になって７０−流中に浸出して戻され、そして次の
ペプチドからのアミノ酸誘導体の単離においてパ゛ツク
グラウンド信号を発生するであろう。
あったとしてもほとんどない。もしそのように捕捉され
蓄積されたアミノ酸や副産物があるとすれば、それらは
、後になって７０−流中に浸出して戻され、そして次の
ペプチドからのアミノ酸誘導体の単離においてパ゛ツク
グラウンド信号を発生するであろう。
（４）逆相高速液体クロマトグラフィーに使用されると
同様な方法で、反応管１４に配置された離散物２０を試
料濃縮器として使用できる。連続フロー反応器１０は、
高速液体クロマトグラフィー法およびエドマン・スター
ク法を応用できる。
同様な方法で、反応管１４に配置された離散物２０を試
料濃縮器として使用できる。連続フロー反応器１０は、
高速液体クロマトグラフィー法およびエドマン・スター
ク法を応用できる。
連続７０−反応器１Ｇ中の離散物２０は、現存のカート
リッジ法の物質移動特性より明らかに優れた良好な物質
移動特性を与える。
リッジ法の物質移動特性より明らかに優れた良好な物質
移動特性を与える。
第５図は、ホーケ氏等の前述の文献に示されているカー
トリッジ室と本発明の連続７０−反応器１０との間にお
ける、クジラ精子のアポミオグロビンを使用することに
よって得られた配列決定の結果の比較を与えるクロマト
グラムを示す。特に、第５図は、循環１〜循環４で得ら
れた配列決定の結果、および、循環７．９、１０そして
１２で得られた配列決定の結果を示す。
トリッジ室と本発明の連続７０−反応器１０との間にお
ける、クジラ精子のアポミオグロビンを使用することに
よって得られた配列決定の結果の比較を与えるクロマト
グラムを示す。特に、第５図は、循環１〜循環４で得ら
れた配列決定の結果、および、循環７．９、１０そして
１２で得られた配列決定の結果を示す。
第５図の上のパネルＡ−Ｈは、２００ ピコモルのクジ
ラ精子アポミオグロビンの配列決定の選択されたエドマ
ン減成循環を示す。試料を、上記したホーケ氏等（ｎｇ
ｓ年）による原稿に記載されているようなポリテトラフ
ルオロエチレンから作られたカートリッジ反応室を使用
して配列決定をした。試料を、カートリッジ反応室中の
グラスファイバー円板に適用できるようになる前に、ポ
リブレン（ｌ ｔａｇ ）をグラスファイバー円板に被
覆し、この円板をエドマン法の２循環にわたって予備循
環することが必要であった。エドマン法の１循環（ｌア
ミノ酸誘導体の除去）に必要な時間が約４５分なので、
予備循環することが分析時間に９０分加わることになる
。
ラ精子アポミオグロビンの配列決定の選択されたエドマ
ン減成循環を示す。試料を、上記したホーケ氏等（ｎｇ
ｓ年）による原稿に記載されているようなポリテトラフ
ルオロエチレンから作られたカートリッジ反応室を使用
して配列決定をした。試料を、カートリッジ反応室中の
グラスファイバー円板に適用できるようになる前に、ポ
リブレン（ｌ ｔａｇ ）をグラスファイバー円板に被
覆し、この円板をエドマン法の２循環にわたって予備循
環することが必要であった。エドマン法の１循環（ｌア
ミノ酸誘導体の除去）に必要な時間が約４５分なので、
予備循環することが分析時間に９０分加わることになる
。
カートリッジ反応室から得られたアミノ酸誘導体を、前
掲のホーケ氏等の文献に記載されている方法と同様な方
法により逆相高速液体クロマトグラフイーによって分析
した。
掲のホーケ氏等の文献に記載されている方法と同様な方
法により逆相高速液体クロマトグラフイーによって分析
した。
第５図の下のパネルＡ′〜Ｈ′は、本発明に記載した連
続フロー反応器１０を使用するクジラ精子のアポミオグ
ロビンの８０ ピコモルの運転から得られたクロマトグ
ラムである。連続フロー反応器１０を、従来技術のカー
トリッジ反応室のための上記と同じ配列決定装置に連結
し、そして、同じ希釈設定値（ａＬｔｅｎｕａｊｉｏｎ
５ｅｔｔｉＢ）で同一の方法で分析する。
続フロー反応器１０を使用するクジラ精子のアポミオグ
ロビンの８０ ピコモルの運転から得られたクロマトグ
ラムである。連続フロー反応器１０を、従来技術のカー
トリッジ反応室のための上記と同じ配列決定装置に連結
し、そして、同じ希釈設定値（ａＬｔｅｎｕａｊｉｏｎ
５ｅｔｔｉＢ）で同一の方法で分析する。
第５図のパネルで、ＤＥＡおよびＤＰＴＵと標識された
スケール外の大ピークが、エドマン法に観察される通常
のバックグラウンドピークである。
スケール外の大ピークが、エドマン法に観察される通常
のバックグラウンドピークである。
ＤＥＡピークはジエチルアミン（Ｄ Ｅ Ａ）のフェニ
ルチオカルバミル誘導体である。ＤＥＡは、エドマン法
に塩基として使用されるトリエチルアミン（Ｔ Ｅ Ａ
）の痕跡量の汚染物である。ＤＰＴＵピークはジフェニ
ルチオウレアであり、フェニルインチオシアナート（Ｐ
Ｉ ＴＣ）とアニリンとの反応から形成される。アニ
リンは今度は、ＰＩＴＣの塩基触媒分解より形成される
。
ルチオカルバミル誘導体である。ＤＥＡは、エドマン法
に塩基として使用されるトリエチルアミン（Ｔ Ｅ Ａ
）の痕跡量の汚染物である。ＤＰＴＵピークはジフェニ
ルチオウレアであり、フェニルインチオシアナート（Ｐ
Ｉ ＴＣ）とアニリンとの反応から形成される。アニ
リンは今度は、ＰＩＴＣの塩基触媒分解より形成される
。
前節で記載したピークと多くのより小さな不同定のピー
クは、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘
導体の同定を妨害するバックグラウンドノイズを引き起
こす。各循環において、単一文字で標識したピークは、
正しい構成分、すなわち、■−バリン、Ｌ−ロイシン、
Ｓ−セリン（Ｓ’−セリンの分解生成物）、Ｅ−グルタ
ミン酸、Ｗ−トリプトファン、そして、Ｈ−ヒスチジン
、に相当する。ピーク標識＋＋ Ｓｔ ｄｌ＋は、国際
標準品（アミノイソ酪酸のＰＴＨ誘導体）である。
クは、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘
導体の同定を妨害するバックグラウンドノイズを引き起
こす。各循環において、単一文字で標識したピークは、
正しい構成分、すなわち、■−バリン、Ｌ−ロイシン、
Ｓ−セリン（Ｓ’−セリンの分解生成物）、Ｅ−グルタ
ミン酸、Ｗ−トリプトファン、そして、Ｈ−ヒスチジン
、に相当する。ピーク標識＋＋ Ｓｔ ｄｌ＋は、国際
標準品（アミノイソ酪酸のＰＴＨ誘導体）である。
パネル中でカッコ内に標識したピークは、前の循環から
繰り越してきた信号である。クロマトグラム上のこの現
象は、通常のことである。
繰り越してきた信号である。クロマトグラム上のこの現
象は、通常のことである。
°たとえ５０％未満の量のクジラ精子アポミオグロビン
が連続フロー反応器ｌＯで配列決定されても、カートリ
ッジ反応室で得られる結果と比較して、適切な感度であ
る。これは、例えば、パネルＡとＡ’のバリン（Ｖ）の
信号またはパネルＢとＢ′のロイシン（Ｌ）を比較する
ことによって理解される。本発明の連続フロー反応器ｌ
Ｏによって与えられる実質的な感度以上に、連続フロー
反応器１０によって与えられる増加した信号対ノイズ比
（Ｓ／Ｎ比）の改良もある。この改良された信号対ノイ
ズ比を、例えば、パネルＡとＡ′のＤＥＡ、Ｖ、および
ＤＰＴＵについての信号の大きさの関係を比較すること
によって、直接観察できる。パネルＡにおけるＤＥＡお
よびＤＰＴＵについての信号の大きさは、これらはバッ
クグラウンドノイズ信号を引き起こすが、必要とされる
構成分のＶについての大きさよりも大きい。この信号の
大きさの関係は、連続フロー反応器１０を使用する結果
を示す、パネルＡ″の場合逆である。このような改良さ
れた信号対ノイズ比が総てのパネルにおいて繰り返し示
されている。
が連続フロー反応器ｌＯで配列決定されても、カートリ
ッジ反応室で得られる結果と比較して、適切な感度であ
る。これは、例えば、パネルＡとＡ’のバリン（Ｖ）の
信号またはパネルＢとＢ′のロイシン（Ｌ）を比較する
ことによって理解される。本発明の連続フロー反応器ｌ
Ｏによって与えられる実質的な感度以上に、連続フロー
反応器１０によって与えられる増加した信号対ノイズ比
（Ｓ／Ｎ比）の改良もある。この改良された信号対ノイ
ズ比を、例えば、パネルＡとＡ′のＤＥＡ、Ｖ、および
ＤＰＴＵについての信号の大きさの関係を比較すること
によって、直接観察できる。パネルＡにおけるＤＥＡお
よびＤＰＴＵについての信号の大きさは、これらはバッ
クグラウンドノイズ信号を引き起こすが、必要とされる
構成分のＶについての大きさよりも大きい。この信号の
大きさの関係は、連続フロー反応器１０を使用する結果
を示す、パネルＡ″の場合逆である。このような改良さ
れた信号対ノイズ比が総てのパネルにおいて繰り返し示
されている。
本発明の連続フロー反応器１０は、少ない量の試料を配
列決定する配列決定装置の能力を大幅に改良した。更に
、ポリプレンの付加後、試料を直接分析した。予備循環
を必要としなかった。これは、試料の分析を開始できる
前の必要な時間の節約を意味する。
列決定する配列決定装置の能力を大幅に改良した。更に
、ポリプレンの付加後、試料を直接分析した。予備循環
を必要としなかった。これは、試料の分析を開始できる
前の必要な時間の節約を意味する。
本発明の前記の検討および関連する説明は、主に、本発
明の好ましい実施態様と応用に関する。
明の好ましい実施態様と応用に関する。
しかし、本明細書中に記載された概念の実際の遂行にお
いて、多くの変更と修正が当業者に明らかであり、特許
請求の範囲により定められた本発明の範囲から逸脱しな
い限り、このような変更と修正がなされうると思考され
る。
いて、多くの変更と修正が当業者に明らかであり、特許
請求の範囲により定められた本発明の範囲から逸脱しな
い限り、このような変更と修正がなされうると思考され
る。
第１図は、本発明の１実施態様を構成する連続フロー反
応器の断面の正面図である。 第２図は、第１図に示した連続フロー反応器に使用され
る１被覆しｔ；離散物の平面の断面図である。 第３図は、第１図に示した連続フロー反応器に使用され
る２被覆した離散物、例えば、ガラスピーズ、の平面の
断面図である。 ８４図は、本発明の別の実施態様を構成する連続７０−
反応器の断面の正面図である。 第５図は、本発明の連続フロー反応器および従来のカー
トリッジ反応室を使用して得られたクロマドグラムの比
較である。 図中、１０ ・・・連続フロー反応器；１２、１６ ・
・・管、１４ ・・・反応管；１８ ・・・支持部材
；２０ ・・・離散物；２２ ・・・ペプチド；２４
・・・第一被覆材；および２６ ・・−・閉じ部材
である。 昭和６２年特許願第１９２４９３号 ２１発明の名称 ベプチドシークエネーター用連続フロー反応器３、補正
をする者
応器の断面の正面図である。 第２図は、第１図に示した連続フロー反応器に使用され
る１被覆しｔ；離散物の平面の断面図である。 第３図は、第１図に示した連続フロー反応器に使用され
る２被覆した離散物、例えば、ガラスピーズ、の平面の
断面図である。 ８４図は、本発明の別の実施態様を構成する連続７０−
反応器の断面の正面図である。 第５図は、本発明の連続フロー反応器および従来のカー
トリッジ反応室を使用して得られたクロマドグラムの比
較である。 図中、１０ ・・・連続フロー反応器；１２、１６ ・
・・管、１４ ・・・反応管；１８ ・・・支持部材
；２０ ・・・離散物；２２ ・・・ペプチド；２４
・・・第一被覆材；および２６ ・・−・閉じ部材
である。 昭和６２年特許願第１９２４９３号 ２１発明の名称 ベプチドシークエネーター用連続フロー反応器３、補正
をする者
Claims (8)
- （１）反応性流体および溶媒を、ペプチドシークエネー
ターからペプチド被覆離散物で充填された反応室内へ通
過させるための第一の管と、反応室から溶媒および反応
生成物を除去するための第二の管とを含む連続フロー反
応器であって、前記反応室が （Ａ）柔軟な、化学的に不活性な管から形成される反応
室； （Ｂ）シークエネーターに反応室を連結するための第一
および第二の柔軟な、化学的に不活性の管からなり；そ
して （Ｃ）前記反応室の管ならびに前記第一連結管および第
二連結管の内側と外側の直径が、管の端部をもう一つの
管の端部に挿入することにより二つの耐漏締まり嵌め接
続部を与えるような寸法であり、前記耐漏締まり嵌め接
続部の一つが前記第一の管と前記反応室の間で与えられ
、かつ、他の接続部が前記第二の管と前記反応室の間で
与えられる ことを特徴とする前記連続フロー反応器。 - （２）反応室管、ならびに第一の連結管および第二の連
結管の各々をフルオロカーボンから形成する特許請求の
範囲第１項記載の連続フロー反応器。 - （３）反応室管、ならびに第一の連結管および第二の連
結管の各々をポリテトラフルオロエチレンから形成する
特許請求の範囲第１項記載の連続フロー反応器。 - （４）反応室に充填する離散ペプチド被覆物がペプチド
被覆多孔性シリカビーズを包含する特許請求の範囲第１
項記載の連続フロー反応器。 - （５）前記離散物がペプチド被覆多孔性シリカビーズで
ある特許請求の範囲第４項記載の連続フロー反応器。 - （６）反応室管が該反応室を充填する離散物のための多
孔性の支持手段を備えている特許請求の範囲第１項記載
の連続フロー反応器。 - （７）前記反応室管ならびに前記第一の連結管および第
二の連結管の内側と外側の直径が、前記第一の連結管お
よび第二の連結管を反応室管の内側に締まり嵌めするよ
うな寸法である特許請求の範囲第１項記載の連続フロー
反応器。 - （８）第一の連結管および反応室管の内側と外側の直径
が、第一の連結管を反応室の内側に締まり嵌めするよう
な寸法であることを特徴とし、そして、反応室管および
第二の連結管の内側と外側の直径が、流動渋滞部分のな
い反応室を与えるように、反応室管を第二の連結管の内
側に締まり嵌めするような寸法であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の連続フロー反応器。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89672486A | 1986-08-15 | 1986-08-15 | |
| US896724 | 1986-08-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63184065A true JPS63184065A (ja) | 1988-07-29 |
Family
ID=25406727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62192493A Pending JPS63184065A (ja) | 1986-08-15 | 1987-07-31 | ペプチドシ−クエネ−タ−用連続フロ−反応器 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0256676B1 (ja) |
| JP (1) | JPS63184065A (ja) |
| AU (1) | AU618515B2 (ja) |
| CA (1) | CA1292606C (ja) |
| DE (1) | DE3750624T2 (ja) |
| NZ (1) | NZ221441A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU626796B2 (en) * | 1987-07-13 | 1992-08-13 | City Of Hope | Protein or peptide sequencing method and apparatus |
| WO1990000932A1 (fr) * | 1988-07-25 | 1990-02-08 | Spetsialnoe Konstruktorskoe Bjuro Biologicheskogo Priborostroenia Akademii Nauk Sssr | Reacteur pour synthese en phase solide de biopolymeres |
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