JPS63190832A - 抗菌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童束よ五五里公１ 本発明は、新規な抗菌剤、より詳しくはアポリポタンパ
ク質Ａ−Ｉを含有するリポタンパク質を有効成分とする
抗菌剤に関する。

従来の技術 近年、生体防御能が低下乃至障害された個体（ｃｏｍｐ
ｒｏｍｉｓｅｄ　ｈｏｓｔ）における易感染性の問題が
着目され、殊に該個体にそれまで無害であった病原体が
病原性を発揮して惹起される、いわゆる日和見感染症（
ＯｐｐＯｒｔｔｌｎｉＳｔｉＣ１ｎｆｅｃｔｉｏｎ或い
はｔｅｒｍｉｎａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）が臨床分野
において重要な問題となってきている。該日和見感染症
の病原体（起炎菌）については、臨床細菌学等の分野で
の研究の結果、表皮ブドウ球菌（３，ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｄｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
　、セラティア（３ｅｒｒａｔ　ｉａ）等のダラム陰性
桿菌、ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ、　ｔ
−！　Ｓ　Ｖ　）　、バリセラーゾースタ（Ｖ　ａｒｉ
ｃｅｌ　ｌａ　ｚｏｓｔｅｒ、　Ｖ　Ｚ　Ｖ　）　、サ
イトメガロウィルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ
、　ＣＭＶ）等のウィルス、キャンディダ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　）　、アスペルギルス（Ａｓ
ｐｃｒｃ＋１ｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）　、ノカ
ルディア（Ｎ　ｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅａ
）等の真菌、カリニ原虫（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　
ｃａｒｉｎｉ　ｉ）、トキソプラズ？　（Ｔｏｘｏｐｉ
ａｓｍａ　ｃ＋ｏｎｄｉｉ）等の原虫等でおることが明
らかにされている。しかしながら該感染症における宿主
側の研究は不充分であり、例えば好中球機構、免疫機溝
を除いて、その感染防御間溝としての血清の細菌防御能
等は未だ殆んど不明でおる。しかして、現在上記日和見
感染症の治療には、公知の各種抗生物質が用いられてい
るが、現用の抗生物質中には、上記病原菌に対して充分
な効果を秦し得るものは存在せず、宿主側の感染防御機
構の知見を考慮にいれた該日和見感染症に対する新しい
薬剤の研究開発が切望されている。

一方、血漿リポタンパク質対する研究が、種々行なわれ
ており、該リポタンパク質と免疫や癌との関連について
もいくつか報告がなされている。

即ち、１９７１年にチャン（Ｃｈａｎ）らは、超低比重
リポタンパク質（ＶＬＤＬ＞に、骨髄細胞によるコロニ
ー刺激因子の産生を抑制する作用のあることを報告して
いる。１９７６年にチサリ（Ｃｈｉｓａｒｉ）らは、リ
ポタンパク質がＴ細胞のロゼツト形成を阻害することを
、ビーバー（Ｂｉｅｂｅｒ）らはリポタンパク質がＰＨ
Ａ試験を抑制することを各々報告している。また１９７
９年に：／’＋ツクＶン（Ｈａｇｍａｎｎ）らは上記Ｖ
ＬＤＬのほか、中間型リポタンパク質（ＩＤＬ）、低比
重リポタンパク質（ＬＤＬ）が、ＥＶウィルスによるＢ
リンパ球のトランスフォーメーションを抑制すると報告
している。更に、発癌と血清コレステロール濃度の逆相
間がフラミンガム調査をはじめとするいくつかの施設で
報告されており、リンパ球を用いたインビトロの実験で
、培養中のコレステロール濃度を下げると、リンパ球膜
のコレステロール濃度は低下し、免疫異常をきたす旨の
報告もある。リポタンパク質による内皮細胞、繊維芽細
胞に対する細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘ　ｉ　ｃ　ｉ　ｔ
ｙ　）についての報告もいくつか存在している。しかる
に、リポタンパク質は勿論のこと、何らかの白酒成分が
、日和見感染症に対する抗菌活性を示す旨の報告は皆無
である。

明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、各種病原菌による感染症、殊に日和見
感染症の予防及び治療に有効な新しい抗菌剤を提供する
ことにある。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、アポリポタンパク質Ａ−工（以下［ア
ポＡ−ＩＪという）を含有するリポタンパク質を有効成
分とする抗菌剤が提供される。

本発明抗菌剤は、殊に日和見感染症の病原菌（起炎菌）
に対して優れた抗菌活性を奏するものであり、該感染症
の予防及び治療剤として有効である。特に本発明抗菌剤
は、かかる日和見感染症が高頻度に見られる抗癌剤投与
時、即ち急性白血病の化学療法や骨髄移植時等における
各種の感染症、例えばガンシダ症、クリプトコックス症
、アスペルギルス症、接合菌症、黒色真菌感染症、ウィ
ルス感染症、サイトメガロウィルス肺炎、之等の合併症
等の予防及び治療剤として有用でおる。

本発明抗菌剤の有効成分とするリポタンパク質は、アポ
タンパク質としてアポＡ−Ｉを含有することを必須とす
る。しかして上記リポタンパク質は、アポＡ−Ｉを含有
する限り特に限定されず、通常の可溶性リポタンパク質
は、いずれも本発明抗菌剤の有効成分として利用できる
。特にヒト血漿リポタンパク質は上記有効成分として好
ましいものであり、その内でも通常の方法、例えば比重
遠心法、電気泳動法、沈澱法、ゲル濾過法、イオン交換
クロマトグラフィー、免疫学的方法等及びそれらの組合
せ等によって分離される高比重リポタンパク質（ＨＤＬ
）は好ましい。かかる本発明抗菌剤有効成分として好ま
しく利用できるリポタンパク質は、比重として１．００
６〜１．２１０、好ましくは１．０６３〜’１．２１０
、ゲル濾過による分子量として１８００００〜２３００
０００、好ましくは１８００００〜３６００００を有し
ているものを包含する。

本発明有効成分としては、アポＡ−■に着目した上記免
疫学的方法、特にアポＡ−Ｉ抗体を利用したアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより（昇られるリポタンパク質
が最も好ましい。

本発明抗菌剤は、通常一般的な医薬製剤の形態で用いら
れる。該製剤はこの分野で通常使用される各種の担体、
例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面
活性剤、潤沢剤等の希釈剤おるいは賦形剤を用いて調製
される。この医薬製剤としては各種の形態が治療目的に
応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、乳剤、
散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤
、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。錠剤の形
態に成形するに際しては、担体として例えば乳糖、白糖
、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カ
ルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形
剤、水、エタ２ノール、プロパツール、単シロップ、ブ
ドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチ
ルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カ
リウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプ
ン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末
、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエ
チレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリルＦｉＡＭ
ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、
乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水
素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラ
ウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デ
ンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベント
ナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製、タルク、
ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等
の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の
剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、Ｌラチン被包錠、腸
溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層
錠とすることができる。乳剤の形態に成形するに際して
は、担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカ
オ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラ
ビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の
結合剤、ラミナランカンテン等の崩壊剤等を使用できる
。坐剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば
ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、
高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセ
ライド等を使用できる。

注射剤として調製される場合、液剤、乳剤及び懸濁剤は
殺菌され、かつ血液と等張でおるのが好ましく、これら
の形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、
エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化
イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリ
ルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステル類等を使用できる。尚、この場合等張性の溶液を
調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を
製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩
衝剤、無痛化剤等を配合してもよい。

上記各形態の本発明製剤中には、更に必要に応じて慣用
される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を配合
することができ、また他の医薬品有効成分化合物を含有
させることもできる。

本発明抗菌剤中に含有されるべき有効成分の但は、特に
限定されず広範囲から適宜選択されるが、通常蛋白量と
して全組成物中に０．０５〜５０重邑％、好ましくは０
．１〜３０重量％含有される量とするのが適当でおる。

本発明抗菌剤の投与方法は、特に制限はなく各種製剤形
態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応
じて適宜決定できる。例えば錠剤、乳剤、液剤、懸濁剤
、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注射
剤は単独でおるいはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液
と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて単独で筋
肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤は直
腸内投与される。

本発明抗菌剤の投与量は用法、患者の年齢、性別その他
の条件、疾患の程度等により適宜逗択されるが、通常有
効成分量が蛋白量として１日当り体重１ｋｇ当り約０．
１〜１００ｍｇとなる量とするのがよい。

Ｘ−思一丘 以下、本発明を更に詳しく説明するため、実験例を挙げ
る。

実験　工 この実験は、日和見感染を起こし易い疾患について、血
清中の抗菌活性を検討したものである。

■　まず、６０穴のマイクロプレートに滅菌したリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２０μＱずつ分注し、これ
に０．４５μｍのミリポアフィルタ−で滅菌濾過した被
験血清各２０μＱを加えて倍数希釈した。

■　菌液として、ブドウ球菌（Ｓ、　ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｄｉｓＨ１５５株）を、トリプトソイブイヨン培地（Ｔ
ＳＢ）中にて１２時間培養し、次いで同培地で１００倍
希釈して３時間培養後、菌数を１Ｘ　１０８ｃｆｕ　／
ｍ１１２に調整し、更に５倍濃度のカシトングルコース
培地（ｃａｓｉｔｏｎ　ｇｌｕｃｏｓｅｂｒｏｔｈ）で
１０’倍希釈し、菌数を１０’　ｃｆｕ　／鵬に再調整
したものを用いた。

■　上記■で調整した菌液５μＱを■の各ウェルに分注
しくこの時菌数は５０ｃｆｕ／ウエルとなる）、３７℃
で１２時間培養し、菌体の増殖率を観察した。

■　上記■において被験血清の何倍の倍数希釈液まで菌
体の増殖が阻止されるかを指標として、該被験血清の抗
菌作用の強さを判断した。

各種疾患患者及び健常人の血清を被験血清として得られ
た結果を下記第１表に示す。

第１表 上記第１表より、健康常人血清は、８〜２４倍希釈まで
抗菌活性を示すが、日和見感染症を起こし易い疾患、例
えば白血病、顆粒球減少症、癌等の患者血清では、１〜
６倍希釈までしか抗菌活性を示さず、生体防御機構が明
らかに低下していることが判る。

実験　２ この実験は、血清の分子量分画を行ない該血清中の抗菌
活性を示す物質の分子量を求めたものである。

■　被験血清３ｍ１２を、ウロトロゲルＡＣＡ５４を用
いて、下記条件で分画した。

カラムサイズ：　２．５ｘ　１００ｃｍ溶出液：０．３
Ｍ　　ＮａＣＱ含有２．５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，８） フラクション：２ｍ１２／チユーブ その結果、フラクションＮ０．７０及び７１に強い抗菌
活性（測定は実験１に従う）を示す物質が得られた。

この物質の分子量は、ヒト血中高比重リポタンパク質（
ＨＤＬ）に相当した。

実験　３ 実験２の結果に基づき、以下の通りヒトＨＤＬの抗菌活
性を検討した。

■　被験血清５ｍｆ２を、イオン交換クロマトグラフィ
ーＤＥ５２セルロース（ワットマン）を利用して下記条
件下に分画した。

使用樹脂重量：１０Ｃｌ（容但１８戒）溶出液：２．５
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８＞、Ｏ→１Ｍ　　Ｎ
ａＣ２グラジェント溶出 フラクション：１ｍ１２／チユーブ 各フラクシヨンの抗菌活性を実験１に準じて、測定した
結果、フラクションＮ０．２〜１３に活性が認められ、
その内特にＮｏ、１２〜１３とＮｏ、４〜６は抗菌活性
が強かった。

■　上記■で得た抗菌活性の認められるフラクション（
フラクションＮ０．１２〜１３）を、ＴＳＫ　　Ｇ３０
００ＳＷを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）によりゲルシン濾過した。その条件は、流速０．５
ｍ１２／分、３０Ｃ）ｐｓｉ　、０．５ＡｕＦｓ、０．
５ｍＧ／チューブ＝１０滴、溶出液＝０．２Ｍ　　　Ｎ
ａ２ＨＰＯｔ緩衝液（ｐＨ６，８＞でおる。

その結果、リテンションタイム２９分〜３９分に強い抗
菌活性（測定は実験１に同じ）を示す物質のフラクショ
ンが得られた。

■　上記■で得た抗菌活性物質を、ＳＤＳゲルで泳動ざ
ぜ、泳動位置を観察した（臨床検査、Ｖ。

１．２９．Ｎｏ、１１．１９８５年１）Ｉ）１４１６〜
１４２１）。

その結果、上記■の抗菌活性物質中に、アポＡ−Ｉと同
位置に泳動される物質の存在を確認し、このことからＨ
ＤＬの抗菌作用の存在が確認された。

実験　４ この実験は、リポタンパク質の抗菌活性を検討したもの
である。

■　被験血清より、超遠心法にて、各リポタンパク質分
画を分離し、それぞれＨＤＬｌＬＤＬ及びＶＬＤＬを採
取した。

■　上記ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬ（７）ｌＬぞｎを
５０ｍＭ　　ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８，０＞１衝液にて
同一濃度に調整し、０．４５μｍミリポアーフィルター
を通過させた後、各１ｍＱを小試験管に分注した。対照
（コントロール）として同緩衝液１噌を同操作により調
整した。

■　菌液として、ブドウ球菌（３，ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓＨ１５５株）を、ＴＳＢ中にて１２時間培養後、同
培地で１００倍希釈して３時間３７°Ｃで培養し、得ら
れる培養液を同培地で更に１００倍希釈したものを用い
た。これを上記■で調整した各小試験管に１０μＱずつ
添加し、菌数５×１０３ｃｆｕ　／試験管とした。

■　上記■の各試験管を、恒温槽にて３７°Ｃに保ち、
経時的に各試験管より５０μＱを採取し、顕微鏡下に菌
体数を測定して、各試験管内のリポタンパク質の抗菌活
性を調べた。

０時間の菌数を１．０（標準）として、各試料における
経時的菌数の推移を算出した結果を、下記第２表に示す
。尚、被験血清として、被験者３名より各々採取したも
のを試験した。

第２表 上記第２表より、リポタンパク質の抗菌活性の強さは、
ＨＤＬ＞ＬＤＬ＞ＶＬＤＬであることが判る。より詳し
くは、上記各リポタンパク質分画は、培養３時間後にて
、いずれも対照に比して菌体の発育をよく阻止している
が、培養９時間後において、ＶＬＤＬは菌体の発育をむ
しろ促進する結果となっている。一方、ＨＤＬは、培養
２１時間後にも、菌体の発育を良好に阻止することが明
らかである。

実験　５ 抗アポＡ−Ｉ抗体のアフィニティクロマトグラフィーに
よるリポタンパク質の精製 ■　実験３で得た抗菌活性物質分画（リテンションタイ
ム３１分、３２分及び３３分の各分画）を原料分画Ｎ３
１、Ｎ３２及びＮ３３として利用した。

各原料分画を、更に抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体結
合アフィニティ力ラム（アポカラムＡ−Ｉ：日本抗体研
究所社製、カラム容量１−）に添加し、まず０．１５Ｍ
　　ＮａＣＱ含有０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，
２＞で溶出させて、第１溶出液分画（カラム非吸着分画
）を得た。次いで同緩衝液でカラムを洗浄した後、０．
５Ｍ　　ＮａＣＱ含有１Ｍ酢酸緩衝液でカラムに吸着さ
れた分画を溶出さぜ、得られた溶出液を０．５倍ｆｆ１
（ｖ／ｖ）の３．５Ｍトリス水溶液にて中和して、第２
溶出液分画くアポＡ−Ｉ含有タンパク質）を得た。

■　上記■で用いた各原料分画、これらから得られた各
溶出分画（第１溶出液及び第２溶出液）並びに対照とし
て０．１５Ｍ　　ＮａＣＱ含有リン酸塩緩衝液（１１７
，２）（対照■）及び０．５Ｍ　　ＮａＣＱ含有１含有
１緩酢酸緩衝液十０ｍ　（ｖ／ｖ）３．５Ｍトリス塩酸
緩衝液（対照■）のそれぞれについて、実験１のマイク
ロプレート法にて抗菌活性を検討した。但しこの検討は
菌の増殖必りを（＋）、なしを（−）として判定した。

得られた結果を下記第３表に示す。

第　　３　　表 尚、各両分に含まれるタンパク質の濃度（ｍｇ／ｍ２）
を求めた結果は、下記第４表に示す通りでおる。

■　また、上記■の各分画について、之等を前記実験３
の■と同様にしてＳＤＳゲルに添加して、各々に含有さ
れるタンパク質の構成解析を行なった。

上記ＳＤＳゲル電気泳動のパターンを解析した結果、第
１溶出液には、アポＡ−Ｉの存在は認められず、第２溶
出液中にアポＡ−Ｉが検出された。

上記第３表及び第４表の結果より、第２溶出液分画は、
第１溶出液分画に比し、タンパク質濃度が低いにもかか
わらず、強い抗菌活性を示すことが明らかであり、この
ことから、アポＡ−Ｉを有する粒子（リポタンパク質）
に強い活性が認められ、このリポタンパク質が抗菌剤と
して有効であることが判った。

以下、本発明抗菌剤の製剤例を挙げる。尚、各側におい
ては有効成分として、上記実験５の■で得た第２溶出液
分画（アポＡ−Ｉ含有すポタンパク質）を用いた。

製剤例　１ 蛋白量として５重量％となるように有効成分が配合され
る以外は、通常のアミノ酸製剤及び脂肪乳剤と略同−組
成を有する注射剤をそれぞれ調製した。

製剤例　２ 蛋白量として１０重口％の有効成分が配合される以外は
、日本薬局方記載の親水軟膏と同様にして親水軟膏を調
製した。

（以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含有するリポタンパ
   ク質を有効成分とする抗菌剤。