JPS63196292A - Ｌ−フエニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株Info
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- JPS63196292A JPS63196292A JP62024705A JP2470587A JPS63196292A JP S63196292 A JPS63196292 A JP S63196292A JP 62024705 A JP62024705 A JP 62024705A JP 2470587 A JP2470587 A JP 2470587A JP S63196292 A JPS63196292 A JP S63196292A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、し−フェニルアラニン・アンモニアリアーゼ
（以後ＰＡＬと略称する）の大腸菌における効率良い発
現を可能とする組換え体プラスミド及び該組換え体プラ
スミドによって形質転換された大腸菌株に関する。
（以後ＰＡＬと略称する）の大腸菌における効率良い発
現を可能とする組換え体プラスミド及び該組換え体プラ
スミドによって形質転換された大腸菌株に関する。
詳しくは、外来遺伝子の大腸菌での発現を可能とする発
現ベクターにＰＡＬ構造遺伝子を遺伝子操作技術により
挿入して新たなハイブリットプラスミド（組換え体プラ
スミド）を構築するに際し、構造遺伝子発現のためのプ
ロモーターに、大腸菌トリプトファンオペロンのプロモ
ーターと大腸菌ラクトースオペロンのプロモーターの融
合プロモーター（ｔａｃプロモーター）と：大腸菌ラム
ダファージのＰＬプロモーターとを特定順序で配列した
連結プロモーターを用いることによって、より効率良い
大腸菌でのＰＡＬの発現を可能としたハイブリッドプラ
スミド及びそれにより形質転換された大腸菌株に関する
。
現ベクターにＰＡＬ構造遺伝子を遺伝子操作技術により
挿入して新たなハイブリットプラスミド（組換え体プラ
スミド）を構築するに際し、構造遺伝子発現のためのプ
ロモーターに、大腸菌トリプトファンオペロンのプロモ
ーターと大腸菌ラクトースオペロンのプロモーターの融
合プロモーター（ｔａｃプロモーター）と：大腸菌ラム
ダファージのＰＬプロモーターとを特定順序で配列した
連結プロモーターを用いることによって、より効率良い
大腸菌でのＰＡＬの発現を可能としたハイブリッドプラ
スミド及びそれにより形質転換された大腸菌株に関する
。
ＰＡＬは、Ｌ−フェニルアラニンからアンモニアが除か
れてトランス桂皮酸を生じる反応を触媒する酵素であり
、この逆反応を利用し、桂皮酸とアンモニアからし一フ
ェニルアラニンを生産するのに有用である。
れてトランス桂皮酸を生じる反応を触媒する酵素であり
、この逆反応を利用し、桂皮酸とアンモニアからし一フ
ェニルアラニンを生産するのに有用である。
このＰＡＬの生産は、従来より酵母、カビおよび植物か
らの抽出により行なわれていたが、これらＰＡＬ生産能
を有する生物のＰＡＬ生産量は僅かであり、工業的規模
での生産には問題があった。
らの抽出により行なわれていたが、これらＰＡＬ生産能
を有する生物のＰＡＬ生産量は僅かであり、工業的規模
での生産には問題があった。
そこで、ＰＡＬの大量生産を実現するための方法として
、大量培養可能な大腸菌などの微生物等にＰＡＬを遺伝
子組換え技術を用いて生産させる方法が注目されている
。
、大量培養可能な大腸菌などの微生物等にＰＡＬを遺伝
子組換え技術を用いて生産させる方法が注目されている
。
遺伝子組換え技術を用いた外来蛋白質（すなわち宿主菌
では通常生産されない蛋白質）を生産するために用いる
宿主菌としては、その生物学的特性の解析が十分になさ
れており、また病原性を持たず、簡単な組成の培地で容
易に培養可能であるという点から大腸菌が広く用いられ
ている。
では通常生産されない蛋白質）を生産するために用いる
宿主菌としては、その生物学的特性の解析が十分になさ
れており、また病原性を持たず、簡単な組成の培地で容
易に培養可能であるという点から大腸菌が広く用いられ
ている。
所望の蛋白質を大腸菌で発現させるために用いる発現ベ
クターとしては、その下流に連結される所望の外来蛋白
質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列の大腸菌内
での転写を可能とするプロモーターと、大腸菌内で複製
可能であるベクターとを基本的構成要素としたものが用
いられる。
クターとしては、その下流に連結される所望の外来蛋白
質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列の大腸菌内
での転写を可能とするプロモーターと、大腸菌内で複製
可能であるベクターとを基本的構成要素としたものが用
いられる。
このような発現ベクターのプロモーターとしては種々の
構成のものが知られており、例えば、プロモーターに、
大腸菌ラムダファージのＰＬプロモーター（以後ＰＬラ
ムダプロモーターと略称する）、大腸菌トリプトファン
オペロンのプロモーター（以下ｔｒｐプロモーターと略
称する）、大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター（
以下ｆｉａｃブロモターと略称する）、及びｔｒｐプロ
モーターとｆｌａｃプロモーターとの融合プロモーター
（以下ｔａｃプロモーターと略称する）等が広く用いら
れている。
構成のものが知られており、例えば、プロモーターに、
大腸菌ラムダファージのＰＬプロモーター（以後ＰＬラ
ムダプロモーターと略称する）、大腸菌トリプトファン
オペロンのプロモーター（以下ｔｒｐプロモーターと略
称する）、大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター（
以下ｆｉａｃブロモターと略称する）、及びｔｒｐプロ
モーターとｆｌａｃプロモーターとの融合プロモーター
（以下ｔａｃプロモーターと略称する）等が広く用いら
れている。
また、発現ベクターを用いて外来蛋白質を宿主大腸菌に
更により効率良く生産させるためには、より効率良い発
現を可能とする活性の高い新たなプロモーターの検索や
従来よりあるプロモーターの活性を向上させるための種
々の検討が必要である。
更により効率良く生産させるためには、より効率良い発
現を可能とする活性の高い新たなプロモーターの検索や
従来よりあるプロモーターの活性を向上させるための種
々の検討が必要である。
例えば、より活性の高いプロモーターを得るために、Ｍ
ａｃｋｅｎｎｅｙ、に、らは複数のプロモーターの直列
での連結を試みており［Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
Ｌｉｏｎａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ｖｏｌ ＩＩ 、
、ｐｐ３８３〜４１５．ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃ
ｅ出版、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８１） ］ 、ま
た］特開昭６０−１２６０８６公報には同様の目的のた
めのＬｒｐプロモーターもしくはｊ２ａｃプロモーター
の上流にＰＬプロモーターもしくはＰ、プロモーター（
大腸菌ラムダファージのＰ、プロモーター）等を直列に
連結した連結プロモーターが開示されている。
ａｃｋｅｎｎｅｙ、に、らは複数のプロモーターの直列
での連結を試みており［Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
Ｌｉｏｎａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ｖｏｌ ＩＩ 、
、ｐｐ３８３〜４１５．ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃ
ｅ出版、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８１） ］ 、ま
た］特開昭６０−１２６０８６公報には同様の目的のた
めのＬｒｐプロモーターもしくはｊ２ａｃプロモーター
の上流にＰＬプロモーターもしくはＰ、プロモーター（
大腸菌ラムダファージのＰ、プロモーター）等を直列に
連結した連結プロモーターが開示されている。
ところが、発現ベクターに組込むプロモーターと、発現
させようとする蛋白質との適合性については未だ十分に
解明されていない。そのため、例えば、ある種の蛋白質
の発現に対して高い活性を有するプロモーターが、他種
の蛋白質の発現に高い活性を示すかどうかを理論的に推
定することは非常に困難である。また、発現効率の向上
を目的とした連結プロモーターの作用についても不明の
点が多く、どのようなプロモーターをどのような順序で
連結するかは、発現させようとする蛋白質に応じて選択
する必要がある。
させようとする蛋白質との適合性については未だ十分に
解明されていない。そのため、例えば、ある種の蛋白質
の発現に対して高い活性を有するプロモーターが、他種
の蛋白質の発現に高い活性を示すかどうかを理論的に推
定することは非常に困難である。また、発現効率の向上
を目的とした連結プロモーターの作用についても不明の
点が多く、どのようなプロモーターをどのような順序で
連結するかは、発現させようとする蛋白質に応じて選択
する必要がある。
したがって、発現させようとする個々の蛋白質ごとによ
り効率良い発現を可能とするプロモーターの選定や開発
が必要である。
り効率良い発現を可能とするプロモーターの選定や開発
が必要である。
このような理由から、大腸菌でのＰＡＬの発現において
も、好適なプロモーターの選定や開発が急務であった。
も、好適なプロモーターの選定や開発が急務であった。
しかも、例えば先に挙げたような従来より知られている
プロモーターを使用した場合、その発現効率は必ずしも
十分に高くなく、ＰＡＬの高発現に好適なプロモーター
の開発が更に必要とされていた。
プロモーターを使用した場合、その発現効率は必ずしも
十分に高くなく、ＰＡＬの高発現に好適なプロモーター
の開発が更に必要とされていた。
本発明者は、このような観点から先に述べたＰＡＬの遺
伝子操作による大腸菌での生産において好適な発現ベク
ターを開発する上で、ＰＡＬの発現と発現ベクターに組
込むプロモーターとの組合せについて着目し、更に連結
プロモーターを用いた場合の連結されるプロモーターの
配列とＰＡＬの発現の関係について種々検討した。その
結果、発現ベクターのプロモーターに、ｔａｃプロモー
ターと、 ＰＬプロモーターとを特定された方向性と順
序をもって配列した連結プロモーターを用いることによ
り、大腸菌でのＰＡＬの高効率での発現が実現できると
の結論が得られ、本発明が完成されるに至った。
伝子操作による大腸菌での生産において好適な発現ベク
ターを開発する上で、ＰＡＬの発現と発現ベクターに組
込むプロモーターとの組合せについて着目し、更に連結
プロモーターを用いた場合の連結されるプロモーターの
配列とＰＡＬの発現の関係について種々検討した。その
結果、発現ベクターのプロモーターに、ｔａｃプロモー
ターと、 ＰＬプロモーターとを特定された方向性と順
序をもって配列した連結プロモーターを用いることによ
り、大腸菌でのＰＡＬの高効率での発現が実現できると
の結論が得られ、本発明が完成されるに至った。
本発明の目的は、遺伝子操作による大腸菌でのＰＡＬ生
産において、大腸菌でのより効率良いＰＡＬの発現を可
能とする組換え体プラスミド及び該プラスミドによって
形質転換され、ＰＡＬの大量生産に好適である大腸菌株
を提供することにある。
産において、大腸菌でのより効率良いＰＡＬの発現を可
能とする組換え体プラスミド及び該プラスミドによって
形質転換され、ＰＡＬの大量生産に好適である大腸菌株
を提供することにある。
（問題点を解決するための手段〕
上記目的は以下の本発明によって達成することができる
。
。
すなわち本発明は、
ａ）大腸菌内でａ製可能であるベクターと：ｂ）大腸菌
トリプトファンオペロンのプロモータ・−と大腸菌ラク
トースオペロンのプロモーターの融合プロモーター（ｔ
ａｃプロモーター）と、該融合プロモーター下流に連結
された大腸菌ラムダファージのＰＬプロモーターとを有
する連結プロモーターと； Ｃ）該連結プロモーター下流に挿入されたＬ−フェニル
アラニン・アンモニアリアーゼをコードするＤＮＡ配列
とを有し、 前記連結プロモーターを構成する２つのプロモーターの
方向性が同一であり、かつ前記ＰＬプロモーターが前記
ＤＮＡ配列の転写を可能とする方向性をもって前記ＤＮ
Ａ配列の上流に配列されているものであることを特徴と
する組換え体プラスミド、および該プラスミドによって
形質転換された大腸菌株である。
トリプトファンオペロンのプロモータ・−と大腸菌ラク
トースオペロンのプロモーターの融合プロモーター（ｔ
ａｃプロモーター）と、該融合プロモーター下流に連結
された大腸菌ラムダファージのＰＬプロモーターとを有
する連結プロモーターと； Ｃ）該連結プロモーター下流に挿入されたＬ−フェニル
アラニン・アンモニアリアーゼをコードするＤＮＡ配列
とを有し、 前記連結プロモーターを構成する２つのプロモーターの
方向性が同一であり、かつ前記ＰＬプロモーターが前記
ＤＮＡ配列の転写を可能とする方向性をもって前記ＤＮ
Ａ配列の上流に配列されているものであることを特徴と
する組換え体プラスミド、および該プラスミドによって
形質転換された大腸菌株である。
なお、本発明でいう「上流」、「下流」とは、ＰＡＬを
コードするＤＮＡ配列のＰＡＬの開始コドンから終了コ
ドンへ向う方向を基準として、ある部位からこの基準方
向と順方向に進んだ側を「下流」、逆方向に進んだ側を
「上流」と呼ぶ。
コードするＤＮＡ配列のＰＡＬの開始コドンから終了コ
ドンへ向う方向を基準として、ある部位からこの基準方
向と順方向に進んだ側を「下流」、逆方向に進んだ側を
「上流」と呼ぶ。
本発明のハイブリッドプラスミド（組換え体プラスミド
）に用いるベクターとしては、宿主大腸菌内で安定保持
され、かつ複製可能である、すなわち大腸菌内で有効に
機能できるプラスミド複製起点（複製オリジン）を有す
るＤＮＡ断片ならばどのようなものでもが用いることが
できる。
）に用いるベクターとしては、宿主大腸菌内で安定保持
され、かつ複製可能である、すなわち大腸菌内で有効に
機能できるプラスミド複製起点（複製オリジン）を有す
るＤＮＡ断片ならばどのようなものでもが用いることが
できる。
このベクターの複製起点としては、ｐＭＢＩ、ｐｓｃｌ
ｏｌ、 Ｃｏ１Ｅ１およびｐ１５Ａ等を用いることがで
き、なかでもプラスミドｐ８Ｒ３２２由来の複製起点は
、ｐＭＢｌ由来のもので大腸菌中ではマルチコピーであ
るのでより好適である。
ｏｌ、 Ｃｏ１Ｅ１およびｐ１５Ａ等を用いることがで
き、なかでもプラスミドｐ８Ｒ３２２由来の複製起点は
、ｐＭＢｌ由来のもので大腸菌中ではマルチコピーであ
るのでより好適である。
また、これらベクターは、宿主菌に組換え体プラスミド
を導入した際の選択マーカーとなる遺伝子を含んでいる
と便利である。
を導入した際の選択マーカーとなる遺伝子を含んでいる
と便利である。
このようなマーカー遺伝子としては、例えばプラスミド
ｐＢＲ３２２、ｐＫｃ７、ｐＭＫＩ６ 、 ｐＭＧ４１
１、ｐへｃＹｃ１８４等に由来する大腸菌でアンピシリ
ン耐性を発現可能な各種遺伝子、テトラサイクリン耐性
、カナマイシン耐性などを発現可能な各種遺伝子および
ｆ）、 ａｃＺ遺伝子などが利用できる。
ｐＢＲ３２２、ｐＫｃ７、ｐＭＫＩ６ 、 ｐＭＧ４１
１、ｐへｃＹｃ１８４等に由来する大腸菌でアンピシリ
ン耐性を発現可能な各種遺伝子、テトラサイクリン耐性
、カナマイシン耐性などを発現可能な各種遺伝子および
ｆ）、 ａｃＺ遺伝子などが利用できる。
本発明のハイブリッドプラスミドに組込む連結プロモー
ターは、ｔａｃプロモーター（ｔ、ｒｐプロモーターと
Ｍａｃプロモーターとの融合プロモーター）と、該融合
プロモーター下流に連結された大腸菌ラムダファージの
ＰＬプロモーターとを有して構成される。 ′ この連結プロモーターに用いる ｔａｃプロモーターは
、Ｅ、Ａｍａｎｎらにより報告された方法［Ｇｅｎｅ、
２５．１６７−１７Ｊ（１９８３）］により、ｔｒｐプ
ロモーターとｌａｃプロモーターより構築することがで
きる。また、例えばＪ、Ｂｉｒｏｓｉｕｓらによって構
築されたベクターｐＫに２３３−３ （ファルマシア社
製）などのような、ｔａｃプロモーターを有する適当な
ベクターから切出して用いてもよい。
ターは、ｔａｃプロモーター（ｔ、ｒｐプロモーターと
Ｍａｃプロモーターとの融合プロモーター）と、該融合
プロモーター下流に連結された大腸菌ラムダファージの
ＰＬプロモーターとを有して構成される。 ′ この連結プロモーターに用いる ｔａｃプロモーターは
、Ｅ、Ａｍａｎｎらにより報告された方法［Ｇｅｎｅ、
２５．１６７−１７Ｊ（１９８３）］により、ｔｒｐプ
ロモーターとｌａｃプロモーターより構築することがで
きる。また、例えばＪ、Ｂｉｒｏｓｉｕｓらによって構
築されたベクターｐＫに２３３−３ （ファルマシア社
製）などのような、ｔａｃプロモーターを有する適当な
ベクターから切出して用いてもよい。
なお、このｔａｃプロモーターはＳＯ［シャインーダル
ガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ） ］配列を含む
ことが好ましい。
ガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ） ］配列を含む
ことが好ましい。
Ｐ、ラムダプロモーターとしては、例えば大腸菌ラムダ
ファージＯＮ＾のＨｉｎｄ ｍ−ＢａａｌｌＩ断片に含
まれているものなどが利用でき、該ラムダファージＤＮ
Ａから制限酵素ｔｌｉｎｄ ｍ及びＢａｍＨＩを用いて
直接切出して、あるいはこのような断片を含む例えば５
ｈｉＩｎａｔａｋｅらの方法［ＮａＬｕｒｅ、 ２９２
゜１２８、 （１９８］） ］で利用しているような適
当なプラスミドから切出して用いることができる。
ファージＯＮ＾のＨｉｎｄ ｍ−ＢａａｌｌＩ断片に含
まれているものなどが利用でき、該ラムダファージＤＮ
Ａから制限酵素ｔｌｉｎｄ ｍ及びＢａｍＨＩを用いて
直接切出して、あるいはこのような断片を含む例えば５
ｈｉＩｎａｔａｋｅらの方法［ＮａＬｕｒｅ、 ２９２
゜１２８、 （１９８］） ］で利用しているような適
当なプラスミドから切出して用いることができる。
これら連結プロモーターを構成する各プロモーターは、
ハイブリッドプラスミドに組み込まれる際に、前述した
ように、同一の方向性で配列される。
ハイブリッドプラスミドに組み込まれる際に、前述した
ように、同一の方向性で配列される。
なお、この「同一の方向性Ｊとは、プロモーターに特徴
的なＲＮＡポリメラーゼ認識部位とＲＮＡポリメラーゼ
結合部位の配列方向が、 ｔａｃプロモーターとＰＬラ
ムダプロモーターとで同一であることを言う。
的なＲＮＡポリメラーゼ認識部位とＲＮＡポリメラーゼ
結合部位の配列方向が、 ｔａｃプロモーターとＰＬラ
ムダプロモーターとで同一であることを言う。
更に、連結プロモーターのｔａｃプロモーター下流に配
置されるＰＬラムダプロモーターは、その下流側に位置
するＤＮＡ配列を転写させるのに必要な活性を有する方
向、すなわちＰＬラムダプロモーターのＲＮＡポリメラ
ーゼ結合部位がＲＮＡポリメラーゼ認識部位の下流に位
置する方向性をもって配列され、 陥プロモーターのＳ
Ｄ配列を含む。
置されるＰＬラムダプロモーターは、その下流側に位置
するＤＮＡ配列を転写させるのに必要な活性を有する方
向、すなわちＰＬラムダプロモーターのＲＮＡポリメラ
ーゼ結合部位がＲＮＡポリメラーゼ認識部位の下流に位
置する方向性をもって配列され、 陥プロモーターのＳ
Ｄ配列を含む。
本発明の組換え体プラスミドにおいて、上記構成の連結
プロモーターの下流側に組込むＰＡＬをコードするＤＮ
Ａ配列としては、例えば、本発明者らによってロドスボ
リジウム属に属する酵母から既にクローン化されている
特願昭６１−２１５８６４号公報に記載されたＰＡＬを
コードするＤＮＡ配列（開始コドンおよび終了コドンを
含む）などが利用でき、またＰＡＬ生産能を有する各種
植物、動物、微生物等からクローン化したものの利用も
可能である。
プロモーターの下流側に組込むＰＡＬをコードするＤＮ
Ａ配列としては、例えば、本発明者らによってロドスボ
リジウム属に属する酵母から既にクローン化されている
特願昭６１−２１５８６４号公報に記載されたＰＡＬを
コードするＤＮＡ配列（開始コドンおよび終了コドンを
含む）などが利用でき、またＰＡＬ生産能を有する各種
植物、動物、微生物等からクローン化したものの利用も
可能である。
本発明のハイブリッドプラスミドにおいて、ＰＡＬをコ
ードするＤＮＡ配列の下流に位置するように組み込むｓ
ＲＮ＾のターミネータ−としては、大腸菌内で有効に機
能するものであればどのようなものでも利用できるが、
ｒｒｎＢ％ｔｒｐ＾等の強力な活性を示すターミネータ
−を用いるのが、先に述べた連結プロモーターの活性と
のバランスを取る上で望ましい。
ードするＤＮＡ配列の下流に位置するように組み込むｓ
ＲＮ＾のターミネータ−としては、大腸菌内で有効に機
能するものであればどのようなものでも利用できるが、
ｒｒｎＢ％ｔｒｐ＾等の強力な活性を示すターミネータ
−を用いるのが、先に述べた連結プロモーターの活性と
のバランスを取る上で望ましい。
本発明の組換え体プラスミドは上記のような各構成材料
を、先に述べたような所定の配列で遺伝子組換え技術を
用いて連結して得ることができる。
を、先に述べたような所定の配列で遺伝子組換え技術を
用いて連結して得ることができる。
各構成材料を連結する方法としては、例えば、後述する
実施例に示された本発明者による方法が有用である。
実施例に示された本発明者による方法が有用である。
なお、このようにして構築された組換え体プラスミドに
おいては、先に述べたマーカーとなる遺伝子と複製開始
起点は、ＰＡＬをコードするＤＮＡ配列の下流に接続さ
せたターミネータ−の下流に、マーカーとなる遺伝子、
複製開始起点の順に、それぞれが上流から下流方向へ有
効に機能する方向性を持って更に連結されているのが好
ましい。
おいては、先に述べたマーカーとなる遺伝子と複製開始
起点は、ＰＡＬをコードするＤＮＡ配列の下流に接続さ
せたターミネータ−の下流に、マーカーとなる遺伝子、
複製開始起点の順に、それぞれが上流から下流方向へ有
効に機能する方向性を持って更に連結されているのが好
ましい。
以上のような構成を有する本発明の組換え体プラスミド
を宿主大腸菌に導入することによって、該宿主大腸菌で
のより効率の高いＰＡＬ発現が可能となる。
を宿主大腸菌に導入することによって、該宿主大腸菌で
のより効率の高いＰＡＬ発現が可能となる。
以下、実施例および比較例に従って本発明を更に詳細に
説明する。なお、以下の実施例および比較例で構築され
た各プラスミドの構築工程の概略図を第１図に示しであ
る。
説明する。なお、以下の実施例および比較例で構築され
た各プラスミドの構築工程の概略図を第１図に示しであ
る。
実施例！
［プラスミドｐｓＷ１１５の構築］
（１）第２図に示した工程に従ったプラスミドｐＴａｃ
１１の構築 まず、特願昭６１−２１５８６４号公報に記載された本
発明者らによる方法に従って構築されたプラスミドｐＹ
Ｌｒｐ ８を有する大腸菌ＭＴ ＋０４１４ （ＦＥＲ
ＭＰ−８８７６）株より抽出したプラスミドを制限酵素
Ｎｖｕ Ｉと旧ｎｄｍで消化して得たＤＮＡ断片混合物
から電気泳動法によって２．４ ｋｂｐの大きさのＤＮ
Ａ断片を分離回収した。
１１の構築 まず、特願昭６１−２１５８６４号公報に記載された本
発明者らによる方法に従って構築されたプラスミドｐＹ
Ｌｒｐ ８を有する大腸菌ＭＴ ＋０４１４ （ＦＥＲ
ＭＰ−８８７６）株より抽出したプラスミドを制限酵素
Ｎｖｕ Ｉと旧ｎｄｍで消化して得たＤＮＡ断片混合物
から電気泳動法によって２．４ ｋｂｐの大きさのＤＮ
Ａ断片を分離回収した。
これとは別に、 ｔａｃプロモーターを有するプラスミ
ドｐＫＫ２２３−３ （ファルマシア社製）を制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化して、ＤＮＡ断片を得た後、これらＤ
ＮＡ断片の粘着末端をＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑
化した。
ドｐＫＫ２２３−３ （ファルマシア社製）を制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化して、ＤＮＡ断片を得た後、これらＤ
ＮＡ断片の粘着末端をＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑
化した。
次に、このようにして得られた粘着末端を有するＤＮＡ
断片と、先に得た２、４ ｋｂｐのＤＮＡ断片とを、リ
ガーゼの存在下で反応させた後、得られた反応生成物を
大腸菌にＳ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎらの方法によって導入した
。
断片と、先に得た２、４ ｋｂｐのＤＮＡ断片とを、リ
ガーゼの存在下で反応させた後、得られた反応生成物を
大腸菌にＳ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎらの方法によって導入した
。
続いて、この反応生成物が導入された大腸菌を、アンピ
シリンプレート（ＬＢ培地［バタトトリプトン（商品名
； Ｂａｃｔｏ（ｒｙｐＬｏｎｅ■、Ｄｉｆｃｏ社製）
ＩＯｇ ；バクトイ−ストエキストラクト（ＢａｃＬ
。
シリンプレート（ＬＢ培地［バタトトリプトン（商品名
； Ｂａｃｔｏ（ｒｙｐＬｏｎｅ■、Ｄｉｆｃｏ社製）
ＩＯｇ ；バクトイ−ストエキストラクト（ＢａｃＬ
。
−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ８、Ｄｉｆｃｏ社製 ）
５ｇ；グルコース１ｇ；蒸留水１１ （ＮａＯＨでｐ）
１７．５に調整）］にアンピシリンを５０μｇ７ｍＡの
濃度て添加した培地に寒天を １．５９６の濃度で含有
させたもの）で培養した。培養後、プレート上に出現し
たアンピシリン耐性の各コロニーのそれぞれから個々に
プラスミドを抽出し、各プラスミドの制限酵素地図を作
製して、目的とする第２図に示したような構成のプラス
ミドｐＴａｃｌｌを有するコロニーを同定し、更に該コ
ロニーからプラスミドｐＴａｃｌｌを単離した。
５ｇ；グルコース１ｇ；蒸留水１１ （ＮａＯＨでｐ）
１７．５に調整）］にアンピシリンを５０μｇ７ｍＡの
濃度て添加した培地に寒天を １．５９６の濃度で含有
させたもの）で培養した。培養後、プレート上に出現し
たアンピシリン耐性の各コロニーのそれぞれから個々に
プラスミドを抽出し、各プラスミドの制限酵素地図を作
製して、目的とする第２図に示したような構成のプラス
ミドｐＴａｃｌｌを有するコロニーを同定し、更に該コ
ロニーからプラスミドｐＴａｃｌｌを単離した。
（２）第３図の工程に従ったプラスミドｐｐＬ−ＰＡＬ
−ｈｅａｄの構築 プラスミドｐＰＬ−入（ファルマシア社製）を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＨｐａＩで消化して、得られたＤＮＡ断片
混合物から電気泳動法により４７０ ｂｐのＤＮＡ断片
を分離回収した。この４７０ ｂｐのＤＮＡ断片を次に
制限酵素旧ｎｆＩで部分消化し、得られたＤＮＡ断片混
合物から電気泳動法により３７０ ｂｐのＤＮＡ断片を
分離回収した。
−ｈｅａｄの構築 プラスミドｐＰＬ−入（ファルマシア社製）を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＨｐａＩで消化して、得られたＤＮＡ断片
混合物から電気泳動法により４７０ ｂｐのＤＮＡ断片
を分離回収した。この４７０ ｂｐのＤＮＡ断片を次に
制限酵素旧ｎｆＩで部分消化し、得られたＤＮＡ断片混
合物から電気泳動法により３７０ ｂｐのＤＮＡ断片を
分離回収した。
更に、この３７０ ｂｐのＤＮＡ断片の末端をＤＮＡポ
リメラーゼを用いて平滑末端化してから、それをリガー
ゼの存在下でＣｆ１ａ ニリンカー（宝酒造社製）と反
応させた。反応終了後、得られた反応生成物を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＣ１１ａ■で消化してＥｃｏＲＩ −Ｃｌ
Ｌａ Ｉ ＤＮＡ断片を含む混合物を得た。
リメラーゼを用いて平滑末端化してから、それをリガー
ゼの存在下でＣｆ１ａ ニリンカー（宝酒造社製）と反
応させた。反応終了後、得られた反応生成物を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＣ１１ａ■で消化してＥｃｏＲＩ −Ｃｌ
Ｌａ Ｉ ＤＮＡ断片を含む混合物を得た。
これとは別に、特願昭６１−２１５８６４号公報に記載
された本発明者らの方法に従って構築したプラスミドｐ
ＳＹＡ ２を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、得ら
れたＤＮＡ断片を、更に制限酵素Ｃ１ａＩで部分消化し
、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気永動
法によって大ＤＮＡ断片を抽出分離した。
された本発明者らの方法に従って構築したプラスミドｐ
ＳＹＡ ２を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、得ら
れたＤＮＡ断片を、更に制限酵素Ｃ１ａＩで部分消化し
、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気永動
法によって大ＤＮＡ断片を抽出分離した。
次に、このようにして得られたプラスミドｐＳＹＡ ２
由来の大ＤＮＡ断片と、先に得たＥｃｏＲＩ −Ｃ１ａ
ｌ断片を含む混合物とをＴ４リガーゼの存在下で反応さ
せ、得られた反応生成物を大腸菌に導入し、これをアン
ピシリンプレートで培養した。アンピシリンプレート上
に出現した各コロニーからプラスミドを調整し、その制
限酵素地図を作製して、目的とする第３図に示す構成の
プラスミドｐＳＹＰＬ−３を有するコロニーを同定し、
該コロニーからプラスミドｐＳＹＰＬ−３を単離した。
由来の大ＤＮＡ断片と、先に得たＥｃｏＲＩ −Ｃ１ａ
ｌ断片を含む混合物とをＴ４リガーゼの存在下で反応さ
せ、得られた反応生成物を大腸菌に導入し、これをアン
ピシリンプレートで培養した。アンピシリンプレート上
に出現した各コロニーからプラスミドを調整し、その制
限酵素地図を作製して、目的とする第３図に示す構成の
プラスミドｐＳＹＰＬ−３を有するコロニーを同定し、
該コロニーからプラスミドｐＳＹＰＬ−３を単離した。
更に、このようにして得られたプラスミドｐｓｙｐＬ−
３をεｃｏＲＩとＤａｍ）ＩＩとで消化し、得られた大
小２種のＤＮＡ断片から電気泳動法によって小ＤＮＡ断
片を分離回収した。
３をεｃｏＲＩとＤａｍ）ＩＩとで消化し、得られた大
小２種のＤＮＡ断片から電気泳動法によって小ＤＮＡ断
片を分離回収した。
次に、プラスミドｐＢＲ３２２（ファルマシア社製）を
制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化し、得られた
大小２種のＤＮＡ断片から電気泳動法によって大ＤＮＡ
断片を分離回収した後、この大ＤＮＡ断片と先に得たプ
ラスミドｐＳＹＰＬ−３由来の小断片とを、リガーゼの
存在下で反応させ、第３図の構成のプラスミドｐＰｔ、
−ＰＡＬ−ｈｅａｄを得た。なお、ここで目的のプラス
ミドが得られたかどうかは、リガーゼを用いた反応で生
成された反応生成物を大腸菌に導入し、これをアンピシ
リンプレートで培養し、アンピシリンプレート上に出現
した各コロニーからプラスミドを調整し、その制限酵素
地図を作成することで確認した。
制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化し、得られた
大小２種のＤＮＡ断片から電気泳動法によって大ＤＮＡ
断片を分離回収した後、この大ＤＮＡ断片と先に得たプ
ラスミドｐＳＹＰＬ−３由来の小断片とを、リガーゼの
存在下で反応させ、第３図の構成のプラスミドｐＰｔ、
−ＰＡＬ−ｈｅａｄを得た。なお、ここで目的のプラス
ミドが得られたかどうかは、リガーゼを用いた反応で生
成された反応生成物を大腸菌に導入し、これをアンピシ
リンプレートで培養し、アンピシリンプレート上に出現
した各コロニーからプラスミドを調整し、その制限酵素
地図を作成することで確認した。
（３）第５図に示した工程に従ったプラスミドｐＳＷ１
１５の構築 まず、前記（１）項で得たプラスミドｐＴａｃｌｌを制
限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し、得られた大小２
種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法により大ＤＮＡ
断片を分離回収した。
１５の構築 まず、前記（１）項で得たプラスミドｐＴａｃｌｌを制
限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し、得られた大小２
種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法により大ＤＮＡ
断片を分離回収した。
次に、前記（２）項で得たプラスミドｐＰＬ −ＰＡＬ
−ｈｅａｄを制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し、
得られた大小２種のＤＮＡ断片混合物から電気泳動法に
より小ＤＮＡ断片を分離回収した。
−ｈｅａｄを制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し、
得られた大小２種のＤＮＡ断片混合物から電気泳動法に
より小ＤＮＡ断片を分離回収した。
最後に、このようにして得たプラスミドｐＴａｃ１１由
来の大ＤＮＡ断片とプラスミドｐＰＬ−ＰＡＬ−ｈｅａ
ｄ由来の小ＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼの存在下で反応
させて結合させ、プラスミドｐｓＷ１１５を得た。
来の大ＤＮＡ断片とプラスミドｐＰＬ−ＰＡＬ−ｈｅａ
ｄ由来の小ＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼの存在下で反応
させて結合させ、プラスミドｐｓＷ１１５を得た。
なお、目的とするプラスミドが得られたかどうかは、得
られたプラスミドを大腸菌に導入して、形質転換株をア
ンピシリンプレートで選択し、アンピシリン耐性を有す
る各形質転換株からプラスミドを調整して、それらの制
限酵素地図を作製するとともに、形質転換株のＰＡＬ活
性を後述する方法によって測定して確認した。ここで得
られたＰＡＬ活性を有する形質転換大腸菌株をＭＴ−１
０４２３株（ＦＥＲＭ Ｐ−９０２３）とした。
られたプラスミドを大腸菌に導入して、形質転換株をア
ンピシリンプレートで選択し、アンピシリン耐性を有す
る各形質転換株からプラスミドを調整して、それらの制
限酵素地図を作製するとともに、形質転換株のＰＡＬ活
性を後述する方法によって測定して確認した。ここで得
られたＰＡＬ活性を有する形質転換大腸菌株をＭＴ−１
０４２３株（ＦＥＲＭ Ｐ−９０２３）とした。
（４）プラスミドｐｓＷ１１５によるＰＡＬの発現上記
（３）項で得たプラスミドｐｓＷＩ１５が導入、された
形質転換大腸菌を先にアンピシリンプレートの組成に用
いたＬ８培地（ｐＨ７，５）にアンピシリンを５０μｇ
／ｍｆｌの濃度で添加した培地に接種し、これを３０
℃で振どう培養した。
（３）項で得たプラスミドｐｓＷＩ１５が導入、された
形質転換大腸菌を先にアンピシリンプレートの組成に用
いたＬ８培地（ｐＨ７，５）にアンピシリンを５０μｇ
／ｍｆｌの濃度で添加した培地に接種し、これを３０
℃で振どう培養した。
２０時間の培養により６６０ｎｍでのＯＤが５．４０を
示す培養菌体濃度が得られたので、培養液から菌体を遠
心分離によって集め、得られた菌体のＰＡＬ活性を以下
の方法に従って測定し、乾燥菌体ｆｆｉ量あたりの比活
性を算出した。その結果を表１に示す。
示す培養菌体濃度が得られたので、培養液から菌体を遠
心分離によって集め、得られた菌体のＰＡＬ活性を以下
の方法に従って測定し、乾燥菌体ｆｆｉ量あたりの比活
性を算出した。その結果を表１に示す。
ＰＡＬ活性の測定；
菌体を遠心分離によって培養液から集菌し、集菌した菌
体を０．８５４に食塩水に懸濁してから再度遠心分離に
かけて洗浄した後、洗浄菌体を、２５ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩＬ１１１衝液（ｐ）ｌ ８．８）に湿重量で１％と
なるように懸濁させ、この懸濁液を、その組成が２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＩＬ４３衝液（ｐＨ８，８） 、
２５＋ｎＭ Ｌ−フェニリアラニン、０．００５！に
セチルピリジウム塩酸塩となるようにした酵素反応液中
に加えて、これらを３０℃、２０分間反応させた。 ｌ
Ｎ−１１０４１の添加で反応を終了させ、反応液中に生
成した桂皮酸量を、液体クロマトグラフィーにより分析
してＰＡＬ活性を測定した。なお、ここでのｔＵ（ユニ
ット）は１分間当りに１マイクロモルの桂皮酸を生成さ
せる酵素量に相当する。
体を０．８５４に食塩水に懸濁してから再度遠心分離に
かけて洗浄した後、洗浄菌体を、２５ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩＬ１１１衝液（ｐ）ｌ ８．８）に湿重量で１％と
なるように懸濁させ、この懸濁液を、その組成が２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＩＬ４３衝液（ｐＨ８，８） 、
２５＋ｎＭ Ｌ−フェニリアラニン、０．００５！に
セチルピリジウム塩酸塩となるようにした酵素反応液中
に加えて、これらを３０℃、２０分間反応させた。 ｌ
Ｎ−１１０４１の添加で反応を終了させ、反応液中に生
成した桂皮酸量を、液体クロマトグラフィーにより分析
してＰＡＬ活性を測定した。なお、ここでのｔＵ（ユニ
ット）は１分間当りに１マイクロモルの桂皮酸を生成さ
せる酵素量に相当する。
なお、表１に示した乾燥菌体重量は、洗浄菌体を乾燥し
て測定した。
て測定した。
比較例１
［第４図に示した工程に従ったプラスミドｐｓＷＩ＋６
の構築とそれを用いた大腸菌でのＰＡＬの発現］（１）
プラスミドｐｓｗｔｏａの構築 まず、特願昭６１−２１５８６４号に記載された本発明
者らの方法に従フて構築されたプラスミドｐｓＷ１３を
制限酵素ｔｌｉｎｄｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、得ら
れＤＮＡ断片混合物から電気泳動法によって２．３ ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を分離回収し、更にこのＤＮＡ断片の
末端を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。
の構築とそれを用いた大腸菌でのＰＡＬの発現］（１）
プラスミドｐｓｗｔｏａの構築 まず、特願昭６１−２１５８６４号に記載された本発明
者らの方法に従フて構築されたプラスミドｐｓＷ１３を
制限酵素ｔｌｉｎｄｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、得ら
れＤＮＡ断片混合物から電気泳動法によって２．３ ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を分離回収し、更にこのＤＮＡ断片の
末端を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。
これとは別に、プラスミド１）ＰＬ−λ（ファルマシア
社製）を制限酵素ＨｐａＩで消化後、得られたＤＮＡ断
片に自己再結合防止のためのＭａｎｉａｌＳらのＣＩＰ
処理［Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら； Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ １ａｂｏｒａＬｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ、１３３．Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂ
ｏｒ。
社製）を制限酵素ＨｐａＩで消化後、得られたＤＮＡ断
片に自己再結合防止のためのＭａｎｉａｌＳらのＣＩＰ
処理［Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら； Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ １ａｂｏｒａＬｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ、１３３．Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂ
ｏｒ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８２） ］を行なってから、
このＤＮＡ断片と先に得たプラスミドｐｓＷ１３からの
２．３ ｋｂｐのＤＮＡ断片をリガーゼの存在下で反応
させた。反応終了後、反応物を大腸菌に導入し、アンピ
シリンプレートで培養した。次に、プレート上に出現し
たアンピシリン耐性の各コロニーのそれぞれからプラス
ミドを抽出し、各プラスミドの制限酵素地図を作製して
目的とする第４図に示したような構成のプラスミドｐｓ
Ｗ１０８を有するコロニーを同定し、更に該コロニーか
らプラスミドｐｓｗｔｏａを単離した。
このＤＮＡ断片と先に得たプラスミドｐｓＷ１３からの
２．３ ｋｂｐのＤＮＡ断片をリガーゼの存在下で反応
させた。反応終了後、反応物を大腸菌に導入し、アンピ
シリンプレートで培養した。次に、プレート上に出現し
たアンピシリン耐性の各コロニーのそれぞれからプラス
ミドを抽出し、各プラスミドの制限酵素地図を作製して
目的とする第４図に示したような構成のプラスミドｐｓ
Ｗ１０８を有するコロニーを同定し、更に該コロニーか
らプラスミドｐｓｗｔｏａを単離した。
（２）プラスミド１）ＰＬ −［Ｅ］の構築プラスミド
Ｉ’ＰＬ−λ（ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化して開環後、得られたＤＮＡ断片の末端をＤＮ
Ａポリメラーゼ処理によって平滑末端化したのち、更に
リガーゼを作用させて閉環してプラスミドＰＰＬ−［Ｅ
］を得た。
Ｉ’ＰＬ−λ（ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化して開環後、得られたＤＮＡ断片の末端をＤＮ
Ａポリメラーゼ処理によって平滑末端化したのち、更に
リガーゼを作用させて閉環してプラスミドＰＰＬ−［Ｅ
］を得た。
（３）プラスミドｐｓＷ１１３の構築
まず、プラスミドＩ）ＰＬ−λ（ファルマシア社製）を
制限酵素ＥｃｏＲＩと１ｌｐａＩで消化し、得られたＤ
ＮＡ断片混合物から電気泳動法によって、４７０ｂｐの
ＤＮＡ断片を分離回収した。次に、得られた４７０ ｂ
ｐのＤＮＡ断片を制限酵素１１ａｅｌＩ［で消化し、得
られた反応生成物とＥｃｏＲｒリンカ−（宝酒造社製）
とを、Ｔ４リガーゼでの存在下で反応させた。次に、該
反応で得られた反応生成物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａ
ａ＋ｔｌＩで処理して、ＤＮＡ断片の混合物を得た。こ
のようにして得らたＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法
によって２４０ ｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。
制限酵素ＥｃｏＲＩと１ｌｐａＩで消化し、得られたＤ
ＮＡ断片混合物から電気泳動法によって、４７０ｂｐの
ＤＮＡ断片を分離回収した。次に、得られた４７０ ｂ
ｐのＤＮＡ断片を制限酵素１１ａｅｌＩ［で消化し、得
られた反応生成物とＥｃｏＲｒリンカ−（宝酒造社製）
とを、Ｔ４リガーゼでの存在下で反応させた。次に、該
反応で得られた反応生成物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａ
ａ＋ｔｌＩで処理して、ＤＮＡ断片の混合物を得た。こ
のようにして得らたＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法
によって２４０ ｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。
これとは別に、上記（１）項で得たプラスミドｐｓＷ１
０８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｒｕ Ｉとで消化し、得
られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法により、４．１
ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。
０８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｒｕ Ｉとで消化し、得
られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法により、４．１
ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。
更に、上記（２）項で得たプラスミドｐＰｔ、 −［Ｅ
］を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｒｕ Ｉとで消化し、得ら
れたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法により、３．４
ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。
］を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｒｕ Ｉとで消化し、得ら
れたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法により、３．４
ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。
最後に、以上のようにして得られた３種のＤＮＡ断片を
、 Ｔ４リガーゼの存在下で反応させて反応生成物を得
た後、該生成物を大腸菌に導入し、これをアンピシリン
プレートで培養した。次に、プレート上に出現したアン
ピシリン耐性の各コロニーのそれぞれから個々に抽出し
たプラスミドの制限酵素地図を作製するとともに、各コ
ロニーの一部を実施例１と同様にして培養してそのＰＡ
Ｌ活性を測定し、目的とする第４図に示したような構成
のプラスミドｐｓＷ１１３を有するコロニーを同定し、
更に該コロニーからプラスミドｐｓＷ１１３を単離した
。
、 Ｔ４リガーゼの存在下で反応させて反応生成物を得
た後、該生成物を大腸菌に導入し、これをアンピシリン
プレートで培養した。次に、プレート上に出現したアン
ピシリン耐性の各コロニーのそれぞれから個々に抽出し
たプラスミドの制限酵素地図を作製するとともに、各コ
ロニーの一部を実施例１と同様にして培養してそのＰＡ
Ｌ活性を測定し、目的とする第４図に示したような構成
のプラスミドｐｓＷ１１３を有するコロニーを同定し、
更に該コロニーからプラスミドｐｓＷ１１３を単離した
。
（４）プラスミドｐｓＷ１１６の構築
まず、上記（３）項で得たプラスミドｐｓＷ１１３を制
限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し、得られた大小２
種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法によって大ＤＮ
Ａ断片を分離回収した。
限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し、得られた大小２
種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法によって大ＤＮ
Ａ断片を分離回収した。
これとは別に、実施例１の（３）項で得たプラスミドＩ
）Ｐｃ、−ＰＡＬ−ｈｅａｄを制限酵素ＥｃｏＲＩとＡ
ａＬＩで消化し、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合
物から電気泳動法によって小ＤＮＡ断片を分離回収した
。
）Ｐｃ、−ＰＡＬ−ｈｅａｄを制限酵素ＥｃｏＲＩとＡ
ａＬＩで消化し、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合
物から電気泳動法によって小ＤＮＡ断片を分離回収した
。
次に、こうして分離回収した２種のＤＮＡ断片をＴ４
リガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラスミドｐ
ｓＷ１１６を得た。
リガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラスミドｐ
ｓＷ１１６を得た。
なお、ここで目的とするプラスミドが得られたかどうか
は、実施例１と同様にして、得られたプラスミドの制限
酵素地図を作製するとともに、形質転換株のＰＡＬ活性
を測定することによって確認した。
は、実施例１と同様にして、得られたプラスミドの制限
酵素地図を作製するとともに、形質転換株のＰＡＬ活性
を測定することによって確認した。
（５）プラスミドｐｓＷ１１ＢによるＰＡＬの発現上記
（４）項で得たプラスミドｐｓＷ１１６用いる以外は、
実施例１の（４）と同様にして、大腸菌を形質転換して
ＰＡ’Ｌを発現させ、生産されたＰＡＬの比活性を算出
した。形質転換株の培養における最終培養菌体濃度及び
得られたＰＡＬ比活性の値を表１に示す。
（４）項で得たプラスミドｐｓＷ１１６用いる以外は、
実施例１の（４）と同様にして、大腸菌を形質転換して
ＰＡ’Ｌを発現させ、生産されたＰＡＬの比活性を算出
した。形質転換株の培養における最終培養菌体濃度及び
得られたＰＡＬ比活性の値を表１に示す。
比較例２
［プラスミドｐｓＩｆｌ１７の構築とそれを用いた大腸
菌でのＰＡＬの発現］ 比較例１の（３）項で得たプラスミドｐｓＷ１１３を、
制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し、得られた大小
２ｇｉのＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法により大Ｄ
ＮＡ断片を分離回収した。
菌でのＰＡＬの発現］ 比較例１の（３）項で得たプラスミドｐｓＷ１１３を、
制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し、得られた大小
２ｇｉのＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法により大Ｄ
ＮＡ断片を分離回収した。
これとは別に、実施例１の（１）項で用いたプラスミド
ｐＹｔｒｐ６を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し
、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動
法により小ＤＮＡ断片を分離回収した。
ｐＹｔｒｐ６を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し
、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動
法により小ＤＮＡ断片を分離回収した。
次に、こうして分離回収した２１４のＤＮＡ断片をＴ４
リガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラスミド
ｐｓＷ１１７を得た。
リガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラスミド
ｐｓＷ１１７を得た。
なお、ここで目的とするプラスミドが得られたかどうか
は、実施例１と同様にして、得られたプラスミドの制限
酵素地図の作製と、形質転換株のＰＡＬ活性の測定とに
よって確認した。
は、実施例１と同様にして、得られたプラスミドの制限
酵素地図の作製と、形質転換株のＰＡＬ活性の測定とに
よって確認した。
更に、このようにして得たプラスミドｐｓＷ１１７を用
いる以外は、実施例１の（４） と同様にして、大腸菌
を形質転換してＰＡＬを発現させ、生産されたＰＡＬの
比活性を算出した。形質転換株の培養における最終培養
菌体濃度及び得られたＰＡＬ比活性の値を表１に示す。
いる以外は、実施例１の（４） と同様にして、大腸菌
を形質転換してＰＡＬを発現させ、生産されたＰＡＬの
比活性を算出した。形質転換株の培養における最終培養
菌体濃度及び得られたＰＡＬ比活性の値を表１に示す。
比較例３
［プラスミドｐｓＷ１１Ｂの構築とそれを用いた大腸菌
でのＰＡＬの発現コ 実施例１の（２）項で得たプラスミドｐＰＬ−ＰＡＬ−
ｈｅａｄを、制限酵素ＥｃｏＲＩと八ａｔＩで消化し、
得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法
により小ＤＮＡ断片を分離回収した。
でのＰＡＬの発現コ 実施例１の（２）項で得たプラスミドｐＰＬ−ＰＡＬ−
ｈｅａｄを、制限酵素ＥｃｏＲＩと八ａｔＩで消化し、
得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法
により小ＤＮＡ断片を分離回収した。
これとは別に、実施例１の（１）項で用いたプラスミド
ｐＹｔｒｐ６を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し
、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動
法により大ＤＮＡ断片を分離回収した。
ｐＹｔｒｐ６を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔＩで消化し
、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動
法により大ＤＮＡ断片を分離回収した。
次に、こうして分離回収した２種のＤＮＡ断片をＴ４リ
ガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラスミドｐｓ
ｗｔｔａを得た。
ガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラスミドｐｓ
ｗｔｔａを得た。
なお、ここで目的とするプラスミドが得られたかどうか
は、実施例１と同様に得られたプラスミドの制限酵素地
図の作製と、形質転換株のＰＡＬ活性の測定とによって
確認した。
は、実施例１と同様に得られたプラスミドの制限酵素地
図の作製と、形質転換株のＰＡＬ活性の測定とによって
確認した。
更に、このようにして得たプラスミドｐｓＷ１１８を用
いる以外は、実施例１の（４） と同様にして、大腸菌
を形質添加してＰＡＬを発現させ、生産されたＰＡＬの
比活性を算出した。形質転換株の培養における最終培養
菌体濃度及び得られたＰＡＬ比活性の値を表１に示す。
いる以外は、実施例１の（４） と同様にして、大腸菌
を形質添加してＰＡＬを発現させ、生産されたＰＡＬの
比活性を算出した。形質転換株の培養における最終培養
菌体濃度及び得られたＰＡＬ比活性の値を表１に示す。
なお、以上の実施例および比較例における組換え体プラ
スミドの大腸菌への導入は、Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎらの方
法［Ｓ、Ｎ、（：ｏｈｅｎら； Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
スミドの大腸菌への導入は、Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎらの方
法［Ｓ、Ｎ、（：ｏｈｅｎら； Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、Ｕ、２１１０（１９７２）］を用い
て行なった。
て行なった。
また、制限酵素、リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼを用いたプラスミドやＤＮＡ断片の処理および
菌体からのプラスミドの調製は、特に指定されている場
合以外は通常用いられている方法によって行なった。更
に、宿主大腸菌としては、ＭＣｌ０６１株［Δ （ｆｔ
ａｃｌＰＯＺＹＡ）Ｆ−、ａｒａＤＩ３９ 、Δ（ａｒ
ａ ｆｆ１ｅｕ） ７６９７ｘ７４ｇａＩＬＵ ｇａＩ
ＬＫ ｓｔｒ＾］ ［Ｍ、Ｊ。
メラーゼを用いたプラスミドやＤＮＡ断片の処理および
菌体からのプラスミドの調製は、特に指定されている場
合以外は通常用いられている方法によって行なった。更
に、宿主大腸菌としては、ＭＣｌ０６１株［Δ （ｆｔ
ａｃｌＰＯＺＹＡ）Ｆ−、ａｒａＤＩ３９ 、Δ（ａｒ
ａ ｆｆ１ｅｕ） ７６９７ｘ７４ｇａＩＬＵ ｇａＩ
ＬＫ ｓｔｒ＾］ ［Ｍ、Ｊ。
Ｃａ５ａｄａｂａｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１３８
、１７９．（１９８０）］を用いた。なお、制限酵素
類、リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、 ＤＮＡポリメラーゼは
特に指定しない限り宝酒造社製を用いた。
、１７９．（１９８０）］を用いた。なお、制限酵素
類、リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、 ＤＮＡポリメラーゼは
特に指定しない限り宝酒造社製を用いた。
表 １
〔発明の効果〕
本発明の大腸菌でのＰＡＬ発現用バイブツリドブラスミ
ドは、ｔａｃプロモーターとｅ５ラムダプロモーターと
が組合わされて、これらがＰＡＬをコードするＤＮＡ配
列上流に特定の位置関係で配列された構成を有し、この
ような特徴ある構成によってＰＡＬのより効率良い発現
が可能となった。
ドは、ｔａｃプロモーターとｅ５ラムダプロモーターと
が組合わされて、これらがＰＡＬをコードするＤＮＡ配
列上流に特定の位置関係で配列された構成を有し、この
ような特徴ある構成によってＰＡＬのより効率良い発現
が可能となった。
また、本発明の組換え体プラスミドで大腸菌を形質転換
することによって、効果的なＰＡＬの大全生産に有用な
形質転換株を提供することが可能となった。
することによって、効果的なＰＡＬの大全生産に有用な
形質転換株を提供することが可能となった。
第１図は実施例１および比較例１〜３で構築された各組
換え体プラスミドの構築工程の概略図、第２図はプラス
ミドｐＴａｃｌｌの、第３図はプラスミドｐＰＬ−ＰＡ
Ｌ−ｈｅａｄの、第４図はプラスミドｐｓＴｌｌＩ３の
、第５図はプラスミドｐｓＷ１１５およびｐｓＷ１１６
の、第６図はプラスミドｐｓＷｌ１７および１１８の構
築工程を具体的に示した図である。
換え体プラスミドの構築工程の概略図、第２図はプラス
ミドｐＴａｃｌｌの、第３図はプラスミドｐＰＬ−ＰＡ
Ｌ−ｈｅａｄの、第４図はプラスミドｐｓＴｌｌＩ３の
、第５図はプラスミドｐｓＷ１１５およびｐｓＷ１１６
の、第６図はプラスミドｐｓＷｌ１７および１１８の構
築工程を具体的に示した図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ａ）大腸菌内で複製可能であるベクターと；ｂ）大
腸菌トリプトファンオペロンのプロモーターと大腸菌ラ
クトースオペロンのプロモーターの融合プロモーター（
ｔａｃプロモーター）と、該融合プロモーター下流に連
結された大腸菌ラムダファージのＰ＿Ｌプロモーターと
を有する連結プロモーターと； ｃ）該連結プロモーター下流に挿入されたＬ−フェニル
アラニン・アンモニアリアーゼをコードするＤＮＡ配列
とを有し、 前記連結プロモーターを構成する２つのプロモーターの
方向性が同一であり、かつ前記Ｐ＿Ｌプロモーターが前
記ＤＮＡ配列の転写を可能とする方向性をもって前記Ｄ
ＮＡ配列の上流に配列されているものであることを特徴
とする組換え体プラスミド。 ２）ａ）大腸菌内で複製可能であるベクターと；ｂ）大
腸菌トリプトファンオペロンのプロモーターと大腸菌ラ
クトースオペロンのプロモーターの融合プロモーター（
ｔａｃプロモーター）と、該融合プロモーター下流に連
結された大腸菌ラムダファージのＰ＿Ｌプロモーターと
を有する連結プロモーターと； ｃ）該連結プロモーター下流に挿入されたＬ−フェニル
アラニン・アンモニアリアーゼをコードするＤＮＡ配列
とを有し、 前記連結プロモーターを構成する２つのプロモーターの
方向性が同一であり、かつ前記Ｐ＿Ｌプロモーターが前
記ＤＮＡ配列の転写を可能とする方向性をもって前記Ｄ
ＮＡ配列の上流に配列されている組換え体プラスミドに
より形質転換された大腸菌株。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62024705A JPS63196292A (ja) | 1987-02-06 | 1987-02-06 | Ｌ−フエニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株 |
| US07/151,234 US4946790A (en) | 1987-02-06 | 1988-02-01 | Recombinant plasmid for the expression of L-phenylalanine ammonia-lyase and transformed strain carrying same |
| CA000558283A CA1293461C (en) | 1987-02-06 | 1988-02-05 | Recombinant plasmid for the expression of l-phenylalanine ammonia-lyase and transformed strain carrying same |
| DK060088A DK60088A (da) | 1987-02-06 | 1988-02-05 | Rekombinant plasmid til ekspression af l-phenylalamin-ammoniaklyase og e.coli-stamme transformeret med samme |
| KR1019880001118A KR910001810B1 (ko) | 1987-02-06 | 1988-02-06 | L-페닐알라닌 암모니아-리아제의 발현용 조환형 플라스미드 및 이를 함유하는 형질전환주 |
| DE8888301011T DE3880520T2 (de) | 1987-02-06 | 1988-02-08 | Rekombinantes plasmid fuer die expression von l-phenylalanin-ammonialyase und transformierte staemme, die es enthalten. |
| ES88301011T ES2056910T3 (es) | 1987-02-06 | 1988-02-08 | Plasmido recombinante para la expresion de l-fenilalanina amoniaco-liasa y raza transformada portando la misma. |
| EP88301011A EP0278706B1 (en) | 1987-02-06 | 1988-02-08 | Recombinant plasmid for the expression of l-phenylalanine ammonia-lyase and transformed strain carrying same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62024705A JPS63196292A (ja) | 1987-02-06 | 1987-02-06 | Ｌ−フエニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63196292A true JPS63196292A (ja) | 1988-08-15 |
Family
ID=12145594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62024705A Pending JPS63196292A (ja) | 1987-02-06 | 1987-02-06 | Ｌ−フエニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63196292A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63317086A (ja) * | 1987-06-18 | 1988-12-26 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株 |
-
1987
- 1987-02-06 JP JP62024705A patent/JPS63196292A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J BACTERIOL=1985 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63317086A (ja) * | 1987-06-18 | 1988-12-26 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株 |
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