JPS63196294A - 真核細胞に於る開放型リーディングフレームの発現のためのカセットベクター系 - Google Patents
真核細胞に於る開放型リーディングフレームの発現のためのカセットベクター系Info
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- JPS63196294A JPS63196294A JP63012417A JP1241788A JPS63196294A JP S63196294 A JPS63196294 A JP S63196294A JP 63012417 A JP63012417 A JP 63012417A JP 1241788 A JP1241788 A JP 1241788A JP S63196294 A JPS63196294 A JP S63196294A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、高等真核細胞に於る開放型リーディングフレ
ーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ Ｉ’ｒａｎ＋ｅ、
０ＲＦ）の転写および翻訳を可能にすると共に、大腸菌
の複製起点であるがゆえに、大腸菌での選別及び増幅を
も許容する、多用途カセットベクター系（ｃａｓｓｅｔ
ｔｅｖｅｃｔｏｒ ５ｙｓｔｅ１１）に関するものであ
る。融合蛋白調製のためのこれまでに知られた系では、
生成融合蛋白について望ましい程度に予測をすることが
できない。特に、ｃＤＮＡ上又はウィルス又は染色体エ
クソン上の、翻訳開始信号（特に、ＡＴＧ開始コード：
＞）をもたない、ＯＲＦの発現に関して、そうである。
ーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ Ｉ’ｒａｎ＋ｅ、
０ＲＦ）の転写および翻訳を可能にすると共に、大腸菌
の複製起点であるがゆえに、大腸菌での選別及び増幅を
も許容する、多用途カセットベクター系（ｃａｓｓｅｔ
ｔｅｖｅｃｔｏｒ ５ｙｓｔｅ１１）に関するものであ
る。融合蛋白調製のためのこれまでに知られた系では、
生成融合蛋白について望ましい程度に予測をすることが
できない。特に、ｃＤＮＡ上又はウィルス又は染色体エ
クソン上の、翻訳開始信号（特に、ＡＴＧ開始コード：
＞）をもたない、ＯＲＦの発現に関して、そうである。
本発明を、図を参考にしながら簡単に説明すれば、下記
の通りである。
の通りである。
第１図は、本発明のカセットベクター系を図式で示した
ものである。ここに於て、Ｐはプロモーターを、Ｔは翻
訳開始を、Ｌはポリリンカー領域を、Ｓはスプライシン
グポリアデニル化信号（ｓｐｌｉｃｅ ｐｏｌｙａｄｅ
ｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ）を表わし、円の一
重の円弧は、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ ）及
び複製起点（ｏｒｉ）を有するｐＢＲ３２２のＰｖｕｌ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントを表象するものである。ポ
リリンカー領域内に示されるセグメントは発現されるべ
きＯＲＦを有する、取込まれるべきＤＮＡを表すもので
ある。
ものである。ここに於て、Ｐはプロモーターを、Ｔは翻
訳開始を、Ｌはポリリンカー領域を、Ｓはスプライシン
グポリアデニル化信号（ｓｐｌｉｃｅ ｐｏｌｙａｄｅ
ｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ）を表わし、円の一
重の円弧は、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ ）及
び複製起点（ｏｒｉ）を有するｐＢＲ３２２のＰｖｕｌ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントを表象するものである。ポ
リリンカー領域内に示されるセグメントは発現されるべ
きＯＲＦを有する、取込まれるべきＤＮＡを表すもので
ある。
第２図の上段には、プラスミドｐ２９７が示しである。
このプラスミドの３２３ｂＴ）領域を下段に記載されて
いるＤＮＡシーケンスで置き替えるとプラスミドｐＡＴ
Ｇとなる。このプラスミドの指示され位置に、たとえば
、一方ではヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）プロ
モーターを有する６７０ｂｐ ＤＮＡフラグメントを
、他方ではポリリンカー領域を有する５７〜５９ｂｐフ
ラグメントを、取込ませることができる。このポリリン
カー領域につい、ての三種類のバリアントは、枠（ボッ
クス）内のＡＴＧ開始コードンが、ポリリンカー領域内
に取り込まれるＤＮＡシーケンスのリーディングフレー
ム内で常に終了するようにデザインされている。
いるＤＮＡシーケンスで置き替えるとプラスミドｐＡＴ
Ｇとなる。このプラスミドの指示され位置に、たとえば
、一方ではヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）プロ
モーターを有する６７０ｂｐ ＤＮＡフラグメントを
、他方ではポリリンカー領域を有する５７〜５９ｂｐフ
ラグメントを、取込ませることができる。このポリリン
カー領域につい、ての三種類のバリアントは、枠（ボッ
クス）内のＡＴＧ開始コードンが、ポリリンカー領域内
に取り込まれるＤＮＡシーケンスのリーディングフレー
ム内で常に終了するようにデザインされている。
最後に第３図は、この三種類の発現ベクターｐＯＲＦＥ
Ｘ１１〜１３のための上記ポリリンカー領域に挿入され
たＤＮＡシーケンスを示し、その下に各々のＤＮＡシー
ケンスに対応するアミノ酸シーケンス、すなわち、これ
らベクターによってコードされる蛋白のアミノ末端領域
を示す。
Ｘ１１〜１３のための上記ポリリンカー領域に挿入され
たＤＮＡシーケンスを示し、その下に各々のＤＮＡシー
ケンスに対応するアミノ酸シーケンス、すなわち、これ
らベクターによってコードされる蛋白のアミノ末端領域
を示す。
本発明の種々の局面は、特許請求の範囲に於て定義され
る。本発明の個々の具体例は、以下にさらに詳細に説明
されている。
る。本発明の個々の具体例は、以下にさらに詳細に説明
されている。
まず第一に、本発明のベクターの構築は、これから記述
されるが、これは、それだけで当業者にとって、様々な
可能な応用を、今後それらについての特別な言及を必要
とせずに開示することになろう。
されるが、これは、それだけで当業者にとって、様々な
可能な応用を、今後それらについての特別な言及を必要
とせずに開示することになろう。
大きさが２２９５ｂｐであって、複製起点及び選別マー
カーを有するＥ、ｃｏｌｉプラスミドの適切なりＮＡシ
ーケンスの単なる例である、ｐＢＲ３２２ＰｖｕＩＩ−
ＥｃｏＲＩフラグメントを、大きさが３２３ｂｐであっ
て初期プロモーターを含む、ＳＶ４０のＢｇｌＩＩ−Ｐ
ｖｕｌｌフラグメントと連結する。大きさが８４８ｂｐ
で、Ｔ抗原領域のスプライシングシグナルを含む、ＳＶ
４０ＢａｍＨＩ −Ｂｇ １ ｎフラグメントがこの下
流に存在する。この構築は、大きさが７４６ｂｐで“後
期”ポリアデニル化領域を有する、ＳＶ４０ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩフラグメントによって完成される。生じた
プラスミドｐ２９７の構造（第２図）は、公知のｐＳＶ
２プラスミド（Ｍｕｌｌｌｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ、 ５
ｃｉｅｎｃｅ ２０９ （１９８０） １４２２−１４
２７）のそれと一致する。
カーを有するＥ、ｃｏｌｉプラスミドの適切なりＮＡシ
ーケンスの単なる例である、ｐＢＲ３２２ＰｖｕＩＩ−
ＥｃｏＲＩフラグメントを、大きさが３２３ｂｐであっ
て初期プロモーターを含む、ＳＶ４０のＢｇｌＩＩ−Ｐ
ｖｕｌｌフラグメントと連結する。大きさが８４８ｂｐ
で、Ｔ抗原領域のスプライシングシグナルを含む、ＳＶ
４０ＢａｍＨＩ −Ｂｇ １ ｎフラグメントがこの下
流に存在する。この構築は、大きさが７４６ｂｐで“後
期”ポリアデニル化領域を有する、ＳＶ４０ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩフラグメントによって完成される。生じた
プラスミドｐ２９７の構造（第２図）は、公知のｐＳＶ
２プラスミド（Ｍｕｌｌｌｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ、 ５
ｃｉｅｎｃｅ ２０９ （１９８０） １４２２−１４
２７）のそれと一致する。
このプラスミドｐ２９７をＢａｍＨＩで切断し、突出端
をクレノーのポリメラーゼで埋填し、この平滑端を、平
滑端連結条件下で再結合する。このＢａｍＨＩ切断部位
を除いたプラスミドのＳＶ４０プロモーターを有するＰ
ｖｕＩＩ −Ｂｇ １■フラグメントを、ここで、３４
ｂｐからなり第２図に描かれた合成オリゴヌクレオチド
と置換する。このようにして、プラスミドｐＡＴＧが得
られる。図中の枠（ボックス）でかこまれた１０ｂｐ領
域は、ＳＶ４０ Ｔ抗原の開始領域に対応する。
をクレノーのポリメラーゼで埋填し、この平滑端を、平
滑端連結条件下で再結合する。このＢａｍＨＩ切断部位
を除いたプラスミドのＳＶ４０プロモーターを有するＰ
ｖｕＩＩ −Ｂｇ １■フラグメントを、ここで、３４
ｂｐからなり第２図に描かれた合成オリゴヌクレオチド
と置換する。このようにして、プラスミドｐＡＴＧが得
られる。図中の枠（ボックス）でかこまれた１０ｂｐ領
域は、ＳＶ４０ Ｔ抗原の開始領域に対応する。
プラスミドｐＡＴＧの５ｐｈＩからＫｐｎｌ切断部位ま
での領域は、いずれの所望真核細胞プロモーターによっ
ても置換することができる。これについての最も簡単な
方法は、両端が平滑端であるそのようなプロモーターを
有するフラグメントを、例えばフレノウポリメラーゼで
埋填して、作製することである。この平滑端フラグメン
トを、ベクターｐＵｃ１８又はｐＵｃ１９’のＳｍａ
Ｉ切断部位に挿入し、その後５ｐｈｌ−Ｋｐｎｌフラグ
メントとして切り出し、対応する切断を行なったｐＡＴ
Ｇプラスミドに連結する。
での領域は、いずれの所望真核細胞プロモーターによっ
ても置換することができる。これについての最も簡単な
方法は、両端が平滑端であるそのようなプロモーターを
有するフラグメントを、例えばフレノウポリメラーゼで
埋填して、作製することである。この平滑端フラグメン
トを、ベクターｐＵｃ１８又はｐＵｃ１９’のＳｍａ
Ｉ切断部位に挿入し、その後５ｐｈｌ−Ｋｐｎｌフラグ
メントとして切り出し、対応する切断を行なったｐＡＴ
Ｇプラスミドに連結する。
６５６ＭのＨｉｎｃｌｌ−Ａｖａ■フラグメント（キャ
ップサイトより５５ｂｐ下流）として、例えばＨＣＭＶ
の極初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｄｔｅｔａｌ、
： Ｃｅ１ｌ ４１ （１９８５） ５２１−５３０、
ＥＰ−Ａ ０１７８１７７号明細書）を選び、上記の方
法を応用すると、発現ベクターｐＯＲＦＥＸ１０が生じ
る。
ップサイトより５５ｂｐ下流）として、例えばＨＣＭＶ
の極初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｄｔｅｔａｌ、
： Ｃｅ１ｌ ４１ （１９８５） ５２１−５３０、
ＥＰ−Ａ ０１７８１７７号明細書）を選び、上記の方
法を応用すると、発現ベクターｐＯＲＦＥＸ１０が生じ
る。
本発明のもう一つのに利点を有する具体例は、ショウジ
ヨウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈ １ ！ ａ）の熱シヨツク
蛋白７０のプロモーターで、温度制御を受けるものを（
ｈｓｐ ； Ｉｌ、 ５ｔｅｌｌｅｒ、学位論文、 Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｒ Ｉｌｃｉｄｅｌｂｅｒｇ ）
、３３５ ｂ ｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ［フラ
グメント（ｍＲＮＡキャップサイトの８５ｂｐ下流）の
形にあるものを選択することから成る。上記のようにし
てプラスミドｐＡＴＧに取込ませて、発現プラスミドｐ
ＯＲＦＥＸ２０が得られる。
ヨウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈ １ ！ ａ）の熱シヨツク
蛋白７０のプロモーターで、温度制御を受けるものを（
ｈｓｐ ； Ｉｌ、 ５ｔｅｌｌｅｒ、学位論文、 Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｒ Ｉｌｃｉｄｅｌｂｅｒｇ ）
、３３５ ｂ ｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ［フラ
グメント（ｍＲＮＡキャップサイトの８５ｂｐ下流）の
形にあるものを選択することから成る。上記のようにし
てプラスミドｐＡＴＧに取込ませて、発現プラスミドｐ
ＯＲＦＥＸ２０が得られる。
プラスミドｐＯＲＦＥＸ１０及びｐＯＲＦＥＸ２０のＢ
ｇｌｎ及びＨｉｎｄｎＩ切断部位に、第２図の枠内に存
在するＡＴＧ開始コードンに連関して正しいリーディン
グフレーム内にＯＲＦを有するＤＮＡシーケンスを挿入
することができる。従ってこれらプラスミドは、本発明
の発現ベクターとなる。さらに、これらのベクターは、
本発明の別のベクター、特に“変位（ｄｌｓｐｌａｃｅ
ｄ ） ” リーディングフレーム（ｓフレームシフト
１）を有するもの、のための出発ベクターとしても役立
つ。
ｇｌｎ及びＨｉｎｄｎＩ切断部位に、第２図の枠内に存
在するＡＴＧ開始コードンに連関して正しいリーディン
グフレーム内にＯＲＦを有するＤＮＡシーケンスを挿入
することができる。従ってこれらプラスミドは、本発明
の発現ベクターとなる。さらに、これらのベクターは、
本発明の別のベクター、特に“変位（ｄｌｓｐｌａｃｅ
ｄ ） ” リーディングフレーム（ｓフレームシフト
１）を有するもの、のための出発ベクターとしても役立
つ。
プラスミドｐＡＴＧの合成オリゴヌクレオチド内のＫｐ
ｎＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを置き換えることによっ
て、５Ｖ４０Ｔ抗原の翻訳開始部位に別の適切な領域を
、特異的かつ都合よく挿入することも又可能であるとい
うことは明白である。
ｎＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを置き換えることによっ
て、５Ｖ４０Ｔ抗原の翻訳開始部位に別の適切な領域を
、特異的かつ都合よく挿入することも又可能であるとい
うことは明白である。
ｐＡＴＧの合成オリゴヌクレオチド内のＢｇｌｌｌ−Ｈ
ｉｎｄｌＩＩ領域に、修飾ｐＵｃ１８ポリリンカー（そ
の５′領域が第３図に表わされている）を挿入すること
ができる。第３図に表わされているシーケンスは、第２
図では枠内にあるＡＴＧ開始コードンで始まる。第３図
のＢｇｌＩＩ切断部位は、上記第２図の枠に３′方向に
隣接して存在するＢｇｌＩＩ切断部位と同一である。第
３図のＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩ切断部位の間の領域の修
飾によって、このＡＴＧ開始コードンに連関するリーデ
ィングフレームの段階的な置換が生じる。
ｉｎｄｌＩＩ領域に、修飾ｐＵｃ１８ポリリンカー（そ
の５′領域が第３図に表わされている）を挿入すること
ができる。第３図に表わされているシーケンスは、第２
図では枠内にあるＡＴＧ開始コードンで始まる。第３図
のＢｇｌＩＩ切断部位は、上記第２図の枠に３′方向に
隣接して存在するＢｇｌＩＩ切断部位と同一である。第
３図のＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩ切断部位の間の領域の修
飾によって、このＡＴＧ開始コードンに連関するリーデ
ィングフレームの段階的な置換が生じる。
修飾ｐＵｃ１８ポリリンカーは、同一の効果を有するＤ
ＮＡシーケンスによって置換えうる、このようなポリリ
ンカー領域の単なる例を表わすにすぎないということは
明白である。このようにして、特定のＮ−末を有する、
十分に定義された蛋白を構成することができる。このよ
うな構築は、例えば自身の開始コードンを有する構造遺
伝子の挿入を許容するものである。のみならず、このよ
うにして、特定のＮ−末を有するアミノ酸シーケンス（
例えば輸送シグナルのための）（ｖｏｎ Ｈｅ１ｊｅｎ
。
ＮＡシーケンスによって置換えうる、このようなポリリ
ンカー領域の単なる例を表わすにすぎないということは
明白である。このようにして、特定のＮ−末を有する、
十分に定義された蛋白を構成することができる。このよ
うな構築は、例えば自身の開始コードンを有する構造遺
伝子の挿入を許容するものである。のみならず、このよ
うにして、特定のＮ−末を有するアミノ酸シーケンス（
例えば輸送シグナルのための）（ｖｏｎ Ｈｅ１ｊｅｎ
。
Ｇ、、 Ｊ、 Ｂｌｏｃｈｅｍ、 １３３ （１９８３
） １７−２１）をコードすることもできる。
） １７−２１）をコードすることもできる。
本発明の構築物は、合成挿入物の上流にはＡＴＧコード
ンを含まない。これは、真核細胞に於るこの人ＴＧトリ
ブレットの非常に効率のよい使用を保証するものである
。従って、例えば、ＤＮＡフラグメントが、ベクターｐ
ＯＲＦＥＸ１１〜１３のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入
されれば、ＡＴＧコードンを有するリーディングフレー
ム中に、ＯＲＦが存在するこの三種のベクターの発現は
、そのベクター内のＡＴＧコードンから開始するという
ことが、ある確実さをもって言い得るのである。
ンを含まない。これは、真核細胞に於るこの人ＴＧトリ
ブレットの非常に効率のよい使用を保証するものである
。従って、例えば、ＤＮＡフラグメントが、ベクターｐ
ＯＲＦＥＸ１１〜１３のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入
されれば、ＡＴＧコードンを有するリーディングフレー
ム中に、ＯＲＦが存在するこの三種のベクターの発現は
、そのベクター内のＡＴＧコードンから開始するという
ことが、ある確実さをもって言い得るのである。
発現のための必要前提条件は、プロモーターが正しい方
向性をもって組み込まれているということである。この
方向性は、ＨＣＭＶプロモーターフラグメントの場合に
は三つの非対称的に配置されたＢｇｌｌ切断部位を基に
して、さらにｈｓｐプロモーターフラグメントの場合に
はＸｈｏＩ切断部位によって、調べることができる。
向性をもって組み込まれているということである。この
方向性は、ＨＣＭＶプロモーターフラグメントの場合に
は三つの非対称的に配置されたＢｇｌｌ切断部位を基に
して、さらにｈｓｐプロモーターフラグメントの場合に
はＸｈｏＩ切断部位によって、調べることができる。
発現のために用いられ得る構造遺伝子の例は、細菌のハ
イグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｍ ）及びもう一つは
細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子である。しかしながら
、本発明のベクターは、特にウィルス蛋白、特にヒトの
パピローマウィルス（ＨＰＶ）蛋白（例えばタイプ６．
１１．１６又は１８）、の発現のために重要である。こ
のウィルス蛋白については、マウス又はヒトの細胞のト
ランスフェクション後、転写は全く行われないか又はほ
んのわずかの不正確な転写が起るだけで、例えば、Ｅ、
ｃｏｌｔから得られる融合蛋白に対する抗体を用いては
、ウィルス蛋白を見出すことはできない。例えば、ＨＰ
Ｖ１８の蛋白Ｅ７のためのＯＲＦが、本発明のベクター
にとりこまれると、マウスＬ線維芽細胞のトランスフェ
クション後、一時的にＥ７蛋白の発現が起り、これは、
全蛋白の２％であって、細胞質成分として存在し得るも
のである。
イグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｍ ）及びもう一つは
細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子である。しかしながら
、本発明のベクターは、特にウィルス蛋白、特にヒトの
パピローマウィルス（ＨＰＶ）蛋白（例えばタイプ６．
１１．１６又は１８）、の発現のために重要である。こ
のウィルス蛋白については、マウス又はヒトの細胞のト
ランスフェクション後、転写は全く行われないか又はほ
んのわずかの不正確な転写が起るだけで、例えば、Ｅ、
ｃｏｌｔから得られる融合蛋白に対する抗体を用いては
、ウィルス蛋白を見出すことはできない。例えば、ＨＰ
Ｖ１８の蛋白Ｅ７のためのＯＲＦが、本発明のベクター
にとりこまれると、マウスＬ線維芽細胞のトランスフェ
クション後、一時的にＥ７蛋白の発現が起り、これは、
全蛋白の２％であって、細胞質成分として存在し得るも
のである。
このようにして達成された発”現は、ＨＰＶ１８の１０
〜５０個の内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ） ：］ビー
が存在するＨｅＬａ細胞での発現より１００倍高いもの
である（Ｓｃｈｖａｒｚ ｅｔ ａｌ、＋ Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１４ （１９８５）１１１−１１４ ）。
〜５０個の内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ） ：］ビー
が存在するＨｅＬａ細胞での発現より１００倍高いもの
である（Ｓｃｈｖａｒｚ ｅｔ ａｌ、＋ Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１４ （１９８５）１１１−１１４ ）。
本発明は、以下の諸例に於てより詳細に説明されるもの
である。
である。
例Ｉ
Ｈｉ ｎ ｄｍ及びＨｐａＩを、プラスミドｐ Ｓ Ｖ
２ ＣＡＴ （ＧｏｒＩＩｌａｎ ｅｔ ａｌ、、
： Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ。
２ ＣＡＴ （ＧｏｒＩＩｌａｎ ｅｔ ａｌ、、
： Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ。
Ｂｌｏｔ、 ２ （１９８２） １０４４−１０５１）
から、ＣＡＴ遺伝子を有すると共に上流の３６ヌクレオ
チド及び下流のＳＶ４０スブライシングシグラナルを有
する遺伝子セグメントをも含むフラグメント（これはプ
ラスミドｐ２９７のＢｇｌｎ−ＨｐａＩセグメン ・ト
と一致する。）の切り出しのために用いる。
から、ＣＡＴ遺伝子を有すると共に上流の３６ヌクレオ
チド及び下流のＳＶ４０スブライシングシグラナルを有
する遺伝子セグメントをも含むフラグメント（これはプ
ラスミドｐ２９７のＢｇｌｎ−ＨｐａＩセグメン ・ト
と一致する。）の切り出しのために用いる。
ベクターｐＯＲＦＥＸ１０をＨｉｎｄＩＩ［及びＨｐａ
Ｉで開環し、ＣＡＴ遺伝子を有する該当するフラグメン
トを連結して、プラスミドｐＯＲＦＥＸ１０−ＣＡＴを
得る。これは、ＣＡＴＡＴＧ開始コードンの上流に、も
う一つのＡＴＧコードンを有するが、そのリーディング
フレームは異なっている。この理由のために、このプラ
スミドにより達成される発現は、２０倍も減少する。
Ｉで開環し、ＣＡＴ遺伝子を有する該当するフラグメン
トを連結して、プラスミドｐＯＲＦＥＸ１０−ＣＡＴを
得る。これは、ＣＡＴＡＴＧ開始コードンの上流に、も
う一つのＡＴＧコードンを有するが、そのリーディング
フレームは異なっている。この理由のために、このプラ
スミドにより達成される発現は、２０倍も減少する。
この理由のために、プラスミドｐＯＲＦＥＸ１０− Ｃ
ＡＴを、Ｋｐｎｌ及びＨｉｎｄｍで切断し、それによっ
て得られる大きいフラグメントを合成オリゴヌクレオチ
ドＡＧＣＴＴＧＴＡＣと、ｄＡＴＰの存在下で連結する
。これにより、プラスミドｐＯＲＦＥＸ１０−ＣＡＴ−
ΔＡＴＧが生じる。このプラスミドによるＣＡＴ発現は
、１）ＳＶ２ＣＡＴのそれより５倍高い。
ＡＴを、Ｋｐｎｌ及びＨｉｎｄｍで切断し、それによっ
て得られる大きいフラグメントを合成オリゴヌクレオチ
ドＡＧＣＴＴＧＴＡＣと、ｄＡＴＰの存在下で連結する
。これにより、プラスミドｐＯＲＦＥＸ１０−ＣＡＴ−
ΔＡＴＧが生じる。このプラスミドによるＣＡＴ発現は
、１）ＳＶ２ＣＡＴのそれより５倍高い。
表１
クロラムフ
ェニコール
プラスミド の変換（％）−〇
ｐＳＶ２ＣＡＴ １２．４ｐＯ
ＲＦＥＸ１０−ＣＡＴ ３．０ｐＯＲＦ
ＥＸ１０−ＣＡＴ−ＩＡＴＧ ６０．９例２ パーナートら（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ、 ： Ｅ
ｘｐ、 Ｃｅ１ｌＲｅｓ、 １５８ （１９８５） ２
３７〜２４３ ）によって、三つのリーディングフレー
ムのすべてに細菌ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｍ
）を含む、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｎＩフラグメントが
報告されている。これらのフラグメントは、Ｈｉｎｄｍ
及びＢａｍＨＩで切断したｐＯＲＦＥＸｌｏにＢａｍＨ
Ｉ−ＨｉｎｄｎＩとして取り込まれる。Ｌ細胞にトラン
スフェクションして、二週間後ハイグロマイシンで選別
すると、ｐＯＲＦＥＸｌｏ−Ｈｍ２４のクローンの場合
のみよく発達した多数のコロニーを生じる。このコロニ
ーは、出発プラスミドｐ ＨＭＲ２７２（Ｂｅｒｎａｒ
ｄ ｅｔ ａｌ、、上掲書）に該当する。クローンｐＯ
ＲＦＥＸ１０−Ｈｍ１９の場合の幾つかの小コロニーは
、該当するリーディングフレーム外の第二のＡＴＧコー
ドンによるものと考えられる。結果は表２に示されてい
る。
ＲＦＥＸ１０−ＣＡＴ ３．０ｐＯＲＦ
ＥＸ１０−ＣＡＴ−ＩＡＴＧ ６０．９例２ パーナートら（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ、 ： Ｅ
ｘｐ、 Ｃｅ１ｌＲｅｓ、 １５８ （１９８５） ２
３７〜２４３ ）によって、三つのリーディングフレー
ムのすべてに細菌ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｍ
）を含む、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｎＩフラグメントが
報告されている。これらのフラグメントは、Ｈｉｎｄｍ
及びＢａｍＨＩで切断したｐＯＲＦＥＸｌｏにＢａｍＨ
Ｉ−ＨｉｎｄｎＩとして取り込まれる。Ｌ細胞にトラン
スフェクションして、二週間後ハイグロマイシンで選別
すると、ｐＯＲＦＥＸｌｏ−Ｈｍ２４のクローンの場合
のみよく発達した多数のコロニーを生じる。このコロニ
ーは、出発プラスミドｐ ＨＭＲ２７２（Ｂｅｒｎａｒ
ｄ ｅｔ ａｌ、、上掲書）に該当する。クローンｐＯ
ＲＦＥＸ１０−Ｈｍ１９の場合の幾つかの小コロニーは
、該当するリーディングフレーム外の第二のＡＴＧコー
ドンによるものと考えられる。結果は表２に示されてい
る。
表２
プラスミド コロニーの数−〇
ｐ ＨＭＲ２７２２９０
ｐＯＲＦＥＸ１０ ０ｐＯＲＦＥＸ
１０−Ｈｍ１６ ０ｐＯＲＦＥＸ１０−Ｈｍ１
９ １１ （小）ｐＯＲＦＥＸｌｏ−Ｈｍ２４
２２０ｐＯＲＦＥＸ１０−Ｈｍ２４＊ ０＊
挿入の方向性が逆向きのもの 例３ ドイツ特許出願Ｐ３６ ２５ ２５７．３明細書には、
類似のベクター系が提案されていて、この場合には、ポ
リリンカー領域のヌクレオチドを１個づつ取り除くと、
内に挿入され発現されるべき遺伝子は、三種の配置の一
つに於て必然的に正しいリーディングフレーム内に位置
することになる。ＨＰＶｌｇ−Ｅ７蛋白のため（７）Ｏ
ＲＦが、ベクターｐＥＸ１０−ｍａｒに挿入されると、
生じたベクターは、下記のＤＮＡシーケンス（コーディ
ング鎖）をＭＳ２蛋白とＨＰＶｌｇ −Ｅ７蛋白との間
の結合部に有する融合蛋白をコードする。
１０−Ｈｍ１６ ０ｐＯＲＦＥＸ１０−Ｈｍ１
９ １１ （小）ｐＯＲＦＥＸｌｏ−Ｈｍ２４
２２０ｐＯＲＦＥＸ１０−Ｈｍ２４＊ ０＊
挿入の方向性が逆向きのもの 例３ ドイツ特許出願Ｐ３６ ２５ ２５７．３明細書には、
類似のベクター系が提案されていて、この場合には、ポ
リリンカー領域のヌクレオチドを１個づつ取り除くと、
内に挿入され発現されるべき遺伝子は、三種の配置の一
つに於て必然的に正しいリーディングフレーム内に位置
することになる。ＨＰＶｌｇ−Ｅ７蛋白のため（７）Ｏ
ＲＦが、ベクターｐＥＸ１０−ｍａｒに挿入されると、
生じたベクターは、下記のＤＮＡシーケンス（コーディ
ング鎖）をＭＳ２蛋白とＨＰＶｌｇ −Ｅ７蛋白との間
の結合部に有する融合蛋白をコードする。
ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ
ＧＴＣＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩＥｃｏＲ
Ｉシーケンスに於て、このトリブレラ） Ａ Ａ Ｔ
ハ、ｐＯＲＦＥＸ１２（７）場合と同一のリーディング
フレームに存在するが、ｐＯＲＦＥＸｌｌ又は１３の場
合とは異なる。同じことが、ＢａｍＨＩ切断部位におけ
るＴＣＣ）リブレットについても言える。
ＧＴＣＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩＥｃｏＲ
Ｉシーケンスに於て、このトリブレラ） Ａ Ａ Ｔ
ハ、ｐＯＲＦＥＸ１２（７）場合と同一のリーディング
フレームに存在するが、ｐＯＲＦＥＸｌｌ又は１３の場
合とは異なる。同じことが、ＢａｍＨＩ切断部位におけ
るＴＣＣ）リブレットについても言える。
ＢａｍＨＩによる切断は、Ｂｇｌｌｌの場合と同一の突
出端を生じるので、Ｂｇｌｎで切断後、ｐＯＲＦＥＸｌ
ｏ及びｐＯＲＦＥＸ２０を、ＢａｍＨＩ切断シーケンス
と連結することができるし、後者は、同様に正しいリー
ディングフレームに配置される。
出端を生じるので、Ｂｇｌｎで切断後、ｐＯＲＦＥＸｌ
ｏ及びｐＯＲＦＥＸ２０を、ＢａｍＨＩ切断シーケンス
と連結することができるし、後者は、同様に正しいリー
ディングフレームに配置される。
生成ベクターでＬ細胞のトランスフェクションを行うと
、コードされた融合蛋白の一時的発現が生じる。この蛋
白は、ＨＰＶｌｇ−Ｅ７蛋白の大半からなる。この細胞
を溶解し、前記特許出願で提案された抗体を用いてウェ
スタンブロッティング蛋白分析を行なうと、予想された
蛋白が、ｐＯＲＦＸｌｏ、１２及び２０（後者の場合は
熱ショックの後）で感染させた細胞に見出されるが、ｐ
ＯＲＦＥＸｌｌ及び１３で感染した細胞又はＨＣＭＶプ
ロモーターを逆方向に挿入された構築物を含む細胞には
見出されない。
、コードされた融合蛋白の一時的発現が生じる。この蛋
白は、ＨＰＶｌｇ−Ｅ７蛋白の大半からなる。この細胞
を溶解し、前記特許出願で提案された抗体を用いてウェ
スタンブロッティング蛋白分析を行なうと、予想された
蛋白が、ｐＯＲＦＸｌｏ、１２及び２０（後者の場合は
熱ショックの後）で感染させた細胞に見出されるが、ｐ
ＯＲＦＥＸｌｌ及び１３で感染した細胞又はＨＣＭＶプ
ロモーターを逆方向に挿入された構築物を含む細胞には
見出されない。
ＨＰＶｌｇ−Ｅ７融合蛋白に対するラビット抗体を、１
０〜５０個のＨＰＶｌｇの内因性コピーを有するＨｅＬ
ａ細胞に於る１２．５ＫＤａ蛋白（これはすなわち予想
される大きさである）のための小バンド検出に用いた。
０〜５０個のＨＰＶｌｇの内因性コピーを有するＨｅＬ
ａ細胞に於る１２．５ＫＤａ蛋白（これはすなわち予想
される大きさである）のための小バンド検出に用いた。
このＥ７のバンドのシンチレーションカウンティングに
よる定量分析により、感染り細胞中に含まれるＥ７蛋白
量は、平均して全細胞蛋白の２％であることが明らかと
なった。これは、全細胞蛋白のわずか０．０１％がＥ７
１白であるＨｅＬａ細胞中のものより１００倍の量であ
った。
よる定量分析により、感染り細胞中に含まれるＥ７蛋白
量は、平均して全細胞蛋白の２％であることが明らかと
なった。これは、全細胞蛋白のわずか０．０１％がＥ７
１白であるＨｅＬａ細胞中のものより１００倍の量であ
った。
免疫染色法により、Ｅ７蛋白は細胞質内に存在すること
が示された。
が示された。
工程条件
マウスＬＴｋ−線維芽細胞を、ダルベツコの調製イーグ
ル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆＥａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｓ、 ＤＭＨＭ
）に１０％牛脂児血清、１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（
ｐＨ７，４）及び１００μｇ ／ ｍｌペニシリン／ス
トレプトマイシンを添加したもので培養した。一時的Ｄ
ＮＡトランスフェクションのためには３Ｘ１０６個の細
胞を、１０国径の培養皿に播き、２４時間後にＤＭＥＭ
で２度洗浄して、ＤＭＥＭ ２ｍｌ （２００ｕ ｇ
／ｍｌ ＤＭＥＭ−デキストラン（０，５ｍＤａ）及
び０．１ｍＭクロロキン含有）中のプラスミドＤＮＡ
１０μｇを、この細胞に加えた。３７℃で５時間イン
キュベーションした後、細胞をＤＭＥＭで２度洗浄して
、その後上記の添加物を含むＤＭＥＭで４８時間培養し
た。ｈｓｐプロモーターを有するプラスミドを用いた場
合には、インキュベーション終了後、４２℃５時間熱シ
ヨツクを与えた。
ル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆＥａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｓ、 ＤＭＨＭ
）に１０％牛脂児血清、１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（
ｐＨ７，４）及び１００μｇ ／ ｍｌペニシリン／ス
トレプトマイシンを添加したもので培養した。一時的Ｄ
ＮＡトランスフェクションのためには３Ｘ１０６個の細
胞を、１０国径の培養皿に播き、２４時間後にＤＭＥＭ
で２度洗浄して、ＤＭＥＭ ２ｍｌ （２００ｕ ｇ
／ｍｌ ＤＭＥＭ−デキストラン（０，５ｍＤａ）及
び０．１ｍＭクロロキン含有）中のプラスミドＤＮＡ
１０μｇを、この細胞に加えた。３７℃で５時間イン
キュベーションした後、細胞をＤＭＥＭで２度洗浄して
、その後上記の添加物を含むＤＭＥＭで４８時間培養し
た。ｈｓｐプロモーターを有するプラスミドを用いた場
合には、インキュベーション終了後、４２℃５時間熱シ
ヨツクを与えた。
トランスフェクションを受けさせた細胞のＣＡＴアッセ
イによる分析は、６５μＣｉの１４ｃｍクロラムフェニ
コールと反応させた５μｇの蛋白を用いて実施した（Ｇ
ｏｒａ＋ａｎ ｃｔ ａｔ、、上掲書）。
イによる分析は、６５μＣｉの１４ｃｍクロラムフェニ
コールと反応させた５μｇの蛋白を用いて実施した（Ｇ
ｏｒａ＋ａｎ ｃｔ ａｔ、、上掲書）。
免疫細胞化学分析のためには、ＤＮＡ添加後２４時間し
て、細胞を加圧蒸気滅菌したガラススライド上に播いた
。このスライドを、２４時間後にリン酸緩衝化食塩水中
で洗浄した。細胞を水冷メタノールで５分間、アセトン
で２分間、固定した。免疫細胞化学分析は、抗ＭＳ２−
ＨＰＶ１８−Ｅ７融合蛋白ウサギ抗体（ドイツ国特許出
願Ｐ３６ ２５ ２５７．３明細書、 Ｋ、 ９ｅｅｄ
ｏｒｌ’、学位論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｒ Ｉ
ｌｅｌｄｅｌｂｅｒｇ （１９８８） ）及び市販の検
出系を用いて実施した。スライドは、最初１：５０〜１
： ２００希釈の上記抗体で１時間インキュベーショ
ンし、リン酸緩衝化食塩水で３度洗浄した。さらにビオ
チニル化抗ウサギ抗体（５０倍希釈）で１時間インキュ
ベーションし、再び洗浄し、ストレプトアビジン／ビオ
チン／ペルオキシダーゼ複合体（１００倍希釈）で１時
間インキュベーションした。発色反応のために用いられ
た基質は、０．９３％過酸化水素を含む５０ｍＭアセテ
ート緩衝液（ｐＨ５，２）中の０．０２％３−アミノ−
９−エチルカルバゾールであった。全インキュベーショ
ンは３７℃で行なった。
て、細胞を加圧蒸気滅菌したガラススライド上に播いた
。このスライドを、２４時間後にリン酸緩衝化食塩水中
で洗浄した。細胞を水冷メタノールで５分間、アセトン
で２分間、固定した。免疫細胞化学分析は、抗ＭＳ２−
ＨＰＶ１８−Ｅ７融合蛋白ウサギ抗体（ドイツ国特許出
願Ｐ３６ ２５ ２５７．３明細書、 Ｋ、 ９ｅｅｄ
ｏｒｌ’、学位論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｒ Ｉ
ｌｅｌｄｅｌｂｅｒｇ （１９８８） ）及び市販の検
出系を用いて実施した。スライドは、最初１：５０〜１
： ２００希釈の上記抗体で１時間インキュベーショ
ンし、リン酸緩衝化食塩水で３度洗浄した。さらにビオ
チニル化抗ウサギ抗体（５０倍希釈）で１時間インキュ
ベーションし、再び洗浄し、ストレプトアビジン／ビオ
チン／ペルオキシダーゼ複合体（１００倍希釈）で１時
間インキュベーションした。発色反応のために用いられ
た基質は、０．９３％過酸化水素を含む５０ｍＭアセテ
ート緩衝液（ｐＨ５，２）中の０．０２％３−アミノ−
９−エチルカルバゾールであった。全インキュベーショ
ンは３７℃で行なった。
第１図は、本発明によるカセットベクター系の説明図で
ある。 第２図は、プラスミドｐ２９７及びｐＡＴＧのための説
明図である。 第３図は、ｐＯＲＦＥＸ１１〜１３のポリリンカー領域
の説明図である。
ある。 第２図は、プラスミドｐ２９７及びｐＡＴＧのための説
明図である。 第３図は、ｐＯＲＦＥＸ１１〜１３のポリリンカー領域
の説明図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、以下のａ）及びｂ）を含んでなり、以下の（１）〜
（３）の特異的なＤＮＡシーケンス（コーディング鎖）
を有する、カセットベクター系。 ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で働く複製起点及び選別マ
ーカーを有する、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドからのセグメ
ント、 ｂ）高等真核細胞で働き、かつ置換しうる下記のセグメ
ント、 ｂ＾１）プロモーター、 ｂ＾２）翻訳開始部位、 ｂ＾３）ポリリンカー、 ｂ＾４）スプライシングシグナル及び ｂ＾５）ポリアデニル化シグナル。 たゞし、これらの置換しうる二つのセグメントは、共に
置換し得るユニットとしてデザインすることもできる。 【遺伝子配列があります】（１） 【遺伝子配列があります】（２） 【遺伝子配列があります】（３） ここに於て（１）、（２）及び（３）のシーケンスの５
′末端のＡＴＧトリプレットは、プロモーターの下流に
機能できるように存在する単一の翻訳開始コードンを表
わし、またｂ＾３）のポリリンカーはこのシーケンス（
１）、（２）及び（３）に続くものである。 ２、該Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドからのセグメントが、実
質的に、ｐＢＲ３２２の２２９５ｂｐのＰｖｕII−Ｅｃ
ｏＲ I フラグメントである、請求項１記載のベクター
系。 ３、該プロモーターがショウジョウバエの熱ショック蛋
白７０のｈｓｐプロモーターである、請求項１又は２記
載のベクター系。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3702116.8 | 1987-01-24 | ||
| DE19873702116 DE3702116A1 (de) | 1987-01-24 | 1987-01-24 | Kassetten-vektor-system zur expression offener leserahmen in eukaryotischen zellen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63196294A true JPS63196294A (ja) | 1988-08-15 |
Family
ID=6319497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63012417A Pending JPS63196294A (ja) | 1987-01-24 | 1988-01-22 | 真核細胞に於る開放型リーディングフレームの発現のためのカセットベクター系 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0276730A3 (ja) |
| JP (1) | JPS63196294A (ja) |
| AU (1) | AU1071188A (ja) |
| DE (1) | DE3702116A1 (ja) |
| DK (1) | DK31288A (ja) |
| FI (1) | FI880259A7 (ja) |
| PT (1) | PT86588B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05503015A (ja) * | 1990-02-28 | 1993-05-27 | シェリング・コーポレーション | 哺乳類発現ベクター |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2214508A (en) * | 1988-01-27 | 1989-09-06 | Bayer Ag | Plasmid vector for the efficient expression of foreign genes fused with newly conceived transcriptional and translational signal sequences. |
| US5614409A (en) * | 1989-05-30 | 1997-03-25 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Production of IBDV VP2 in highly immunogenic form |
| DE19601319A1 (de) * | 1996-01-16 | 1997-07-17 | Wilo Gmbh | Kühler eines Kraftfahrzeugmotors |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3485497D1 (de) * | 1983-03-07 | 1992-03-19 | Abbott Lab | Eukaryotischer expressionsvektor. |
| DE3625257A1 (de) * | 1986-07-23 | 1988-02-04 | Behringwerke Ag | Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika |
-
1987
- 1987-01-24 DE DE19873702116 patent/DE3702116A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-01-20 EP EP88100715A patent/EP0276730A3/de not_active Withdrawn
- 1988-01-21 PT PT86588A patent/PT86588B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-01-21 FI FI880259A patent/FI880259A7/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 JP JP63012417A patent/JPS63196294A/ja active Pending
- 1988-01-22 AU AU10711/88A patent/AU1071188A/en not_active Abandoned
- 1988-01-22 DK DK031288A patent/DK31288A/da not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05503015A (ja) * | 1990-02-28 | 1993-05-27 | シェリング・コーポレーション | 哺乳類発現ベクター |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK31288D0 (da) | 1988-01-22 |
| EP0276730A3 (de) | 1990-02-07 |
| FI880259L (fi) | 1988-07-25 |
| FI880259A7 (fi) | 1988-07-25 |
| DK31288A (da) | 1988-07-25 |
| EP0276730A2 (de) | 1988-08-03 |
| DE3702116A1 (de) | 1988-08-04 |
| PT86588A (pt) | 1988-02-01 |
| AU1071188A (en) | 1988-07-28 |
| FI880259A0 (fi) | 1988-01-21 |
| PT86588B (pt) | 1991-12-31 |
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