JPS63190864A - グルタミン酸レセプタ−阻害物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 泉棗上Δに１分圧 本発明はグルタミン酸レセプター阻害作用を有する新規
化合物またはその塩に関する。

従来の技術 昆虫などの節足動物はジョロウグモ類、たとえばジョロ
ウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ）やオオジョ
Ｃ７ウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｍａｃｕｌａｔａ　）に
咬まれると麻痺状態となり、ついでクモの餌食となる。

従ってジョロウグモ類の体中には昆虫などの節足動物の
神経を麻痺させる化学物質が存在するものと考えられて
いた。

発明が解決しようとする問題点 しかしジョロウグモ類の体中に存在する昆虫などの節足
動物の神経を麻痺させる化学物質は極めて微量なため単
離は非常に困難であり、当然そのような化合物の化学構
造は知られていなかった。

問題点を解決するための手段 本発明者らはジョロウグモ類の毒腺から得られる節足動
物の神経を麻痺させる化合物の化学構造を解明しさらに
検討を行って本発明を完成した。

本発明の化合物は次式［１］で表わされる化合物または
その塩である。

Ｃ０ＮＨ。

［式中、Ｒは水素原子または基 をＡｒｇと略称する）を、ｍ、ｎはそれぞれ３または４
を、ｐは０または１を示す］ 化合物［Ｉ］の塩としては無機酸または有機酸との塩が
あげられる。無機酸塩としては塩酸塩２硫酸塩、炭酸塩
、硝酸塩などがあげられる。有機酸塩としてはギ酸塩、
酢酸塩、プロピオン酸塩、ンユウ酸塩、コハク酸塩、安
息香酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などがあげられる
。化合物［Ｉ］を構成するα−アミノ酸はＬ体またはＤ
Ｌ体であるが、Ｌ体がより好ましい。

まず本発明の化合物［＋］の製造法について説明する。

製造は抽出、精製の各工程からなる。抽出はジョロウグ
モ類の虫体、好ましくは毒腺のみを取り出したのち、抽
出溶媒を用いて行なう。虫体（好ましくは毒腺）はあら
かじめ破砕しておいたほうがよいが、抽出溶媒中で破砕
するのがより好ましい。破砕にはアトマイザ−、ホモジ
ナイザーなどが用いられるが、超音波による破砕も採用
される。抽出溶媒は水、電解質水溶液または水と均一に
混ざりうる有機溶媒と水との混合溶媒などの水性溶媒が
用いられる。電解質水溶液としては食塩水、塩化アンモ
ニウム水溶液、硫酸ナトリウム水溶液などが用いられる
。電解質水溶液は０〜１゜５％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは
０．３〜０．５％（Ｗ／Ｖ）の濃度範囲のものを用いる
。水と均一に混ざりうる有機溶媒としてはたとえばメタ
ノール、エタノール、プロパツールなどのアルコール類
、アセトニトリルなどのニトリル類、アセトンなどのケ
トン類などがあげられる。抽出溶媒として最も好ましく
はアセトニトリルと水との混合溶媒である。抽出は長時
間静置することによっても行ないうるが、通常の攪拌機
や遠心分離機などを用いて短時間で行なってもよい。抽
出後の抽出液と残渣部分との分離が容易なことから遠心
分離機を使用するのが有利である。遠心の速度は１，０
００−１００゜０００回転／分、遠心の時間は５分〜３
時間がよい。

活性成分の追跡はイセエビの歩脚の神経筋接合部のンナ
プスを用いてその興奮性ンナブス後電位（ＥＰＳＰ）を
測定することにより行うのが便利である。測定法は後述
する。測定の結果、活性成分が抽出液の方に移行してい
るのがわかる。活性成分は酢酸エチル、塩化メチレンな
どの通常の有機溶媒に転溶させようとしても実質的には
転溶されずに水層に残存する。

次に上記抽出物を精製するが、精製のまえに抽出溶媒を
除去しておくのが望ましい。抽出溶媒の除去は通常の溶
媒の除去法、すなわち減圧蒸留や凍結乾燥などが用いら
れる。精製操作としてはゲルろ過、イオン交換樹脂によ
る精製、シリカゲル分取薄層クロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィーなどか用いられるか、活性成分
が多数含まれているので高速液体クロマトグラフィーに
よる分離精製が好ましい。分離精製に使用する溶媒とし
ては抽出に用いた水性溶媒がここでもあげられる。分離
精製した活性成分、すなわち本発明の化合物［＋］は凍
結乾燥品として保存することができる。複数個得られる
化合物　［１Ｆはいずれも、シリカゲル薄層クロマトグ
ラフィー、ゲルろ過、電気泳動により単一の化合物であ
ることが確認できる。

実施例に示すとおり、ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃ
ｌａｖａｔａ）からは化合物置］としてＩ　ａ、　Ｉ　
ｂ、　Ｉ　ｃ。

Ｉｄの４種類の化合物が、オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈ
ｉｌａ　ｍａｃｕｌａｔａ）か：；Ｉｅ、［ｆ、Ｉｇの
３種類の化合物が単一品としてえられる。

化合物［＋］の化学構造はアミノ酸分析、Ｉ）（−Ｎ　
Ｍ　Ｒ，、”　ＣＮ　Ｍ　Ｒ、マススペクトル、ＩＲ。

Ｕ■などを用いて行われる。

化合物Ｉｂ、Ｉｃ、ＩｄおよびＩｇの構造はそれぞれ以
下のとおりである。

Ｃ０ＮＩ＋。

−ＮＨ［（Ｃ１ｌ、）ｍＮＨ］ｐ（Ｃ１ｌ、）ｎＮｌｌ
Ｒ［ＩコＩ　ｂ　　　　ｎ＝Ｈ，ｍ＝　３　、ｎ＝　３
　、ｐ＝　ｉまたはｎ＝Ｈ，ｍ＝３．ｎ＝４．ｐ＝ＩＩ
ｃ　　　　ｎ＝Ｈ，ｍ＝４．ｎ＝３．ｐ＝　１１　ｄ　
　　　Ｒ＝Ａｒｇ、ｍ＝　３　、ｎ＝　４　、ｐ＝　１
またはｎ　＝Ａｒｇ、ｍ＝　４　、ｎ＝　３　、ｐ＝　
１１　ｇ　　　　　Ｒ＝Ａｒｇ、ｎ＝　４　、ｐ＝　０
活性成分の検定はイセエピ歩脚の神経筋シナプスを用い
て行う。イセエピ歩脚の伸張筋を露出し、３Ｍ塩化カリ
ウム水溶液をつめたガラス管微小電極を用いて電位を測
定する。阻害物質の活性はっぎの（１）または（２）の
いずれかにより求める。

（１）伸張筋の支配神経を単一線維に分離し吸引電極に
よって電気刺激を行う。興奮性神経刺激により神経末端
よりグルタミン酸が放出されてレセプターと結合するの
でシナプス後膜に通常３〜５ｍＶの興奮性シナプス後電
位（ＥＰＳＰ）が発生する。

グルタミン酸レセプター阻害物質はこのＥＰＳＰを５０
％以上低下もしくは消失させる。

（２）グルタミン酸（ＩＭ、ｐＨ８）をガラス管微小電
極内につめ、神経筋ノナブスに近づけ、１０″９Ａ程度
の内向き電流を加えて電気泳動的に１Ｍ５度のグルタミ
ン酸を流す。これによりンナブス後膜には通常３〜５ｍ
Ｖの脱分極電位（グルタミン酸電位）が生じ、この電位
は加える電流の強さに比例する。グルタミン酸レセプタ
ー阻害物質はこのグルタミン酸電位を５０％以上低下も
しくは消失させる。

作用・効果 化合物［１］のグルタミン酸レセプター阻害作用は水洗
しても消失しない不可逆的な作用である。

このことから本発明の化合物［１］のグルタミン酸レセ
プターとの結合は既知のグルタミン酸レセプターと比較
してはるかに強いことが示される。従って本発明の化合
物を標識化することによりグルタミン酸レセプターの単
離、構造解析、局所分析どの研究に存用となると考えら
れる。またグルタミン酸が関与ずろ記憶のメカニズムや
脳神経疾轡の解明にも役立つと思われ、本化合物のｆｉ
ｌ用価値は高い。

実施例１ 日本産のジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　　ｃｌａｖａ
Ｌａ）２．５匹から得られる毒腺５個をガラス製のホモ
ジナイザーに入れ、６０％水性アセトニトリル（アセト
ニトリル・水−６０：４０Ｖ／Ｖ）ｌｄを加えて５分間
ホモジナイズした。ホモジナイズしたしのを遠心分離機
で５．０００回転／分、１０分間遠心した。遠心分離し
た上清を凍結乾燥機で凍結乾燥したのち、あらためて１
０μｇの水に溶解し、高速液体クロマトグラフィー（以
下、ＨＰ　Ｌ　Ｃと略す）でクロマトグラムを作成した
。ＨＰ　Ｌ　Ｃには東洋ソーダ製の逆相分配カラム（Ｔ
ＳＫｇｅｌ　　０ＤＳ−１２０Ｔ）を使用した。カラム
の大きさは長さ２５０　ｍｍ、内径４．６ｍｍとし、樹
脂径は５μｍのらのを使用した。カラム温度は４０°Ｃ
１溶出溶媒は０．０２％塩酸とアセトニトリルの混合溶
媒を使用し、直線勾配法によった。すなわち０．０２％
塩酸のみから溶出を開始し、１分ごとにアセトニトリル
含量を１％（Ｖ／Ｖ）づつ増加し、アセトニトリル含量
６０％（Ｖ／Ｖ）で終了した。流速は５００μｍ２／分
とした。えられたクロマトグラムは第１図に示すとおり
である。４種類の単一品かえられ、流出する順はＩａ、
　　Ｉｂ、　　１．ｃ、　　Ｉｄである。

実施例２ バブアニューギニア産のオオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉ
ｌａ　　ｍａｃｕｌａｔａ）について実施例１と全く同
様にして第２図のようなりロマトグラムをえた。

３種類の単一品が得られ、流出する順はＩｅ、［。

Ｉｇである。

実施例３ 日本産のジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　　ｃｌａｖａ
ｔａ）２００匹から得られる毒腺０．５ｇをガラス製の
ホモジナイザーに入れ、６０％水性アセトニトリル（ア
セトニトリル；水＝６０：４０Ｖ／Ｖ）Ｉ　Ｏ−を加え
て５分間ホモジナイズした。ホモジナイズしたものを遠
心分離機で１０，０００回転／分、３０分間遠心した。

遠心分離した上清を凍結乾燥機で凍結乾燥したのち、あ
らためてＩｄの水に溶解し、実施例１と同じく東洋ソー
ダ製の逆相分配カラム（ＴＳＫｇｅｌ　　０ＤＳ−１２
０Ｔ）を用いてＨＰ　Ｌ　Ｃで分離・精製した。

上記の水溶液をｌ／１０づつ、合計１０回の分離・精製
を行ない、分取した同一の化合物をそれぞれまとめてＮ
ＭＲ試料とした。カラムの大きさは長さ３００　ｍｍ、
内径７　、８　ｍｍとし、樹脂径は１０μｍのものを使
用した。カラム温度は４０°Ｃ５溶出溶媒は０．０２％
塩酸とアセトニトリルの混合溶媒を使用し、実施例Ｉと
同じく直線勾配法によった。　流速は１．５ｄ／分とし
た。　分取後、凍結乾燥機らしくは遠心エバポレーター
で溶媒を除き、重水（Ｄ、Ｏ）中または重りメチルスル
ホキンド（ｄｏ　　ＤＭＳＯ）中でＮＭＲを測定した。

実施例４ パプアニューギニア産のオオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉ
ｌａ　　ｍａｃｕｌａｔａ）について実施例３と全く同
様にしてＮＭＲ用の試料を調製し、重水（ｐｔｏ）中ま
たは重ジメチルスルホキンド（ｄ、ＤＭＳＯ）中てＮ　
Ｍ　Ｒを測定した。

Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、ＩｇのＤｔｏ中のプロトンＮＭＲス
ペクトルは第３図に示すとおりである。

Ｉｇのり、Ｏ中およびｄ、−ＤＭＳＯ中のプロトンＮＭ
Ｒスペクトルを比較すると第４図に示すとおりとなる。

１ｇのｄａ−ＤＭＳＯ中のプロトン−ｃｏｓＹ−ＮＭＲ
スペクトルは第５図に示すとおりである。

なおＮ　Ｍ　Ｒは日本電子製ＧＸ２７０またはＧＸ４０
０、ＢＲＯＫＥＲ製ＷＨ２７０（ｅｑｕｉｐｐｅｄｗｉ
ｔｈ　　ＡＳＰＥＣＴ２０００）またはＡＭ４００（ｅ
ｑｕｉｐｐｅｄ　　ｗｉｔｈ　　ＡＳＰＥＣＴ３０００
）を用いて測定した。

日本電子製ＤＸ−３０３型の重速原子衝突質量スペクト
ル（ＦＡＢ−ＭＡＳＳ）では、ＩｇはＭ＋Ｈ”　：　ｍ
／ｚ６６５にピークが観測されるので１ｇの分子量は６
６４である。

ＩｇのＵＶスペクトルを０．０２％塩酸−アセトニトリ
ル混合液（５０：　５０　ｖ／ｖ）中で測定すると２１
０ｎｍ以下と２８０ｎｍに吸収極大をもつ。また励起波
長２８０ｎｍで蛍光波長３１５ｎｍの自然蛍光が観測さ
れる。

【図面の簡単な説明】

ジョロウグモのクロマトグラムは第１図である。 オオジョロウグモのクロマトグラムは第２図である。化
合物１ｂ、Ｉｃ、Ｉｄおよび［ｇのＤｔＯ中のプロトン
Ｎ　Ｍ　Ｒスペクトルは第３図である。　化合物１ｇの
り、Ｏ中およびｄａ−ＤＭｓｏ中のプロトンＮＭＲスペ
クトルの比較は第４図である。化合物１ｇのｄ、−ＤＭ
ＳＯ中のプＣ７）：／−ＣＯＳＹ−ＮＭＲスペクトルは
第５図である。 饗 ○ 手続補正書［方式］ 昭和６２年特許願第２３１４７号 ２、発明の名称 グルタミン酸レセプター阻害物質 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　大阪市東区道修町２丁目２７番地名称　　（２
９３）　　武田薬品工業株式会社代表者　梅本純正 （ほか１名） １代理人 東京連絡先（特許法規課）電話２７８−２２１．８・２
２１９５、補正命令の日付 図面および代理権を証明する書面 ７、補正の内容 （１）別紙のとおり、鮮明に浄書した図面全図を提出し
ます。 （２）別紙のとおり、代理権を証する書面を提出いたし
ます。 ８、添付書類の目録 （１）図面（第１図〜第５図）　　　　　　　　　　　
　　１通（２）委任状　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２通以上

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは水素原子または基 ▲数式、化学式、表等があります▼を、ｍ、ｎはそれ ぞれ３または４を、ｐは０または１を示す）で表わされ
   るグルタミン酸レセプター阻害物質またはその塩。
2. （２）Ｒが基▲数式、化学式、表等があります▼、ｎ が４、ｐが０である特許請求の範囲第（１）項に記載の
   物質。
3. （３）Ｒが基▲数式、化学式、表等があります▼、ｍ が３、ｎが４、ｐが１である特許請求の範囲第（１）項
   に記載の物質。
4. （４）Ｒが基▲数式、化学式、表等があります▼、ｍ が４、ｎが３、ｐが１である特許請求の範囲第（１）項
   に記載の物質。
5. （５）Ｒが水素原子、ｍが３、ｎが３、ｐが１である特
   許請求の範囲第（１）項に記載の物質。
6. （６）Ｒが水素原子、ｍが３、ｎが４、ｐが１である特
   許請求の範囲第（１）項に記載の物質。
7. （７）Ｒが水素原子、ｍが４、ｎが３、ｐが１である特
   許請求の範囲第（１）項に記載の物質。